本發(fā)明涉及醫(yī)用的配制品，具體涉及含有來(lái)源于植物的未確定結(jié)構(gòu)的藥物制劑。

背景技術(shù)：

1型糖尿病是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)自身胰島β細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答導(dǎo)致胰島損傷，胰島素絕對(duì)缺乏的急發(fā)性慢性病，需胰島素終身治療。國(guó)外資料表明，全世界不同地區(qū)的1型糖尿病發(fā)病率有數(shù)十倍差異，最高的是芬蘭白人，達(dá)36.0/10萬(wàn)人年，而東南亞地區(qū)則較低，報(bào)告的結(jié)果為2.0/10萬(wàn)人年左右，而我國(guó)0～14歲人群中該病發(fā)病率達(dá)0.6/10萬(wàn)。由此看來(lái)，雖然我國(guó)1型糖尿病發(fā)病率較低，但是人口的眾多決定了患者并不在少數(shù)，是危害人類健康的疾病之一。有研究資料顯示我國(guó)青少年1型糖尿病患者呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，發(fā)病率也隨年齡的增長(zhǎng)而增加，民族間的發(fā)病率差異達(dá)12倍，且發(fā)病率在不同地區(qū)之間呈現(xiàn)明顯的南低北高現(xiàn)象。因此尋找有效治療和改善該病的藥物已成為一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。

在1型糖尿病(即胰島素依賴型，IDDM)患者中，胰腺常有明顯的病理改變，β細(xì)胞數(shù)量?jī)H在正常的10％以下，多伴有胰小島炎。主要病理改變有：1.胰小島萎縮：此為1型糖尿病最常見(jiàn)的病理改變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，呈條束狀而變窄。萎縮的小島細(xì)胞形態(tài)較小，核致密，胞漿少。此類皺縮細(xì)胞尚能分泌胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽激素，但很少分泌胰島素。2.胰小島增生肥在：此系另一種較少見(jiàn)的重要改變，多見(jiàn)于病程短或新發(fā)病的患者。胰小島細(xì)胞增生，甚至肥大，直徑超過(guò)300～400μm。細(xì)胞較大，外形規(guī)則清晰，核較大。顆粒染色后觀察，小島主要含有具有流行性的β細(xì)胞，顆粒幾乎全脫去，也含有α細(xì)胞。為“蜜月期”病情緩解的表現(xiàn)，數(shù)年后病情加重時(shí)β細(xì)胞可幾乎完全消失。3.β細(xì)胞空泡變性：主要見(jiàn)于本病的急性型，特點(diǎn)為細(xì)胞漿變空，光鏡下未見(jiàn)顆?；蚱渌?xì)胞器。主要由于糖原子核沉著所致，并不造成β細(xì)胞永久性損傷，屬可逆性改變。4.胰小島炎：50％～70％的1型糖尿病患者，尤其是得病不久后死亡的兒童，?？梢?jiàn)有胰小島及其周圍有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，為胰島炎(insulitis)。由此提示自身免疫反應(yīng)系1型糖尿病的發(fā)病機(jī)理。

