本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，特別涉及一種干細胞制劑及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率在世界范圍內(nèi)上升，已成為繼心血管疾病及腫瘤后的第3大非傳染性疾病。糖尿病足是糖尿病一種嚴重的并發(fā)癥，是糖尿病患者致殘，甚至致死的重要原因之一。糖尿病足是指糖尿病患者足部由于神經(jīng)病變使下肢保護功能減退，大血管和微血管病變使動脈灌注不足致微循環(huán)障礙而發(fā)生潰瘍和壞疽的疾病狀態(tài)。1972年，Catterall首先提出了糖尿病足(diabeticfoot，DF)發(fā)病的三大因素：血管閉塞性缺血、感染以及神經(jīng)病變。其中，血管病變是一個重要因素。它不僅是導致DM患者足部感染的主要病因，而且也是影響糖尿病足部潰瘍(diabetic footulcer，DFU)預后的最重要因素。

Loomans等的研究結(jié)果顯示，糖尿病患者在代謝紊亂的狀態(tài)下，血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)的數(shù)量減少且有功能障礙，影響其增殖、黏附及血管生成。糖尿病的高胰島素血癥導致了血管內(nèi)皮祖細胞的增殖和存活能力的減低，因此，在糖尿病等一些疾病狀態(tài)下，血管內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能兩方面均有所降低。血管內(nèi)皮祖細胞的功能狀態(tài)異常導致血管再生能力減弱，這可能是引起糖尿病血管病變的基礎(chǔ)，同時也是此類疾病預后差、治療困難的原因之一。

此外，由于糖尿病患者機體持續(xù)處于高血糖與蛋白質(zhì)的非酶糖化狀態(tài)，引起脂代謝紊亂。使血液持續(xù)處于高粘稠、高凝狀態(tài)，因此患者下肢動脈較容易發(fā)生血管壁增厚、管腔狹窄等血管病變，進而導致不同程度的微循環(huán)障礙，出現(xiàn)下肢供血逐漸減少，最終發(fā)生組織損傷，從而導致糖尿病足等并發(fā)癥產(chǎn)生。

目前DF對各種治療方法不敏感，治療效果不佳，預后不良，病變惡化易導致截肢。DF的傳統(tǒng)治療方法有藥物治療、血管搭橋、局部涂抹中藥及介入治療，但是手術(shù)和介入治療對患者的選擇要求較高，有嚴格的指征，導致許多自身條件欠佳或合并有重要臟器嚴重病變而不能耐受搭橋手術(shù)及介入治療的中老年患者只能選擇藥物治療，而這些治療方法的遠期效果均不理想且不能從根本上解決問題，很多患者最終無法避免截肢的厄運。因此，各國研究者在不斷地探索并尋找出更好的非藥物的治療方案，以此來提高糖尿病足患者的治療效果。

干細胞是一類具有自我復制功能力的多潛能細胞，在一定條件下，能夠分化成多種功能的細胞。近年來，干細胞技術(shù)飛速發(fā)展，其在糖尿病治療中的基礎(chǔ)研究和臨床應用也得以迅速開展，干細胞研究給糖尿病足的治療帶來新的希望。

脂肪干細胞是一種多向分化的干細胞，并發(fā)現(xiàn)它能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、胰、神經(jīng)等細胞系類型,具有易獲得、易擴增、不易衰老等特點。近年來，大量的研究表明脂肪干細胞可以產(chǎn)生和分泌多種促血管化的細胞因子(如VEGF、HGF、bFGF等),并參與了組織損傷修復的血管化過程，并具有造血支持作用、抗凋亡作用、趨化作用等。

纖維母細胞是皮膚真皮中的主體細胞成分，它與自身分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質(zhì)成分一同構(gòu)成了真皮的主體。纖維母細胞的主要功能是：合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、基質(zhì)大分子物質(zhì)和某些生長因子，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用，纖維母細胞的減少也是引起皺紋產(chǎn)生的重要原因。

纖連蛋白也稱纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)，一種高分子糖蛋白，具有多種生物學功能。大量國內(nèi)外的研究結(jié)果證明，F(xiàn)N分子在進化過程中保守性很強，各種動物體液中的FN具有非常相近的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物學功能，因而不同來源的FN可以相互替代使用。FN主要功能是介導細胞粘著，純化的纖連蛋白可增強細胞間粘連及細胞與基質(zhì)的粘連。通過粘著，纖連蛋白可以通過細胞信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)細胞的形狀和細胞骨架的組織，促進細胞鋪展。在胚胎發(fā)生過程中，纖連蛋白對于許多類型細胞的遷移和分化是必需的。在創(chuàng)傷修復中，纖連蛋白亦是重要的。在血凝塊形成過程中，纖連蛋白促進血小板附著于血管受損部位。

