本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷的放射性藥物，特別涉及含新雙功能連接劑的用于intergrinαvβ3受體陽性腫瘤診斷的RGD多肽放射性藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全世界惡性腫瘤每年發(fā)病1100多萬人，病死800多萬人。惡性腫瘤發(fā)病率在我國也呈明顯上升趨勢(shì)，據(jù)國家衛(wèi)生資料統(tǒng)計(jì)，近兩年來我國城市居民惡性腫瘤占死亡原因的第1位，每年新增患者約220萬人。近年來惡性腫瘤的治療手段在不斷發(fā)展，不僅傳統(tǒng)的化療和放療技術(shù)更加規(guī)范化和科學(xué)化，新的治療方法，如：分子靶向治療、免疫治療和基因治療等，正在逐步應(yīng)用于臨床。與之相適應(yīng)，要求惡性腫瘤診斷技術(shù)不僅要能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，更迫切需要進(jìn)一步反映惡性腫瘤的生物學(xué)行為和病理特點(diǎn)，為治療方案的科學(xué)化決策提供確切的依據(jù)。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力直接關(guān)系到患者的預(yù)后，同時(shí)對(duì)于臨床醫(yī)師選擇治療方案具有至關(guān)重要的意義。但目前臨床上還缺乏準(zhǔn)確判定惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè)方法，而主要依靠經(jīng)驗(yàn)判斷。新生血管和淋巴管的形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤新生血管形成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，淋巴道形成與腫瘤轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。整合素(integrin)是一組跨膜糖蛋白，由一個(gè)α亞單位和β亞單位通過非共價(jià)鍵組成的異二聚體，也是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的受體，與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如纖維結(jié)合蛋白、玻璃結(jié)合蛋白、層粘蛋白和膠原等)的受體識(shí)別序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)特異結(jié)合。整合素調(diào)控新生血管和淋巴道的形成。諸多研究表明，整合素調(diào)控金屬基質(zhì)蛋白酶等蛋白水解酶，直接參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促使腫瘤轉(zhuǎn)移；整合素的豐富表達(dá)是促使腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲的重要分子，它直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的粘附和結(jié)合；參與調(diào)控胞內(nèi)細(xì)胞骨架構(gòu)成，細(xì)胞增殖。αvβ3是目前研究最多的整合素分子，在骨肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及浸潤性黑色素瘤等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤新生血管均有豐富的表達(dá)，在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織表達(dá)缺乏或幾乎不表達(dá)。αvβ3受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞粘附和移行，在腫瘤新生血管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。αvβ3的表達(dá)水平與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力等惡性表型有關(guān)，也可以作為評(píng)價(jià)某些惡性腫瘤預(yù)后的的指標(biāo)。放射性核素標(biāo)記的RGD序列配體已經(jīng)被用于腫瘤的放射性核素顯像研究，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移潛力較高的integrinαvβ3表達(dá)陽性的腫瘤。已有的研究結(jié)果認(rèn)為：RGD多肽二聚體顯像劑與惡性腫瘤表面integrinαvβ3的親和力更好，要優(yōu)于RGD多肽四聚體。目前報(bào)道的RGD環(huán)肽二聚體E[c(RGDxk)]2(E代表谷氨酸，c代表環(huán)化，R代表精氨酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x為f或y，分別代表苯丙氨酸和酪氨酸)，其兩個(gè)RGD模序之間的距離為6個(gè)鍵，由于距離不夠長(zhǎng)，因此E[c(RGDxk)]2的兩個(gè)RGD模序很難同時(shí)與細(xì)胞表面相鄰的兩個(gè)integrinαvβ3受體結(jié)合。但目前已有的RGD多肽二聚體顯像劑在非靶器官，特別是腸道等器官的攝取較多，腹部本底較高，干擾了腹部腫瘤的成像效果，肝臟和腎臟攝取高。