西醫(yī)雖然還無(wú)法治愈1型糖尿病，臨床中已取得了重大的進(jìn)展，治療手段日趨多樣化，不同程度地延緩了疾病的發(fā)生，減輕疾病的癥狀，提高1型糖尿病患者的生活質(zhì)量。近幾年，1型糖尿病的治療取得了許多新的突破，如胰島移植，胰島素類似物及給藥途徑，基因，免疫干預(yù)，干細(xì)胞治療等方面的研究為1型糖尿病的治療提供了新的思路和方法。但是純西醫(yī)制劑副作用較大，血糖波動(dòng)明顯，胰島素注射治療患者依從性較差，所以急需研制用于治療1型糖尿病的中藥復(fù)方。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于中藥治療1型糖尿病的研究多局限在中藥單體或活性成分，而中藥組合物治療1型糖尿病的研究很少。陳蔚等研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用黃芪多糖(Astragalus Polysacharin，APS)預(yù)免疫可以糾正NOD小鼠Ts細(xì)胞的缺陷，恢復(fù)其細(xì)胞功能，使免疫抑制作用加強(qiáng)，糾正Thl型細(xì)胞/細(xì)胞因子的免疫失衡狀態(tài)，從而預(yù)防或延緩NOD小鼠糖尿病發(fā)病。Kobayashi等發(fā)現(xiàn)人參提取物可降低NOD鼠的IFN-γ含量，增高IL-4含量從而預(yù)防糖尿病的發(fā)生發(fā)展。蔥酸類成分大黃酸具有明顯治療NOD小鼠糖尿病及其腎病的作用，還可以明顯改善db/db小鼠糖尿病腎病的損害，延緩腎功能減退。研究發(fā)現(xiàn)桑葉水提物對(duì)鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠胰島的治療作用和對(duì)腎臟以及肝臟的保健功效?？得舻妊芯拷Y(jié)果顯示黑苦蕎粉對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降糖作用。施念瑋等研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷通過(guò)下調(diào)NOD鼠胰腺中的Th1表達(dá)來(lái)預(yù)防糖尿病的發(fā)生。曹莉等發(fā)現(xiàn)葛根素可顯著改善實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠的胰島索抵抗。王莉英等發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用茶多糖預(yù)免疫可以預(yù)防或延緩NOD小鼠1型糖尿病的發(fā)生。關(guān)于防治1型糖尿病的中藥，國(guó)知局的專利文獻(xiàn)中先后公開(kāi)了各種中藥復(fù)方。其中，CN104042928專利申請(qǐng)公開(kāi)了由石斛40-60份，葫蘆巴5-15份制備的復(fù)方；CN103816438專利申請(qǐng)公開(kāi)了由葛根50g；苦瓜50g；玉米須50g；番石榴葉25g；麥冬20g；海帶20g；枸杞子15g；麥芽10g；生地9g；赤芍6g；二甲雙胍0.03g制備的復(fù)方；CN103316101專利申請(qǐng)公開(kāi)了由葫蘆巴6-15份、黃芪6-15份、淫羊藿3-8份、補(bǔ)骨脂3-8份、山茱萸3-8份、大黃1-5份、肉桂3-8份、黃連2-6份制備的復(fù)方；CN103005446專利申請(qǐng)公開(kāi)了由玉米須、蛹蟲草合成的純天然復(fù)方片劑，為降血糖功能食品；CN103585431專利申請(qǐng)公開(kāi)了由土木香3-9份，艾葉3-9份，覆盆子6-12份，瓜子金15-30份，紅景天3-6份，酸棗仁10-15份，知母6-12份，芡實(shí)9-15份，菟絲子6-12份制備的復(fù)方。

公開(kāi)號(hào)為CN101632827A的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種治療銀屑病中藥組合物，該組合物由赤芍、腫節(jié)風(fēng)、莪術(shù)、烏梅、紫草、土茯苓、甘草7味傳統(tǒng)中草藥配制而成的，具有活血祛瘀消斑，祛風(fēng)除濕止癢之功。上述藥物是由全國(guó)名老中醫(yī)、著名皮膚病專家禤國(guó)維教授臨床應(yīng)用數(shù)十年的經(jīng)驗(yàn)方加減而來(lái)，是廣東省中醫(yī)院用于治療銀屑病的常用藥，具有活血祛瘀消斑，祛風(fēng)除濕止癢之功效，臨床用于治療血虛風(fēng)燥型的銀屑病療效確切。

現(xiàn)代藥理研究表明，該中藥組合物具有多種藥理活性，概況起來(lái)講，目前已公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用如下：

(1)方中含有的芍藥苷和甘草酸等指標(biāo)成分，具有抗炎、免疫抑制等作用，腫節(jié)風(fēng)中含有綠原酸、迷迭香酸、落新婦苷等化合物，也具有抗炎、免疫抑制等作用(馮麗敏，趙瑞芝，王銀潔，韓凌，盧傳堅(jiān).正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選銀屑靈片中腫節(jié)風(fēng)有效成分的提取工藝[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，08：1860-1861.)。

(2)紫草中的紫草素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞株增殖有抑制及凋亡的作用(吳曉霞，周武慶.紫草素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞株增殖的抑制及凋亡的作用[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病學(xué)雜志，2003，19(6)：563-565.)。

(3)莪術(shù)能使天然角化不全表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞，并能抑制上皮細(xì)胞有絲分裂而起到抑制表皮增生過(guò)快的作用(徐厚謙，李應(yīng)東.莪術(shù)研究概況[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，12(1)：46.)。

(4)莪術(shù)、腫節(jié)風(fēng)、赤勺等活血化瘀諸藥對(duì)于皮膚病微循環(huán)障礙的病理有明顯的改善作用(黃詠菁，吳元?jiǎng)伲瘟休x，王蕾.阿維A膠囊聯(lián)合銀屑靈片治療尋常性銀屑病的臨床觀察[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2007，10：643-644.)。

