本發(fā)明涉及一種具有保護(hù)肝臟的黑枸杞提取物，及其在非酒精性脂肪肝的抑制方面的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平的不斷提高和勞動(dòng)方式的轉(zhuǎn)變，脂肪肝已成為一種常見代謝疾病。脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過多的病變，并伴隨多種并發(fā)癥，如糖尿病、心血管疾病、激素紊亂和某些類型的腫瘤等。脂肪性肝病正嚴(yán)重威脅國人的健康，脂肪生成是造成非酒精性脂肪肝重要原因。脂肪生成的促進(jìn)或者抑制對于個(gè)體生理機(jī)能都有著十分重大的影響。而藥物對人體有不同程度的副作用，因此，從天然食物源中尋找能夠有效降低非酒精性脂肪肝的功能性成分已經(jīng)成為非酒精性脂肪肝預(yù)防與治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

黑果枸杞(Lycium Ruthenicum Murr.)是我國西北特有的抗鹽抗旱野生植物種。分布于新疆、西藏、青海、甘肅、寧夏、陜西北部，中亞、高加索和歐洲。黑果枸杞味甜多汁，含豐富的維生素、有機(jī)酸及糖類，民間常生食或榨汁做飲料；黑果枸杞也具有一定的醫(yī)療保健功能，其味甘、性平、清心熱，藏醫(yī)用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥。

黑枸杞主要是純天然保健品，其中含有苦丁皂甙、氨基酸、維生素C、多酚類、黃酮類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等200多種成分，具有降壓、抑癌防癌、抗衰老、活血脈等多種功效，素有“植物軟黃金”的美稱。近十年來，對黑枸杞生理活性的研究表明其具有顯著的抗氧化、增強(qiáng)心血管功能等生理活性。實(shí)驗(yàn)研究表明黑枸杞對于高血壓病有較好的療效等，研究也表明黑枸杞在降血糖、提高免疫和抗衰老抗疲勞方面和體外脂質(zhì)的抗氧化都有一定的療效。

對于消費(fèi)者來說，可廣泛得到來自不同產(chǎn)地、不同種屬或加工方式的各種食品，但這些物質(zhì)對于肝臟脂肪累積作用的效果以及潛在的機(jī)制尚不清楚。在實(shí)踐中，通常利用不同食品、醫(yī)藥產(chǎn)品處理脂肪細(xì)胞和/或動(dòng)物和/或人，然后檢測其對肝臟細(xì)胞脂滴積累和/或動(dòng)物非酒精性脂肪肝的作用及機(jī)理，從而確證不同食品、醫(yī)藥產(chǎn)品對非酒精性脂肪肝抑制的生理效應(yīng)。

本發(fā)明旨在提供一種基于純天然植物的具有保護(hù)肝臟的食品或醫(yī)藥產(chǎn)品，檢測其在非酒精性脂肪肝的抑制方面的作用，評估該食品或醫(yī)藥產(chǎn)品對肝臟保護(hù)的作用效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述目的，本發(fā)明采用傳統(tǒng)的黑枸杞為原料，通過醇提法提取其活性組分。通過檢測和評估該組分在抑制非酒精性脂肪肝方面的效果和應(yīng)用機(jī)制，發(fā)掘該組分在防治非酒精性脂肪肝和保護(hù)肝臟方面的應(yīng)用，既進(jìn)一步擴(kuò)充了黑枸杞對人體健康保護(hù)作用，促進(jìn)了活性植物資源的開發(fā)利用，又可實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)藥食兩用資源的高值轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

本發(fā)明提供一種具有肝臟保護(hù)功效的組分，該組分是天然食物黑枸杞的提取物。

所述具有保護(hù)肝功效的黑枸杞提取物的制備方法為：稱取黑枸杞，以1:1-1:20的料液比，用體積分?jǐn)?shù)為50-70％的乙醇進(jìn)行浸提，浸提溫度30-100℃，浸提時(shí)間大于15分鐘，過濾后取濾液，浸提1-5次，合并所有濾液進(jìn)行低溫真空濃縮至凝膏狀，移除幾乎全部的乙醇和水分后，獲得黑枸杞的提取物。

