本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蒽環(huán)類化合物在制藥中的應(yīng)用，更具體地涉及蒽環(huán)類化合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

艾滋病，是一種由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)感染引起的一種嚴重傳染病。作為一種可以直接破壞人體免疫系統(tǒng)的慢性傳染病，艾滋病已經(jīng)成為世界上嚴重威脅人類健康的疾病之一。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署(unaids)的數(shù)據(jù)顯示，截至2011年年末，全球共有3420萬人感染了hiv。目前我國艾滋病流行正處于快速增長期，感染人數(shù)逾78萬(unaids,2011)。因此，對hiv/aids的防治已成為不容忽視的社會問題和重大科研課題。研發(fā)新型的抗hiv藥物是治療和防控艾滋病的主要途徑。20世紀90年代以來，隨著人類對病毒及其感染過程的分子生物學(xué)研究的不斷深入，以及藥物研發(fā)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，抗病毒藥物有了突飛猛進的發(fā)展，尤其是抗hiv的藥物。許多大型國際制藥公司，如輝瑞、默克、葛蘭素史克、羅氏、雅培、百時美施貴寶等，投入大量資源用于抗hiv的藥物研發(fā)。其中，部分公司已經(jīng)擁有多種抗hiv藥物，并借此獲得豐厚的收益和回報。自1987年第一個治療hiv感染的藥物齊多夫定(zidovudine,azt)被美國fda批準上市以來，截止2013年已有33種抗hiv病毒的化學(xué)實體藥物被美國fda批準上市，其中包括18種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，11種蛋白酶抑制劑，2種整合酶抑制劑，1種ccr5協(xié)同受體拮抗劑和1種膜融合抑制劑(usfda，2013)。這些不斷涌現(xiàn)出來的抗hiv新藥能夠有效地抑制人體內(nèi)hiv病毒的復(fù)制，減緩艾滋病發(fā)展進程，大大提高了艾滋病人的平均存活時間。但是，由于這些藥物主要靶向逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶、gp41和整合酶等有限的幾個病毒蛋白，病毒通過頻繁變異極易適應(yīng)和逃避藥物施加的選擇壓力。隨著這些藥物的廣泛使用，很容易產(chǎn)生交叉耐藥性及嚴重的毒副作用，使其臨床應(yīng)用受到很大限制。而且目前使用的抗hiv感染藥物還存在其他種種弊病,諸如價格昂貴、使用不方便、毒性高,服藥繁瑣、不能清除體內(nèi)病毒等。綜合以上原因,開發(fā)新藥勢在必行，需要不斷地創(chuàng)制出新的、高效的、價廉的抗hiv藥物。

藥物重定位可能是快速發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的優(yōu)選策略。藥物重定位，也稱為舊藥新用，是指利用相關(guān)的技術(shù)方法對已有的藥物進行重新篩選、組合或改造從而發(fā)現(xiàn)其未知新用途的過程。相比于從零開始的新藥研發(fā)，藥物重定位基于已有藥物的重新開發(fā)能夠節(jié)省大量前期研發(fā)投入(如藥靶發(fā)現(xiàn)、化合物篩選、安全性測試等)。因此，系統(tǒng)地發(fā)掘和評價所有上市藥物的抗hiv潛力對于新穎抗hiv藥物發(fā)現(xiàn)和藥物重定位用于艾滋病治療具有重要意義和重大價值。但是通過實驗來篩選所有的上市藥物是一個艱難的、花費昂貴而又耗時的過程。

因此本發(fā)明利用新開發(fā)的預(yù)測化合物抗hiv活性的方法發(fā)現(xiàn)并驗證蒽環(huán)類化合物具有抗hiv活性，可在制備治療艾滋病的藥物中進行應(yīng)用。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有快速準確地預(yù)測和發(fā)現(xiàn)已有藥物具有抗hiv活性的方法的報道，也未見有蒽環(huán)類化合物具有較高的抗hiv活性的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蒽環(huán)類化合物在制備抗hiv的藥物中的應(yīng)用。更具體地的提供柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)在制備抗hiv的藥物中的新用途。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

蒽環(huán)類化合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明同時還提供了蒽環(huán)類化合物柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。

如所述的蒽環(huán)類化合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用，其中蒽環(huán)類化合物對hiv-1誘導(dǎo)c8166細胞形成合胞體的抑制作用的ec50在0.004～0.082μm的范圍內(nèi)，治療指數(shù)ti在5～34范圍內(nèi)；蒽環(huán)類化合物抑制p24抗原作用的ec50在0.003～0.095μm的范圍內(nèi)，治療指數(shù)在11.4～44.2范圍內(nèi)。