糖尿病足的治療目前主要是控制血糖改善微循環(huán)等保守治療效果不理想，因其病變特點是遠端血管流出道差，故即使搭橋、介入均難再通。因此，研發(fā)一種對糖尿病足有良好療效的干細胞制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，所述干細胞制劑對糖尿病足具有良好的療效。

本發(fā)明公開了一種干細胞制劑，包括：脂肪干細胞、纖維母細胞和纖連蛋白；

所述脂肪干細胞的含量為4×10⁶～1×10⁸個/ml；

所述纖維母細胞的含量為2×10⁶～5×10⁷個/ml；

所述纖連蛋白的含量為0.4～1.5μg/ml。

優(yōu)選地，所述干細胞制劑包括：脂肪干細胞、纖維母細胞和纖連蛋白；

所述脂肪干細胞的含量為8×10⁶個/ml；

所述纖維母細胞的含量為5×10⁶個/ml；

所述纖連蛋白的含量為0.5μg/ml。

本發(fā)明公開了上述干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

將所述脂肪干細胞、所述纖維母細胞、所述纖連蛋白和溶劑混合，制得所述干細胞制劑。

優(yōu)選地，所述溶劑為生理鹽水。

優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的制備方法包括以下步驟：

a1)、在無菌條件下抽取脂肪組織；

a2)、在無菌條件下用清洗液清洗脂肪組織，用眼科剪刀將脂肪組織剪成0.2-0.3cm³的小塊，再用D-Hank’s液清洗；

a3)、用Ⅰ型膠原酶消化脂肪塊20min，離心收集脂肪細胞；

a4)、以5000個/cm²的密度將步驟a3)收集的脂肪細胞進行接種培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后將細胞用0.25％胰酶消化后再以5000個/cm²的密度繼續(xù)接種培養(yǎng)；

a5)、收集培養(yǎng)至第三代的脂肪干細胞，用生理鹽水重懸制得所述脂肪干細胞的懸液。

優(yōu)選地，步驟1)抽取的脂肪組織為腹部皮膚下的脂肪組織。選擇腹部皮下部位進行脂肪組織的抽取既方便取材，又不影響個體的生命健康。抽取脂肪組織的部位并不限于腹部皮下組織，也可選擇其它部位進行脂肪組織抽取。

優(yōu)選地，步驟2)所述的清洗液為D-Hank’s液。

優(yōu)選地，所述纖維母細胞的制備方法包括以下步驟：

b1)、在無菌條件下取皮膚組織塊；

b2)、清洗皮膚組織塊后用眼科剪刀剪成小塊，再進行清洗；

b3)、用Ⅰ型膠原酶對步驟b2)得到的皮膚組織塊進行低溫消化過夜，第二天轉(zhuǎn)移置37℃至消化完全；

b4)、加入培養(yǎng)液，離心后去上清，再加入培養(yǎng)液混勻后進行培養(yǎng)，每3天換一次液；當?shù)谝淮毎_到80％的匯合度時傳第二代；當?shù)诙毎_到80％的匯合度時傳第三代；當?shù)谌毎_到85％的匯合度時，收集培養(yǎng)的細胞，用生理鹽水重懸制得所述纖維母細胞的懸液。

優(yōu)選地，步驟b3)所述的低溫為4℃。

本發(fā)明還公開了所述干細胞制劑和所述制備方法制得的干細胞制劑在治療糖尿病足中的應用。

在本發(fā)明公開的干細胞制劑中，纖維母細胞能促進創(chuàng)口的愈合，脂肪干細胞不僅在壞死端能發(fā)揮修復功能，而且對患者機體的微環(huán)境有一定的改善作用。纖連蛋白能增強細胞間粘連及細胞基質(zhì)粘連，促進血小板附著于血管受損部位，達到修復的作用。

本發(fā)明建立了糖尿病足的大鼠動物模型，對本發(fā)明公開的干細胞制劑和本發(fā)明公開的制備方法制得的干細胞制劑進行了動物試驗，動物試驗的結(jié)果顯示本發(fā)明公開的干細胞制劑和本發(fā)明公開的制備方法制得的干細胞制劑對糖尿病足具有良好的療效。