因此，有必要發(fā)明新型的RGD多肽二聚體顯像劑，通過改變配體的結(jié)構(gòu)，采用新的雙功能連接劑進(jìn)一步降低顯像劑在腸等非靶器官的攝取，從而降低放射性本底，提高腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服已有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的主要目的在于提供一種具有制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、標(biāo)記率和放射化學(xué)純度高、靶與非靶比值高、腫瘤攝取值高且滯留時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)的以亞氨基二乙酸為雙功能連接劑的99mTc標(biāo)記RGD多肽腫瘤診斷藥物。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下：將HYNIC-OSu與亞氨基二乙酸化的RGD肽二聚體I2P-RGD2相連接，制備得到配體HYNIC-I2P-RGD2。再利用配體中HYNIC的螯合作用，實(shí)現(xiàn)99mTc標(biāo)記，制成RGD多肽二聚體顯像藥物99mTc-I2P-RGD2。在配體結(jié)構(gòu)中引入亞氨基二乙酸以及兩個(gè)PEG4連接鏈，減少了藥物在肝臟、腎臟和腸道中的攝取，從而降低了放射性本底，提高了腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。具體技術(shù)方案如下：(1).一類含亞氨基二乙酸為雙功能連接劑的99mTc配合物99mTc-I2P-RGD2，其結(jié)構(gòu)式如下式(1)所示：(2).一種用于制備如上述(1)所述的含亞氨基二乙酸的99mTc配合物99mTc-I2P-RGD2的方法，其特征在于，主要步驟為：先將HYNIC-OSu與亞氨基二乙酸化的RGD肽二聚體I2P-RGD2反應(yīng)，使二者相連接，制備得到配體HYNIC-I2P-RGD2；再向反應(yīng)瓶中加入20-25μgHYNIC-I2P-RGD2、5mg三苯基膦三間磺酸鈉(TPPTS)、6.5mgN-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、40mg甘露醇、38.5mg六水合琥珀酸二鈉、12.7mg琥珀酸和1.0-1.5mLNa99mTcO4生理鹽水溶液(1,110-1,850MBq)，在沸水浴下反應(yīng)10-15min得到。(3)如(1)所述的含亞氨基二乙酸為雙功能連接劑的99mTc配合物99mTc-I2P-RGD2在制備腫瘤診斷藥物中的應(yīng)用。附圖說明[圖1]是表示標(biāo)記前體化合物HYNIC-I2P-RGD2的合成路線示意圖；[圖2]是表示99mTc標(biāo)記的診斷藥物99mTc-I2P-RGD2的合成路線示意圖；[圖3]是表示99mTc-I2P-RGD2的放射性HPLC圖譜；[圖4]是表示在過量E[c(RGDfK)]2抑制或未經(jīng)E[c(RGDfK)]2抑制的條件下，99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠中注射后60min的生物分布。[圖5]是表示99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠模型中的3D和橫斷面的SPECT-CT圖像。具體實(shí)施方式一.99mTc標(biāo)記的RGD多肽腫瘤診斷藥物的制備方法1.材料和設(shè)備化學(xué)試劑均購于美國Sigma/Aldrich公司，無需進(jìn)一步純化。I2P-RGD2環(huán)肽二聚體(I2P-RGD2)由美國PeptidesInternational公司(Louisville，KY)按照常規(guī)工藝制造。HYNIC-Osu根據(jù)以往文獻(xiàn)中方法進(jìn)行合成，屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)。ESI(電噴射離子化)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由FinniganLCQ傳統(tǒng)質(zhì)譜儀上采集獲得。99mTcO4-從原子高科股份有限公司購得。2.HPLC(高效液相色譜)方法HPLC方法1：使用LabAillance色譜系統(tǒng)，包括紫外-可見光檢測(cè)儀(波長(zhǎng)為254nm)和ZorbaxC18半制備柱(柱寬×柱長(zhǎng)為9.4nm×250mm，固定相的孔徑大小為美國AgilentTechnologies公司提供)。流速為2.5mL/min，流動(dòng)相A相為含0.1％TFA的水；B相為含0.1％TFA的甲醇。流動(dòng)相梯度：0-5min，90％A-＞80％A；5.01-20min，80％A-＞70％A。HPLC方法2：使用LabAillance色譜系統(tǒng)，包括-ramIN/US檢測(cè)儀(Tampa，F(xiàn)L)和ZorbaxC18色譜柱(柱寬×柱長(zhǎng)為4.6mm×250mm，固定相的孔徑大小為美國AgilentTechnologies公司提供)。流速為1mL/min，流動(dòng)相A相為25mMNH4OAc；B相為乙腈。流動(dòng)相梯度為0-5min，90％A；5.01-20min，90％A-＞60％A；20.01-25min，60％A-＞40％A。3.標(biāo)記前體化合物HYNIC-I2P-RGD2的制備方法將HYNIC-Osu(13.5mg，30μmol)和I2P-RGD2(5.9mg，3.2μmol)溶于DMF(2mL)。