本發(fā)明涉及動(dòng)物中藥領(lǐng)域，尤其涉及一種芪貞增免顆粒及制備工藝。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)方法中制備長(zhǎng)效芪貞增免顆粒成本太高，主要在于芪貞增免顆粒本身的特性。

并且，傳統(tǒng)中藥提取工藝一般采用直接加水煎煮醇沉方法，中藥的有效成分被纖維素包裹，煎煮過(guò)程中有效成分不易被提取，提取效率低，提取時(shí)一般溫度是100℃，有效成分容易被破壞一部分。

傳統(tǒng)煎煮黃芪甲苷含量檢測(cè)結(jié)果6.41％，提取率偏低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種芪貞增免顆粒及制備工藝，有效成分更容易煎煮浸出，主要成分提取有效率比傳統(tǒng)提高48％，提高生物利用率，提高產(chǎn)品質(zhì)量和臨床使用效果；工藝簡(jiǎn)單，成本低，易操作。

解決以上技術(shù)問(wèn)題的一種芪貞增免顆粒，其特征在于：所述顆粒配方由以下重量份的原料組成：黃芪175-185份，淫羊藿85-95份，女貞子85-95份，纖維素酶5000萬(wàn)iu-15000萬(wàn)iu，蔗糖2-4份、糊精0.7-1.4份，其余為水。

所述顆粒配方由以下重量份的原料組成：黃芪180份，淫羊藿90份，女貞子90份，纖維素酶適量12000萬(wàn)iu，蔗糖3份、糊精1份，其余為水。

所述芪貞增免顆粒的水份含量<＝2％。

本發(fā)明中的一種芪貞增免顆粒的制備工藝，包括以下步驟：

(1)多功能提取罐中加水，加入纖維素酶攪拌均勻，將中藥組份粗粉后加入水剛好浸漬為準(zhǔn)，加熱到35-40℃保溫11-13h，中藥組份軟化后煎煮三次，合并煎液；這里的中藥為黃芪、淫羊藿和女貞子的混合物。其中，煎煮為負(fù)壓煎煮1小時(shí)。

(2)用負(fù)壓過(guò)濾，濃縮至中藥組份與水質(zhì)量濃度比1:1濃度，加入2.5-3.5倍乙醇靜置23-25h，過(guò)濾，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.3-1.35的浸膏，加蔗糖和糊精，混勻；

(3)低溫干燥，制成中藥組份與成品的質(zhì)量濃度比為1:1的顆粒，成品即為最終產(chǎn)品。

所述中藥組份粗粉后顆粒大小為10-13目。

所述負(fù)壓為-10pa。

所述水為純化水。

所述步驟(1)中第一次往提取罐中加入的水為中藥組份重量的30％。

所述回收乙醇過(guò)程中為蒸餾收回乙醇，溫度為75-85℃；優(yōu)化溫度為80℃.

所述步驟(3)中低溫干燥為溫度55-65℃條件下，蒸汽烘箱烘干11-13h；優(yōu)化低溫干燥為溫度60℃條件下，蒸汽烘箱烘干12h。

本發(fā)明中的中藥組份的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁里，傳統(tǒng)工藝直接煎煮，細(xì)胞壁未破壞，中藥組份有效成分提取收得率較低；采用加入纖維素酶的工藝后，能對(duì)中藥材細(xì)胞壁有分解作用，有效成分更容易煎煮浸出，主要成分提取有效率比傳統(tǒng)提高48％，這能很大提高產(chǎn)品質(zhì)量和臨床使用效果。

本發(fā)明中的芪貞增免顆粒主要用于豬、雞滋補(bǔ)肝腎、益氣固表。主治豬、雞免疫力低下，每升水雞1g，豬0.5g。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中的免疫后豬瘟抗體水平圖

具體實(shí)施方式

以下用具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：

以下實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)器材：多功能提取罐(提取罐、負(fù)壓過(guò)濾器、藥液暫貯罐、酒精暫貯罐)、試管、濾紙、中性氧化鋁柱(100-120目)、層析缸、電子天平、容量瓶、紫外光燈、電吹風(fēng)、硅膠gf254薄層板；