如所述的蒽環(huán)類化合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用，其中所述的藥物中有效成分蒽環(huán)類化合物占0.5-90％。

如所述的蒽環(huán)類化合物在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用，其中檢測蒽環(huán)類化合物抗hiv活性是通過采用人t淋巴細胞系c8166和hiv-1實驗株hiv-1nl4-3對蒽環(huán)類化合物進行體外細胞毒性和抗hiv活性實驗，細胞毒性使用mtt比色法檢測，抗hiv活性利用合胞體抑制試驗和hiv-1p24抗原定量兩者方法進行檢測，結(jié)果證實蒽環(huán)類化合物柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星具明顯抗hiv活性。

蒽環(huán)類化合物柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)等作為藥物時，可直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物中含有0.1-99％的蒽環(huán)類化合物，優(yōu)選為0.5-90％的有效成分蒽環(huán)類化合物，其余為藥物學(xué)和藥劑學(xué)上可接受的，對人和動物無毒的藥用輔料或載體。

所述的藥用載體為一種或多種固體、半固體和/或液體稀釋劑，填料以及藥物制品輔料。本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(肌注和靜注)和口服兩種形式給藥，功能性食品以口服形式給藥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)益性在于：

為了預(yù)測和找出具有抗hiv活性的藥物化合物，本發(fā)明首次采用如下的技術(shù)來進行操作。目前還沒有只利用化合物的結(jié)構(gòu)就可以直接預(yù)測化合物抗hiv活性的方法。本發(fā)明通過利用大量的抗hiv活性數(shù)據(jù)并整合相對頻率權(quán)重的分子指紋方法以及機器學(xué)習方法(向量機和隨機森林)來實現(xiàn)對化合物的抗hiv活性的預(yù)測。該技術(shù)只需要輸入化合物的結(jié)構(gòu)就可以快速而準確的預(yù)測出該化合物是否具有抗hiv活性。利用該技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)類化合物具有顯著的抗hiv活性且細胞毒性較低，可以在制備治療艾滋病的藥物中應(yīng)用。蒽環(huán)類化合物目前是用于制備治療急性白血病、霍奇金病、膀胱癌和乳腺癌等腫瘤的藥物。因此，現(xiàn)有技術(shù)中還未有任何下述機理和方法的記載：本發(fā)明首先建立了一個稱為“anti-hiv-predictor”的抗hiv化合物預(yù)測和發(fā)掘平臺(http://bsb.kiz.ac.cn/anti-hiv-predictor)。該平臺的建立過程見圖1。該平臺整合3種方法：相對頻率權(quán)重的分子指紋方法、支持向量機方法和隨機森林方法來預(yù)測化合物的抗hiv活性。該平臺的roc曲線線下面積大于0.95并且準確率超過93％(圖2)。因此該平臺可以快速準確地預(yù)測指定化合物是否具有抗hiv活性。本發(fā)明利用該平臺對已經(jīng)上市的1835個藥物進行預(yù)測和篩選，以便對這些藥物進行藥物重定位用于抗hiv治療。本發(fā)明預(yù)測出來若干新的抗hiv化合物，這些化合物到目前為止都沒做過任何的抗hiv活性實驗。因此，本發(fā)明對這些化合物進行了一系列的體外抗hiv活性實驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)類化合物主要包括柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)等具有非常顯著的抗hiv活性。因此蒽環(huán)類藥物在制備治療艾滋病藥物中具有重要應(yīng)用價值。這些蒽環(huán)類化合物目前的主要適應(yīng)癥用于治療急性白血病、霍奇金病、急性骨髓性白血病、膀胱癌和乳腺癌等腫瘤。因此，本發(fā)明開辟了蒽環(huán)類化合物的新的用途即作為制備治療艾滋病藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明選用人t淋巴細胞系c8166和hiv-1實驗株hiv-1nl4-3對蒽環(huán)類化合物進行體外的細胞毒性和抗hiv活性實驗。其中細胞毒性使用mtt比色法檢測，抗hiv活性利用合胞體抑制試驗和hiv-1p24抗原定量兩者方法進行檢測。使用不同劑量的蒽環(huán)類藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類藥物具有明顯的抗hiv效果，因此可作為制備治療艾滋病藥物的應(yīng)用。

附圖說明

圖1顯示：抗hiv化合物預(yù)測和發(fā)掘平臺“anti-hiv-predictor”的建立過程和在藥物重定位中的應(yīng)用。

圖2顯示：抗hiv化合物預(yù)測和發(fā)掘平臺“anti-hiv-predictor”的預(yù)測性能

圖3顯示：五種蒽環(huán)類化合物對c8166的毒性作用(方塊曲線)和對hiv-1p24抗原的抑制作用(圓點曲線)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實際例子來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實施例1

