本發(fā)明涉及含有聚合栓塞物質(zhì)和一種結(jié)合到該聚合物基質(zhì)中的治療劑的組合物。這種組合物用于栓塞腫瘤和向腫瘤釋放細(xì)胞毒劑。

栓塞治療是介入醫(yī)學(xué)中一個(gè)正在發(fā)展的領(lǐng)域，但是通常它要依賴(lài)導(dǎo)管經(jīng)動(dòng)脈到達(dá)指定位置，從而釋放出一種試劑以阻塞特定的血管。這種治療已經(jīng)被用于阻斷諸如肝細(xì)胞腫瘤的某些血管過(guò)多的腫瘤的血液供應(yīng)，而且近來(lái)正成為子宮纖維瘤治療的一個(gè)普遍選擇。

臨床應(yīng)用的栓塞物質(zhì)具有一定的范圍，需要能夠經(jīng)導(dǎo)管釋放到栓塞部位，從而被釋放到血流中并將其阻斷。這可以通過(guò)應(yīng)用小的粒子或小球從物理上阻斷血管實(shí)現(xiàn)，或者在液體栓塞劑情況下，需要某種相變或反應(yīng)使流動(dòng)性物質(zhì)固化并在血管內(nèi)形成鑄型物(cast)。

最普遍的基于微粒的栓塞劑是已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年的聚乙烯醇(PVA)泡沫粒子(如埃弗倫)。最近，已經(jīng)出現(xiàn)了這種物質(zhì)的微粒而不是薄片形式，因此不需要在釋放前由外科醫(yī)師制成顆粒狀。

在WO-A-0168720中敘述了基于PVA的栓塞治療組合物。先將PVA衍生化形成具有丙烯酸側(cè)鏈基團(tuán)的大單體。然后任選在共聚單體存在下使這些丙烯酸基團(tuán)聚合，形成遇水可膨脹但不溶于水的聚合物基質(zhì)。聚合反應(yīng)可以在原位發(fā)生，藉此PVA在被釋放入血管到達(dá)栓塞部位后具有了水不溶性。另外，聚合也可在釋放前進(jìn)行，通常形成微球并在以在水性媒介中的懸浮液形式釋放。

在WO-A-0168720中，建議可以在栓塞組合物中加入生物活性劑，使活性劑可以從所形成的水凝膠中釋放。一類(lèi)活性劑是化學(xué)治療劑?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例有順鉑、阿霉素和絲裂霉素。該文獻(xiàn)給出了關(guān)于將活性劑結(jié)合到栓塞組合物中的方法的一些一般性的指導(dǎo)。如果組合物是一種原位固化的液體，只需將活性劑和液體混合。如果該制品是預(yù)先形成的，則建議可通過(guò)“包封”或者通過(guò)涂到表面上來(lái)結(jié)合活性劑。還沒(méi)有將治療劑結(jié)合到任何類(lèi)型的組合物中成功的例子。

用醛交聯(lián)劑如戊二醛使聚甲基丙烯酸羥乙酯、經(jīng)水解的聚甲基丙烯酸甲酯和PVA交聯(lián)形成的水凝膠物質(zhì)的微球也已經(jīng)用作栓塞劑。甲基丙烯酸羥乙酯可與共聚單體如含有酸性基團(tuán)的共聚單體共聚。例如，甲基丙烯酸羥乙酯和約1－2摩爾％丙烯酸通過(guò)0.3-1.0摩爾％乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯(lián)后形成的交聯(lián)共聚物，其平衡水分含量范圍在55－60％(重量)之間，并已以隱形眼鏡形式使用多年。

市場(chǎng)上的一種栓塞產(chǎn)品由Biosphere公司出售，該產(chǎn)品含有帶有膠原蛋白涂層的三丙烯酰明膠(trisacrylgelatin)微球。膠原蛋白在生理pH下總體上帶有正電荷。在Ball,D.S.et al.,J.Vasc.Interv.Radiol.(2003),14,83-88中,Biosphere公司證明，當(dāng)微球體與常與栓塞組合物同時(shí)給予的一系列藥物混合時(shí)，微球的機(jī)械特性并沒(méi)有受到不利的影響。對(duì)阿霉素、順鉑和米托蒽醌進(jìn)行了專(zhuān)門(mén)的測(cè)試。

阿霉素和其他蒽環(huán)類(lèi)已經(jīng)結(jié)合到許多以聚合物基質(zhì)為基礎(chǔ)的釋放系統(tǒng)中，例如聚丙交酯類(lèi)或聚乙交酯類(lèi)微球以及交聯(lián)纖維蛋白原和白蛋白微球。Juni,K.等人(Chem.Pharm.Bull.(1985),33(1),313-318)描述了將阿霉素結(jié)合到聚乳酸微球中以及使該組合物動(dòng)脈內(nèi)釋放至狗的肝臟。該組合物栓塞了肝臟的外周動(dòng)脈。這些類(lèi)型的微球比較堅(jiān)硬，不易存儲(chǔ)和釋放。已經(jīng)將阿霉素共價(jià)連接到交聯(lián)聚乙烯醇表面并且檢測(cè)了它的細(xì)胞毒特性(Wingard，L B et al.Cancer Research(1985)45(8)3529-3536)。由于藥物被共價(jià)結(jié)合到聚合物上，在釋放之前必須從表面上切下，因此在生理?xiàng)l件下可能無(wú)法釋放。

Jones，C.等人(Brit.J.Cancer(1989)59(5))描述了將阿霉素結(jié)合到離子交換微球上及用該組合物對(duì)大鼠腫瘤模型進(jìn)行化學(xué)栓塞治療。

本發(fā)明的一種新的適用于栓塞的組合物包含具有一種遇水可膨脹但不溶于水的聚合物基質(zhì)和一種吸收在該基質(zhì)中的水溶性治療劑的粒子，其特征在于：該聚合物在pH6－8范圍內(nèi)總體帶有負(fù)電荷，當(dāng)粒子在水中膨脹達(dá)到平衡時(shí)，其粒子大小在40－1500μm之間，治療劑為帶有至少一個(gè)氨基的蒽環(huán)類(lèi)化合物。

本發(fā)明中的聚合物必須是遇水可膨脹但不溶于水的。因此，在水性液體存在下，聚合物會(huì)形成水凝膠。一般而言該聚合物是共價(jià)交聯(lián)的，但該聚合物至少部分離子交聯(lián)也是合適的。該聚合物可以通過(guò)烯鍵不飽和單體在雙官能或更高官能度的交聯(lián)單體存在下進(jìn)行聚合而制成，烯鍵不飽和單體包括陰離子單體?？梢允褂眉谆┧崃u乙酯、丙烯酸和交聯(lián)單體如乙二醇二甲基丙烯酸酯或亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物，如用于基于etafilcon A的隱形眼鏡的共聚物。

另一類(lèi)可以用于形成遇水可膨脹但不溶于水的基質(zhì)的聚合物是用醛類(lèi)交聯(lián)劑如戊二醛交聯(lián)的聚乙烯醇。對(duì)于這種產(chǎn)物，聚乙烯醇必須是陰離子型的，例如通過(guò)使含有酸性官能團(tuán)的單體與羥基反應(yīng)提供陰離子側(cè)鏈基團(tuán)。合適的試劑的例子有二酸，如二羧酸。

如果聚合物基質(zhì)由每個(gè)分子都含有不止一個(gè)烯鍵不飽和側(cè)鏈基團(tuán)的聚乙烯醇大分子單體，通過(guò)與包括一種酸性單體的烯鍵不飽和單體共聚合而制成，則本發(fā)明具有特殊的價(jià)值。PVA大分子單體可以通過(guò)例如提供具有合適的分子量如1000-500,000D之間，優(yōu)選在10,000-100,000D之間，帶有乙烯或丙烯酸側(cè)鏈基團(tuán)的PVA聚合物來(lái)制成。丙烯酸側(cè)鏈基團(tuán)可以由例如丙烯酸或甲基丙烯酸與PVA通過(guò)某些羥基發(fā)生反應(yīng)生成酯鍵來(lái)形成。能夠使乙烯基團(tuán)聚合到聚乙烯醇上的方法在例如US 4,978,713，優(yōu)選US 5,508,317和5,583,163中有所敘述。例如，優(yōu)選的大分子單體包含一個(gè)聚乙烯醇的骨架，該骨架通過(guò)一個(gè)環(huán)狀縮醛鍵與一個(gè)(烷基)丙烯酰胺烷基部分連接。實(shí)施例1描述了這樣一種大分子單體的合成。優(yōu)選每個(gè)分子具有約2-20個(gè)(例如5-10個(gè))烯基側(cè)鏈基團(tuán)的PVA大分子單體，。