(5)中藥提取液對(duì)于TNF-α刺激產(chǎn)生的IL-8的具有抑制作用(盧傳堅(jiān)，劉鳳年.“銀屑靈片”中藥提取液對(duì)腫瘤壞死因子-α刺激后角朊細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-8的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，11：1862-1863.)。

以上研究提示，治療銀屑病中藥組合物具有一定的抗炎、免疫抑制作用。目前，該方尚未見(jiàn)有將其應(yīng)用于防治1型糖尿病(胰島素依賴性糖尿病，insulin-dependent diabetes mellitus，簡(jiǎn)稱IDDM)的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供治療銀屑病中藥在制藥中的新用途。

上述治療銀屑病中藥在制藥中的新用途具體是：

治療銀屑病中藥在制備防治1型糖尿病的藥物中的應(yīng)用；所述防治1型糖尿病的藥物是公開(kāi)號(hào)為CN101632827A的專利申請(qǐng)所述的一種治療銀屑病中藥組合物，其有效成分由以下重量份原料制得：

腫節(jié)風(fēng)15份，莪術(shù)9份，烏梅15份，土茯苓60份，赤芍9份，紫草15份，甘草6份。

上述防治1型糖尿病的藥物為片劑，該片劑的制備方法由以下步驟組成：

(1)將所述的原料藥，直接搗碎成粗粉，加入10倍量體積濃度為70％的乙醇提取兩次，每次2小時(shí)，合并提取液；

(2)減壓濃縮，回收乙醇，制得浸膏；

(3)取浸膏，加入3重量倍的淀粉，混均，制粒，干燥，按片劑重量的5％加入硬脂酸鎂，混均，壓片即可。

本發(fā)明采用治療銀屑病中藥組合物治療將NOD(shi/Ltj)雌性小鼠脾淋巴細(xì)胞移植到NOD-SCID雌性小鼠體內(nèi)而誘發(fā)1型糖尿病的小鼠模型并采用臨床上成人服用劑量換算而來(lái)的藥物濃度對(duì)1型糖尿病小鼠模型干預(yù)33天，觀察小鼠血糖到建模后35天，然后取材觀測(cè)指標(biāo)。

結(jié)果表明，治療銀屑病中藥組合物可顯著提高1型糖尿病模型鼠胰腺內(nèi)胰島細(xì)胞的存活率，延緩小鼠發(fā)病，降低小鼠1型糖尿病的發(fā)病程度，延長(zhǎng)1型糖尿病小鼠的生存期。胰島β細(xì)胞被自身T細(xì)胞攻擊出現(xiàn)免疫反應(yīng)是引發(fā)1型糖尿病的重要免疫因素，該中藥組合物對(duì)于淋巴細(xì)胞移植建立的動(dòng)物模具有有效保護(hù)作用，預(yù)示著可用于1型糖尿病的預(yù)防和治療。根據(jù)銀屑病的治療經(jīng)驗(yàn)，該中藥組合物用法如下：成人每日用量相當(dāng)于上述有效成分2.15g生藥/kg體重，加水煎煮2-3次的合并液，分三次服，每次150毫升，30天一個(gè)療程。

為了公眾能更好地理解本發(fā)明的有益效果，下面將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

附圖說(shuō)明

圖1為造模后小鼠的血糖變化趨勢(shì)曲線圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

圖2為造模后小鼠的發(fā)病率曲線圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

圖3為造模后小鼠的平均體重曲線圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

圖4為造模后小鼠的平均飲水量曲線圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

圖5為造模后小鼠的平均食量曲線圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

圖6為各組小鼠胰腺組織的HE染色圖片?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組?！?0X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

圖7為各組小鼠胰腺組織胰島素抗體的免疫組織化學(xué)染色圖片。“Control”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組?！?0X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

圖8為各組小鼠胰腺組織CD3抗體的免疫組織化學(xué)染色圖片?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。“10X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

圖9為目的基因的Q-PCR的結(jié)果柱狀圖?！癈ontrol”表示正常組，“Model”表示模型組，“Treantment”表示中藥處理組，即治療組。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)驗(yàn)采用模擬人1型糖尿病的動(dòng)物模型，通過(guò)該模型觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的血糖值驗(yàn)證治療銀屑病中藥組合物對(duì)于1型糖尿病的治療作用。首先，通過(guò)嘗試性實(shí)驗(yàn)摸索造模方法，建立穩(wěn)定的1型糖尿病小鼠模型，然后通過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證治療銀屑病中藥組合物具有降低血糖和延緩發(fā)病的作用。