綜上所述，本發(fā)明公開的干細胞制劑和本發(fā)明公開的制備方法制得的干細胞制劑具有以下有益效果：本發(fā)明公開的干細胞制劑對糖尿病足對糖尿病足具有良好的療效，能夠減輕患者的痛苦，滿足疾病各個進展程度的患者，為糖尿病足的治療奠定了基礎(chǔ)；且本發(fā)明公開的制備方法取材容易，利用推廣應用。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，該干細胞制劑對糖尿病足具有良好的療效。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明所述的成分和制劑均為市售或自制來源。

纖連蛋白購自上海江萊生物科技有限公司

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。

實施例1脂肪干細胞的制備

1、在無菌條件下，取大鼠自體腹部健康皮膚下的3mL脂肪組織，置于5mL離心管；

2、在無菌條件下用D-Hank’s液離心清洗3遍脂肪組織，離心條件為4℃、200g，離心時間為10min；離心完后用眼科剪刀將脂肪組織剪成0.2-0.3cm³的小塊，再用D-Hank’s液清洗2遍；

3、用Ⅰ型膠原酶消化脂肪塊20min，400g離心10min收集脂肪干細胞；

4、以5000個/cm²的密度將離心收集的脂肪干細胞接種至六孔板培養(yǎng)，每培養(yǎng)三天將細胞用0.25％胰酶消化再以5000個/cm²的密度接種培養(yǎng)；

5、用0.25％胰酶消化收集第3代脂肪干細胞，用生理鹽水重懸成1.5mL細胞懸液，置于4℃保存待用。

實施例2纖維母細胞的制備

1、在無菌條件下麻醉大鼠，選擇大鼠較平坦的部位用脫毛膏去除絨毛，用滅菌手術(shù)剪刀剪下1×1cm²自體皮膚組織塊，置于50mL離心管；

2、用D-Hank’s清洗液離心清洗2遍皮膚組織塊，用眼科剪刀剪成1-2mm²的小塊，再加清洗液清洗3遍；

3、用Ⅰ型膠原酶置4℃消化過夜，第二天轉(zhuǎn)移置至37℃消化完全；

4、消化完畢后加入培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)，離心后棄上清，再加入培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移到六孔板培養(yǎng)，每3d換一次液，并實時觀察細胞狀態(tài)并做好記錄；

5、當原代細胞達到70％匯合度時進行傳代；當?shù)谝淮毎_到80％的匯合度時傳第二代；當?shù)诙毎_到80％的匯合度時傳第三代；當?shù)谌毎_到85％的匯合度時，用0.25％胰酶消化細胞，400g離心10min；離心后棄上清，加入生理鹽水重懸細胞，再次400g離心10min；然后再次棄上清加入生理鹽水重懸細胞，400g離心10min，棄上清；將收集到的5×10⁶個細胞用1.5mL生理鹽水重懸，置于4℃保存待用。

實施例3制備干細胞制劑

將纖連蛋白以濃度為0.5μg/mL的量加入1.0mL生理鹽水中，制成纖連蛋白溶液。往制備好的纖連蛋白溶液中加入制備好的脂肪干細胞和制備好的纖維母細胞，使脂肪干細胞的含量為8×10⁶個/ml，使纖維母細胞的含量為5×10⁶個/ml?；靹?，轉(zhuǎn)移至5mL注射器中待用，制得干細胞制劑。

實施例4制備干細胞制劑

將纖連蛋白以濃度為0.4μg/mL的量加入1.0mL生理鹽水中，制成纖連蛋白溶液。往制備好的纖連蛋白溶液中加入制備好的脂肪干細胞和制備好的纖維母細胞，使脂肪干細胞的含量為4×10⁶個/ml，使纖維母細胞的含量為5×10⁷個/ml?；靹?，轉(zhuǎn)移至5mL注射器中待用，制得干細胞制劑。

實施例5制備干細胞制劑

將纖連蛋白以濃度為1.5μg/mL的量加入1.0mL生理鹽水中，制成纖連蛋白溶液。往制備好的纖連蛋白溶液中加入制備好的脂肪干細胞和制備好的纖維母細胞，使脂肪干細胞的含量為1×10⁸個/ml，使纖維母細胞的含量為2×10⁶個/ml?；靹?，轉(zhuǎn)移至5mL注射器中待用，制得干細胞制劑。