實(shí)驗(yàn)試劑：甲醇、正丁醇、三氯甲烷、硫酸乙醇、乙醇、黃芪甲苷對(duì)照品、淫羊藿苷對(duì)照品、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、三氯化鋁。

實(shí)施例1

一種芪貞增免顆粒，顆粒配方由以下重量份的原料組成：黃芪175份，淫羊藿85份，女貞子85份，纖維素酶5000萬(wàn)單位，蔗糖2份、糊精0.7份，含水量為2％。

具體制備方法如以下步驟：

(1)多功能提取罐中加為中藥重量的30％的純化水，加入纖維素酶攪拌均勻，再將中藥粗粉為10目后加入多功能提取罐中，又加入純化水以剛好浸漬為準(zhǔn)，加熱到35℃保溫12小時(shí)，中藥材軟化后煎煮三次，合并煎液；

(2)用負(fù)壓-10pa過(guò)濾煎液，濃縮至中藥與水質(zhì)量濃度比為1:1，加入2.5倍乙醇靜置24小時(shí)，過(guò)慮，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.3的浸膏，加蔗糖3份、糊精1份、混勻；回收乙醇過(guò)程中為蒸餾收回乙醇，溫度為75℃。

(3)低溫干燥，制成中藥與成品的質(zhì)量濃度比1:1的顆粒，即可。低溫干燥為溫度55℃條件下，蒸汽烘箱烘干13h。

煎煮黃芪甲苷含量9.38％。提取效率提高約46％。

實(shí)施例2

配方由以下重量份的原料組成：黃芪185份，淫羊藿95份，女貞子95份，纖維素酶15000萬(wàn)iu，蔗糖4份、糊精1.4份，含水量為1.5％。

具體制備方法包括以下步驟：

(1)多功能提取罐中加30％的純化水，加入適量纖維素酶攪拌均勻，將中藥粗粉為13目后加入純化水剛好浸漬為準(zhǔn)，加熱到40℃保溫11小時(shí)，中藥材軟化后煎煮三次，合并煎液；

(2)用負(fù)壓-10pa過(guò)濾，濃縮至中藥與水質(zhì)量濃度1:1濃度，加入3.5倍乙醇靜置23小時(shí)，過(guò)慮，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.35的浸膏，加蔗糖和糊精、混勻；回收乙醇過(guò)程中為蒸餾收回乙醇，溫度為85℃。

(3)低溫干燥，制成中藥與成品的質(zhì)量濃度比1:1的顆粒，即可。低溫干燥為溫度65℃條件下，蒸汽烘箱烘干11h。

煎煮黃芪甲苷含量9.41％。提取效率提高約47％。

實(shí)施例3

配方由以下重量份的原料組成：

黃芪180份，淫羊藿90份，女貞子90份，纖維素酶12000萬(wàn)iu，蔗糖3份、糊精1份，含水量為1.8％。

具體制備方法包括以下步驟：

(1)多功能提取罐中加30％的純化水，加入適量纖維素酶攪拌均勻，將中藥粗粉為13目后加入純化水剛好浸漬為準(zhǔn)，加熱到38℃保溫12小時(shí)，中藥材軟化后煎煮三次，合并煎液；

(2)用負(fù)壓-10pa過(guò)濾，濃縮至中藥與水質(zhì)量濃度1:1濃度，加入3倍乙醇靜置24小時(shí)，過(guò)慮，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.32的浸膏，加蔗糖和糊精、混勻；回收乙醇過(guò)程中為蒸餾收回乙醇，溫度為80℃。

