本發(fā)明涉及一種醫(yī)用鈦基材料及其制備方法和應(yīng)用，具體說，是涉及一種以生物醫(yī)用鈦或鈦合金為基底，以(a)二價(jià)金屬離子M₁的可溶性鹽、(b)三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂的可溶性鹽、(c)尿素、(d)藥物的混合水溶液或水溶膠為水熱介質(zhì)，通過一步水熱反應(yīng)原位生長(zhǎng)得到的具有選擇性抗癌抗菌能力的薄膜材料，屬于金屬材料表面改性技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鈦及其合金被廣泛用作植入材料。針對(duì)其不同的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，對(duì)材料性能有著不同的要求。目前許多應(yīng)用都需要材料具有選擇性的抗癌抗菌能力。比如對(duì)于骨癌患者，患處被植入體替代后，癌癥仍有復(fù)發(fā)的可能，但如果植入體本身就有抗腫瘤的能力將降低其復(fù)發(fā)的可能性(Nature Reviews Cancer 2011,11:411-425.)；再比如在宮頸癌的治療中，鈦合金常作為輔助化療或放療的設(shè)備植入人體中(International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 2011,80:974-955)，不利于癌細(xì)胞粘附的材料表面無疑會(huì)增強(qiáng)治療效果，特別是在惡性梗阻治療中，具有抗癌能力的支架表面將極大得降低再阻塞的概率，減輕病人的痛苦。因此發(fā)展具有選擇性抗癌抗菌能力的新型植入材料成為研究熱點(diǎn)之一。

近期研究表明層狀雙氫氧化物在負(fù)載化學(xué)藥物或生物分子以及選擇性調(diào)控細(xì)胞行為等多個(gè)方面表現(xiàn)出極大得潛力。層狀雙氫氧化物的主體結(jié)構(gòu)是由二價(jià)金屬氫氧化物構(gòu)成的八面體水鎂石狀的板層結(jié)構(gòu)，部分高價(jià)離子取代了原始結(jié)構(gòu)中的二價(jià)金屬離子，從而在板層中引入了正電荷，為了補(bǔ)償板層上的正電荷，環(huán)境中的陰離子會(huì)進(jìn)入板層之間，從而構(gòu)成了這種層間距極大的層狀結(jié)構(gòu)(Journal of Materials Chemistry 2006,16:3809-3813)。傳統(tǒng)的載藥層狀雙氫氧化物一般只能被制備成粉體形式，并不適用藥物的局部載釋(Chemical Reviews 2012,7:4124-4155)。此外，藥物的負(fù)載通常需要在保護(hù)氣氛下進(jìn)行，工藝較為復(fù)雜。目前還未見有關(guān)直接在生物醫(yī)用鈦或鈦合金表面構(gòu)建層狀雙氫氧化物薄膜進(jìn)行載藥的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前生物材料市場(chǎng)對(duì)生物醫(yī)用鈦及其合金抗癌抗菌性能的要求，本發(fā)明在鈦或鈦合金表面構(gòu)建了一種載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料提供一種醫(yī)用鈦基材料，包括生物醫(yī)用鈦或鈦合金、原位生長(zhǎng)在所述生物醫(yī)用鈦或鈦合金表面的層狀雙氫氧化物薄膜，以及負(fù)載在層狀雙氫氧化物的晶格之中抗癌藥物。

本發(fā)明提供的醫(yī)用鈦基材料，以鈦或鈦合金為基底，原位誘導(dǎo)生長(zhǎng)層狀雙氫氧化物薄膜，用于負(fù)載抗癌藥物。由于層狀雙氫氧化物這種獨(dú)特的晶體結(jié)構(gòu)，帶負(fù)電的抗癌元素或藥物分子可與板層間的陰離子發(fā)生交換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的負(fù)載。這一載藥基底具有較高的載藥效率和較大的載藥能力，還可以有效的防止藥物在生物體內(nèi)降解。并且與其它常見無機(jī)載藥基體如氧化鐵、二氧化硅、碳納米管相比，層狀雙氫氧化物具有更好的生物相容性。由于層狀雙氫氧化物獨(dú)特的與羥基自由基有較強(qiáng)的親和力，層狀雙氫氧化物中的陰離子可與環(huán)境中的羥基自由基發(fā)生交換。又因?yàn)樗幬锓肿右雅c板層間的陰離子發(fā)生交換，此時(shí)藥物分子便會(huì)與環(huán)境中的羥基自由基發(fā)生二次交換，從而導(dǎo)致藥物的釋放。本發(fā)明采用鈦或鈦合金作為基底，其中鈦或鈦合金在水熱過程中發(fā)生活化，表面形成大量Ti-OH基團(tuán)可為層狀雙氫氧化物的形成提供結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)層狀雙氫氧化物的形成。