在使用該黑枸杞的提取物時(shí)，可用水稀釋為提取物的水溶液，每克黑枸杞的提取物加1.5-2.0毫升的水進(jìn)行稀釋。

本發(fā)明還提供上述具有肝臟保護(hù)功效的組分的應(yīng)用，該組分是天然食物黑枸杞的提取物，所述黑枸杞的提取物可用于制備具有肝臟保護(hù)功效的食品、醫(yī)藥產(chǎn)品中，服用或食用所述提取物制備的產(chǎn)品，可以明顯抑制非酒精性脂肪肝進(jìn)程，降低并發(fā)代謝疾病的發(fā)生。

食用所述具有肝臟保護(hù)功效的產(chǎn)品時(shí)，所述提取物的效果是多種有效成分共同起作用而不是單一物質(zhì)的作用。

所述具有護(hù)肝功效的黑枸杞提取物的制備方法為：稱取黑枸杞，以1:1-1:20的料液比，用體積分?jǐn)?shù)為50-70％的乙醇進(jìn)行浸提，浸提溫度30-100℃，浸提時(shí)間大于15分鐘，過濾后取濾液，浸提1-5次后，合并所有濾液進(jìn)行低溫真空濃縮至凝膏狀，待移除幾乎全部的乙醇和水分后，獲得該黑枸杞的提取物。

在使用該黑枸杞的提取物時(shí)，可用水稀釋為提取物的水溶液，每克黑枸杞的提取物加1.5-2.0毫升的水進(jìn)行稀釋。

所述具有保護(hù)肝臟功效的提取物對非酒精性脂肪肝抑制效果的評估方法是：采用高脂飼料喂食小鼠8周，構(gòu)建非酒精性脂肪肝模型。將所述提取物灌注喂食高脂的小鼠4周，實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測小鼠體重和飲食變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測小鼠血清中血脂以及肝功能的變化，肝臟組織的病理學(xué)改變和肝細(xì)胞的脂滴累積情況，以及PPARγ、MAPK信號通路變化情況中的至少一種，來評估所述提取物料對小鼠非酒精性脂肪肝的影響，以確定所述提取物能否抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)生。

當(dāng)檢測結(jié)果為小鼠肝臟內(nèi)脂肪變得到緩解以及肝臟細(xì)胞脂滴積累抑制時(shí)，則所述提取物有益于非酒精性脂肪肝的抑制；當(dāng)檢測結(jié)果為小鼠肝臟內(nèi)脂肪變和肝臟細(xì)胞脂滴積累不被抑制時(shí)，則所述提取物對非酒精性脂肪肝的抑制無益或有害。

所述小鼠為C57BL/6或/和APOE^-/-雄鼠。

所述肝臟組織的病理學(xué)改變情況通過石蠟包埋H&E染色顯微鏡拍照、觀察。

所述肝臟細(xì)胞脂滴積累情況可以通過油紅O染色顯微鏡觀察、拍照。

每周檢測小鼠的體重和進(jìn)食量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取小鼠血液，分離血清進(jìn)行血脂、肝功能指標(biāo)測定。

