本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體涉及毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用。
背景技術：
輪狀病毒(rotavirus，rv)是導致嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體，每年約有60萬名嬰幼兒因rv感染死亡，目前尚無防治rv感染的特效藥物。而有關rv疫苗方面，國內(nèi)尚處于研究階段，國外上市rv疫苗價格昂貴，rv毒株的多樣性使其預防范圍有限?，F(xiàn)臨床多采用who推薦的口服補液以緩解癥狀。因此加強對輪狀病毒感染機制的研究，開發(fā)安全有效的藥物防治輪狀病毒感染非常重要。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
提供毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用。
所述抗輪狀病毒藥物中，所述毛蕊異黃酮的抗輪狀病毒的摩爾濃度為10umol/l～80umol/l。
所述抗輪狀病毒藥物中，所述毛蕊異黃酮對細胞產(chǎn)生毒性的摩爾濃度為大于80umol/l。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比較，有益效果在于：
(1)本發(fā)明提供的毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用，揭示了毛蕊異黃酮能夠應用于制備抗輪狀病毒藥物，該應用能夠為開發(fā)安全有效的藥物以防治輪狀病毒感染提供極具意義的價值。
(2)本發(fā)明提供的毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用，揭示了抗輪狀病毒藥物中，毛蕊異黃酮的抗輪狀病毒的摩爾濃度為10umol/l～80umol/l，即，揭示了在一定的藥物濃度下，毛蕊異黃酮能夠很好地防治輪狀病毒感染，并且揭示了抗輪狀病毒藥物中，毛蕊異黃酮對細胞產(chǎn)生毒性的摩爾濃度為大于80umol/l，進而對利用毛蕊異黃酮抗輪狀病毒藥物提供了很好的指導價值。
附圖說明
附圖1是毛蕊異黃酮對ma104的細胞毒性作用實驗結果圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明所解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
其中，本發(fā)明提及的dmem是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基。
實施例1。
毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用。
該毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用，揭示了毛蕊異黃酮能夠應用于制備抗輪狀病毒藥物，該應用能夠為開發(fā)安全有效的藥物以防治輪狀病毒感染提供極具意義的價值。
并且，本實施例的毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用，揭示了抗輪狀病毒藥物中，毛蕊異黃酮的抗輪狀病毒的摩爾濃度為10umol/l～80umol/l，即，揭示了在一定的藥物濃度下，毛蕊異黃酮能夠很好地防治輪狀病毒感染，并且揭示了抗輪狀病毒藥物中，毛蕊異黃酮對細胞產(chǎn)生毒性的摩爾濃度為大于80umol/l，進而對利用毛蕊異黃酮抗輪狀病毒藥物提供了很好的指導價值。
毛蕊異黃酮在制備抗輪狀病毒藥物中的應用實驗：
一、實驗材料
實驗藥品：
毛蕊異黃酮(成都曼斯特有限公司，純度99.08％，批號：must-16031110)。實驗試劑：
dmem培養(yǎng)液、胎牛血清均為gibco公司提供；
mtt(4，5，二甲基噻唑-2，5，二苯基四唑溴化物)，m1124amresco公司提供；
青霉素-鏈霉素混合溶液、胰蛋白酶、pbs、二甲基亞砜均為solarbio公司提供。
試劑的配制和分裝：
(1)胎牛血清分裝在滅菌的50ml離心管中，-20℃保存。
(2)胰蛋白酶分裝在滅菌的10ml離心管中，-20℃保存。
(3)霉素-鏈霉素混合溶液分裝在滅菌的10ml離心管中，-20℃保存。
(4)mtt應用液：
mtt粉50mg，pbs10ml，攪拌溶解，0.22μm濾膜濾過除菌，分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
實驗器材：
96孔細胞培養(yǎng)板、可調(diào)式微量加樣器、細胞培養(yǎng)瓶、濾器、吸管、恒溫箱、消毒鍋；
