本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是皮膚修復(fù)材料制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：由機(jī)械、化學(xué)腐蝕或是微生物感染所引起的皮膚損傷是日常常見(jiàn)的皮膚疾病。雖然多數(shù)皮膚傷口可以自然愈合，但大面積的損傷或是由急性和慢性患者的皮膚損傷不加以適當(dāng)?shù)闹委熓请y以愈合。傳統(tǒng)的治療方法是通過(guò)自體或者異體供皮對(duì)損傷創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)，但這種治療方法存在著供體有限的不足。組織工程皮膚是采用“支架+種子細(xì)胞”的模式而制備，即先制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的支架材料，再將種子細(xì)胞接種到支架上進(jìn)行培養(yǎng)，最終制得組織工程皮膚。但是這種方法存在著三大不足之處：支架結(jié)構(gòu)的精確度不足，細(xì)胞植入的準(zhǔn)確性低，整個(gè)制備過(guò)程所需時(shí)間長(zhǎng)。首先，通過(guò)常規(guī)的支架成型方法如靜電紡絲、相分離等技術(shù)所制備的支架其孔隙率，結(jié)構(gòu)尺寸和微孔結(jié)構(gòu)的連通性均只能控制在一定范圍而不能精確在某一特定數(shù)值。而在細(xì)胞接種到支架材料的過(guò)程中，由于支架材料自身性能影響或是接種時(shí)人為操作的影響，接種后細(xì)胞在支架上的分別有一定隨機(jī)性，或有可能出現(xiàn)細(xì)胞在支架材料上分布不均的情況，從而導(dǎo)致所制備的組織工程材料的生物活性大大降低。在整個(gè)制備的的過(guò)程中，需要先制成支架材料，再將種子細(xì)胞接種在其上面，最后還需要進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)整個(gè)過(guò)程所需時(shí)間較長(zhǎng)。綜上所述這種組織工程皮膚的構(gòu)建方法雖然簡(jiǎn)單易操作，但是在組織的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)上的性能與正常的皮膚組織存在明顯的差距。而三維打印技術(shù)（3D-printing）在生物組織工程中的應(yīng)用研究國(guó)內(nèi)外已有大量的研究報(bào)道，其中生物三維打印已在個(gè)性化醫(yī)療模型、人體永久植入物、仿生支架、藥物緩釋模式等方面等到應(yīng)用，這位皮膚組織工程的研究帶來(lái)了新的研究思路。生物三維打印與普通的三維打印技術(shù)的不同在于其所打印的材料主要是以細(xì)胞、生物材料或是生產(chǎn)因子等。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助軟件建模后，控制打印機(jī)沉積細(xì)胞或者生物材料的速度和位置，來(lái)實(shí)現(xiàn)仿生活性支架或是仿生材料的制造。在組織工程的應(yīng)用上，生物三維打印能精確地控制支架材料和支架內(nèi)部細(xì)胞的分布，構(gòu)建與正常人體組織高度相似的組織材料，而且整個(gè)過(guò)程一步到位。采用生物三維打印來(lái)制備組織工程皮膚，可以解決支架結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)性、細(xì)胞植入的準(zhǔn)確性和支架準(zhǔn)備耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的組織工程皮膚的缺陷，解決現(xiàn)有的組織工程皮膚存在的支架結(jié)構(gòu)精確度不足，細(xì)胞植入準(zhǔn)確性低，制備過(guò)程需時(shí)的缺點(diǎn)。本發(fā)明提供一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料及其制備方法，該具有生物活性的皮膚修復(fù)材料免疫原性低，材料來(lái)源豐富，具有良好的生物相容性，對(duì)創(chuàng)面的愈合具有明顯的促進(jìn)作用。本發(fā)明通過(guò)生物三維打印技術(shù)所制備而成，可根據(jù)患者的實(shí)際情況來(lái)制備，整個(gè)制備過(guò)程所耗時(shí)間短，能做到現(xiàn)制現(xiàn)用，能真正地達(dá)到個(gè)性化治療，也不存在產(chǎn)品因在運(yùn)輸或儲(chǔ)存時(shí)的操作不當(dāng)而對(duì)產(chǎn)品的性能造成影響。同時(shí)，本發(fā)明以膠原為基質(zhì)材料，角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為生物活性成分，通過(guò)生物三維打印技術(shù)制備出具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果的仿生皮膚修復(fù)材料。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料，所述的皮膚修復(fù)材料由膠原、DMEM培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成。