所述PPARγ、MAPK信號通路變化情況是指PPARγ和p38蛋白質(zhì)活性、基因表達(dá)變化情況，通過Western Blot和/或Q-PCR方法來檢測。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將所述提取物灌胃高脂飼養(yǎng)的小鼠，檢測小鼠實(shí)驗(yàn)過程中的體重和進(jìn)食量，實(shí)驗(yàn)后測定肝體比和脂體比，通過小鼠體重和進(jìn)食量、肝體比和脂體比等來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對小鼠脂肪代謝作用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將所述提取物灌注高脂飼養(yǎng)的小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束取小鼠血液，分離血清進(jìn)行血脂、肝功能指標(biāo)測定。以評估所述食品對于小鼠血脂和肝功能的作用效果，是否對高脂喂養(yǎng)的小鼠肝臟損傷具有一定的抑制作用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將所述提取物灌喂高脂飼養(yǎng)的小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，取肝臟組織制作石蠟/冷凍切片，觀察肝臟病理變化和肝臟細(xì)胞的脂肪滴積累情況，以評估黑枸杞對于非酒精性脂肪肝的病理改變的作用和肝臟細(xì)胞的脂肪累積的影響。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將所述提取物灌喂高脂飼養(yǎng)的小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠肝臟組織，通過實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(QPCR)和/或免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測PPARγ和/或MAPK信號通路的活性變化來評估食品和/或營養(yǎng)補(bǔ)充劑對小鼠肝臟細(xì)胞脂肪生成和炎癥相關(guān)信號通路的作用，以檢測所述食品對非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制。

非酒精性脂肪肝是以肝臟細(xì)胞脂肪過度貯積和脂肪變性為特征的臨床綜合征。非酒精性脂肪肝嚴(yán)重時(shí)幾乎所有的肝細(xì)胞均發(fā)生脂肪變，伴有肝臟腫大，可有輕度壓痛及肝功能異常。非酒精性脂肪肝嚴(yán)重后也會(huì)引起肝功能異常。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，又名天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，是轉(zhuǎn)氨酶中比較重要的一種。它是醫(yī)學(xué)臨床上肝功能檢查的指標(biāo)，用來判斷肝臟是否受到損害。當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，才能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度會(huì)偏高。非酒精性非酒精性脂肪肝的病理改變以大泡性或以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變性為特征。根據(jù)肝內(nèi)脂肪變性的程度分為：單純性脂肪性肝病、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化。

本發(fā)明中，通過對實(shí)驗(yàn)鼠血清肝功能檢測，肝臟組織外觀以及肝組織病理切片觀察，非酒精性脂肪肝相關(guān)基因和蛋白等分子水平的檢測，評估黑枸杞的提取物成分對肝臟保護(hù)功效及其在非酒精性脂肪肝防治中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，正常組肝臟呈鮮紅色，有光澤，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟肉眼可見肝臟均勻腫大，呈談黃色，包膜緊張，邊緣較鈍，質(zhì)地略軟，觸之油膩感。經(jīng)藥物和黑枸杞處理的小鼠肝臟肉眼觀察幾乎接近正常，肝臟邊緣較薄，未見腫脹和包膜緊張，質(zhì)地柔軟。關(guān)于肝功能的檢測發(fā)現(xiàn)，黑枸杞提取物能夠顯著降低高脂飲食導(dǎo)致的血清AST的升高，提示肝臟損傷的程度降低。

本發(fā)明中，關(guān)于小鼠肝臟H&E染色和油紅染色的觀察中，我們發(fā)現(xiàn)，黑枸杞明顯能夠抑制高脂進(jìn)食導(dǎo)致的小鼠肝臟組織脂肪變性和脂肪空泡的數(shù)目，未見炎性細(xì)胞的浸潤和肝細(xì)胞壞死，油紅染色進(jìn)一步證實(shí)肝臟細(xì)胞中脂滴的累積緩解，黑枸杞一定程度上能夠延緩非酒精性脂肪肝的進(jìn)程。

p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和炎性反應(yīng)有著密切關(guān)系，致炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子TNF-α在非酒精性脂肪肝的形成過程中也起著重要作用。p38MAPK可以調(diào)節(jié)TNF-α等致炎因子等抗炎因子的生成，影響生物體內(nèi)致炎與抗炎因素的平衡。

本發(fā)明中，在基因水平上的探索發(fā)現(xiàn)，黑枸杞的提取物可以下調(diào)P38蛋白的激活和肝臟組織中TNF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，降低肝臟中炎性信號通路的活性，同時(shí)有利于脂酶活性增加和胰島素抵抗緩解，改善肝細(xì)胞內(nèi)脂類積聚和脂肪變性的狀況。