(3)低溫干燥，制成中藥與成品的質(zhì)量濃度比1:1的顆粒，即可。低溫干燥為溫度60℃條件下，蒸汽烘箱烘干12h。

煎煮黃芪甲苷含量9.43％，提取效率提高48％。

實(shí)施例4

制備方法如實(shí)施例3中的內(nèi)容，其配方由以下重量份的原料組成：

黃芪178份，淫羊藿88份，女貞子88份，纖維素酶8000萬(wàn)iu，蔗糖2.5份、糊精0.9份，含水量為2％。

煎煮黃芪甲苷含量9.4％。提取效率提高約47％。

實(shí)施例5

制備方法如實(shí)施例1中的內(nèi)容，其配方由以下重量份的原料組成：

黃芪182份，淫羊藿92份，女貞子92份，纖維素酶10000萬(wàn)iu，蔗糖3.5份、糊精1.2份，含水量為2％。

煎煮黃芪甲苷含量9.41％。提取效率提高約47％。

實(shí)施例6

制備方法如實(shí)施例1中的內(nèi)容，其配方由以下重量份的原料組成：

黃芪181份，淫羊藿93份，女貞子89份，纖維素酶13000萬(wàn)iu，蔗糖3.2份、糊精1.3份，含水量為1.9％。

煎煮黃芪甲苷含量9.36％。提取效率提高約46％。

本發(fā)明中的中藥的有效成分往往包裹在植物細(xì)胞壁里，傳統(tǒng)工藝直接煎煮，細(xì)胞壁未破壞，中藥有效成分提取收得率較低；采用加入纖維素酶的工藝后，能對(duì)中藥材細(xì)胞壁有分解作用，有效成分更容易煎煮浸出，在負(fù)壓煎煮情況下，溫度更低，有效成分不易受到破壞。有效提取效率更高，提高了生物利用度。

試驗(yàn)一

芪貞增免顆粒對(duì)豬瘟抗體水平影響

試驗(yàn)用藥物與試驗(yàn)用儀器設(shè)備

試驗(yàn)用中藥：黃芪、淫羊藿、女貞子為飲片(安徽中藥飲片廠生產(chǎn)，批號(hào)2011120807)。黃芪、淫羊藿、女貞子采用生物發(fā)酵提取工藝提取為i號(hào)。

具體步驟如以下：(1)多功能提取罐中加30％的純化水，加入適量纖維素酶攪拌均勻，將中藥粗粉為13目后加入純化水剛好浸漬為準(zhǔn)，加熱到38℃保溫12小時(shí)，中藥材軟化后煎煮三次，合并煎液；

(2)用負(fù)壓-10pa過(guò)濾，濃縮至中藥與水質(zhì)量濃度1:1濃度，加入3倍乙醇靜置24小時(shí)，過(guò)慮，濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.32的浸膏，加蔗糖和糊精、混勻；回收乙醇過(guò)程中為蒸餾收回乙醇，溫度為80℃。

水煮工藝提取為ii號(hào)。水煮工藝用常見(jiàn)的水煮工藝即可。

試驗(yàn)用疫苗：豬瘟細(xì)胞苗為成都中牧股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20120103)。

試驗(yàn)用儀器設(shè)備：

冷凍高速離心機(jī)(beckman)，medol550型酶標(biāo)儀(美國(guó)bio-rad公司)，rt-3000全自動(dòng)洗板機(jī)(雷杜公司)

試驗(yàn)動(dòng)物：

四川犍為榮興豬場(chǎng)三元雜交(d×l×y)同品種、同日齡斷奶仔豬50頭，隨機(jī)平均分成五組，每組10頭。

試驗(yàn)用日糧：四川巨星飼料有限公司提供，飼料營(yíng)養(yǎng)水平詳見(jiàn)表1。

表1營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)試劑

冷凍高速離心機(jī)(beckman)，medol550型酶標(biāo)儀(美國(guó)bio-rad公司)，rt-3000全自動(dòng)洗板機(jī)(雷杜公司)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為5個(gè)組，將分好組的試驗(yàn)用豬分別用豬瘟細(xì)胞疫苗按5頭份/頭進(jìn)行肌肉注射免疫，同時(shí)按以下試驗(yàn)：i組在飼料中添加0.1％i號(hào)；ii組在飼料中添加0.2％i號(hào)；iii組在飼料中添加0.3％i號(hào)，iv組在飼料中直接添加0.2％ii號(hào)，v組為對(duì)照組ii號(hào)。試驗(yàn)共30天。具體如下表2：