較佳地，所述層狀雙氫氧化物為片狀的納米結(jié)構(gòu)，其中納米片的長(zhǎng)度為0.5～2微米，厚度為20～40nm。

另一方面，本發(fā)明提供了一種上述醫(yī)用鈦基材料的制備方法，將生物醫(yī)用鈦或鈦合金置于反應(yīng)釜內(nèi)，再加入包含有二價(jià)金屬離子M₁的可溶性鹽、三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂的可溶性鹽、尿素和抗癌藥物的混合水溶液或水溶膠作為水熱介質(zhì)，然后在80～160℃下水熱處理12～36小時(shí)，以在所述生物醫(yī)用鈦或鈦合形成載藥層狀雙氫氧化物薄膜。

較佳地，所述二價(jià)金屬離子M₁為Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和Cu²⁺中的至少一種。其中，所述水熱介質(zhì)中二價(jià)金屬離子M₁的濃度為2～20mM。

較佳地，所述三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂為Fe³⁺、Al³⁺和Ti⁴⁺中的至少一種。

較佳地，所述水熱介質(zhì)中二價(jià)金屬離子M₁與三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂的摩爾比可為1:1～5:1。

較佳地，所述水熱介質(zhì)中尿素的濃度可為4～8g/L。

較佳地，所述抗癌藥物可為5-氟尿嘧啶、丁酸鈉、順鉑、羧酸化的阿霉素中的至少一種。其中，所述水熱介質(zhì)中藥物的濃度可為4～20mM。

較佳地，所述反應(yīng)釜的填充度可為30～80％。

再一方面，本發(fā)明還提供了一種載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料在制造與腫瘤組織接觸的醫(yī)用鈦合金器件中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用一步水熱法在鈦或鈦合金表面成功構(gòu)建出載藥層狀雙氫氧化物薄膜，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，利于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明所制備的載藥薄膜，藥物插于層狀雙氫氧化物的晶格之中，分布均勻，且藥物釋放量與環(huán)境中的過氧化氫濃度正相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)藥物在不同條件下的選擇性釋放。本發(fā)明制備的載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料可選擇性的殺傷癌細(xì)胞和細(xì)菌而對(duì)正常細(xì)胞負(fù)面作用較小，可應(yīng)用于與腫瘤組織接觸的生物醫(yī)療器械。

附圖說明

圖1為經(jīng)實(shí)施例1處理后得到樣品的低倍a與高倍b掃描電鏡形貌圖；

圖2為經(jīng)實(shí)施例1處理后得到樣品的XRD圖譜；

圖3為經(jīng)實(shí)施例1處理后得到樣品的紅外光譜；

圖4為經(jīng)實(shí)施例1處理后得到樣品的藥物釋放情況；

圖5為a癌細(xì)胞RBE與b正常細(xì)胞HIBEpiC在未處理的鎳鈦合金和經(jīng)實(shí)施例1制備樣品表面的增殖情況，圖中，NiTi表示未處理的樣品，LDH/Butyrate表示經(jīng)過實(shí)施例1制備的樣品；

圖6為癌細(xì)胞RBE在未處理的鎳鈦合金表面和經(jīng)實(shí)施例1制備的樣品表面培養(yǎng)4天后的掃描電鏡圖片。圖中NiTi表示未處理的樣品，LDH/Butyrate表示經(jīng)過實(shí)施例1制備的樣品；a、c為低倍圖片，b、d為高倍圖片；

圖7為正常細(xì)胞HIBEpiC在未處理的鎳鈦合金表面和經(jīng)實(shí)施例1制備的樣品表面培養(yǎng)4天后的掃描電鏡圖片。圖中NiTi表示未處理的樣品，LDH/Butyrate表示經(jīng)過實(shí)施例1制備的樣品；a、c為低倍圖片，b、d為高倍圖片；