潔凈操作臺sik-202型，安徽蚌埠凈化設備廠提供；
olympμs倒置光學顯微鏡ckx41；
酶聯(lián)免疫檢測儀dg3022a；
二氧化碳孵育箱，美國thermo公司提供；
細胞與病毒；
ma104細胞(恒河猴胚胎腎細胞)，wa株輪狀病毒。
二、實驗方法
(一)細胞和病毒：
ma104細胞在含10％胎牛血清，100μ/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)液中生長和傳代。感染病毒為適應細胞培養(yǎng)增殖的人wa株輪狀病毒。
(二)藥物的細胞毒性實驗：
毛蕊異黃酮溶液配制：稱取毛蕊異黃酮樣品5mg，先用dmso(二甲基亞砜)溶解后加入用適量dmem溶解，以dmso終濃度不超過0.5％為標準，并設置溶劑對照組。潔凈臺內(nèi)無菌操作用一次性濾頭過濾除菌。計算初濃度。各種藥物終濃度1.25umol/l～320umol/l。
細胞毒性實驗：將ma104細胞以10×104個/ml的細胞密度，加入在96孔細胞培養(yǎng)板上每孔200μl。37℃5％co2孵育至細胞生長成單層。吸出生長液，先按照1:1、1：10、1：100、1：1000的比例用不含血清的dmem培養(yǎng)液進行稀釋得到一系列濃度的藥液，然后100μl/孔加入到96孔板內(nèi)，每個濃度重復6孔。正常對照只加入等體積不含血清的dmem維持液。37℃5％co2孵育，光學顯微鏡連續(xù)觀察，72小時之內(nèi)若藥物的第一、第二濃度之間有細胞毒性變化之外的其余三個藥物濃度的細胞均正常。這表明有效濃度在1:1與1:100之間。按照1:1，1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64的比例得到一系列濃度藥液，重復上述操作，光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)72小時以內(nèi)高于1：4的藥物濃度出現(xiàn)細胞毒性變化。
37℃5％co2孵育，光學顯微鏡連續(xù)觀察3d后，將藥液吸出，避光，加入5mg/ml的mtt25μl/孔(用不含血清的dmem培養(yǎng)基配制，避光放置)，37℃5％co2孵育4h后，800r/ml離心，棄上清，加入dmso50μl/孔，室溫下振蕩約10min，待結晶溶解后，混勻，在酶標儀上檢測570nm波長下每孔的光密度(opticaldensity,od)值。按下列公式求出細胞存活率：
細胞存活率％＝藥物組平均吸光度值/細胞對照組平均吸光度值×100％。
(三)病毒增殖和滴度測定：
wa株rv的增殖和滴度測定在ma104上進行。當細胞在培養(yǎng)瓶中生長至單層時接種rv。接種病毒前，細胞單層先用磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7)洗一次，用無血清dmem培養(yǎng)液洗兩次。接種前，將原始病毒液從-80℃冰箱中取出，4℃溶解，37℃與10μg/ml的胰酶作用30min，將長成單層的ma104細胞用pbs沖洗兩次。隨后加入與胰酶孵育后的病毒液，接種病毒后的細胞維持液為無胎牛血清,含1μg/ml胰酶的dmem培養(yǎng)液。接種病毒后的細胞放37℃二氧化碳培養(yǎng)箱(含5％二氧化碳)中孵育，至病毒感染ma104細胞病變(cpecytopathiceffect)達到+++時，將培養(yǎng)瓶放入-20℃凍存，再4℃融解，如此反復凍融三次，低溫高速12000r/min離心取上清收獲病毒液，再同上法重復一次病毒在細胞中傳代實驗，收獲病毒。分裝，-80℃保存。
病毒感染性滴度測定用ma104細胞在96孔培養(yǎng)板中進行(微量滴定法)。在用不含血清的dmem培養(yǎng)液將其按照1:10稀釋成10-110-210-3…10-6等系列濃度，將培養(yǎng)成單層ma104細胞的96孔板用pbs沖洗2次，再將不同稀釋度的病毒加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，25μl/孔每個濃度重復8孔。設置正常對照細胞，37℃5％co2孵育2h后吸取出病毒液，加入不含血清的細胞培養(yǎng)液，200μl/孔。37℃5％co2孵育，連續(xù)觀察。當能夠出現(xiàn)細胞病變cpe的最低稀釋度的病毒孔中不再繼續(xù)出現(xiàn)cpe時，計數(shù)每個稀釋度出現(xiàn)cpe的細胞孔數(shù)，按照reed-mμnch方法計算病毒的tcid50(tissuecultureinfectivedose)。
(四)藥物抗rv作用：
在實驗中我們首先選擇藥物tc90-95的濃度進行以下抗rv實驗，然后將篩選出的有抗rv作用的藥物后，用dmem培養(yǎng)液(不含血清)倍比稀釋，考察不同濃度抗rv作用。