本發(fā)明原料黑枸杞為我國傳統(tǒng)的野生植物資源，來源廣泛，成本低廉，本發(fā)明關(guān)于黑枸杞的提取物對于小鼠高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的作用的探索，對藥食兩用資源的開發(fā)具有重要意義，而且實(shí)現(xiàn)了活性植物資源的高值轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了農(nóng)產(chǎn)品的精深加工利用。通過評估其對非酒精性脂肪肝的抑制功效，發(fā)現(xiàn)黑枸杞提取物可用于非酒精性非酒精性脂肪肝的防治，對預(yù)防或治療非酒精性非酒精性脂肪肝的活性成分的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。所述具有保護(hù)肝臟功效的組分，可廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1給枸杞提取物制備的工藝流程

圖2黑枸杞提取物對小鼠體重增長的影響

圖3黑枸杞提取物對小鼠進(jìn)食量的影響

圖4黑枸杞提取物對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

圖5黑枸杞提取物對小鼠肝體比的影響

圖6黑枸杞提取物對小鼠脂體比的影響

圖7黑枸杞提取物對小鼠總膽固醇的影響

圖8黑枸杞提取物對小鼠低密度脂蛋白的影響

圖9黑枸杞提取物對小鼠高密度脂蛋白的影響

圖10黑枸杞提取物對小鼠甘油三酯的影響

圖11黑枸杞提取物對小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響

圖12黑枸杞提取物對小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響

圖13黑枸杞提取物對小鼠堿性磷酸酶的影響

圖14黑枸杞提取物處理后，肝臟H&E染色細(xì)胞形態(tài)的影響

圖15黑枸杞提取物處理后，肝臟油紅染色細(xì)胞脂滴積累的影響

圖16黑枸杞提取物處理后，肝臟細(xì)胞中PPARγmRNA的表達(dá)情況

圖17黑枸杞提取物處理后，肝臟細(xì)胞中SREBP mRNA的表達(dá)情況

圖18黑枸杞提取物處理后，肝臟細(xì)胞中FAS mRNA的表達(dá)情況

圖19黑枸杞提取物處理后，肝臟細(xì)胞中TNF-αmRNA的表達(dá)情況

圖20黑枸杞提取物處理后，肝臟細(xì)胞中PPARγ、FAS、P38的蛋白表達(dá)情況

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。

實(shí)施例1一種具有肝臟保護(hù)功能的提取物，主要原料為天然食物源黑枸杞。

制備方法為：稱取黑枸杞，以1:1-1:20的料液比，用體積分?jǐn)?shù)為50-70％的乙醇進(jìn)行浸提，浸提溫度30-100℃，浸提時(shí)間大于15分鐘，過濾后取濾液，浸提1-5次，合并所有濾液進(jìn)行低溫真空濃縮至凝膏狀，移除全部的乙醇和幾乎全部的水分，然用水稀釋為提取物的水溶液，每克黑枸杞的提取物加1.5-2.0毫升的水進(jìn)行稀釋。

圖1是黑枸杞提取物制備的工藝流程，對上述制備方法進(jìn)行了概括。

在下述實(shí)施例2-10中使用的黑枸杞提取物的工藝條件為：稱取黑枸杞20g，用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇400ml進(jìn)行浸提，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間30分鐘，過濾后取濾液，重復(fù)3次，合并所有濾液進(jìn)行低溫真空濃縮至凝膏狀，移除全部的乙醇和幾乎全部的水分，然用水稀釋為提取物的水溶液。每克黑枸杞的提取物加水1.5毫升，加水30ml充分溶解后得到黑枸杞的提取物水溶液，水溶液顏色為紫紅色，色澤鮮艷。以蘆丁為對照物，紫外分光光度法測定提取物類黃酮濃度。

實(shí)施例2黑枸杞提取物對小鼠體重和進(jìn)食量的作用效果

6-8周齡的雄性小鼠，隨機(jī)分成4組：正常對照組、模型對照組、黑枸杞組、辛伐他汀組。每組10只小鼠。除空白對照組喂食普通飼料外，其他3組均喂食高脂營養(yǎng)飼料，黑枸杞組和辛伐他汀組分別在高脂飼料同時(shí)灌胃濃縮的黑枸杞提取物和辛伐他汀的水溶液，測量小鼠的體重和飲食。