當(dāng)PVA大分子單體與包括一種酸性單體的烯鍵不飽和單體共聚合時(shí)，所述酸性單體優(yōu)選具有通式I

Y¹BQ

其中Y¹選自：

CH₂＝C(R)-CH₂-O-，CH₂＝C(R)-CH₂OC(O)-，CH₂＝C(R)OC(O)-，CH₂＝C(R)-O-，CH₂＝C(R)CH₂OC(O)N(R¹)-，R²OOCCR＝CRC(O)-O-，RCH＝CHC(O)O-，RCH＝C(COOR²)CH₂-C(O)-O-，

其中：

R是氫或者C₁-C₄烷基；

R¹是氫或者C₁-C₄烷基；

R²是氫或者C_1-4烷基或者BQ，其中B和Q定義如下；

A是-O-或者-NR¹-；

K¹是基團(tuán)-(CH₂)_rOC(O)-、-(CH₂)_rC(O)O-、-(CH₂)_rOC(O)O-、-(CH₂)_rNR³-、-(CH₂)_rNR³C(O)-、-(CH₂)_rC(O)NR³-、-(CH₂)_rNR³C(O)O-、-(CH₂)_rOC(O)NR³-、-(CH₂)_rNR³C(O)NR³-(其中基團(tuán)R³相同或不同)、-(CH₂)_rO-、-(CH₂)_rSO₃-、或任選與B¹結(jié)合而形成一個(gè)價(jià)鍵，r為1到12，R³是氫或C₁-C₄烷基；

B是直鏈或支鏈烷二基、氧亞烷基、烷二基氧烷二基或烷二基低聚(氧烷二基)鏈，該鏈任選包含一個(gè)或多個(gè)氟原子，直到形成并且包括全氟取代鏈；或者，如果Q或Y¹包含一個(gè)與B鍵接的末端碳原子，是一個(gè)價(jià)鍵；

Q是一個(gè)陰離子基團(tuán)。

所述陰離子基團(tuán)可以是諸如羧酸鹽、碳酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、膦酸鹽或磷酸鹽基團(tuán)，優(yōu)選磺酸鹽基團(tuán)。單體可以以游離酸或者鹽的形式聚合。優(yōu)選共軛酸的pK_a值小于5。

在通式I的單體中，Y¹優(yōu)選為CH₂＝CRCOA-基團(tuán)，其中R是H或甲基，優(yōu)選甲基，A優(yōu)選為NH。B優(yōu)選為1－12個(gè)碳原子，優(yōu)選2－6個(gè)碳原子的烷二基。

一種特別優(yōu)選的單體類(lèi)型是(烷基)丙烯酰胺基烷基磺酸，如2－丙烯酰胺基－2－甲基－1－丙磺酸(AMPS)。

在烯鍵不飽和單體中可以包含稀釋單體，例如非離子單體。這種單體可能有利于控制酸性基團(tuán)的pK_a，控制產(chǎn)物的親水性或疏水性，在聚合物中提供疏水區(qū)，或者僅起惰性稀釋劑的作用。非離子稀釋單體的例子有(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺，尤其是含有1-12個(gè)碳原子的烷基的這類(lèi)化合物；羥基和二羥基取代的(烷基)丙烯酸烷基酯和(烷基)丙烯酰胺；乙烯基內(nèi)酰胺；苯乙烯及其他芳香單體。

烯鍵不飽和單體還可以包括兩性離子單體，例如為了增加粒子的親水性、潤(rùn)滑性、生物相容性和/或血相容性。合適的兩性離子單體在我們先前公開(kāi)的WO-A-9207885、WO-A-9416748、WO-A-9416749和WO-A-9520407中有所敘述。兩性離子單體優(yōu)選為2-甲基丙烯酰氧基-2’-三甲胺乙基磷酸內(nèi)鹽(MPC)。

在聚合物基質(zhì)中，陰離子水平優(yōu)選在0.1-10meq g^-1的范圍，優(yōu)選至少為1.0meq g^-1。

在PVA大分子單體與其他烯鍵不飽和單體共聚合時(shí)，PVA大分子單體與其他單體的重量比優(yōu)選在50：1到1：5范圍內(nèi)，更優(yōu)選在20：1到1：2范圍內(nèi)。在烯鍵不飽和單體中，陰離子單體的含量?jī)?yōu)選在10－100摩爾％范圍，優(yōu)選至少25摩爾％。

通過(guò)重量分析測(cè)定，遇水可膨脹但不溶于水的聚合物優(yōu)選具有40－99％(重量)的平衡水含量，優(yōu)選75－95％。

聚合物可以通過(guò)幾種方法形成粒子。例如，交聯(lián)的聚合物可以制成整塊材料如薄片或塊狀，然后粉碎成所需的尺寸。另外，交聯(lián)聚合物也可以本身就制成粒子形式，例如在連續(xù)的不互溶載體的分散相中以單體的小滴進(jìn)行聚合。已知的例子如合適的油包水聚合能夠產(chǎn)生膨脹時(shí)具有預(yù)期大小的粒子。例如，US 4,224,427描述了在存在懸浮劑的情況下，通過(guò)將水溶性單體分散到連續(xù)的溶劑相中，形成最大直徑為5mm的大小一致的球狀珠的方法?？梢约尤敕€(wěn)定劑和表面活性劑以控制分散相粒子的大小。聚合后，交聯(lián)的微球用已知方法回收，清洗并任選消毒。粒子例如微球優(yōu)選在水性液體中膨脹并根據(jù)它們的大小進(jìn)行分級(jí)。

本發(fā)明所使用的治療活性物質(zhì)是一種蒽環(huán)類(lèi)化合物，它包括連接有一個(gè)氨基糖的蒽醌基團(tuán)。據(jù)認(rèn)為，糖上的氨基與聚合物基質(zhì)中的陰離子基團(tuán)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)高水平的載藥量和給藥后的受控釋放。

合適的蒽環(huán)類(lèi)化合物的例子具有通式Ⅱ

我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)各種腫瘤的有效性已經(jīng)得到全面測(cè)試的阿霉素具有特別有趣的載藥和釋放特性。該藥物似乎對(duì)聚乙烯醇-接枝-丙烯酰胺基丙磺酸共聚物有特殊的親和力，因此高水平的阿霉素能夠結(jié)合到該聚合物中并在多日內(nèi)釋放。

在本發(fā)明中，藥物非共價(jià)結(jié)合到聚合物基質(zhì)上是很重要的。

治療活性物質(zhì)可以通過(guò)多種方法結(jié)合到聚合物基質(zhì)中。在一種方法中，在聚合或交聯(lián)之前治療活性物質(zhì)可以與一種聚合物前體混合，例如一種單體或大分子單體混合物或者一種可交聯(lián)的聚合物和交聯(lián)劑的混合物。另外，活性物質(zhì)也可以在聚合物交聯(lián)后再加載到其中。例如，微粒狀干燥聚合物可以在治療活性物質(zhì)的溶液(優(yōu)選水溶液)中膨脹，隨后任選除去未吸收的藥物并/或蒸發(fā)溶劑?；钚晕镔|(zhì)溶于諸如乙醇等有機(jī)溶劑(或更優(yōu)選的是水)的溶液，可以噴射到粒子的移動(dòng)床上，藉此藥物在除去溶劑的同時(shí)被吸收到粒子本體內(nèi)。最為方便的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以?xún)H僅將懸浮于連續(xù)液體介質(zhì)如水中的膨脹粒子與藥物溶液長(zhǎng)時(shí)間接觸，由此藥物被吸收到粒子本體內(nèi)。據(jù)認(rèn)為，這類(lèi)似于陽(yáng)離子交換型過(guò)程。隨后可以將膨脹介質(zhì)除去，或者方便地將膨脹介質(zhì)和粒子一起作為產(chǎn)物的一部分保留下來(lái)，以后用作為栓塞劑。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，膨脹粒子通過(guò)簡(jiǎn)單的凝膠/液體分離技術(shù)與未被基質(zhì)吸收的膨脹介質(zhì)分離，例如經(jīng)孔徑合適的濾器(方便的是玻璃濾器)過(guò)濾。帶有很少或沒(méi)有粒子外液體的膨脹粒子漿可被泵入合適的貯存容器中以消毒和以原樣保存。發(fā)現(xiàn)該粒子漿足夠穩(wěn)定，因?yàn)樵谶@種形式的儲(chǔ)存過(guò)程中很少有液體滲出，也沒(méi)有藥物損失。