圖8為經(jīng)過實(shí)施例1處理的樣品抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中：a表示未處理的鎳鈦合金對(duì)金黃色葡萄球菌的影響；b表示經(jīng)過實(shí)施例1制備的樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的影響；c表示未處理的鎳鈦合金對(duì)大腸桿菌的影響；d表示經(jīng)過實(shí)施例1處理的樣品對(duì)大腸桿菌的影響。

具體實(shí)施方式

以下通過下述實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明以生物醫(yī)用鈦或鈦合金為基底，以(a)二價(jià)金屬離子M₁的可溶性鹽、(b)三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂的可溶性鹽、(c)尿素、(d)藥物的混合水溶液或水溶膠為水熱介質(zhì)，通過一步水熱反應(yīng)對(duì)鈦或鈦合金進(jìn)行水熱處理制備載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料。所得載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料原位生長(zhǎng)于生物醫(yī)用鈦或鈦合金表面，所述載藥層狀雙氫氧化物薄膜材料中的藥物負(fù)載于層狀雙氫氧化物的晶格之中。所述層狀雙氫氧化物為片狀的納米結(jié)構(gòu)，其中納米片的長(zhǎng)度可為0.5～2微米，厚度可為20～40nm。

載藥層狀雙氫氧化物薄膜通過水熱反應(yīng)原位生長(zhǎng)于生物醫(yī)用鈦或鈦合金表面，藥物均勻摻雜與層狀雙氫氧化物晶格之中。其合成過程只需一步水熱過程，工藝較為簡(jiǎn)單。

以下示例性地說明本發(fā)明提供的載藥層狀雙氫氧化物薄膜的制備方法。

將生物醫(yī)用鈦或鈦合金依次用酒精、去離子水和超純水超聲清洗干凈后置于水熱釜中。其中生物醫(yī)用鈦或鈦合金可為純鈦、鎳鈦合金、鈦鋁釩合金等。

將清洗干凈后的生物醫(yī)用鈦或鈦合金置于反應(yīng)釜內(nèi)，以(a)二價(jià)金屬離子M₁的可溶性鹽(或稱二價(jià)金屬M(fèi)₁的可溶性鹽)、(b)三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂的可溶性鹽(或稱三價(jià)或四價(jià)金屬M(fèi)₂的可溶性鹽)、(c)尿素、(d)抗癌藥物的混合水溶液或水溶膠為水熱介質(zhì)進(jìn)行水熱處理。所述二價(jià)金屬離子M₁可為Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺或Cu²⁺。三價(jià)或四價(jià)金屬離子M₂可為Fe³⁺、Al³⁺或Ti⁴⁺。其中M₁與M₂的摩爾比可為1:1～5:1，M₁溶液的濃度可為2～20mM。

其中反應(yīng)溫度可為80～160℃。反應(yīng)時(shí)間可為12～36小時(shí)。整個(gè)過程中保持反應(yīng)釜填充度為40～80％最佳。

上述M₁、M₂金屬鹽可為該金屬的硝酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、氯化物、溴化物、氟化物等一切在水中有一定溶解性的鹽類。

上述抗癌藥物可為5-氟尿嘧啶、丁酸鈉等陰離子型藥物或生物分子。其中，藥物的濃度可為4～20mM。

上述尿素的濃度可為4～8g/L。其中尿素濃度對(duì)載藥層狀雙氫氧化物薄膜形成的影響較大，需要進(jìn)行精確調(diào)控。尿素濃度太低會(huì)導(dǎo)致水熱過程中pH過低，層狀雙氫氧化物無法形成。而尿素濃度過高，會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中CNO^-離子濃度過高，該離子會(huì)和藥物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，使得藥物難以插入層狀雙氫氧化物晶格之中。