進(jìn)一步的，所述的皮膚修復(fù)材料為兩層結(jié)構(gòu)，由仿表皮層和仿真皮層構(gòu)成；所述的仿表皮層由膠原、DMEM培養(yǎng)基和角質(zhì)細(xì)胞組成，仿真皮層由膠原、DMEM培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞組成。更進(jìn)一步的，所述的仿表皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和角質(zhì)細(xì)胞0.01~0.03份組成，所述的仿真皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和成纖維細(xì)胞0.01~0.03份組成。優(yōu)選的，所述的膠原為市售豬源性膠原，DMEM培養(yǎng)基為市售細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是從人體皮膚獲得，并用體積份數(shù)為10%的牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一技術(shù)方案為：一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料的制備方法，所述的制備方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：仿表皮層材料的制備，仿真皮層材料的制備，用生物三維打印方法打印仿真皮層，用生物三維打印方法將仿表皮層打印在仿真皮層上，形成兩層結(jié)構(gòu)的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料。進(jìn)一步的，所述仿表皮層材料的制備具體如下：（1）按配方量將膠原溶于0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成質(zhì)量濃度為10%的膠原溶液；（2）按配方量將DMEM粉末溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為4g/L的DMEM培養(yǎng)液；（3）將步驟（1）配置的膠原溶液與步驟（2）配成的DMEM培養(yǎng)液等體積混合，然后加1mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH至中性，備用；（4）將步驟（3）得到的混合液置于無(wú)菌操作臺(tái)，在紫外光燈下照射滅菌2~3h，然后按每毫升混合液1000個(gè)細(xì)胞的比例加入角質(zhì)細(xì)胞，制備得到仿表皮層材料。更進(jìn)一步的，所述仿真皮層材料的制備具體如下：（1）按配方量將膠原溶于0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成質(zhì)量濃度為10%的膠原溶液；（2）按配方量將DMEM粉末溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為4g/L的DMEM培養(yǎng)液；（3）將步驟（1）配置的膠原溶液與步驟（2）配成的DMEM培養(yǎng)液等體積混合，然后加1mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH至中性，備用；（4）將步驟（3）得到的混合液置于無(wú)菌操作臺(tái)，在紫外光燈下照射滅菌2~3h，然后按每毫升混合液1000個(gè)細(xì)胞的比例加入成纖維細(xì)胞，制備得到仿真皮層材料。優(yōu)選的，所述的生物三維打印方法采用氣體動(dòng)力噴射打印，溫度控制在35~37℃。本發(fā)明的有益效果為：（1）本發(fā)明公開(kāi)的具有生物活性的皮膚修材料具有免疫原性低，原材料豐富，價(jià)格低廉，制備方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。（2）本發(fā)明以膠原作為皮膚修復(fù)材料的基質(zhì)，將角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞與膠原基質(zhì)復(fù)合后，利用生物三維打印技術(shù)進(jìn)行仿生打印，達(dá)到現(xiàn)打現(xiàn)用的效果。這不僅克服了傳統(tǒng)活性皮膚修復(fù)材料因存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者存放條件錯(cuò)誤而導(dǎo)致的活性失效的問(wèn)題，而且所制得的皮膚修復(fù)材料可以跟著患者創(chuàng)面的實(shí)際情況去制定，不受產(chǎn)品的規(guī)格型號(hào)所限制，能真正達(dá)到個(gè)性化治療的效果。（3）本發(fā)明所制備的皮膚修復(fù)材料是通過(guò)生物三維打印技術(shù)制備所得，通過(guò)將基質(zhì)材料和種子細(xì)胞復(fù)合后再進(jìn)行仿生打印。相比于傳統(tǒng)的“支架+種子細(xì)胞”的組織工程皮膚材料制備方法，本發(fā)明所公開(kāi)的制備方法具有支架已經(jīng)支架微結(jié)構(gòu)精確成型，種子細(xì)胞在支架中能均為分布，整個(gè)組織工程皮膚材料的制作所需時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。（4）本發(fā)明公開(kāi)的皮膚修復(fù)材料為仿生雙層結(jié)構(gòu)，由仿表皮層和仿真皮層所構(gòu)成。