另外，粒子的懸浮液也可以通過(guò)過(guò)濾來(lái)除去任何殘留的載藥溶液，粒子可以通過(guò)用于干燥藥物產(chǎn)品的任何經(jīng)典方法來(lái)干燥。這包括但不局限于室溫或高溫、或減壓或真空下的空氣干燥；經(jīng)典的冷凍干燥；常壓冷凍干燥；超臨界流體的溶液強(qiáng)化分散(SEDS)。另外，載藥的微球可以用有機(jī)溶劑取代水通過(guò)一系列步驟而脫水，接著使更易揮發(fā)的有機(jī)溶劑蒸發(fā)。有機(jī)溶劑應(yīng)當(dāng)選擇不能溶解藥物的溶劑。

簡(jiǎn)言之，一個(gè)典型的經(jīng)典冷凍干燥過(guò)程可以如下進(jìn)行：將一份樣品分裝到一些被部分塞住的玻璃小瓶中，將小瓶放置在冷凍干燥器中冷卻的控溫架上。降低控溫架的溫度，使樣品凍結(jié)至均勻的確定溫度。冷凍完成以后，降低干燥器中的壓力至確定的壓力以啟動(dòng)初級(jí)干燥。在初級(jí)干燥過(guò)程中，水蒸氣通過(guò)升華從凍結(jié)塊中被逐步除去，同時(shí)控溫架的溫度被控制在恒定的低溫。二級(jí)干燥通過(guò)提高控溫架溫度并進(jìn)一步降低室壓來(lái)啟動(dòng)，因此吸收在半干燥塊中的水可以被除去直到殘余的水分減少到希望的水平。小瓶可以在原位密封，如果需要可在保護(hù)氣氛下密封。

常壓冷凍干燥法是通過(guò)在冷凍產(chǎn)物上進(jìn)行非常干燥的空氣的快速循環(huán)來(lái)完成的。與經(jīng)典的冷凍干燥方法相比，非真空冷凍干燥具有許多優(yōu)點(diǎn)。循環(huán)的干燥氣體改善了熱量和物質(zhì)從冷凍樣品的轉(zhuǎn)移，這與洗滌物在有風(fēng)的天氣中干得更快是相同的。這個(gè)領(lǐng)域的大多數(shù)工作都與食品生產(chǎn)有關(guān)，已經(jīng)觀察到揮發(fā)性芳香化合物的保留量有所增加，其對(duì)生物制品干燥的潛在益處尚不確定。特別引人注意的是，使用常壓噴霧干燥方法得到的是自由流動(dòng)的細(xì)粉末而不是塊狀物。可以獲得具有亞微米級(jí)直徑的粒子，這比通常由磨制得到的粒子小十倍。微粒的本質(zhì)以及它的大表面積導(dǎo)致產(chǎn)生易于再水合的產(chǎn)物，目前還不可能對(duì)可吸入和經(jīng)皮膚應(yīng)用所需的粒子大小進(jìn)行精細(xì)的控制，但是這個(gè)領(lǐng)域仍存在潛力。

對(duì)于患有實(shí)體瘤如肝細(xì)胞腫瘤并需要進(jìn)行栓塞治療的患者給予的組合物是含有吸收藥物的膨脹粒子的水懸浮液。通常希望懸浮液在釋放之前與成像劑如用于凝膠型栓塞組合物的常規(guī)造影劑混合。例如，含有吸收藥物的膨脹粒子的水懸浮液可以在臨給藥之前與通常與栓塞劑一起使用的液體造影劑如碘油按體積比2:1到1:2的量(優(yōu)選約1:1)混合。對(duì)于本發(fā)明中含有吸收藥物但極少或不含有粒子外液體的膨脹粒子漿的實(shí)施方案，粒子漿和造影劑可以類(lèi)似地在臨釋放前混合在一起，例如按體積比在1:5到2:1范圍，優(yōu)選在1:2到1:1范圍的量混合。當(dāng)含有藥物的組合物以干燥的形式供給使用時(shí)，可將干燥的粒子加入造影劑中，或者優(yōu)選先在水性介質(zhì)如生理鹽水中膨脹以形成漿液或懸浮液，然后在釋放之前與造影劑混合。另外，除蒽環(huán)化合物外，粒子還可以預(yù)先裝載造影劑。給藥的組合物也可以與其他治療劑相混合，或者也可以與其他治療劑分開(kāi)聯(lián)合給藥。通常，組合物用常規(guī)的釋放裝置如動(dòng)脈內(nèi)導(dǎo)管從注射器針筒中給藥。

給予需要栓塞治療的患者的栓塞組合物可以以一次性單劑量釋放。栓塞過(guò)程采用常規(guī)技術(shù)通過(guò)跟蹤造影劑來(lái)監(jiān)控?？赡軙?huì)發(fā)現(xiàn)，最好在第一次劑量給予一段時(shí)間后，如在第一次用含有阿霉素的組合物治療4－10周后，釋放二次劑量的栓塞組合物，以栓塞新形成的向腫瘤供血的血管，優(yōu)選二次劑量的栓塞組合物，優(yōu)選可用于本發(fā)明的化學(xué)栓塞組合物。組合物以每次治療25－100mg/m²范圍的藥物劑量給藥，但也可以在經(jīng)過(guò)充分的安全性評(píng)估后使用更高的劑量。阿霉素每次治療的優(yōu)選劑量可大于50mg/m²，例如達(dá)到100mg/m²或更高。通常認(rèn)為每個(gè)患者每次治療給予高于150mg的劑量是不可取的。

作為本發(fā)明的第二方面，提供了一種蒽環(huán)化合物在制備用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行栓塞治療的組合物中的用途，在此治療中，蒽環(huán)化合物從一種聚合物基質(zhì)中釋放，所述聚合物基質(zhì)是由每個(gè)分子帶有至少兩個(gè)烯鍵不飽和側(cè)鏈基團(tuán)的聚乙烯醇大分子單體和烯鍵不飽和陰離子單體共聚合形成的。

在本發(fā)明的這個(gè)方面，聚合物基質(zhì)可以在原位形成。這樣，含有大分子單體、陰離子單體和蒽環(huán)化合物的液體組合物可以被釋放到患者的血液循環(huán)中并被置于能夠在靶部位引發(fā)聚合的條件下，由此形成栓塞凝膠。另外，聚合物基質(zhì)也可以在給藥前預(yù)先形成，如本發(fā)明的第一方面所述。

PVA大分子單體和陰離子單體優(yōu)選如以上第一方面所述。其他單體也可以如本發(fā)明第一方面所述進(jìn)行共聚合。

附圖說(shuō)明：

圖1示出了低AMPS和高AMPS微球?qū)Π⒚顾氐妮d藥量。

圖2示出了阿霉素的濃度對(duì)高AMPS微球載藥過(guò)程的影響。

圖3示出了微球大小范圍對(duì)阿霉素載藥過(guò)程的影響。

圖4示出了阿霉素加載到高AMPS微球中的重現(xiàn)性。

圖5示出了阿霉素從高AMPS微球中的體外洗脫。

圖6示出了高AMPS微球?qū)Π⒚顾氐奈铡?/p>

圖7示出了目標(biāo)劑量和實(shí)際劑量的圖。

圖8示出了不同阿霉素溶液的載藥量。

圖9示出了不同蒽環(huán)類(lèi)在微球中的載藥量。

圖10示出了蒽環(huán)類(lèi)在2小時(shí)內(nèi)的洗脫。

圖11示出了蒽環(huán)類(lèi)在72小時(shí)內(nèi)的洗脫。

圖12示出了蒽環(huán)類(lèi)對(duì)微球大小的影響。

圖13示出了阿霉素在不同微球(900-1200微米)中的載藥量。

圖14示出了載藥對(duì)大小分布的影響(100-300μm微球)。

圖15示出了微球大小對(duì)阿霉素洗脫的影響。

圖16示出了阿霉素從血漿中和PBS中的微球中的洗脫。

圖17示出了不同藥物劑量和微球大小的失重。

圖18示出了阿霉素在100小時(shí)內(nèi)的洗脫。

圖19示出了處理過(guò)程對(duì)微球大小范圍的影響。

圖20示出了從阿霉素洗脫微球(DEB)中釋放的阿霉素與動(dòng)脈內(nèi)注射阿霉素(IA)在腫瘤中以及外周肝組織中阿霉素水平的藥物代謝動(dòng)力學(xué)比較。