1治療銀屑病中藥組合物對(duì)于1型糖尿病小鼠模型降低血糖和延緩發(fā)病的作用

1.1 1型糖尿病小鼠模型的建立

1.1.1儀器、材料和試劑

超凈工作臺(tái)，電腦，管式低速常溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；解剖器械若干套-剪刀和鑷子，5mL注射器針柄，細(xì)胞培養(yǎng)皿(35mm×10mm)，45mL離心管，15mL離心管，濾網(wǎng)，載物臺(tái)，擦手紙，乳膠手套，管架，廢物缸，1mL注射器，冰盒，細(xì)胞計(jì)數(shù)板(Countstart)，1mL/200μL/10μL移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)和槍頭，電子移液槍，10mL移液管等；PBS(1×)溶液，紅細(xì)胞裂解液(1×，ACK Lysis Buffer)，10％FBS/PBS溶液，0.2％的臺(tái)盼藍(lán)，消毒酒精。

1.1.2自發(fā)1型糖尿病NOD(shi/Ltj)雌性小鼠篩選

飼養(yǎng)NOD(shi/Ltj)雌性小鼠﹥4個(gè)月時(shí)，通過(guò)觀測(cè)小鼠墊料的濕潤(rùn)、粘連程度和飲水量初步判定小鼠是否發(fā)病，開(kāi)始檢測(cè)血糖，將血糖≥11.1mmol/L的小鼠進(jìn)行標(biāo)記并與未發(fā)病小鼠分開(kāi)放置，造模備用。

1.1.3自發(fā)1型糖尿病NOD(shi/Ltj)雌性小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離與移植

1.超凈臺(tái)照紫外消毒，拿出ACK溶液復(fù)溫，從動(dòng)物房取出自發(fā)病造模用小鼠，準(zhǔn)備冰盒，用裝有少量10％FBS/PBS溶液的45mL離心管盛放脾臟。

2.將造模用小鼠頸椎脫臼處死，噴灑75％乙醇消毒，從側(cè)面開(kāi)腹取出脾臟，放入10％FBS/PBS溶液中，直至所有小鼠的脾臟全部取完。

3.將脾臟放在濾網(wǎng)上，置于裝有一定量10％FBS/PBS溶液的培養(yǎng)皿中，一個(gè)一個(gè)的剪碎，研磨，再通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾到45mL離心管中，置于冰盒中。

4.用管式低速常溫離心機(jī)離心，1300轉(zhuǎn)/分鐘或300g，離心7分鐘。

5.離心結(jié)束后，倒出上清，先加入2mL的ACK溶液，用槍頭吹打均勻，室溫靜置30秒，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，棄去白色沉淀，再在新管中加入14mL的ACK溶液，上下顛倒混勻，室溫靜置到5分，待溶液顏色變淺。

6.然后加入適量的PBS溶液停止反應(yīng)，上下顛倒混勻，300g，離心7分鐘。

7.離心結(jié)束后倒出上清，加入2mLPBS吹打均勻，再加至30mL預(yù)冷的PBS溶液，上下顛倒，同條件離心。

8.離心結(jié)束后倒出上清，加入4mLPBS，用移液管吹打均勻，取出10μL細(xì)胞懸液，再加入PBS至30mL清洗，同條件離心。同時(shí)，10μL細(xì)胞懸液中加入490μL的PBS溶液稀釋50倍，用槍頭吹打均勻后，再取出20μL細(xì)胞懸液，加入20μL的濃度為0.2％的臺(tái)盼藍(lán)，混合均勻，取出20μL用countstart計(jì)數(shù)軟件計(jì)數(shù)(稀釋了400倍)，得3.5×10⁶個(gè)細(xì)胞，則細(xì)胞總數(shù)為3.5×10⁶×50×2×4＝1.4×10⁹個(gè)。

9.離完心后，倒出上清，加入10mLPBS，則細(xì)胞濃度為1.4×10⁸個(gè)/mL，因?yàn)槊恐恍∈笠浦?.2mL細(xì)胞懸液，則每只小鼠移植的細(xì)胞數(shù)量為2.8×10⁷個(gè)。

10.將10mL的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15mL離心管中，吹打均勻，置于冰盒中，帶入動(dòng)物房。