實施例6建立動物模型

1、建立糖尿病模型

取健康雌雄性Wistar大鼠30只。隨機分為對照組(n＝5)和模型組(n＝25)。高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后，禁食5天(不禁水)，稱量體重。模型組按50mg/kg腹腔注射新鮮配制的鏈脲佐菌素，對照組給予腹腔注射與模型組同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。5天后測晨起空腹血糖(fastingplasmaglucose，F(xiàn)PG)，以14.0mmol/L為成模標準。并以第一次注射為起點，分別于第5、7、10、15和25天測量晨起空腹血糖。血糖不達標者根據(jù)血糖水平再次注射鏈脲佐菌素(25mg/kg或20mg/kg)。

2、建立糖尿病足模型

1)將糖尿病成模大鼠連同對照組大鼠用10％水合氯醛以0.03mL/kg的濃度進行腹腔麻醉；

2)在大鼠的左側(cè)腹股溝韌帶處切開一縱行切口，分離肉膜層及肌層；在手術(shù)放大鏡下暴露股動脈、靜脈及其分支，結(jié)扎并離斷；

3)逐層縫合皮下組織及皮膚，觀察大鼠各項生命體征平穩(wěn)后放回鼠籠；術(shù)后所有大鼠給予青霉素3萬單位/天，持續(xù)3天以預防感染。

3、糖尿病及糖尿病足模型指標測定

1)血糖以第一次注射鏈脲佐菌素為起點，于注射后第5天、第7天、第14天和第28天用剪尾法測量晨起空腹血糖；

2)體重、飲水量、尿量，體重量為單個樣本體重的測定；其中，飲水量為各飲水瓶總體飲水量，尿量為肉眼觀察粗測；

3)肉眼觀察糖尿病足潰瘍或壞疽，分別觀察模型組及對照組的缺血下肢的一般活動情況、皮膚顏色、潰瘍或者壞疽出現(xiàn)時間及其累計部位。

4、結(jié)果

1)血糖水平：模型組的25只大鼠注射鏈脲佐菌素5天后，血糖均有不同程度的升高，其中23只大鼠的FPG>15.7mmol/l，并有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀。對照組的血糖在注射鏈脲佐菌素前為4.53±0.47mmol/L，注射鏈脲佐菌素5天后為4.6±0.32mmol/L，無明顯差異；模型組血糖于注射鏈脲佐菌素5天后由4.47+0.27mmol/L升高至17.34+4.72mmol/L，與注射前及對照組同一時點進行比較有差異明顯(P<0.05)。

2)體重：注射鏈脲佐菌素7天后，對照組大鼠的體重由注射前的214.5±14.21增加到215.5±15.46，無明顯差異(P>0.05)；注射鏈脲佐菌素7天后，模型組大鼠的體重由注射前的215.24±16.03下降至148.47±10.05，與試驗組注射鏈脲佐菌素前和同一時間點試驗組大鼠的體重相比有明顯差異(P<0.05)。

3)進行股動脈結(jié)扎后，大鼠進食量明顯減少，左后肢活動受限。5天后，精神狀況有所改善，但缺血后肢的活動力明顯下降。用眼科剪分別在結(jié)扎動脈的下方皮膚制造約16cm²的創(chuàng)面，糖尿病足模型建立完成。

實施例7干細胞制劑的治療效果驗證

選取實施例6模型組中FPG>15.7mmol/L的23只大鼠中的20只作為試驗對象，其中10只為空白對照組，10只為治療試驗組。治療試驗組的大鼠使用實施例3制備的干細胞制劑進行注射，空白對照組使用等量的生理鹽水進行注射。在無菌條件下，消毒好創(chuàng)面周圍的皮膚，圍繞創(chuàng)面皮下分別對治療試驗組和空白對照組進行均勻點狀肌注實施例3制備的干細胞制劑4mL和生理鹽水4mL。在1h內(nèi)完成肌注，連續(xù)定時觀察10天創(chuàng)面愈合情況，并做好創(chuàng)面的記錄。

試驗結(jié)果如表1所示，治療試驗組大鼠的創(chuàng)面平均面積在治療的10天不斷縮小，有痊愈的趨勢?？瞻讓φ战M大鼠的創(chuàng)面平均面積不僅沒有縮小，反而潰爛面積在不斷增大。說明實施例3制備的干細胞制劑對治療糖尿病足有良好的療效。用實施例4和5制備的干細胞制劑重復上述試驗，得到相似的結(jié)論。

表1各組大鼠的創(chuàng)面平均面積變化

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。