圖21示出了動(dòng)脈注射阿霉素與阿霉素載藥微球的血漿阿霉素和阿霉素醇水平的藥物代謝動(dòng)力學(xué)比較。

圖22示出了使用阿霉素洗脫微球(DEB)進(jìn)行栓塞后腫瘤組織隨時(shí)間壞死。

本發(fā)明由以下實(shí)施例具體說(shuō)明，其結(jié)果如下圖所示：

圖1顯示實(shí)施例2的結(jié)果；

圖2顯示實(shí)施例3的結(jié)果；

圖3顯示實(shí)施例4的結(jié)果；

圖4顯示實(shí)施例5的結(jié)果；

圖5顯示實(shí)施例6的結(jié)果；

圖6a和b顯示實(shí)施例7的結(jié)果。

實(shí)施例1：微球制備方法概述

Nelfilcon B大分子單體合成：

微球合成的第一個(gè)階段包括制備N(xiāo)elfilcon B,它是一種來(lái)自廣泛使用的水溶性聚合物PVA的可聚合性大分子單體。將Mowiol 8－88聚乙烯醇(PVA)粉末(88％水解，含12％醋酸鹽，平均分子量約67,000D)(150g)(Clariant，Charlotte，NC USA)加入到一個(gè)2升的玻璃反應(yīng)容器內(nèi)。輕輕地?cái)嚢柘录尤?000ml水并將攪拌速度提高到400rpm。為了確保PVA完全溶解，將溫度提高到99±9℃保持2－3小時(shí)。在冷卻到室溫后，將N-丙烯酰胺基乙醛(NAAADA)(Ciba Vision，德國(guó))(2.49g或0.104mmol/g的PVA)混合到PVA溶液中，隨后加入濃鹽酸(100ml)，以催化NAAADA通過(guò)酯交換作用與PVA的加成。反應(yīng)在室溫進(jìn)行6－7小時(shí)，然后使用2.5M的氫氧化鈉溶液中和至pH7.4來(lái)終止反應(yīng)。所生成的氯化鈉和所有未反應(yīng)的NAAADA用透析過(guò)濾法除去(步驟2)。

大分子單體的透析過(guò)濾：

透析過(guò)濾(切向流過(guò)濾)的原理是使需要純化的進(jìn)料溶液(在本例中為Nelfilcon B溶液)跨過(guò)濾膜表面連續(xù)循環(huán)，濾膜能使不需要的物質(zhì)(NaCl、NAAADA)透過(guò)成為廢棄物，同時(shí)具有足夠小的孔徑可以阻止保留液通過(guò)而使其留在循環(huán)中。

Nelfilcon B透析過(guò)濾使用不銹鋼P(yáng)ellicon 2小型支架進(jìn)行，該支架上堆放有若干其孔徑的截留分子量為3000的0.1m²纖維素濾膜(Millipore Corporation，Bedford，MA美國(guó))。Mowiol 8－88的重均分子量為67000，因此透過(guò)濾膜的能力有限。

向裝有大分子單體的燒瓶中放入磁性攪拌棒并將燒瓶放置在攪拌板上。使用LS24Ⅵ型導(dǎo)管，經(jīng)安裝有Easy LoadⅡ泵頭的Masterflex LS蠕動(dòng)泵將溶液加入到透析過(guò)濾組件中。Nelfilcon以大約50磅/平方英寸在濾膜上循環(huán)以加速滲透。當(dāng)溶液被濃縮到約1000ml時(shí)，以與廢棄的濾出液收集速度相同的速度加入水以保持體積恒定，直到額外加入6000ml水。完成后立即在25℃下將溶液濃縮至20-23％固體，粘度為1700-3400厘泊。Nelfilcon通過(guò)GFC、NMR和粘度來(lái)定性鑒定。

微球合成：

用懸浮聚合法合成微球，其中將水相(Nelfilcon B)加入到與其不互溶的有機(jī)相(乙酸丁酯)中。采用快速混合能夠使水相分散形成液滴，液滴的大小和穩(wěn)定性受諸如攪拌速度、粘度、水相和有機(jī)相的比例以及影響兩相之間界面能的穩(wěn)定劑和表面活性劑的使用等因素的控制。制造了兩個(gè)系列的微球，即較低AMPS系列和較高AMPS系列，它們的組成如下所示。

A高AMPS:

水相：約21％w/w Nelfilcon B溶液(約400±50g)

約50％w/w 2－丙烯酰胺基－2－甲基丙磺酸鈉鹽(140±10g)

純化水(137±30g)

過(guò)硫酸鉀(5.22±0.1g)

四甲基乙二胺TMEDA(6.4±0.1ml)

有機(jī)相：乙酸正丁酯(2.7±0.3L)

乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纖維素(46±0.5g)(穩(wěn)定劑)

純化水(19.0±0.5ml)

B低AMPS:

水相：約21％w/w Nelfilcon B溶液(約900±100g)

約50％w/w 2－丙烯酰胺基－2－甲基丙磺酸鈉鹽(30.6±6g)

純化水(426±80g)

過(guò)硫酸鉀(20.88±0.2g)

TMEDA(25.6±0.5ml)

有機(jī)相：乙酸正丁酯(2.2±0.3L)

乙酸乙酯中的10％w/w乙酸丁酸纖維素(CAB)(92±1.0g)

純化水(16.7±0.5ml)

用計(jì)算機(jī)控制的具有連續(xù)檢測(cè)反應(yīng)溫度的反饋傳感器的熱浴(Julabo PN 9-300-650)加熱帶夾層的4000ml反應(yīng)器。

25℃下將乙酸丁酯加入反應(yīng)器中，然后加入CAB溶液和水。系統(tǒng)用氮?dú)獯祾?5分鐘，然后加入PVA大分子單體。加入TMEDA并在氮?dú)庀聦囟壬?5℃保持3小時(shí)，引發(fā)分散的PVA溶液的交聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)通過(guò)氧化還原引發(fā)的聚合反應(yīng)來(lái)進(jìn)行，即，TMEDA的氨基與過(guò)硫酸鉀中的過(guò)氧化基團(tuán)反應(yīng)生成自由基。然后這些自由基引發(fā)PVA和AMPS上的雙鍵的聚合和交聯(lián)，從而將分散的PVA-AMPS小滴轉(zhuǎn)化成不溶性的聚合物微球。冷卻到25℃后，產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到過(guò)濾反應(yīng)器上進(jìn)行純化，其中過(guò)濾除去乙酸丁酯，然后進(jìn)行以下步驟：

·用2×300ml乙酸乙酯清洗以除去乙酸丁酯和CAB

·在乙酸乙酯中平衡30分鐘，然后過(guò)濾

·用2×300ml乙酸乙酯在真空過(guò)濾下清洗

·在丙酮中平衡30分鐘并過(guò)濾除去乙酸乙酯、CAB和水

·用2×300ml丙酮在真空過(guò)濾下清洗

·在丙酮中平衡過(guò)夜

·用2×300ml丙酮在真空下清洗

·55℃下真空干燥2小時(shí)以除去殘余溶劑

染色：

這一步是任選的，但是通常當(dāng)藥物與有色活性物一起加載時(shí)這一步是不必要的(因?yàn)樵撚猩钚晕锉旧砭涂商峁╊伾?。當(dāng)水合時(shí)，微球含有約90％(w/w)的水，很難觀察。為了便于在臨床環(huán)境中進(jìn)行觀察，微球用活性藍(lán)4號(hào)染料(RB4)染成藍(lán)色。RB4是一種水溶性氯三嗪染料，它在堿性條件下能與PVA骨架上的羥基側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)生成共價(jià)醚鍵。反應(yīng)在pH12(NaOH)下進(jìn)行，因此所生成的HCl會(huì)被中和而生成NaCl。

在染色之前，微球被完全重新水合并以35g為一份分成多份(分別處理)。染色液如下制備：將0.8g RB4溶于2.5M NaOH溶液(25ml)和水(15ml)中，然后將其加入到2升80g/l鹽溶液中的微球中。混合20分鐘后，用32μm篩收集產(chǎn)物并漂洗除去未反應(yīng)的染料塊。