11.用1mL的注射器吸取細(xì)胞懸液，每只NOD-SCID小鼠注射0.2mL的細(xì)胞懸液。

12.將造完模的NOD-SCID小鼠進(jìn)行分組，用苦味酸進(jìn)行編號(hào)。

1.1.4結(jié)果

最后統(tǒng)計(jì)，我們將來(lái)源于8只已發(fā)IDDM(血糖≥11.1mmol/L)的NOD(shi/Ltj)小鼠的部分脾淋巴細(xì)胞成功移植到20只NOD-SCID小鼠體內(nèi)，每只小鼠植入脾淋巴細(xì)胞量約2.8×10⁷個(gè)。已造模小鼠隨機(jī)分為2組，模型組10只，只灌胃雙蒸水，用于療效對(duì)照；治療組10只，用治療銀屑病中藥組合物干預(yù)處理。正常NOD-SCID小鼠8只作為正常對(duì)照組，用于模型對(duì)照。由于觀察期內(nèi)操作失誤，導(dǎo)致灌胃前期模型組和治療組各有1只小鼠死亡。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物的制備

根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》規(guī)定，小鼠給藥劑量的選擇按照不同種屬動(dòng)物間等效劑量的直接折算公式計(jì)算，成人每日服用相當(dāng)于129g生藥，小鼠的用藥劑量是成人的12倍，即每10g體重?cái)z入0.258g生藥量。取公開(kāi)號(hào)為CN101632827A的專利申請(qǐng)實(shí)施例1所制得的浸膏，用水稀釋至相當(dāng)于每毫升混懸液含有生藥量1.89g，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3灌胃與血糖監(jiān)測(cè)

造模后第三天開(kāi)始灌胃，正常對(duì)照組無(wú)需任何處理，模型組只灌胃雙蒸水，治療組只灌胃藥液，兩組灌胃容量一致，灌胃前均進(jìn)行小鼠體重稱重，做好記錄，灌胃33天至取材。從造模后第15天開(kāi)始通過(guò)小鼠尾靜脈采血檢測(cè)所有小鼠的隨機(jī)血糖，使用雅培安妥血糖儀及試紙快速檢測(cè)。血糖監(jiān)測(cè)點(diǎn)設(shè)置在第15天，第21天，第23天，第25天，第26天，第27天，一直到第35天，做好小鼠血糖記錄。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.1各組小鼠一般狀況在實(shí)驗(yàn)前后的變化

正常組活動(dòng)頻繁，動(dòng)作敏捷，反應(yīng)迅速；模型組精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩，毛發(fā)枯槁無(wú)光澤，弓背蜷體；治療組精神狀況、反應(yīng)、毛色活動(dòng)較模型組明顯增多。

1.4.2各組小鼠平均血糖在實(shí)驗(yàn)前后的變化

造模后第30天，模型組和治療組小鼠血糖與正常組三組間比較有顯著性差異(P＜0.01)，提示模型造模成功。與正常組比較，治療組有差異，但遠(yuǎn)沒(méi)有模型組差異顯著，說(shuō)明藥物治療有效。(結(jié)果見(jiàn)表1及圖1)

表1 NOD-SCID小鼠及造模后小鼠血糖(mmol/L)變化

注：采用單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行總體間的比較，P＝0.006＜0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。小鼠后期血糖很高，血糖儀無(wú)法檢測(cè)，顯示“HI”，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)用“27.8”表示。由于發(fā)病后期，模型組均已達(dá)到“HI”，用“27.8”表示無(wú)偏差，為方便統(tǒng)計(jì)，以“0.01”表示標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.4.3各組小鼠發(fā)病率在造模后的變化

以小鼠血糖≥11.1mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)，判定造模的NOD-SCID小鼠是否發(fā)病。造模后3周內(nèi)，各組小鼠發(fā)病率無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但模型組(n＝9)有明顯發(fā)病趨勢(shì)，4周后有明顯差異(P＜0.01)，說(shuō)明1型糖尿病造模成功，而治療組(n＝9)發(fā)病緩慢，到4周以后才有發(fā)病趨勢(shì)，到第32天時(shí)，有明顯發(fā)病趨勢(shì)(P＜0.01)，說(shuō)明藥物治療有效。(結(jié)果見(jiàn)表2及圖2)

表2 造模后NOD-SCID小鼠IDDM發(fā)病率(％)

注：三組間進(jìn)行兩兩比較，由于兩組間的總樣本量小于40,采用卡方檢驗(yàn)中的確切概率法進(jìn)行比較，模型組、治療組與正常組比較，^△P＜0.05，^*P＜0.01，^**P＜0.001，^***P＜0.0001。

1.4.4各組小鼠平均體重在實(shí)驗(yàn)前后的變化

實(shí)驗(yàn)前期各組小鼠體重?zé)o明顯差異，在實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重均增長(zhǎng)，但三者之間無(wú)顯著差異，實(shí)驗(yàn)后期模型組小鼠體重呈下降趨勢(shì)，與治療組比較有顯著性差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)用藥能明顯改善小鼠的生存狀態(tài)。(結(jié)果見(jiàn)表3及圖3)