小鼠體重、進(jìn)食量測量方法：用電子天平進(jìn)行監(jiān)測，計(jì)算差值。

圖2是黑枸杞提取物喂食小鼠后，小鼠體重增長的變化比較。圖3是黑枸杞提取物喂食后，小鼠進(jìn)食量的變化。由圖2和圖3的結(jié)果可以看出，保證同樣的能量攝入的情況下，高脂進(jìn)食量較普通進(jìn)食量小。在同樣的高脂進(jìn)食量的情況下，黑枸杞處理組的小鼠的體重較模型組顯著增加。

實(shí)施例3黑枸杞對小鼠肝臟形態(tài)和肝體比以及脂體比的作用效果

肥胖與脂肪肝有著密切的關(guān)系，有報(bào)道肝內(nèi)輕度脂肪浸潤可見于約半數(shù)的肥胖患者，在重度肥胖者中脂肪肝的發(fā)病率可達(dá)61％～94％。肝內(nèi)脂肪的堆積與體重的超標(biāo)程度呈正相關(guān)。肥胖患者的體形特點(diǎn)對脂肪肝的形成也有一定的影響。本發(fā)明通過對肝重、附睪脂肪重和體重的稱量計(jì)算肝體比和脂體比進(jìn)行驗(yàn)證，并對小鼠組織形態(tài)拍照。

圖4是黑枸杞處理小鼠后組織的形態(tài)，可以看出，體重變化以及與肝臟病變相以及肝臟顏色變化并不一致。黑枸杞處理后小鼠的肝臟邊緣較薄，沒有發(fā)生模型組類似的腫脹現(xiàn)象。肝臟顏色較為正常，肝臟表面沒有油膩感。圖5是黑枸杞處理小鼠后肝體比的變化。圖6黑枸杞處理小鼠后脂體比的變化。由圖5和圖6可以看出，雖然黑枸杞處理的小鼠的體重較模型組增加，但是相應(yīng)的肝體比和脂體比并沒有發(fā)生明顯的變化。

實(shí)施例4黑枸杞對小鼠血脂指標(biāo)的作用效果

圖7是黑枸杞水提物處理小鼠后的總膽固醇(CHOL)水平的變化。圖8是黑枸杞水提物處理小鼠后，低密度脂蛋白(LDL)水平的變化。圖9是黑枸杞水提物處理小鼠后，高密度脂蛋白(HDL)水平的變化。圖10是黑枸杞水提物處理小鼠后，血清血脂(TG)水平的變化。黑枸杞水提物作用后，小鼠總膽固醇含量稍微增加，而高、低密度脂蛋白水平?jīng)]有受到影響，甘油三酯的水平較模型組下降，但是沒有顯著性差異。

實(shí)施例5黑枸杞對小鼠肝功能的作用效果

本發(fā)明從小鼠血清肝功能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證黑枸杞提取物對于小鼠肝臟的作用效果。

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是醫(yī)學(xué)臨床上肝功能檢查的指標(biāo)，用來判斷肝臟是否受到損害。肝細(xì)胞病變時(shí)，AST釋放入血，故血清AST活性隨肝細(xì)胞損害的程度增高。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，當(dāng)肝細(xì)胞或某些組織損傷或壞死，都會(huì)使血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高。堿性磷酸酶(ALP)主要用于阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查。患這些疾病時(shí)，肝細(xì)胞過度制造ALP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。圖11-13分別是黑枸杞處理小鼠后，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平的變化。在黑枸杞處理組谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量降低，提示肝臟損傷的程度降低/得到恢復(fù)。而谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶則沒有發(fā)生顯著的變化。