滴加過量的DIEA(5滴)至上述混合液，室溫?cái)嚢?4h至反應(yīng)結(jié)束。將2mL水加至反應(yīng)液中，用三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)pH至3～4。產(chǎn)品經(jīng)HPLC分離純化(HPLC方法1)，收集保留時(shí)間12～15min的組分，冷凍干燥后得到5.8mg目標(biāo)產(chǎn)物HYNIC-I2P-RGD2(合成路線圖參見圖1)。ESI-MS(C95H141N25O30S)：實(shí)驗(yàn)值為2145.28([M]+)，計(jì)算值為2145.00([M]+)。4.99mTc-I2P-RGD2的制備方法將1.0～1.5mL含有1110～1850MBqNa99mTcO4的生理鹽水加至含有20-25μgHYNIC-I2P-RGD、5mgTPPTS、6.5mgtricine、40mg甘露醇、38.5mg六水合琥珀酸二鈉和12.7mg琥珀酸的凍干瓶中。將上述反應(yīng)液在沸水浴中反應(yīng)10～15min，然后在室溫中放置5min，采用HPLC對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析(HPLC方法2)(合成路線參見圖2)。將上述反應(yīng)液配制成約30μCi/mL的生理鹽水溶液用于生物分布研究，配制成約1mCi/mL的生理鹽水溶液用于顯像研究。用于上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的99mTc-I2P-RGD2，其放化純度＞90％。在給動(dòng)物注射前，溶液均經(jīng)0.20μmMillex-LG濾膜過濾，每只動(dòng)物注射0.1mL。從99mTc-I2P-RGD2的放射性HPLC圖譜(參見圖3)可見，99mTc-I2P-RGD2具有高的放射化學(xué)純度，RCP＞95％。二.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)生物分布及顯像研究依據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行，并符合動(dòng)物倫理的要求。U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用含厄爾平衡鹽緩沖液的MEM培養(yǎng)基培育，并培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清和1％青霉素和鏈霉素。腫瘤細(xì)胞于37℃，含有5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細(xì)胞單層生長(zhǎng)，待達(dá)到90％匯合度時(shí)收獲。選擇雌性4-5周齡裸鼠，將腫瘤細(xì)胞懸于生理鹽水中，數(shù)量調(diào)整為5×107個(gè)/mL，取0.1mL細(xì)胞懸液植于裸鼠肩側(cè)。所有步驟均于超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。待腫瘤長(zhǎng)至0.1～0.5g時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的生物分布實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇5只荷瘤小鼠(20～25g)，均于尾靜脈注射約3μCi99mTc-I2P-RGD2。在注射5、30、60和120min后，將動(dòng)物用過量的戊巴比妥鈉(約200mg/kg)麻醉處死。從心臟取血樣，再取出腫瘤及正常器官(腦、眼、心、脾、肺、肝、腎、肉和腸)，用生理鹽水洗滌后擦干稱重，并用PerkinElmerWizard1480γ計(jì)數(shù)器(Shelton，CT)測(cè)計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出各組織的單位質(zhì)量注射劑量百分?jǐn)?shù)(％ID/g)和瘤與正常組織的比值。表1列出了99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中不同時(shí)相的生物分布數(shù)據(jù)；表2對(duì)荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠注射后60min后，99mTc-99mTc-I2P-RGD2和99mTc-3P-RGD2的生物分布數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。表199mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的生物分布數(shù)據(jù)(％ID/g)器官5min30min60min120min血3.62±0.411.02±0.040.51±0.050.27±0.04腦0.34±0.100.30±0.060.16±0.020.18±0.06眼2.48±0.633.46±0.922.25±1.111.96±0.72心4.30±0.913.21±0.801.82±0.391.51±0.43腸23.99±5.7212.32±2.897.36±1.347.11±0.84腎24.80±3.8316.07±1.4312.17±1.169.73±1.37肝5.55±0.492.45±0.191.76±0.211.67±0.40肺6.44±1.214.55±0.482.28±0.452.27±0.27肌肉2.46±0.502.19±0.281.39±0.341.21±0.36脾5.03±0.653.26±0.622.91±0.702.69