表3 造模后各組NOD-SCID小鼠平均體重變化

注：三組間比較采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，三組間比較差異極顯著。

1.4.5各組小鼠平均飲水量在實(shí)驗(yàn)前后的變化

實(shí)驗(yàn)前期各組小鼠飲水量無(wú)明顯差異，在實(shí)驗(yàn)期間正常組小鼠飲水量波動(dòng)不大，基本沒(méi)有什么差別，而模型組和治療組明顯呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明造模成功。但是，模型組與治療組比較，上升趨勢(shì)明顯大于治療組，與治療組比較差異極顯著性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)用藥能明顯改善小鼠的生存狀態(tài)，減少平均飲水量。(結(jié)果見(jiàn)表4及圖4)

表4 造模后各組NOD-SCID小鼠平均飲水量變化

注：三組間比較采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，三組間比較差異極顯著。

1.4.6各組小鼠平均食量在實(shí)驗(yàn)前后的變化

實(shí)驗(yàn)前期各組小鼠食量無(wú)明顯差異，在實(shí)驗(yàn)期間正常組和治療組小鼠飲水量波動(dòng)不大，前后基本沒(méi)有什么差別，但治療組平均食量明顯低于正常組，而模型組明顯呈上升趨勢(shì)，總體高于其他兩組，說(shuō)明造模成功。治療組平均飲食量較低，可能是由于灌胃實(shí)驗(yàn)用藥的緣故。模型組與治療組比較，差異極顯著性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)用藥能明顯改善小鼠的生存狀態(tài)，減少平均飲食量。(結(jié)果見(jiàn)表5及圖5)

表5 造模后各組NOD-SCID小鼠平均飲食量變化

注：兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，兩組間比較差異極顯著。

2從蛋白與分子水平探索治療銀屑病中藥組合物對(duì)于1型糖尿病小鼠模型的治療作用

2.1病理學(xué)檢測(cè)

2.1.1取材

所有組小鼠在造模后第35天取材，頸椎脫臼處死，取胰腺組織，分三部分保存。一部分置于10％的中性甲醛中固定18小時(shí)，然后組織脫水，進(jìn)行石蠟包埋；一部分置于冰凍包埋液(OCT)中迅速放于液氮中冷卻，-80℃保存?zhèn)溆?；一部分置于RNAlater(RNA StabilizationSolution，RNA穩(wěn)定劑，購(gòu)于life公司)中保存，以提取RNA檢測(cè)組織樣品中基因的表達(dá)。

2.1.2蘇木素-伊紅染色

用石蠟切片機(jī)進(jìn)行石蠟樣本的切片，厚度3μm，連續(xù)切片，一部分普通載玻片撈片用作HE染色，一部分粘附載玻片撈片用作免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片放于切片架上室溫過(guò)夜，次日用HE染色-封片一體機(jī)(ST5020-CV5030，Leica，Nussloch，Germany)進(jìn)行染色，染色程序見(jiàn)表6，結(jié)束染色后直接封片機(jī)封片。

表6 HE機(jī)染程序

2.1.3各組小鼠胰腺組織病理變化

光鏡下觀察：分別在光鏡下放大100倍、200倍、400倍觀察。先在光鏡下放大100倍觀察，尋找胰腺組織中的胰島并拍照，然后在200倍和400倍鏡下拍照。低倍鏡下，可見(jiàn)標(biāo)本外圍有一不太完整的結(jié)締組織被膜。被膜伸入實(shí)質(zhì)形成小葉間隔，將腺實(shí)質(zhì)分隔成許多小葉。小葉間結(jié)締組織內(nèi)可見(jiàn)胰腺導(dǎo)管與血管的斷面。小葉內(nèi)大部分染色較深的是漿液性腺泡(外分泌部)，腺泡之間可見(jiàn)一些染色較淺、大小不等的細(xì)胞團(tuán)，此即為胰島(內(nèi)分泌部)。胰島為染色較淺淡的細(xì)胞團(tuán)，大小不等，外包薄層結(jié)締組織，位于外分泌部的腺泡之間。胰島內(nèi)細(xì)胞排列成團(tuán)或索狀，細(xì)胞間有豐富的毛細(xì)血管。HE染色圖片中正常組胰腺組織中胰島包膜完整，胰島β細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核染色清亮，著色均勻，核膜完整；模型組胰腺組織中胰島β細(xì)胞減少、顆粒脫失、空泡變性、壞死、消失，纖維組織增生、玻璃樣變，胰島α細(xì)胞明顯增多，β細(xì)胞代償性肥大，胰島內(nèi)部和周邊有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組胰腺組織中胰島靠近導(dǎo)管一側(cè)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且有胰島α細(xì)胞增殖，另一側(cè)存留的胰島β細(xì)胞較多，形態(tài)完整，排列分布整齊。(見(jiàn)圖6)