實(shí)施例6黑枸杞對肝臟病理改變的作用

本發(fā)明采用石蠟切片后H&E染色的方法對黑枸杞處理后小鼠肝臟病理學(xué)改變進(jìn)行驗(yàn)證。圖14黑枸杞處理后，肝臟H&E染色細(xì)胞形態(tài)的改變。高脂誘導(dǎo)后，小鼠肝臟細(xì)胞體積變大，伴有脂肪空泡的出現(xiàn)，大部分細(xì)胞出現(xiàn)水泡樣變性和脂肪變性，以中小型空泡為主，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞的浸潤，黑枸杞處理后小鼠肝臟細(xì)胞的水泡樣變和脂肪變性的程度明顯減輕，脂肪空泡的數(shù)目明顯減少，呈現(xiàn)少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞。因而黑枸杞提取物能夠延緩高脂小鼠誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的進(jìn)程，減輕肝臟脂肪病變的輕度。

實(shí)施例8黑枸杞對肝臟細(xì)胞脂滴積累的作用

本發(fā)明采用冰凍切片后油紅染色的方法對黑枸杞處理后小鼠肝臟脂肪滴的積累情況進(jìn)行驗(yàn)證。圖15黑枸杞處理后，肝臟油紅染色細(xì)胞脂滴積累的改變?？梢钥匆姾阼坭教幚砗蟮男∈蟾闻K細(xì)胞中的脂肪滴數(shù)目明顯少于模型組小鼠，黑枸杞體提取物的處理可以減少肝臟中脂肪的累積，其肝臟細(xì)胞中脂肪滴的數(shù)目和體積明顯小于模型組小鼠。

實(shí)施例9黑枸杞對脂肪生成和炎性相關(guān)基因mRNA水平的作用

本發(fā)明采用QPCR的方法對PPARγ、FAS、SREBP-1c等與脂肪生成相關(guān)和炎性因子TNF-α的基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖16是黑枸杞作用細(xì)胞后的PPARγ基因水平的變化。圖17是黑枸杞作用細(xì)胞后，SREBP-1c基因水平的變化，圖18是黑枸杞作用細(xì)胞后，F(xiàn)AS基因水平的變化。圖19是黑枸杞作用后炎性因子TNF-α基因水平的變化。由圖16、圖17、圖18和圖19可以看出，黑枸杞處理后，PPARγ、FAS的轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)生明顯的改變，但是與脂肪生成相關(guān)的PPARλ的變化趨勢與血清甘油三酯的含量變化具有一致性。介導(dǎo)膽固醇生成相關(guān)的SREBP-1c的表達(dá)量下降。炎性因子TNF-α的表達(dá)量顯著降低，表明黑枸杞處理后對小鼠肝臟細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)的基因的表達(dá)的影響較小，并能夠抑制炎性因子TNF-α基因的表達(dá)。

實(shí)施例10黑枸杞對肝臟中脂肪生成相關(guān)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平的作用效果

本發(fā)明采用western blotting的方法對MAPK和PPARγ信號通路進(jìn)行驗(yàn)證。

圖20是黑枸杞作用細(xì)胞后的MAPK磷酸化和PPARγ表達(dá)水平的變化。由圖可看出，黑枸杞處理后，p38的磷酸化水平增加，F(xiàn)AS的表達(dá)量上升，PPARγ的表達(dá)沒有發(fā)生顯著性的變化，表明黑枸杞可以上調(diào)p-p38抑制肝細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)上調(diào)FAS的合成促進(jìn)TG的生成。