本發(fā)明所制備的載藥層狀雙氫氧化物薄膜以鈦或鈦合金為基底，藥物摻雜于層狀雙氫氧化物的晶格之中。由于層狀雙氫氧化物獨(dú)特的離子交換效應(yīng)，藥物會(huì)與環(huán)境中的羥基自由基發(fā)生交換，從而導(dǎo)致藥物的釋放。因此該載藥層狀雙氫氧化物薄膜的藥物的釋放量與環(huán)境中的羥基自由基含量正相關(guān)。癌細(xì)胞代謝過程中會(huì)有過氧化氫產(chǎn)生，過氧化氫又會(huì)進(jìn)一步裂解成羥基自由基從而導(dǎo)致癌細(xì)胞微環(huán)境中羥基自由基含量過剩。因此當(dāng)本發(fā)明所制備材料處于癌細(xì)胞環(huán)境中時(shí)會(huì)有大量藥物釋放，對(duì)癌細(xì)胞起到殺傷作用。而當(dāng)材料處于正常細(xì)胞微環(huán)境中時(shí)，藥物釋放量較少，使得材料對(duì)正常細(xì)胞抑制作用較低。此外，由于材料中所含重金屬離子的釋放，使得材料在選擇性抗癌的同時(shí)，對(duì)細(xì)菌也可以起到較好的殺傷作用。

本發(fā)明所制備的載藥層狀雙氫氧化物薄膜所具備的這種獨(dú)特的選擇性抗癌抗菌能力，使其在與腫瘤組織接觸的醫(yī)用鈦或鈦合金器件中表現(xiàn)出極佳的應(yīng)用前景。

下面進(jìn)一步例舉實(shí)施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個(gè)示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。

實(shí)施例1

本實(shí)施例選取鈦合金中的鎳鈦合金為基底，將直徑為12mm厚度為1mm的鎳鈦合金圓片，依次用酒精、去離子水和超聲清洗干凈，每次15min。以(a)6mM二價(jià)金屬M(fèi)₁的可溶性鹽NiCl₂(b)2mM四價(jià)金屬M(fèi)₂的可溶性鹽TiCl₄(c)6.5g/L尿素(d)6mM丁酸鈉的混合溶液作為水熱介質(zhì)進(jìn)行水熱處理，水熱溫度為120℃，時(shí)間為24h。水熱釜的填充度為35％。水熱處理后用大量去離子水涮洗。

圖1是經(jīng)本實(shí)施例改性處理得到的樣品表面形貌低倍和高倍掃描電鏡圖片。從圖中可以看到，所制備的載藥薄膜呈現(xiàn)出片狀結(jié)構(gòu)，片層長(zhǎng)度和寬度約為1μm，而厚度在40nm左右。圖2給出了經(jīng)本實(shí)施例處理后制備樣品的XRD譜圖，從圖中可以看到對(duì)應(yīng)于層狀雙氫氧化物(003)和(006)晶面的特征峰，(003)峰位于11.29°對(duì)應(yīng)的晶面間距為0.783nm。該間距符合丁酸根離子的尺寸，可從側(cè)面印證丁酸根離子已經(jīng)進(jìn)入層狀雙氫氧化物晶格之中。圖3為經(jīng)本實(shí)施例處理后所得到樣品的紅外圖譜。在1405.8cm^-1和1558.2cm^-1處的兩個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)于丁酸根中COO^-基團(tuán)的對(duì)稱伸縮震蕩和非對(duì)稱伸縮震蕩；位于2939.0cm^-1的峰對(duì)應(yīng)于-CH₂-基團(tuán)的非對(duì)稱伸縮震蕩；而2878.3cm^-1和2964.1cm^-1處的峰分別對(duì)應(yīng)于-CH₃基團(tuán)的對(duì)稱伸縮震蕩和非對(duì)稱伸縮震蕩。上述數(shù)據(jù)可說明所采用的模型藥物丁酸鈉已經(jīng)成功插入層狀雙氫氧化物的晶格之中。

實(shí)施例2

將經(jīng)過實(shí)施例1處理的樣品浸泡于磷酸緩沖液(PBS,pH＝7.4)中，每隔一段時(shí)間，取出浸提液，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量浸提液中模型藥物丁酸鈉的濃度。浸泡一定時(shí)間后，相PBS中加入125μM過氧化氫，并立即測(cè)定丁酸鈉的釋放量，從而檢測(cè)過氧化氫對(duì)藥物釋放的影響。圖4給出了藥物釋放的情況，可以看到在沒加過氧化氫之前，藥物釋放量處于較低的水平，加入過氧化氫之后藥物釋放量急劇增多。而去除環(huán)境中的過氧化氫之后，藥物釋放量又回復(fù)到較低的水平。這說明環(huán)境中的過氧化氫濃度可作為啟動(dòng)藥物釋放的“開關(guān)”，可有效調(diào)控藥物的釋放量。