2.1.4結(jié)果與分析

從整體上看，正常組無(wú)胰島炎；治療組胰腺組織中胰島β細(xì)胞明顯比模型組多，炎癥浸潤(rùn)的范圍和程度明顯比模型組要小，要輕。從病理學(xué)圖片可以看出治療銀屑病中藥組合物治療1型糖尿病模型小鼠效果明顯。(見(jiàn)圖6)

3.1免疫組織化學(xué)染色

3.1.1胰島素抗體檢測(cè)

3.1.1.1染色方法

胰腺組織石蠟切片3μm，37℃過(guò)夜，次日放入65℃烘箱烤片2小時(shí)。然后用二甲苯脫蠟兩次，按無(wú)水乙醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇梯度復(fù)水。用1×檸檬酸修復(fù)液修復(fù)，3％H₂O₂消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶消酶，二抗同來(lái)源血清封閉，然后孵一抗，4℃冰箱過(guò)夜，次日孵二抗，DAB顯色，復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察與拍照。

3.1.1.2鏡下觀察及分析

分別在光鏡下放大100倍、200倍、400倍觀察。先在光鏡下放大100倍觀察，尋找胰腺組織中的胰島并拍照，然后在200倍和400倍鏡下拍照。觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組insulin抗體陽(yáng)性的區(qū)域彌漫整個(gè)胰島，只有胰島周邊α細(xì)胞未被染上；模型組染上的只有零星的幾個(gè)胰島β細(xì)胞，治療組胰島中insulin陽(yáng)性的胰島β細(xì)胞較多。(見(jiàn)圖7)

3.1.2 CD3抗體檢測(cè)

3.1.2.1染色方法

胰腺組織石蠟切片3μm，37℃過(guò)夜，次日放入65℃烘箱烤片2小時(shí)。然后用二甲苯脫蠟兩次，按無(wú)水乙醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇梯度復(fù)水。用1×檸檬酸修復(fù)液修復(fù)，3％H₂O₂消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶消酶，二抗同來(lái)源血清封閉，然后孵一抗，4℃冰箱過(guò)夜，次日孵二抗，DAB顯色，復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察與拍照。

3.1.2.2鏡下觀察及分析

分別在光鏡下放大100倍、200倍、400倍觀察。先在光鏡下放大100倍觀察，尋找胰腺組織中的胰島并拍照，然后在200倍和400倍鏡下拍照。觀察可見(jiàn)，正常組CD3抗體陰性；模型組染上CD3陽(yáng)性的T細(xì)胞很多，治療組胰島中CD3陽(yáng)性的T細(xì)胞較少。(見(jiàn)圖8)

4.1分子生物學(xué)檢測(cè)

4.1.1實(shí)驗(yàn)方法

用Micro Kit提取胰腺組織總RNA，然后測(cè)RNA樣品的濃度，調(diào)整至合適做RNA逆轉(zhuǎn)錄的濃度。用Promega的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA樣本的逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)胰腺樣品中InsulinⅡ、CD3ε、IL-4、IL-10、IL-1β、IFN-γ、IL-17A各基因的相對(duì)表達(dá)量?；蛐蛄幸?jiàn)表7。

表7 基因序列

4.1.2結(jié)果與分析

InsulinⅡ是胰腺中胰島細(xì)胞的特征基因，其含量的多少反映組織中胰島的功能狀況。正常組(n＝8)小鼠胰島功能正常，模型組(n＝9)和治療組(n＝9)基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常組，治療組保留胰島一半的功能，模型組幾乎完全喪失胰島功能，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，差異極顯著(P＜0.0001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-A。

CD3ε是T淋巴細(xì)胞的特征基因，其含量的多少反映組織中炎癥浸潤(rùn)的程度。正常NOD-SCID小鼠胰島組織中不表達(dá)CD3ε，模型組(n＝9)CD3ε基因的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于治療組(n＝9)和正常組(n＝8)，說(shuō)明模型組炎癥浸潤(rùn)相當(dāng)嚴(yán)重，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，差異極顯著(P＜0.0001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-B。

IL-4是Th2細(xì)胞的特征因子，治療組(n＝9)IL-4基因的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于模型組(n＝9)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，差異極顯著(P＜0.0001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-C。