1.實驗?zāi)康模簻y試蒽環(huán)類化合物的抗hiv作用。

2.實驗材料：

測定藥物和化合物：

待測樣品柔紅霉素(daunorubicin)和表柔比星(epirubicin)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。待測樣品伊達比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)購自北京樂博生物科技有限公司。待測樣品多柔比星(doxorubicin)購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司。陽性對照化合物疊氮胸苷(3’-azido-3’-deoxythymidine，azt)購自sigma公司。待測樣品根據(jù)溶解性溶解于rpmi-1640完全培養(yǎng)基或dmso中，溶解于dmso中的樣品儲液濃度為50mm，溶解于rpmi-1640完全培養(yǎng)基的樣品儲液濃度為10mm、5mm或2mm(根據(jù)溶解度確定)，儲存條件為：-20℃；azt溶解于rpmi-1640完全培養(yǎng)基中，0.22μm濾膜過濾除菌，貯存液濃度為6mg/ml，分裝后-20℃保存。

試劑和溶液：

試劑：

hepes(n-2(2-hydroxyothyl)piperazine-n'-(2-ethanesufonicacid)、mtt(3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)、dmf(n,n’-dimethylformamine)、青霉素(penicillin)、硫酸鏈霉素(streptomycinsulfate)、谷氨酰胺(glutamine)均購自sigma公司；2－巰基乙醇(2－me，2-mercaptoethanol)為bio-rad公司產(chǎn)品。rpmi－1640和胎牛血清為invitrogen公司產(chǎn)品。

培養(yǎng)基：

rpmi-1640完全培養(yǎng)基，含有10％胎牛血清,2mm谷氨酰胺，10mmhepes，50μm2-巰基乙醇，100,000iu青霉素，100μg/ml鏈霉素。

細胞和病毒：

人t淋巴細胞系c8166、hiv-1實驗株hiv-1ⅲb由英國medicalresearchcouncil,aidsreagentproject惠贈。hiv-1實驗株hiv-1nl4-3由nih惠贈。所有細胞和病毒均以含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備hiv-1ⅲb和hiv-1nl4-3，滴定并計算出病毒的tcid50。病毒貯存液分裝后，置-70℃保存。細胞和病毒按常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇。

3.hiv-1感染性滴定：

hiv-1nl4-3按johnson&byington(1990)所述方法改良進行滴定，簡述如下：將hiv-1貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個梯度，每梯度6個重復(fù)孔，同時設(shè)置對照孔6孔。每孔加入c8166細胞50μl，每孔終體積為200μl。37℃,5％co2培養(yǎng)。第3天補加新鮮rpmi-1640完全培養(yǎng)基100μl，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中hiv-1誘導(dǎo)的細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,cpe),以每孔是否有合胞體(syncytium)的形成確定；按reed&muench方法計算病毒的tcid50(50％tissuecultureinfectiondose)。

4.對c8166細胞的毒性實驗：

4×10⁵/mlc8166細胞懸液100μl與不同的待測藥物溶液混合，設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的對照孔,37℃,5％co2培養(yǎng)3天，采用mtt比色法檢測細胞毒性。elx800酶標儀測定od值，測定波長為570nm，參考波長為630nm。計算得到cc50值(50％cytotoxicconcentration)，即對50％的正常t淋巴細胞系c8166產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。

5、對hiv-1nl4-3致細胞病變(cpe)的抑制實驗

將8×10⁵/mlc8166細胞50μl/孔接種到含有100μl/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入50μl的hiv-1nl4-3稀釋上清，1300tcid50/孔。設(shè)3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的正常細胞對照孔。azt為陽性藥物對照。37℃,5％co2培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體的形成。ec50(50％effectiveconcentration)為抑制合胞體形成50％時的藥物濃度。

6、對hiv-1nl4-3急性感染c8166細胞中病毒復(fù)制的抑制實驗

將4×10⁵個/ml的c8166細胞與hiv-1nl4-3(moi＝0.04)在37℃下感染2小時，用pbs離心洗滌2次，去除游離的病毒離子，取100μl細胞接種到含有100μl不同稀釋度待測化合物的96孔板上，37℃，5％co2培養(yǎng)3天。培養(yǎng)上清離心后收集，用終濃度0.5％tritonx-100裂解滅活。檢測藥物對hiv-1復(fù)制的抑制作用采用捕捉p24抗原elisa方法。