±0.53腫瘤7.24±1.186.61±0.885.61±1.385.28±1.31腫瘤/血2.04±0.296.48±0.729.31±0.4422.35±4.51腫瘤/肝1.32±0.282.68±0.592.85±0.333.47±0.75腫瘤/肺1.08±0.121.44±0.202.13±0.302.34±0.41腫瘤/肌肉3.13±0.513.10±0.263.33±0.523.82±0.15表2注射后60min，99mTc-I2P-RGD2與99mTc-3P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠中的生物分布數(shù)據(jù)比較(％ID/g)器官99mTc-I2P-RGD299mTc-3P-RGD2血0.51±0.050.70±0.11腦0.16±0.020.16±0.02眼2.25±1.112.00±0.28心1.82±0.392.01±0.19腸7.36±1.344.98±0.21腎12.17±1.1620.39±0.90肝1.76±0.214.68±0.40肺2.28±0.453.41±0.57肌肉1.39±0.341.73±0.25脾2.91±0.703.64±0.34腫瘤5.61±1.384.68±0.61腫瘤/血9.31±0.446.68±1.21腫瘤/肝2.85±0.331.01±0.45腫瘤/肺2.13±0.301.37±0.25腫瘤/肌肉3.33±0.522.70±0.89從表1中可以看出，注射后5、30、60和120min，99mTc-I2P-RGD2的腫瘤攝取依次為7.24±1.18、6.61±0.88、5.61±1.38和5.28±1.31％ID/g，注射后60min的腫瘤攝取值明顯高于99mTc-3P-RGD2。注射后5、30、60和120min，99mTc-I2P-RGD2在肝中的攝取依次為5.55±0.49、2.45±0.19、1.76±0.21和1.67±0.40％ID/g，腫瘤/肝攝取比值依次為1.32±0.28、2.68±0.59、2.85±0.33和3.47±0.75。注射后60min內(nèi)，99mTc-I2P-RGD2在肝中的攝取與99mTc-3P-RGD2相比明顯降低。99mTc-I2P-RGD2在腎臟中的攝取值為12.17±1.16％ID/g，也明顯低于99mTc-3P-RGD2的20.39±0.90％ID/g，p＜0.01(表2)。因此，認(rèn)為99mTc-I2P-RGD2在非靶組織中的攝取更低，性能優(yōu)于99mTc-3P-RGD2。2.99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的抑制實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇4只荷瘤小鼠(20-25g)，均于尾靜脈共注射約3μCi99mTc-I2P-RGD2和約350μg(約14mg/kg)的經(jīng)典整合素αvβ3拮抗劑E[c(RGDfK)]2(RGD2)。在注射60min后，將動(dòng)物用過量的戊巴比妥鈉(約200mg/kg)麻醉處死。從心臟取血樣，再取出腫瘤及正常器官(腦、眼、心、脾、肺、肝、腎、肉和腸)，用生理鹽水洗滌后擦干稱重，并用PerkinElmerWizard1480γ計(jì)數(shù)器(Shelton，CT)測(cè)計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出各組織的單位質(zhì)量注射劑量百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖4。由圖可知，未注射過量RGD2時(shí)99mTc-I2P-RGD2的腫瘤攝取為5.61±1.38％ID/g，而共注射過量RGD2后腫瘤攝取降至0.59±0.28％ID/g，可見過量的RGD2顯著抑制了99mTc-I2P-RGD2在腫瘤中的攝取。同樣地，RGD2也抑制了99mTc-I2P-RGD2在正常組織中的攝取。未經(jīng)抑制時(shí)99mTc-I2P-RGD2在腸、肺和脾的攝取為7.36±1.34，2.28±0.45，2.91±0.71％ID/g，而抑制后它們相應(yīng)的攝取依次降至0.88±0.26、0.85±0.39和0.51±0.03％ID/g。上述實(shí)驗(yàn)清楚地證明，99mTc-I2P-RGD2在腫瘤中的定位是具有integrinαvβ3特異性的。3.99mTc-I2P-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的SPECT-CT顯像研究SPECT/CT顯像采用配有0.6mm多針孔準(zhǔn)直器的u-SPECT-II/CT掃描儀(Milabs，Utrecht，TheNetherlands)。荷膠質(zhì)瘤的小鼠經(jīng)尾靜脈注射劑量為37.0MBq的99mTc-I2P-RGD2，體積為0.1mL。注射后60min后將其置于連有異氟醚麻醉裝置的屏蔽室內(nèi)(Univentor，Zejtun，Malta)，通過流速為350mL/min含有3.0％異氟醚的氣流進(jìn)行麻醉。麻醉完畢后，立即將動(dòng)物仰臥在掃描床上進(jìn)行SPECT-CT掃描，并將氣流調(diào)整為流速250mL/min，含有2.0％異氟醚。顯像結(jié)束后，SPECT圖像采用迭代法(6次迭代，16個(gè)子集)進(jìn)行重建，并進(jìn)行SPECT圖像與CT圖像的融合。顯像結(jié)果見圖5，可見腫瘤部位放射性濃聚，顯影清晰，肺、腸道等器官放射性本底較低。由上述數(shù)據(jù)可見，99mTc-I2P-RGD2相比99mTc-3P-RGD2在多個(gè)方面均具備明顯的優(yōu)勢(shì)，可適用于臨床中。當(dāng)前第1頁1 2 3