表2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時(shí)間及飼養(yǎng)環(huán)境

試驗(yàn)時(shí)間從2014年3月-2014年4月在四川犍為榮興豬場(chǎng)。試驗(yàn)在同一條件下進(jìn)行，全部飼養(yǎng)在同一棟同一朝向豬舍內(nèi)。環(huán)境溫度、環(huán)境濕度等按常規(guī)飼養(yǎng)管理方式進(jìn)行，試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行統(tǒng)一清洗、消毒，嚴(yán)格按照“全進(jìn)全出”的原則。自由采食和飲水，專(zhuān)人飼養(yǎng)管理。

樣品的制備

試驗(yàn)后的7天、14天、21天、28天每組隨機(jī)抽取5頭豬從前腔靜脈采血1-2ml,置37℃恒溫箱中1-5h后,在4℃冰箱中放置2h，經(jīng)1500r/min離心5min，取出血清置-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)指標(biāo)

豬瘟抗體檢測(cè)

稀釋

待檢血清將100μl稀釋液(1倍pbs)加入反應(yīng)孔中，然后向相應(yīng)的孔中加入待檢測(cè)血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各2μl，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清各加2孔，37℃濕盒作用2h。

洗滌

將孔中的液體用力甩凈，每孔加入300μl洗液(pbst),室溫震蕩洗滌3min,如此洗滌3次,最后一次拍打干凈。

加入豬igg酶標(biāo)抗體

將試劑盒配備的辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的兔抗豬igg用稀釋液(1倍pbs)以1:5000稀釋,充分混合均勻。用多道移液器加入到各反應(yīng)孔中,100μl/孔。37℃濕盒作用45min。

洗滌

重復(fù)操作上一次洗滌步驟，洗滌3次,最后一次拍干。

加入tmb底物和0.75％過(guò)氧化氫尿素

臨用前將底物作用液a:b以1:50稀釋,混勻后加入0.75％過(guò)氧化氫尿素(按1.8μl/mlab混合液),用多道移液器加入到各反應(yīng)孔中,100μl/孔。避光作用5min。

4.3.6加入終止液

用多道移液器將終止液(2mol/lh2so4)加入到各反應(yīng)孔中,50μl/孔。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。應(yīng)用酶標(biāo)儀，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣本的od值。

統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析。

試驗(yàn)結(jié)果如表3和圖1：

表3免疫后不同時(shí)期csf抗體值

注：表中數(shù)據(jù)為每組5個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一列是同一時(shí)間不同組別間抗體水平的比較，肩標(biāo)字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。

結(jié)果分析

從圖1可知，在免疫后7d，豬瘟抗體水平開(kāi)始逐漸上升，在免疫后21d達(dá)到最高水平，然后緩慢下降，且添加0.1％i號(hào)、添加0.2％i號(hào)、添加0.3％i號(hào)以及添加0.2％ii號(hào)組豬瘟抗體水平均顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)；添加0.1％i號(hào)組、添加0.2％i號(hào)組、添加0.3％i號(hào)組豬瘟抗體水平顯著高于添加0.2％水ii號(hào)組(p＜0.05)；添加0.1％、0.2％、0.3％i號(hào)組抗體水平高于添加0.2％ii號(hào)組，但差異不顯著(p＞0.05)。

不同劑量的芪貞增免顆粒均可顯著提高豬瘟抗體水平，但添加0.1％i號(hào)組效果好于添加0.2％ii號(hào)組。

本發(fā)明中的生物發(fā)酵提取芪貞增免顆粒和水煮法提取芪貞增免顆粒均可顯著增強(qiáng)豬群免疫功能，提高豬群免疫水平。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。