(五)藥物對病毒吸附細胞的作用：
在生長成單層的ma104細胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入藥液，每個藥液重復4孔，100μl/孔。設置正常細胞對照組，病毒對照組均只加入等體積dmem培養(yǎng)液(不含血清)。37℃5％co2孵育2h。
將藥液吸出，除正常對照組以外加入100tcid50的病毒(病毒與10μg/ml濃度的胰酶37℃作用30min)100μl/孔，37℃5％co2孵育2h，將病毒吸出，加入細胞維持液200μl/孔，37℃5％co2孵育連續(xù)觀察。
待細胞出現(xiàn)cpe在++-+++間時將維持液吸出，加入5mg/ml的mtt50μl/孔，孵育2h后棄上清。加入dmso25μl/孔，室溫下震蕩混勻約10min。隨后570nm下酶聯(lián)免疫檢測儀讀取吸光度值。
按照下列公式計算藥物對病毒抑制率和治療指數(shù)：
藥物對病毒抑制率＝(藥物組平均吸光度值—病毒對照組平均吸光度值)/(正常細胞對照組平均吸光度值—病毒對照組平均吸光度值)×100％，重復實驗三次。
采用治療指數(shù)(treatmentindex，ti)作為評價指標，衡量藥物對rv的抑制效力，ti＝cc50/ic50。
注：在光學顯微鏡下觀察，無cpe，記作：—；25％的細胞出現(xiàn)cpe，記作：+；25％-50％的細胞出現(xiàn)cpe，記作：++；50％-75％的細胞出現(xiàn)cpe，記作：+++；75％-100％的細胞出現(xiàn)cpe，記作：++++。
(六)藥物對病毒的直接滅活作用：
將藥物與100tcid50的病毒液(病毒與10μg/ml濃度的胰酶作用30min)等體積混合作用2h。
將其加入到生長成單層ma104細胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，之前用pbs將細胞沖洗2次。設置正常細胞對照組，病毒對照組均只加入等體積dmem。37℃5％co2孵育2h，然后將混合液吸出，加入細胞維持液200μl/孔，37℃5％co2孵育連續(xù)觀察，待細胞出現(xiàn)cpe在++—+++間時同上法做mtt檢測，并計算藥物對病毒的抑制率和治療指數(shù)。
(七)藥物對病毒生物合成的作用：
(1)將100tcid50的病毒液(病毒與10μg/ml濃度的胰酶作用30min)加入到生長成單層的ma104細胞96孔培養(yǎng)板內(nèi)100μl/孔，之前用pbs將細胞沖洗2次。設細胞正常對照，加入等體積dmem培養(yǎng)液。37℃5％co2孵育2h，然后將病毒液吸出，加入藥液100μl/孔，設病毒對照，只加入等體積dmem培養(yǎng)液。
(2)37℃5％co2孵育2h，之后將藥液吸出，加入細胞維持液200μ/孔，37℃5％co2孵育連續(xù)觀察。
(3)即細胞cpe在++—+++間時按照上法做mtt檢測，并計算藥物對病毒的抑制率和治療指數(shù)。
(八)統(tǒng)計分析
采用spss13.0軟件，選擇one-wayanova法，將用藥組od值與模型組od值進行均數(shù)比較。選擇probit回歸法，將藥物濃度與細胞存活率，藥物濃度與藥物對病毒的抑制率進行回歸分析。得到藥物的細胞半數(shù)存活濃度cc50，藥物對病毒感染細胞半數(shù)的抑制濃度ic50，并按照治療指數(shù)ti＝細胞半數(shù)存活藥物濃度/抑制半數(shù)病毒藥物濃度，計算治療指數(shù)。
三、實驗結果
(一)毛蕊異黃酮細胞毒性實驗結果：
毛蕊異黃酮對ma104的細胞毒性作用(n＝3)實驗結果，見附圖1所示，結果表明毛蕊異黃酮在濃度1.25～80umol/l均未出現(xiàn)細胞毒性，當濃度大于160umol/l出現(xiàn)明顯的細胞毒性。
(二)毛蕊異黃酮預防輪狀病毒入侵細胞的實驗結果：
mtt顯示各藥物濃度組od值與病毒對照組相比較差異無顯著性，p＞0.05(n＝3)。結果表明，藥物無預防輪狀病毒入侵細胞的作用。
(三)毛蕊異黃酮直接滅活輪狀病毒的實驗結果：
mtt顯示各藥物濃度組od值與病毒對照組相比較差異無顯著性，p＞0.05(n＝3)。結果表明，藥物無直接殺滅輪狀病毒的作用。
(四)毛蕊異黃酮對病毒生物合成的作用：
毛蕊異黃酮對rv生物合成作用(n＝3)
結果表明，隨著毛蕊異黃酮濃度的提高，其抗rv生物合成作用的抑制率越大，表明毛蕊異黃酮抗rv的生物合成作用隨濃度增加而增強，但無預防輪狀病毒入侵細胞和直接殺滅輪狀病毒的作用。上述研究為開發(fā)毛蕊異黃酮作為抗rv的新藥提供了實驗依據(jù)。
最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。