提?。?/p>

采用一種粗提取方法來(lái)除去所有未結(jié)合的或非特異性吸附的RB4。所用的方案如下所示：

·在2升水中平衡5分鐘。在篩上收集并漂洗。重復(fù)5次。

·在2升80mM磷酸氫二鈉在0.29％(w/w)鹽溶液中的溶液中平衡。加熱至沸騰30分鐘。冷卻，在篩上收集并用1升鹽溶液洗滌。再重復(fù)2次。

·收集，在篩上洗滌，并在2升水中平衡10分鐘。

·收集并于1升丙酮中脫水30分鐘。

·合并所有各份微球并在2升丙酮中平衡過(guò)夜。

篩分：

所制得的微球產(chǎn)品大小范圍在100－1200微米，必須使用一定范圍篩孔大小進(jìn)行篩分從而使其分級(jí)，獲得下列的額定分布。

1.100－300μm

2.300－500μm

3.500－700μm

4.700－900μm

5.900－1200μm

在篩分之前，將微球真空干燥以除盡溶劑，然后于60℃在水中平衡以完全重新水合。使用帶有15英寸不銹鋼篩分盤(pán)、篩孔大小在32－1000μm范圍的316升不銹鋼渦旋篩裝置(vortisieve unit)(MM Industries，Salem Ohio)對(duì)微球進(jìn)行篩分。使過(guò)濾后的鹽溶液通過(guò)該裝置再循環(huán)以幫助分級(jí)。棄去32微米篩中收集的微球。

實(shí)施例2：阿霉素的加載

本實(shí)驗(yàn)使用如實(shí)施例1制備的低AMPS微球。對(duì)所使用的每一種大小的微球，取0.5ml轉(zhuǎn)移至2個(gè)1ml注射器中，一個(gè)用于吸收藥物，另一個(gè)用作對(duì)照。實(shí)驗(yàn)所選用的大小為106－300μm、300－500μm、500－710μm和850－1000μm。為了驗(yàn)證操作的可靠性，再另外準(zhǔn)備3個(gè)裝500－710μm微球的注射器。將11個(gè)10ml小玻璃瓶用箔包好，以防止在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中阿霉素被光降解。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用80ml濃度為20mg/ml的藥物溶液制備下列濃度并測(cè)定其光吸收(483nm)：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml和3.125μg/ml。將所得到的光吸收繪制成曲線圖，用曲線方程計(jì)算實(shí)驗(yàn)中被微球吸收的藥物濃度。在加入微球時(shí)在4個(gè)小玻璃瓶中裝入5ml蒸餾水(ROMIL)用作對(duì)照。剩下的7個(gè)小玻璃瓶中加入5ml所需濃度的藥物溶液。起始光吸收及其對(duì)應(yīng)的溶液濃度在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)就已經(jīng)得知。(為了測(cè)定20mg/ml溶液的光吸收，必須將其稀釋200倍而使用100μg/ml的濃度。這種1：200的稀釋液在測(cè)定微球?qū)θ芤旱奈盏恼麄€(gè)過(guò)程中都一直采用。)從第一批微球加入到第一個(gè)裝有藥物的小玻璃瓶中時(shí)就立即開(kāi)始用計(jì)時(shí)表計(jì)時(shí)，微球按從最小到最大的順序加入其余6個(gè)小玻璃瓶的每個(gè)瓶中。小玻璃瓶用蓋子密封后，立即將其放到旋轉(zhuǎn)混合器上。對(duì)照組樣品重復(fù)同樣的操作。以和設(shè)立小玻璃瓶相同的順序在0.167小時(shí)(10分鐘)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、24小時(shí)和96小時(shí)的時(shí)間間隔測(cè)定光吸收。從這些數(shù)據(jù)可以計(jì)算出每1ml微球的藥物量(mg數(shù))和每1ml微球的藥物吸收百分率。結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3：藥物濃度對(duì)加載的影響

依照實(shí)施例2所概述的方法，可以將一定范圍不同濃度的阿霉素加載到高AMPS微球制品上。據(jù)觀察，大部分藥物在幾小時(shí)內(nèi)加載到微球(500－710μm大小范圍)上(見(jiàn)圖2)。可以觀察到加載量按重量計(jì)遠(yuǎn)高于低AMPS制品。

實(shí)施例4：微球大小對(duì)加載的影響

在幾個(gè)不同大小范圍的微球上進(jìn)行阿霉素的加載以便比較藥物吸收量。盡管觀察到較小的微球加載藥物較快，24小時(shí)內(nèi)連續(xù)加載的結(jié)果表明，等重的微球達(dá)到平衡后的載藥量也大致相同。較快的吸收是由于較小微球的表面積增大(見(jiàn)圖3)。

實(shí)施例5：加載的重現(xiàn)性

為了測(cè)定阿霉素加載的重現(xiàn)性，將實(shí)施例2中概述的加載實(shí)驗(yàn)重復(fù)多次。500－710μm大小范圍的高AMPS微球用20mg/ml藥物水溶液加載藥物，并監(jiān)測(cè)藥物隨時(shí)間的吸收(圖4)。

實(shí)施例6：阿霉素從微球中的洗脫

高AMPS微球用不同濃度的阿霉素加載并將微球洗脫至250ml蒸餾水中(圖5)。

從133.2μg/ml和2mg/ml載藥微球上洗脫的藥物在3小時(shí)時(shí)仍低于檢測(cè)限。對(duì)于較高的載藥量，在最初的幾分鐘內(nèi)有明顯的突釋效應(yīng)(burst effect)，隨后是較緩慢的延時(shí)釋放。據(jù)推測(cè)，突釋反映了從微球內(nèi)攜帶的水中洗脫出的游離藥物，而延時(shí)洗脫是由主要通過(guò)帶電基團(tuán)間的離子相互作用“結(jié)合”到微球上的藥物造成的。就最高載藥量(來(lái)自20mg/ml加載溶液)而言，突釋效應(yīng)代表了微球總載藥量的約45％，其余部分從載體上完全洗脫需要數(shù)天。研究表明，最終100％的藥物都能從微球上洗脫。

實(shí)施例7：高AMPS微球?qū)Π⒚顾匚兆饔玫挠^察

將1ml阿霉素在磷酸鹽緩沖液PBS中的溶液(66.6μg/ml)和3ml PBS加入裝有約0.5g大小在850－1000μm范圍(手工篩分)的高AMPS微球的小瓶中。將微球放在CCD照相機(jī)下，每隔2分鐘拍照一次，持續(xù)2.5小時(shí)。在此時(shí)間段內(nèi)樣品未出現(xiàn)攪動(dòng)，但觀察到由于光源的局部加熱所致的小量運(yùn)動(dòng)。因此最初和最后的微球是相同的，在整個(gè)時(shí)間段中都是可比的。借助微球中紅色的增強(qiáng)和周?chē)芤旱臏p少而觀察到藥物的吸收(圖6)。

實(shí)施例8：干燥的載藥微球的制備

微球可以按照實(shí)施例2所述的方法加載阿霉素。微球使用如下方法脫水：將待脫水的微球放在塑料容器內(nèi)，并用在PBS(Inverclyde Biologicals)中制備的10％丙酮(ROMIL)溶液覆蓋。微球在溶液中放置10分鐘，在這個(gè)過(guò)程中攪拌幾次，每次30秒。然后將溶液傾倒出來(lái)，將這個(gè)過(guò)程再重復(fù)兩次。增加丙酮濃度至25％、50％、75％和最終100％，重復(fù)該步驟。在最終100％脫水步驟后，倒出丙酮并將微球放在50℃烤箱中干燥至恒重。

得到的干燥產(chǎn)物在栓塞操作前可以重新懸浮/重新水合于鹽水/造影劑中。水合速度很快，膨脹至＞80％完全水合時(shí)的體積只需幾分鐘。

實(shí)施例9：微球漿的制備

使按上面實(shí)施例1生產(chǎn)的高AMPS微球在20mg/ml阿霉素水溶液中膨脹30分鐘。在此之后觀察到粒子外液體已基本脫色，顏色(紅色)已基本被局限在微球內(nèi)。懸浮液經(jīng)燒結(jié)的玻璃漏斗過(guò)濾除去上清液。微球在輕微的負(fù)壓下，在過(guò)濾器上用兩倍體積的蒸餾水洗滌。然后將微球轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，并用蠕動(dòng)泵將其從廣口瓶泵入玻璃注射器中。移走泵后用注射器塞將注射器封閉并用伽馬射線滅菌。