仿生表皮層中含有角質(zhì)細(xì)胞，仿生真皮層中含有成纖維細(xì)胞，該皮膚修復(fù)材料在使用時(shí)能同時(shí)對(duì)患者受損處的真皮層和表皮層進(jìn)行修復(fù)重建，能促進(jìn)患者創(chuàng)面的愈合速度。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料為兩層結(jié)構(gòu)，由仿表皮層和仿真皮層構(gòu)成；所述的仿表皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和角質(zhì)細(xì)胞0.01份組成，所述的仿真皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和成纖維細(xì)胞0.01份組成。所述的膠原為市售豬源性膠原，DMEM培養(yǎng)基為市售細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。所述的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是從人體皮膚獲得，并用體積份數(shù)為10%的牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例2一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料為兩層結(jié)構(gòu)，由仿表皮層和仿真皮層構(gòu)成；所述的仿表皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和角質(zhì)細(xì)胞0.02份組成，所述的仿真皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和成纖維細(xì)胞0.02份組成。所述的膠原為市售豬源性膠原，DMEM培養(yǎng)基為市售細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。所述的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是從人體皮膚獲得，并用體積份數(shù)為10%的牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例3一種具有生物活性的皮膚修復(fù)材料為兩層結(jié)構(gòu)，由仿表皮層和仿真皮層構(gòu)成；所述的仿表皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和角質(zhì)細(xì)胞0.03份組成，所述的仿真皮層按重量份數(shù)計(jì)由膠原10份、DMEM培養(yǎng)基10份和成纖維細(xì)胞0.03份組成。所述的膠原為市售豬源性膠原，DMEM培養(yǎng)基為市售細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。所述的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是從人體皮膚獲得，并用體積份數(shù)為10%的牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例4實(shí)施例1～實(shí)施例3任一例具有生物活性的皮膚修復(fù)材料，其制備方法的具體步驟如下：（1）仿表皮層材料的制備：按配方量將膠原溶于摩爾濃度為0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成質(zhì)量濃度為10%（w/v）的膠原溶液；按配方量將DMEM粉末溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為4g/L的DMEM培養(yǎng)液；將配置的膠原溶液與配成的DMEM培養(yǎng)液等體積混合，加1mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH至中性，然后置于無(wú)菌操作臺(tái)中，在紫外光燈下照射滅菌2~3h，按每毫升混合液1000個(gè)細(xì)胞的比例加入角質(zhì)細(xì)胞，即得仿表皮層材料；（2）仿真皮層材料的制備：按配方量將膠原溶于摩爾濃度為0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成質(zhì)量濃度為10%（w/v）的膠原溶液；按配方量將DMEM粉末溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為4g/L的DMEM培養(yǎng)液；將配置的膠原溶液與配成的DMEM培養(yǎng)液等體積混合，加1mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH至中性，然后置于無(wú)菌操作臺(tái)中，在紫外光燈下照射滅菌2~3h，按每毫升混合液1000個(gè)細(xì)胞的比例加入成纖維細(xì)胞，即得仿真皮層材料；（3）仿真皮層的打?。和ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)輔助軟件進(jìn)行建模，采用氣體動(dòng)力噴射打印，設(shè)置打印的起始位置和打印速度，將步驟（2）中制得的仿真皮層材料加入生物三維打印機(jī)中，設(shè)置打印機(jī)接收平臺(tái)的溫度為35~37℃，開(kāi)始打印，打印完成后，將所得仿真皮層放置于接收平臺(tái)上不作任何處理；（4）仿表皮層的打印：以步驟（3）中已建好的模型進(jìn)行打印，采用氣體動(dòng)力噴射打印，打印機(jī)的起始位置和打印速度的設(shè)置與步驟（3）中的設(shè)置相同，將步驟（1）中制得的仿表皮層材料加入生物三維打印機(jī)中，設(shè)置打印機(jī)接收平臺(tái)的溫度為35~37℃，開(kāi)始打印，將仿表皮層直接打印在仿真皮層上，得到具有生物活性的皮膚修復(fù)材料。