7、elisa檢測p24抗原

1μl/板抗鼠igg-fc抗體4℃鋪板過夜；5％脫脂奶粉4℃封板過夜；加入100μl/孔鼠抗p24單抗(利用liugj等人建立的方法制備，liugj,wangjp,xiaojc,etal.preparationandcharacterizationofthreemonoclonalantibodiesagainsthiv-1p24capsidprotein[j].cellmolimmunol,2007,4(3):203-208.)，37℃，1小時；加入100μl/孔裂解感染細胞培養(yǎng)上清，37℃，2小時；加入100μl/孔1：100稀釋的兔抗p24多抗(利用liugj等人建立的方法制備，liugj,wangjp,xiaojc,etal.preparationandcharacterizationofthreemonoclonalantibodiesagainsthiv-1p24capsidprotein[j].cellmolimmunol,2007,4(3):203-208.)，37℃，1小時；加入100μl/孔1：20000稀釋的羊抗兔igg-hrp(sigma)，37℃，1小時；加入opd底物反應(yīng)液。10分鐘后，2m硫酸終止反應(yīng)。elx800elisa儀測定od值，測定波長490nm，參考波長630nm。計算出藥物對hiv-1復(fù)制表達p24抗原的抑制率和ec50，即抑制50％hiv-1p24抗原表達的藥物濃度。

8、計算公式

根據(jù)實驗結(jié)果繪制劑量反應(yīng)曲線，按reed&muench法計算出化合物抑制病毒的50％有效濃度(ec50)，50％抑制細胞生長濃度(cc50)及抗hiv-1活性的治療指數(shù)ti值(therapeuticindex)為：ti＝cc50/ec50。

1、細胞生長存活率(％)＝實驗孔od值/對照孔od值×100

2、hiv-1致細胞病變的抑制率(％)＝(1-實驗孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))×100

3、hiv-1p24抗原表達的抑制率(％)＝(1-實驗孔od值/對照孔od值)×100

9、實驗結(jié)果和評價：

五種蒽環(huán)類化合物對c8166細胞的毒性實驗結(jié)果：

表1列出了五種蒽環(huán)類化合物的cc50，本發(fā)明的圖3中方塊曲線所示顯示了不同濃度的蒽環(huán)類藥物對細胞c8166的毒性作用。實驗結(jié)果表明蒽環(huán)類化合物對細胞的有一定的毒性。在濃度等于有效濃度ec50時，細胞活力比例為80％-90％。這意味著，在濃度等于ec50時，蒽環(huán)類化合物只對小部分細胞(10％-20％)產(chǎn)生毒性(圖3)。

五種蒽環(huán)類化合物對hiv-1nl4-3病毒株的抗hiv活性實驗結(jié)果：

表1列出了五種蒽環(huán)類化合物的ec50，本發(fā)明的圖3中圓點曲線所示顯示了不同濃度的蒽環(huán)類化合物對hiv-1nl4-3病毒株的抑制作用。蒽環(huán)類化合物對hiv-1誘導(dǎo)c8166細胞形成合胞體的抑制作用的ec50在0.004～0.082μm的范圍內(nèi)，治療指數(shù)ti介于5～34范圍內(nèi)。在hiv-1p24抗原定量結(jié)果顯示蒽環(huán)類化合物抑制p24抗原作用的ec50ec50在0.003～0.095μm的范圍內(nèi)，治療指數(shù)介于11.4～44.2范圍內(nèi)。

以上實驗結(jié)果表明蒽環(huán)類化合物雖然具有一定的細胞毒性，但是由于該類化合物具超強的抗hiv活性，這使得蒽環(huán)類化合物具有較高的治療指數(shù)。這5種蒽環(huán)類化合物的治療指數(shù)均大于10，因此可作為制備治療艾滋病藥物的應(yīng)用。

表1.五種蒽環(huán)類化合物對hiv-1nl4-3病毒株的抑制作用及對c8166細胞的毒性作用

實施例2：

將實施例1所提到的蒽環(huán)類化合物溶于無菌注射用水，使溶解，再經(jīng)無菌漏斗抽濾，精濾，灌封，滅菌，制成注射液。

實施例3：

取實施例1所提到的蒽環(huán)類化合物，按其與賦形劑重量比1:8的比例混合均勻，制粒，壓片。

實施例4：

取實施例1所提到的蒽環(huán)類化合物，按其與賦形劑重量比1:12的比例混合均勻，制粒，制成膠囊劑。

實施例5：

將實施例1所提到的蒽環(huán)類化合物，按常規(guī)口服液的制法制成口服液。