實(shí)施例10：加載－目標(biāo)載藥劑量和實(shí)際載藥劑量

在水中制備濃度為22－80mg/ml的一系列阿霉素溶液。取1ml這些溶液加入1ml高AMPS微球中，紫外檢測(cè)藥物吸收。樣品在滾動(dòng)混勻器上攪動(dòng)。取10、20、30、60分鐘時(shí)間點(diǎn)，其后是2小時(shí)，再后是24小時(shí)。由溶液中剩余的阿霉素計(jì)算吸收量。微球可以用最高至每ml水合微球80mg的不同劑量加載，在不到30分鐘內(nèi)，99％的藥物溶液都已處于微球內(nèi)。

實(shí)施例11：高劑量阿霉素

在實(shí)施例10中制備了80mg/ml的阿霉素溶液。這是一種粘稠的膠狀混合物，不適于日常使用。重復(fù)該高劑量，但使用4ml 20mg/ml的阿霉素溶液。紫外檢測(cè)藥物吸收，又獲得了1ml水合的高AMPS微球中載有80mg藥物的最終載藥量。

實(shí)施例12：加載－藥物來(lái)源

使用三種來(lái)源的阿霉素制備本發(fā)明中25mg/ml載藥量的微球。

·Adriamycin^TM PFS是一種市售(Pharmacia and Upjohn)的濃度為2mg/ml的溶液。

·Adriamycin^TM RDF是一種市售(Pharmacia and Upjohn)的加入了乳糖以助溶的粉劑。

·阿霉素EP。

對(duì)Adriamycin RDF和阿霉素EP溶液，取2ml加入2ml微球中，紫外檢測(cè)藥物吸收。對(duì)Adriamycin PFS溶液，取50ml 2mg/ml的溶液加入2ml微球中，檢測(cè)藥物吸收。30分鐘后兩個(gè)25mg/ml的溶液均已全部加載，而2mg/ml的溶液被跟蹤了24小時(shí)才顯示完全吸收(圖8)。

實(shí)施例13：其他蒽環(huán)類(lèi)的加載

制備4個(gè)1ml水合的高AMPS微球(900-1200μm)裝入一個(gè)8ml玻璃容器的樣品。用10ml玻璃量筒量取1ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中的微球，并將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)玻璃容器內(nèi)。然后，用巴斯德玻璃吸管移出每個(gè)樣品中的所有PBS。加載溶液如下制備：將1個(gè)小瓶中的20mg柔紅霉素(Beacon Pharmaceuticals)用1ml水(ROMIL)復(fù)原，達(dá)到終濃度20mg/ml。將1個(gè)小瓶中的50mg表柔比星速溶液(Pharmacia)用2.5ml水復(fù)原，達(dá)到終濃度20mg/ml。如前面實(shí)施例所述，制備20mg/ml阿霉素(Dabur Oncology)溶液用于比較。制備后立即測(cè)定溶液在483nm處的紫外吸收，并制備稀釋液以制作每種藥物溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1ml每種加載溶液和1ml水(作為對(duì)照)加入每個(gè)裝有1ml如上所述制備的微球的小瓶中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中小瓶都放置在滾動(dòng)混勻器上。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)(0、10、20、30、45和60分鐘)取出50μl，按需要進(jìn)行稀釋并在483nm處讀數(shù)。由這些讀數(shù)，根據(jù)每種情況下的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的溶液濃度。加載到微球中的藥物量通過(guò)用該裝置提取時(shí)溶液中藥物的減少來(lái)測(cè)定。由這些數(shù)據(jù)計(jì)算每1ml水合微球載藥的mg數(shù)并做圖(圖9)。這表明被測(cè)試的蒽環(huán)類(lèi)均以相同的方式加載。

實(shí)施例14：其他蒽環(huán)類(lèi)的洗脫

用如實(shí)施例13所述載藥的微球確定藥物釋放形式。每種類(lèi)型的載藥微球取1ml轉(zhuǎn)移到裝有100ml PBS的棕色玻璃容器中并開(kāi)始計(jì)時(shí)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中容器置于37℃水浴中。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)(0、0.16、0.5、1、2和72小時(shí))取出1ml溶液，讀數(shù)后放回容器中，這樣使體積保持恒定。樣品在483nm處讀數(shù)，并由實(shí)施例12所確定的各個(gè)蒽環(huán)類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計(jì)算濃度。由這些數(shù)據(jù)計(jì)算每1ml微球中洗脫出的藥物的mg數(shù)并做圖(圖10+11)。這表明所研究的蒽環(huán)類(lèi)從微球上洗脫時(shí)具有相同的洗脫形式。

實(shí)施例15：蒽環(huán)類(lèi)對(duì)微球大小的影響

使用實(shí)施例13所述的微球，用CCD照相機(jī)和顯微鏡所拍攝的微球圖像確定大小分布，然后用Image Pro Plus 4.05辨別其直徑。將加載了不同蒽環(huán)類(lèi)的微球轉(zhuǎn)移到小細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每張圖像拍攝50－1500個(gè)微球。Image Pro Plus 4.05根據(jù)大小范圍辨別100－1500個(gè)微球的直徑。將直徑列表并轉(zhuǎn)換成大小范圍對(duì)出現(xiàn)頻率的柱形圖，將其標(biāo)準(zhǔn)化并用Excel做圖(圖12)。這表明蒽環(huán)類(lèi)對(duì)微球大小具有相同的影響。

實(shí)施例16：其他市售微球的載藥

按照前面實(shí)施例中概述的步驟，將阿霉素加載到本發(fā)明的微球和另一種市售栓塞微球(Embosphere，包覆有膠原包衣的三丙烯酰微球)中，并對(duì)其進(jìn)行比較。顯然，由圖15可見(jiàn)，本發(fā)明的微球具有吸收藥物的能力，而標(biāo)準(zhǔn)的市售產(chǎn)品則沒(méi)有。

實(shí)施例17：載藥－物理效應(yīng)

通過(guò)測(cè)定藥物加載和洗脫后的大小和壓縮及阿霉素載藥微球的釋放能力，評(píng)估阿霉素的加載和洗脫對(duì)高AMPS微球的影響。當(dāng)藥物有效地從水合微球上取代水時(shí)，藥物的加載使整體大小范圍少許下降(圖14)，這同時(shí)伴隨著可壓縮性的少許下降。洗脫后觀察到大小和可壓縮性都未受到持久的影響(如通過(guò)用Instron拉伸試驗(yàn)儀測(cè)定楊氏模量所確定的)。微球通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)管釋放的能力在載藥過(guò)程中保持不變。

實(shí)施例18：洗脫－微球大小的影響

用70mg/ml阿霉素溶液加載本發(fā)明的各種大小的微球。然后將微球放入500ml磷酸鹽緩沖液中，紫外測(cè)定釋放量。體外洗脫圖顯示高至40％加載的阿霉素在洗脫的最初2小時(shí)以突釋的形式釋放，然后剩余的藥物在至少12天時(shí)間內(nèi)洗脫。所有大小范圍的釋放均具有相似的特征，相差在±5％以?xún)?nèi)(圖15)。

實(shí)施例19：洗脫－介質(zhì)的影響

將本發(fā)明的載有25mg/ml阿霉素的微球放置于不同的介質(zhì)中并在60分鐘內(nèi)監(jiān)測(cè)洗脫。在血漿和PBS中顯示在最初的60分鐘內(nèi)釋放緩慢。水中的釋放低于紫外檢測(cè)限。這說(shuō)明藥物的釋放取決于離子的存在，因?yàn)檫@樣才能從帶有陰離子電荷的聚合物基質(zhì)上置換出離子鍵結(jié)合的藥物(圖16)。

實(shí)施例20：阿霉素的穩(wěn)定性

測(cè)定加載和釋放過(guò)程對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響。測(cè)定了阿霉素溶液在不同條件下保存時(shí)的穩(wěn)定性。用USP方法通過(guò)HPLC跟蹤本發(fā)明的微球中阿霉素的加載和釋放，以確定阿霉素是否受到該過(guò)程的影響。產(chǎn)生的色譜圖均在相似的保留時(shí)間出現(xiàn)單峰，顯示微球加載和釋放的過(guò)程對(duì)阿霉素沒(méi)有任何不利的影響。

實(shí)施例21：阿霉素加載的微球－材料相容性

本發(fā)明的微球用25mg/ml阿霉素加載。然后將微球懸浮于造影劑和鹽水中，然后在釋放導(dǎo)管(Progreat^TM,Terumo)和注射器(Merit)中放置24小時(shí)。在不同的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定阿霉素和各組分的穩(wěn)定性(阿霉素用紫外/HPLC法，組分用肉眼觀察/SEM法)。在室溫下24小時(shí)內(nèi)未觀察到組分或藥物的降解。