實(shí)施例5對(duì)比例：為單獨(dú)的膠原敷料（參考申請(qǐng)?zhí)枮镃N201510121162.5所公開(kāi)的無(wú)菌膠原貼敷料的制備方法所制得）。實(shí)驗(yàn)組：為實(shí)施例1～3所得的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。將上述實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料與對(duì)比例進(jìn)行傷口修復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比例對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：表1傷口修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對(duì)比例傷口愈合時(shí)間97712愈合情況傷口愈合完整傷口愈合完整傷口愈合完整傷口愈合完整由上表可知，實(shí)施例1~3所制備的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料和對(duì)比例均能對(duì)傷口創(chuàng)面完整修復(fù)，但是與對(duì)比例相比，實(shí)施例1~3所需的時(shí)間明顯較短，說(shuō)明本發(fā)明通過(guò)生物三維打印技術(shù)所制得的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料具有明顯的促進(jìn)傷口愈合的作用。實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)組：為實(shí)施例1～3所得的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。將上述實(shí)施例1～3所制備的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)、體外溶血評(píng)價(jià)和皮膚刺激評(píng)價(jià)等生物安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)試方法：急性毒性評(píng)價(jià)方法：按GB/T16886.11-2011《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分：全身毒性試驗(yàn)》中的急性毒性檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。體外溶血評(píng)價(jià)方法：將2mL血液于1000×g離心5min，去除上層清液，加入適量PBS溶液（pH=7.4），緩慢搖勻，將紅細(xì)胞清洗三次后再以1000×g離心5min，取下層紅細(xì)胞懸液用PBS溶液配制成16%的紅細(xì)胞懸浮液。取50μL上述紅細(xì)胞懸浮液，分別加入1mL蒸餾水、PBS溶液和1mg/mL的樣品浸提液溶液中，分別設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組，輕輕混勻后在37℃下孵育1h，將各組樣品于1000×g離心5min，取上清液200μL加入96孔板中，每組3個(gè)平行樣，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)試其吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次。根據(jù)測(cè)得的吸光度，由公式（1）計(jì)算各試驗(yàn)的溶血率（Y）。Y(%)=（A-A0）/(A100-A0)×100皮膚刺激評(píng)價(jià)方法：按GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)》中皮內(nèi)刺激檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示：表2急性毒性評(píng)價(jià)、體外溶血評(píng)價(jià)和皮膚刺激評(píng)價(jià)結(jié)果實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3急性毒性評(píng)價(jià)正常，無(wú)癥狀正常，無(wú)癥狀正常，無(wú)癥狀體外溶血評(píng)價(jià)2.33%1.25%3.11%皮膚刺激性評(píng)價(jià)（PⅡ）000從上表結(jié)果可知，實(shí)施例1~3所制得的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料均無(wú)急性毒性，體外溶血均符合溶血率合格標(biāo)準(zhǔn)，且皮膚刺激性評(píng)價(jià)中PⅡ均為0，證明本發(fā)明通過(guò)生物三維打印技術(shù)所制備的具有生物活性的皮膚修復(fù)材料具有良好的生物安全性。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定；對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3