實(shí)施例3

采用人膽管癌細(xì)胞RBE以及正常細(xì)胞肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估上述實(shí)施例1制備載藥層狀雙氫氧化物薄膜對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞活性的影響，以未處理的鎳鈦合金作為對(duì)照樣(標(biāo)記為NiTi)利用阿爾瑪藍(lán)(AlamarBlue^TM，AbD serotec Ltd，UK)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在材料表面的增殖情況。方法如下：

1)將使用75％乙醇滅菌的樣品放入24孔培養(yǎng)板中，每孔滴加1mL密度為5×10⁴cell/mL細(xì)胞懸液；

2)將細(xì)胞培養(yǎng)板放入5％CO₂飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中36.5℃孵化18h；

3)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗樣品表面后，將樣品移至新的24孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

4)細(xì)胞培養(yǎng)1、4和7天后，吸去原培養(yǎng)液，加入含有5％阿爾瑪藍(lán)(AlamarBlue^TM)染液的新培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，從每孔取出100μL培養(yǎng)液放入96孔板中；

5)利用酶標(biāo)儀(BIO-TEK，ELX800)測(cè)量各孔在570nm和600nm波長(zhǎng)下的吸光度值。按照以下公式計(jì)算AlamarBlue^TM被細(xì)胞還原的百分率：

$\frac{117,216\×A^{{\mathrm{\λ}}_1}-80,586\×A^{{\mathrm{\λ}}_2}}{155,677\×A^{\′{\mathrm{\λ}}_2}-14,652\×A^{\′{\mathrm{\λ}}_1}}\×100\%$

其中：A為吸光度值，A’為陰性對(duì)照孔的吸光度值，λ₁＝570nm，λ₂＝600nm。

同時(shí)在培養(yǎng)不同時(shí)間段后，通過掃描電鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，從而進(jìn)一步表征材料對(duì)細(xì)胞的作用。

圖5是經(jīng)上述實(shí)施例1得到載藥層狀雙氫氧化物薄膜對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞增殖的影響情況。結(jié)果表明，經(jīng)實(shí)施例1制備的載藥層狀雙氫氧化物可有效殺傷癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞抑制作用較小。在經(jīng)實(shí)施例1處理得到的材料表面，癌細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變長(zhǎng)逐漸變少，而正常細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)的進(jìn)行逐漸增多。圖6和圖7分別給出了在材料表面培養(yǎng)4天后，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的SEM圖片，從圖中可以看到，在經(jīng)過實(shí)施例1處理的材料表面的癌細(xì)胞呈現(xiàn)出梭形，高倍圖片中還可以看到細(xì)胞膜的破損；而在其表面的正常細(xì)胞排列規(guī)律，形態(tài)完整。以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明經(jīng)過實(shí)施例1處理得到的載藥層狀上氫氧化物具有較好的選擇性抗癌作用。

實(shí)施例4

對(duì)通過實(shí)施例1制備的材料進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，以為處理的鎳鈦合金作為對(duì)照：所有樣品在121℃高壓滅菌40min，將濃度為10⁷CFU/mL的菌液滴在滅菌過的樣品表面(0.06mL/cm²)，然后將滴有菌液的樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。取出24h培養(yǎng)的樣品，將菌液倍比稀釋后接種在含有培養(yǎng)基的瓊脂板上。接種后的瓊脂板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取出后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察菌落數(shù)目。

圖6為經(jīng)過上述實(shí)施例處理后得出的載藥層狀雙氫氧化物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌結(jié)果。從圖中可以看到，經(jīng)實(shí)施例1制備的薄膜材料對(duì)兩種細(xì)菌均有極高的殺傷作用，抗菌能力基本可以達(dá)到接近100％的水平。

細(xì)胞和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所制備的載藥薄膜可有效殺傷對(duì)人體有害的癌細(xì)胞和細(xì)菌，而對(duì)正常細(xì)胞卻沒有明顯的抑制作用。因此本發(fā)明可被廣泛應(yīng)用于與腫瘤組織接觸的鈦合金醫(yī)療器械。