實(shí)施例22：預(yù)載產(chǎn)品－加載劑量

在本發(fā)明微球的大小范圍內(nèi)制備系列劑量為5、10、20、45mg/ml的樣品。每個(gè)樣品的載藥量由紫外檢測(cè)法測(cè)定。25個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)列于下表：

表1：加載溶液紫外檢測(cè)測(cè)得的實(shí)際劑量

測(cè)得的劑量范圍是：

45mg/ml：44.37-45.77mg/ml(3.11％范圍)

20mg/ml：21.11-21.32mg/ml(1.05％范圍)

10mg/ml：9.93-9.98mg/ml(0.5％范圍)

5mg/ml：4.98-5.14mg/ml(3.2％范圍)

這些數(shù)據(jù)表明，在不同試驗(yàn)之間幾乎沒(méi)有差異，可以達(dá)到精確而準(zhǔn)確的載藥量。

實(shí)施例23：預(yù)載產(chǎn)品－凍干失重

對(duì)本發(fā)明中的阿霉素加載的微球用一種專(zhuān)用循環(huán)進(jìn)行凍干。所有大小范圍的微球以25個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)測(cè)定劑量為5、10、20、45mg/ml時(shí)的失重百分?jǐn)?shù)(以載藥微球的百分?jǐn)?shù)表示，表2)。得到了一致的失重量，表明凍干前載藥微球的任何重量變化對(duì)凍干后的產(chǎn)品都沒(méi)有影響。圖17的數(shù)據(jù)顯示凍干時(shí)由于失水總是導(dǎo)致大于82％的失重。

表2：阿霉素載藥微球在凍干時(shí)的失重

實(shí)施例24：預(yù)載產(chǎn)品－殘留水分

制備用5、10、20、45mg/ml的阿霉素加載的所有大小范圍的本發(fā)明微球，凍干，然后用伽馬射線滅菌。然后用重量法測(cè)定樣品中殘留的水分，包括在70℃加熱微球至達(dá)到恒重。測(cè)得所有樣品中殘留的水分少于5％。

表3

實(shí)施例25：預(yù)載產(chǎn)品－重新水合后釋放

制備用5、20、45mg/ml的阿霉素加載的所有大小范圍的本發(fā)明微球，凍干，然后用伽馬射線處理。然后使樣品在水中重新水合，紫外跟蹤藥物在PBS中的釋放100小時(shí)(圖18)。

實(shí)施例26：重新水合的阿霉素載藥微球的大小

制備用20mg/ml阿霉素加載的本發(fā)明微球(300-500μm)，凍干，然后對(duì)部分樣品進(jìn)行伽馬射線處理。樣品在水中重新水合，然后用校準(zhǔn)的圖像分析儀(Image Pro-Plus，圖19)測(cè)定大小。

未載藥的樣品也同樣進(jìn)行處理和測(cè)定大小。圖20的數(shù)據(jù)顯示進(jìn)行不同的處理后大小略有變化，但是均未使產(chǎn)品超出250-500μm的合格范圍。

實(shí)施例27：兔肝癌模型(Vx-2)中經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞后阿霉素從阿霉素載藥微球中持續(xù)釋放

本研究的目的是為了評(píng)估在兔肝癌模型中通過(guò)經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞(TACE)釋放的本發(fā)明的阿霉素載藥微球的性能。該研究在美國(guó)巴爾的摩的約翰·霍普金斯醫(yī)院(The John Hopkins Hospital)進(jìn)行。

27.1材料與方法

將動(dòng)物分成6組(第1、2、3、4、5、6組)，每組5只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4只，對(duì)照動(dòng)物1只)。所有組的對(duì)照動(dòng)物都動(dòng)脈內(nèi)注射阿霉素(與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物濃度相同)，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照經(jīng)修改的化學(xué)栓塞方案用含有阿霉素的藥物洗脫微球處理。不同組的動(dòng)物在以下時(shí)間點(diǎn)處死：

第1組：化學(xué)栓塞操作后1小時(shí)

第2組：化學(xué)栓塞操作后12小時(shí)

第3組：化學(xué)栓塞操作后24小時(shí)

第4組：化學(xué)栓塞操作后3天

第5組：化學(xué)栓塞操作后7天

第6組：化學(xué)栓塞操作后14天

27.2動(dòng)物的準(zhǔn)備

將VX2腫瘤細(xì)胞系注射到載體兔(新西蘭白兔)的后腿并培養(yǎng)14天。從每一只載體兔體內(nèi)收集產(chǎn)生的腫瘤，并通過(guò)對(duì)每只兔解剖活體腫瘤組織、無(wú)菌切碎和通過(guò)不銹鋼篩，從每只兔來(lái)制備腫瘤漿。兔子預(yù)先肌內(nèi)給予乙酰丙嗪(1mg/kg)和鹽酸氯胺酮(20mg/kg)的混合物將兔預(yù)麻醉。大約15分鐘后，經(jīng)耳緣靜脈做靜脈入口，并靜脈給予動(dòng)物硫噴妥鈉(40mg/kg)，以在手術(shù)過(guò)程中保持麻醉狀態(tài)。刮去腹部的毛，用聯(lián)苯胺備皮并做一個(gè)中線切口。通過(guò)中間正中剖腹暴露每只兔的肝臟，然后用21G靜脈血管穿刺針(angiocath)直接注射一份腫瘤漿液(0.2ml)至暴露的肝臟的左葉以形成周?chē)凶銐蚋螌?shí)質(zhì)的唯一的孤立損傷。每?jī)芍粚?shí)驗(yàn)兔用一份腫瘤漿。使腫瘤在兔肝中生長(zhǎng)14天，使其達(dá)到根據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)所預(yù)期的直徑在2.5-3.5cm范圍的大小。用電灼燒控制出血。然后將腹部用連續(xù)縫線縫合關(guān)閉，皮膚用縫線縫合并用繃帶包扎。整個(gè)操作中均采用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌技術(shù)。手術(shù)后，將動(dòng)物放入籠子中，用毛毯保暖并進(jìn)行呼氣末CO₂濃度監(jiān)測(cè)，直至動(dòng)物從麻醉中蘇醒。如果動(dòng)物明顯出現(xiàn)疼痛或身體上的痛苦，皮下給予0.02-0.05mg/kg止痛劑似普羅啡，每12小時(shí)一次，連續(xù)3天。

27.3阿霉素洗脫微球的制備：

按實(shí)施例22制備本發(fā)明的大小范圍在100-300微米并用45mg/ml阿霉素加載的微球，按實(shí)施例23凍干并用伽馬射線滅菌。在臨使用前將微球用1ml無(wú)菌水水合，并加入2ml歐乃派克和1ml鹽水。溶液在要注射前至少10分鐘準(zhǔn)備好，每只兔動(dòng)脈注射總?cè)芤褐械?ml(如下所述)。

27.4化學(xué)栓塞操作：

腫瘤移植入兔肝臟兩周后，將動(dòng)物取回做“化學(xué)栓塞”。按上述進(jìn)行預(yù)麻醉、做靜脈入口、用硫噴妥鈉麻醉。做進(jìn)入股總動(dòng)脈的入口，然后將一個(gè)導(dǎo)管插入肝總動(dòng)脈。注射造影劑證實(shí)腫瘤所在的位置后，插入一個(gè)2F JB1導(dǎo)管使其盡可能接近腫瘤。如果需要，用Transsend導(dǎo)絲將導(dǎo)管引導(dǎo)至靶動(dòng)脈。一旦導(dǎo)管被適當(dāng)定位，立即如上所述將阿霉素洗脫微球注射到腫瘤床內(nèi)。對(duì)照組只注射相同濃度的阿霉素,而不進(jìn)行栓塞操作。完成“化學(xué)栓塞”后，移出導(dǎo)管，動(dòng)脈用可被重吸收的縫合材料結(jié)扎來(lái)止血。整個(gè)操作及后續(xù)操作中均采用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌技術(shù)。盡所有可能盡量減小不適和痛苦，包括限制腫瘤移植的手術(shù)切口，皮下注射似普羅啡以盡量減輕疼痛，在需要評(píng)估動(dòng)物的身體狀況及疼痛和不適水平時(shí)隨時(shí)臨床呼叫。然后將動(dòng)物放回籠子。所有動(dòng)物依照上述時(shí)間點(diǎn)處死。

按照獸醫(yī)管理規(guī)則處死動(dòng)物。各組中的所有動(dòng)物在處理后按照其時(shí)間點(diǎn)在通過(guò)靜脈注射100mg/kg戊硫代巴比妥IV所致的深度麻醉狀態(tài)下處死。