IL-10是一種重要的抗炎因子。治療組(n＝9)IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(n＝9)，說(shuō)明藥物治療可能調(diào)節(jié)胰腺組織病變部分T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，采用采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，差異極顯著(P＜0.0001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-D。

IL-1β是一種與抗原協(xié)同作用，促使CD4⁺T細(xì)胞活化的炎性細(xì)胞因子。模型組(n＝9)IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量高于治療組(n＝9)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0103＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-E。

IFN-γ是Th1細(xì)胞的特征因子，模型組(n＝9)IFN-γ基因的相對(duì)表達(dá)量高于治療組(n＝9)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，差異較顯著(P＝0.0001＜0.001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-F。

IL-17A是Th中與1型糖尿病發(fā)展密切相關(guān)Th-17細(xì)胞的特征因子，為促炎因子。模型組(n＝9)IL-17A基因的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于治療組(n＝9)，說(shuō)明模型組炎癥浸潤(rùn)的嚴(yán)重程度，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，差異較顯著(P＝0.0008＜0.001)，結(jié)果見(jiàn)表8及圖9-G。

表8 胰腺組織內(nèi)特定基因相對(duì)表達(dá)量

注：insulinⅡ和CD3ε是以β-actin為內(nèi)參基因，以正常組為對(duì)照組；IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A是以CD3ε為內(nèi)參基因，以模型組為對(duì)照組。insulinⅡ和CD3ε三組的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行三組間總體比較，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05，說(shuō)明方差不齊，采用均值相等性的鍵壯性檢驗(yàn)(Welch/Brown-Forsythe)，P＜0.0001，組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn)法，正常組與模型組，模型組與治療組，治療組與正常組比較，^***P＜0.001，^**P＜0.01。IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A的模型組與治療組兩組獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A的數(shù)據(jù)雖有符合正態(tài)性分布，但方差不齊，所以采用非參數(shù)檢驗(yàn)法中Wilcoxon檢驗(yàn)法，P值分別為＜0.0001，＜0.0001，0.0103＜0.05，0.0001＜0.001，0.0008＜0.001。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的定量資料以(SEM)表示，樣本數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定，用Graphpad Prism 5軟件作圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graphpad Prism 5軟件、SPSS 20.0軟件，重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析法，方差不齊時(shí)使用Dunnett’s T3檢驗(yàn)法。定量資料三組間的比較采用單因素方差分析法；方差齊時(shí)，組間多重比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)，采用均值相等性的鍵壯性檢驗(yàn)(Welch/Brown-Forsythe)，組間多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn)法。定量資料兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)性分布且方差不齊的兩組數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)法中Wilcoxon檢驗(yàn)法。分類資料使用Fisher's Exact檢驗(yàn)法，而1型糖尿病小鼠的生存評(píng)價(jià)資料采用Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)法。等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)中的Kruskal Wallis H檢驗(yàn)法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4結(jié)論

1型糖尿病動(dòng)物模型經(jīng)過(guò)治療銀屑病中藥組合物干預(yù)處理，起到了很大延緩病情和治療的作用。該中藥組合物能夠減輕小鼠胰腺組織內(nèi)炎癥的浸潤(rùn)，保護(hù)胰島細(xì)胞的功能?？傊?，如今的研究表明該中藥組合物能夠顯著提高T1D模型鼠胰腺內(nèi)胰島細(xì)胞的存活率，減少胰島內(nèi)炎性細(xì)胞如T細(xì)胞的浸潤(rùn)，延緩小鼠發(fā)病，降低小鼠T1D的發(fā)病率，延長(zhǎng)小鼠的生存期，提示該中藥組合物對(duì)模擬人自發(fā)1型糖尿病建立的T1D模型小鼠胰腺內(nèi)胰島細(xì)胞損傷具有良好的保護(hù)作用，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，預(yù)示著該中藥組合物在防治1型糖尿病方面有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省中醫(yī)院

<120> 治療銀屑病中藥在制備防治1型糖尿病的藥物中的應(yīng)用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacccaggct tttgtcaagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtctgaagg tcacctgctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcctcagaag catgataagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccagagtga tacagatgtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaaggtgct tcgcatattt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcgaaaagc ccgaaagagt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggcgctgtc atcgatttct 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggccttgt agacaccttg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgccaccttt tgacagtgat g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgtgctgct gcgagatttg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaggtcaaca acccacaggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gggacaatct cttccccacc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actacctcaa ccgttccacg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttccctccgc attgacacag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaggccaacc gtgaaaagat 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtggtacgac cagaggcata c 21