結(jié)果表明黑枸杞可以抑制高脂進(jìn)食的小鼠肝臟細(xì)胞中脂滴的積累，降低肝臟細(xì)胞空泡化的產(chǎn)生，降低肝臟細(xì)胞水泡樣變和脂肪變的發(fā)生，緩解非酒精性脂肪肝的進(jìn)程，有一定的護(hù)肝作用。在基因表達(dá)水平上探索發(fā)現(xiàn)，黑枸杞對脂肪生成相關(guān)基因PPARγ、FAS基因的表達(dá)的影響較小，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上探索發(fā)現(xiàn)，黑枸杞通過下調(diào)p-p38蛋白的表達(dá)和下調(diào)TNF-αmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，降低肝臟細(xì)胞中炎性信號通路的活性，抑制炎性反應(yīng)，同時(shí)黑枸杞處理后AST的含量降低，表明肝臟損傷減輕。本發(fā)明提供一種具有護(hù)肝功能的黑枸杞提取物，并評估其非酒精性脂肪肝的抑制效果，從而給藥食兩用資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。然而，黑枸杞處理的小鼠的體重有一定程度的增加，這可能與FAS在蛋白水平的表達(dá)的增加有關(guān)，同時(shí)，黑枸杞處理后，血清中總膽固醇的含量增加，其中的更深層次的機(jī)制還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和探討。而黑枸杞對其他并發(fā)癥的作用，還需要進(jìn)一步被驗(yàn)證。

石蠟切片H&E染色的步驟如下：

1、固定 組織樣品用生理鹽水洗一下，立即投入中性多聚甲醛固定液中固定。

2、洗滌 流水沖洗或浸泡數(shù)小時(shí)或過夜(控制好固定時(shí)間，一般不需要洗滌)。

3、脫水 樣品依次經(jīng)70％、80％、90％各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。

4、透明 1/2純酒精+1/2二甲苯混合液15min、二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明為止)。

5、浸蠟 將樣品放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各1h。

6、包埋 以最大的面在底層，使切出的面組織面所占最大；另外，注意包埋方向，夾樣品時(shí)要注意不要太用力，切片是也要盡量避開被夾的部分。

7、切片

9.展片、貼片

10.脫蠟復(fù)水 將烘箱溫度調(diào)至60℃，并控制在60℃時(shí)，將切片連同切片架放入30min至蠟熔化。之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。

11.染色 切片放入蘇木精中染色約7s。

12.水洗 用自來水流水沖洗約15min。

13.分化 將切片放入1％鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。

14.漂洗 切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。

15.脫水Ⅰ 切片入50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min。

16、復(fù)染 用0.5％伊紅乙醇液對比染色1-3min。

17.脫水Ⅱ 將切片放入95％乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。

18.透明 切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

19.封藏：中性樹膠封存

冰凍切片油紅染色步驟如下：

1 取新鮮組織于4％多聚甲醛固定24小時(shí)

2 -25度包埋(冰凍切片機(jī)內(nèi))

3 冰凍切片

4、油紅O染色10分鐘。

5、蒸餾水洗30分鐘；

6、甘油明膠封片

實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(QPCR)實(shí)驗(yàn)如下：

(一)RNA的提取：

1.儀器、材料與試劑：

(1)儀器：冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)；制冰機(jī)、恒溫水浴鍋

(2)材料：eppendorf管、槍頭、eppendorf管架、冰盒；移液槍

(3)試劑：Trizol；氯仿、異丙醇、DEPC水；75％乙醇

2.具體步驟如下：

(1)加1ml TRizol(預(yù)冷)試劑，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫靜置10min；

(2)加入200μl(或1/5體積)的氯仿，用力顛倒離心管混合30s，室溫靜置5min，分層。4℃12000rpm離心15min。離心管中液體分為3層：上層為水相，RNA在此相中，蛋白質(zhì)在下層黃色的有機(jī)相中，DNA保留在上下兩層的界面處的中間層中；

(3)小心吸取上層水相約0.4ml于新的塑料離心管中(切勿吸取中間層和下層液體)。加入1倍體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，室溫放置20min(或-20℃靜置30min以上)；

(4)4℃12000rpm離心15min，沉淀RNA，棄上清；

(5)用1ml預(yù)冷的75％乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，12000rpm 4℃離心10min，棄盡上清；

(6)重復(fù)步驟5，然后室溫中自然干燥約10min，至RNA呈半透明狀即可；

(7)根據(jù)RNA提取量加20-100μl DEPC處理的水溶解沉淀，56℃水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液；

(8)RNA純度、濃度測定及分子完整性的鑒定：測定樣品260nm/280nm光吸收比值。(二)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：