27.5病理學(xué)和組織學(xué)評(píng)價(jià)

剖出兔的肝臟，小心摘除并放置在裝有5％甲醛的容器中。將肝臟以5mm的間距切片以用于肉眼檢查。每一個(gè)切片都用石蠟完全包埋，然后切成4μ厚的切片并用蘇木精和伊紅染色處理。通過(guò)肉眼觀察估計(jì)腫瘤存活率，并以每張切片上活腫瘤面積的百分率表示。用HPLC測(cè)定腫瘤中和無(wú)腫瘤肝組織中阿霉素的濃度。

27.6采集血液以進(jìn)行阿霉素分析

通過(guò)在耳中插入動(dòng)脈導(dǎo)管，從注射藥物洗脫微球時(shí)開(kāi)始，分別在20分、40分、60分、120分和180分時(shí)采集3ml全血，然后轉(zhuǎn)移到肝素化真空采血試管中，并在室溫下2000g離心10分鐘。分離出血漿并將其移到標(biāo)記的聚丙烯帶蓋管中。使其在甲醇/冰中迅速凍結(jié)，于－20℃保存以供進(jìn)行分析。

27.7對(duì)組織進(jìn)行處理以確定腫瘤中和無(wú)腫瘤肝組織中阿霉素的濃度

切下腫瘤和無(wú)腫瘤肝組織(約100mg)并除去上面的表皮和死細(xì)胞。使用預(yù)先稱(chēng)重的試管準(zhǔn)確稱(chēng)量組織的重量并記錄，然后立即將其放到干冰上，而后于－80℃保存以供進(jìn)行分析。

27.8結(jié)果：

藥物分布總結(jié)：

1.阿霉素在腫瘤中的濃度在治療后7天達(dá)到最高，其次是3天組(圖20)。

2.阿霉素在腫瘤中的濃度甚至在14天組中仍然很高，表明阿霉素是從微球中連續(xù)洗脫的(圖20)。

3.所有時(shí)間點(diǎn)阿霉素及其降解產(chǎn)物阿霉素醇(doxorubicinol)在血漿中的濃度很低。這在給藥后20分鐘特別顯著，而且阿霉素在血漿中的濃度在20－180分鐘幾乎以線性持續(xù)下降。當(dāng)動(dòng)脈注射無(wú)微球的阿霉素時(shí)，血漿中阿霉素的濃度高10－17倍(圖21)。

組織學(xué)觀察：

1.在7－14天腫瘤壞死最大(圖22)。

2.注意1小時(shí)組和12小時(shí)組可視為對(duì)照組，因?yàn)榛瘜W(xué)治療劑還未開(kāi)始?xì)缂?xì)胞。

3.最后，在3天和7天組中分別有50％和37％的腫瘤細(xì)胞既不是完全死亡也不是完全存活。這些細(xì)胞可能“受損”，甚至可能凋亡。

4.關(guān)于微球的分布，和預(yù)期的一樣，對(duì)照動(dòng)物中均未發(fā)現(xiàn)任何微球。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)所有的微球都保留在具有預(yù)期的血管直徑即100－300微米的小動(dòng)脈中。沒(méi)有任何微球逃離血管內(nèi)空間。

5.在14天組中，腫瘤植入位置即肝組織左側(cè)似乎大部分已壞死。壞死的腫瘤和正常細(xì)胞的差別很難確定。因此，我們可以推測(cè)藥物洗脫微球的效力在14天后已達(dá)到最大。這些結(jié)果是一致的。

6.組織學(xué)分析也證實(shí)了藥物洗脫微球殺滅腫瘤細(xì)胞的效力。我們從前面的多組實(shí)驗(yàn)了解到，動(dòng)脈內(nèi)注射阿霉素或卡鉑(濃度相同)僅導(dǎo)致30％的腫瘤壞死，這與未治療(即對(duì)照)動(dòng)物大致相等。相反，用藥物洗脫微球?qū)ν眠M(jìn)行治療導(dǎo)致50－100％的壞死，壞死在14天最為完全，顯著高于單獨(dú)動(dòng)脈內(nèi)注射(圖22)。

實(shí)施例28：臨床試驗(yàn)

用根據(jù)實(shí)施例9制備的微球漿進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其在用于對(duì)不能切除的肝細(xì)胞腫瘤(HCC)患者進(jìn)行治療的安全性、藥物動(dòng)力學(xué)形式和效力。適合本研究的患者年齡在18－75歲，患有不宜進(jìn)行根除治療如切除術(shù)、肝移植、經(jīng)皮治療的HCC，具有良好的肝功能(Child-Pugh A型)，沒(méi)有任何肝失代償。排除以下患者：

a)以前曾經(jīng)用任何抗癌療法治療HCC的患者；

b)患有另一種原發(fā)性腫瘤的患者；

c)患有重度肝臟疾病的患者：Child-Pugh B-C型或活動(dòng)性胃腸出血、腦病或腹水。膽紅素水平>3mg/dL；

d)患有癌性疾病的患者：C型BCLC(血管侵襲，包括節(jié)段性門(mén)靜脈阻塞；肝外擴(kuò)散或癌癥相關(guān)癥狀＝PST為1－4)或D型BCLC(WHO體能狀況3或4，OkudaⅢ期)；

e)患有任何肝臟栓塞手術(shù)禁忌癥的患者：門(mén)體分流、離肝血流、凝血實(shí)驗(yàn)異常(血小板計(jì)數(shù)<50.000/mm³或凝血酶原活性<50％)、腎衰、嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化；

f)患有阿霉素給藥禁忌癥的患者(血清膽紅素≥5mg/dL，白細(xì)胞計(jì)數(shù)≤3.000細(xì)胞/mm³，心臟射血分?jǐn)?shù)<50％)。

化學(xué)栓塞在0時(shí)和第2月進(jìn)行。治療將由于任何排除標(biāo)準(zhǔn)的形成或由患者決定而中止。通過(guò)注射在臨給藥前與造影劑混合的阿霉素載藥微球進(jìn)行栓塞，直至達(dá)到流動(dòng)停滯。PVA微球的直徑由外科醫(yī)師來(lái)選擇，其大小可能為500μm左右。不使用抗生素預(yù)防。

為了分析阿霉素微球的藥物代謝動(dòng)力學(xué)形式，對(duì)膽紅素水平<1.5mg/dL的患者，以以下劑量開(kāi)始給予按比例增大的劑量：每次治療25mg/m²(2個(gè)患者)、50mg/m²(2個(gè)患者)、75mg/m²(2個(gè)患者)、100mg/m²(2個(gè)患者)。對(duì)膽紅素水平在1.5-3mg/dL的患者以以下劑量開(kāi)始：25mg/m²(2個(gè)患者)、50mg/m²(2個(gè)患者)、75mg/m²(2個(gè)患者)、100mg/m²(2個(gè)患者)。如果在某個(gè)劑量水平?jīng)]有觀察到任何劑量限制性毒性，則在下一組按比例增加劑量，單次治療中阿霉素的最大總劑量是150mg。

藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)：在操作之后的1小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和7天，在患者住院期間或在門(mén)診部，從外周血中采集樣本進(jìn)行阿霉素水平分析。

安全性：在6個(gè)月的整個(gè)研究過(guò)程中記錄并分析與治療相關(guān)的并發(fā)癥。在第0月和第2月的住院期(4天)記錄不良反應(yīng)事件。在第7天、第14天和第1、3和6月，在門(mén)診部對(duì)患者進(jìn)行回訪，對(duì)其進(jìn)行臨床檢查并測(cè)定實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。開(kāi)始治療后所有回訪中都會(huì)發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)事件，其中包括骨髓抑制和其他與阿霉素相關(guān)的毒性的出現(xiàn)、肝功能衰竭、腎功能衰竭、感染(膽囊炎、肝腫大、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、菌血癥、缺血性肝炎或膽道狹窄)、胃腸道出血。

療效：在第3和6月通過(guò)造影劑強(qiáng)化的螺旋斷層攝影術(shù)評(píng)價(jià)客觀反應(yīng)。其幅度根據(jù)歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)定義：完全反應(yīng)：無(wú)癌性疾病跡象；部分反應(yīng)：腫瘤總量下降>50％；無(wú)變化：下降<50％或增加<25％；進(jìn)行性疾?。涸黾?gt;25％。因此，客觀反應(yīng)反映了完全反應(yīng)和部分反應(yīng)。