1.儀器、材料與試劑：

(1)儀器：PCR熱循環(huán)儀、離心機(jī)

(2)材料：PCR管、槍頭；移液槍

(3)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒

2.具體步驟如下：

(1)在PCR管中加20μl反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的①號試劑4μl，模板RNA2μg，②號試劑補(bǔ)充到20μl；

(2)離心后，37℃30min，85℃10s；

(3)測定cDNA濃度，并用無菌水稀釋成50ng/μl，-20℃保存。

(三)PCR：

(1)在滅菌ep管中配制20μl反應(yīng)體系：mix 10μl，ddH₂O 6μl，上、下游引物各1μl，cDNA2μl；

(2)離心，混勻，離心，加入96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；

(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

1)95℃預(yù)變性 5min

2)95℃變性 15s

3)62℃退火 30s

4)65℃延伸 5s

5)重復(fù)步驟(2)-(4) 39次

6)95℃延伸 5min

免疫雜交(Western blotting)實(shí)驗(yàn)如下：

1.溶液配制：

(1)10％(w/v)十二烷基硫酸鈉SDS溶液:0.1gSDS，1mlH₂O去離子水配制，室溫保存。

(2)分離膠緩沖液:1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris用80ml水溶解，用HCL調(diào)節(jié)pH到8.8，加水稀釋到100ml終體積。

(3)濃縮膠緩沖液:0.5mol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于80ml水中，用HCL調(diào)至pH6.8，加水稀釋到100ml終體積。

(4)SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10％SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05％溴酚藍(lán)1.6ml，H₂O 32ml混勻備用。

(5)Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，臨用前稀釋10倍。

(6)轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取14.4g甘氨酸、6.04gTris堿，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。

(7)Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。

2.具體步驟如下：

加入裂解液，超聲破碎，冰上冷卻后，12000rpm離心2min,取上清，-20保存?zhèn)溆谩?/p>

(一)SDS-PAGE凝膠電泳

(1)清洗后的玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。

(2)配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，隨即用乙醇液封，膠充分凝固就可倒去膠上層乙醇并用吸水紙吸干。

(3)配4％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕將其拔出。

(5)將其放入電泳槽中，加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。蛋白質(zhì)樣品測完蛋白含量后，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，在沸水中煮5min混勻后上樣，總蛋白量50μg。

(6)恒壓80V電泳跑膠，當(dāng)樣品進(jìn)入下層膠后恒壓120V電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部為止，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

(二)轉(zhuǎn)膜：

(1)切膠：將玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，將濃縮膠刮去，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按照蛋白的分子量，以Marker為對照進(jìn)行切膠。

(2)備膜：裁剪PVDF膜和濾紙，將切好的PVDF置于甲醇溶液中激活30s。

(3)裝膜：將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開使黑的一面(負(fù)極)保持水平。在上面墊一張海綿墊，加入轉(zhuǎn)膜液浸濕，在墊子上墊上中浸泡好的濾紙，隨后按照凝膠—硝酸纖維素膜—濾紙—海綿墊的順序依次疊放。最后將白色板(正極)蓋好裝入轉(zhuǎn)膜槽中。

(4)轉(zhuǎn)膜：將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。4℃轉(zhuǎn)膜，恒流400mA。

(5)轉(zhuǎn)完后將膜取下，標(biāo)記一角。

(三)免疫反應(yīng)

(1)封閉：將膜用TBST中漂洗3次，每次5min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入5％脫脂奶粉中，室溫下?lián)u床1h。

(2)加一抗：將封閉后的硝酸纖維素膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min。放入加有一抗的平皿中4℃過夜孵育。

(3)加二抗：回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次5min，然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放入加有二抗的平皿中，避光室溫孵育1h。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次，每次5min。

(四)化學(xué)發(fā)光

(1)將A和B兩種試劑在小離心管里按照發(fā)光試劑盒說明書操作將其混合，加到硝酸纖維素膜上，用化學(xué)發(fā)光成像儀顯色。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。