本發(fā)明涉及PP242的新用途，具體地涉及PP242在制備用于減輕腎纖維化相關(guān)病癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指持續(xù)的腎臟損害≥3個月(腎損害包括了腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常)，伴或不伴腎小球?yàn)V過率(GFR)下降。CKD是一組威脅人類健康的進(jìn)行性發(fā)展的慢性疾病，已經(jīng)成為一個社會性的公共問題。2000年的一項(xiàng)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示全中國約有10％的人口患有CKD。不管是由何種原發(fā)病引起，CKD患者都不可避免的進(jìn)入尿毒癥期。如果未經(jīng)適當(dāng)治療，尿毒癥及其并發(fā)癥的預(yù)后極差，死亡率很高。因此，研究和認(rèn)識延緩或防止慢性腎臟病發(fā)展、改善慢性腎臟病預(yù)后的藥物具有重要意義。

腎間質(zhì)纖維化是CKD的主要病理特征，與CKD患者腎功能減退速度和預(yù)后密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明腎間質(zhì)纖維化主要是肌成纖維細(xì)胞聚集及活化，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，包括纖維連接蛋白(Fibronectin)以及膠原I和膠原III。研究表明，腎臟肌成纖維細(xì)胞至少有五種不同來源，包括腎臟固有成纖維細(xì)胞的活化，骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，周細(xì)胞的分化，小管上皮、內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。腎組織中固有成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的主要來源(約50％)。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度保守的非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR作為核心蛋白參與組成兩種復(fù)合體，包括mTORC1和mTORC2。Raptor(regulatory associated protein of TOR)mLST8(mammalian lethal with SEC13protein 8)和PRAS40(proline-rich Akt/PKB substrate 40kDa)等形成雷帕霉素敏感的復(fù)合體1(Mammalian Target of Rapamycin Complex 1，mTORC1)。mTORC1通過活化下游的核糖體激酶S6K1(Ribosome p70 S6 kinase，S6K1)和真核細(xì)胞始動因子4E結(jié)合蛋白1(eIF.4E binding protein1，4EBP1)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞的自噬、代謝和存活。另外，mTOR、Rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)、mLST8、mSIN1(mamalian stress-activated interacting protein 1)和Protor(protein observed with Rictor)等形成mTORC2復(fù)合物。mTORC2通過磷酸化下游底物，包括Akt、proteinkinase Cα (PKCα)、glucocorticoid-induced protein kinase 1(SGK1)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、細(xì)胞骨架的完整以及水鹽代謝等。已經(jīng)有研究證實(shí)mTORC1以及mTORC2信號通路在TGFβ1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化與腎間質(zhì)纖維化的過程中具有重要作用，阻斷這條信號通路可以抑制成纖維細(xì)胞活化并減輕腎間質(zhì)纖維化。

PP242是一個mTOR的ATP競爭性和選擇性抑制劑，能夠同時抑制mTORC1以及mTORC2的活性。

已經(jīng)有研究表明PP242能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前，尚未有PP242可以減輕慢性腎臟病的報道。

發(fā)明目的：本發(fā)明的發(fā)明目的在提出PP242的新適應(yīng)癥，即在在制備用于減輕腎纖維化相關(guān)病癥的藥物中的應(yīng)用。

其中，所述的腎纖維化相關(guān)病癥為慢性腎臟病、腎間質(zhì)纖維化、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化和腎臟炎性細(xì)胞浸潤中的任意一種。

具體地，所述的腎間質(zhì)纖維化為單側(cè)輸尿管結(jié)扎造成的腎間質(zhì)纖維化。

其中，研究表明，PP242抑制TGF-β1誘導(dǎo)的mTORC1以及mTORC2的活化。

PP242抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化。

PP242抑制TGF-β1引起的FN、α-SMA以及I型膠原蛋白的高表達(dá)。

PP242抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎組織mTORC1以及mTORC2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

PP242抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎組織細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

附圖說明

圖1為PP242對NRK49F細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的mTORC1以及mTORC2的活化的影響；

圖2為PP242對TGF-β1誘導(dǎo)的NRK49F細(xì)胞活化的影響，其中，上圖為Western blot分別檢測FN、α-SMA以及type-I Collagen的表達(dá)下圖利用免疫熒光染色檢測FN以及α-SMA的表達(dá)；

圖3為Western blot檢測了UUO術(shù)一周后(UUO1W)，兩組小鼠腎組織mTORC1靶分子p-s6的表達(dá)以及UUO術(shù)兩周后(UUO2W)，兩組小鼠腎組織mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表達(dá)；

圖4為UUO兩周后UUO側(cè)腎組織以及其對側(cè)腎組織中行PAS，Masson以及天狼星紅(SirusRed)染色結(jié)果；

圖5為利用Western blot檢測10％DMSO或PP242組UUO一周后的腎組織以及其對側(cè)腎中Fibronectin的表達(dá)以及10％DMSO或PP242組UUO兩周后的腎組織以及其對側(cè)腎中Fibronectin以及α-SMA的表達(dá)的結(jié)果圖；

圖6為利用免疫熒光染色檢測10％DMSO或PP242組UUO兩周后的腎組織以及其對側(cè)腎中Fibronectin以及α-SMA的表達(dá)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。

實(shí)施例1 PP242在NRK49F細(xì)胞中能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的mTORC1以及mTORC2的活化。

應(yīng)用大鼠成纖維細(xì)胞系(NRK49F)，單獨(dú)TGF-β1處理組中，利用TGF-β1(2ng/ml)處理12小時；PP242處理組中，預(yù)先30min將PP242以不同濃度(3.6，16，80，400nM)加入細(xì)胞，隨后利用TGF-β1(2ng/ml)處理12小時。Western blot分別檢測mTORC1靶分子p-s6以及mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果分析：TGF-β1在NRK49F細(xì)胞中可以誘導(dǎo)mTORC1靶分子p-s6以及mTORC2靶分子p-Akt(ser473)高表達(dá)，而PP242可以明顯抑制TGF-β1引起的mTORC1以及mTORC2信號通路激活，并且隨著PP242劑量的增高，抑制效果更明顯，呈一個劑量依賴性。

實(shí)施例2 PP242能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK49F細(xì)胞活化。

應(yīng)用大鼠成纖維細(xì)胞系(NRK49F)，單獨(dú)TGF-β1處理組中，利用TGF-β1(2ng/ml)處理48小時；PP242處理組中，預(yù)先30min將PP242以不同濃度(3.6、16、80、400nM)加入細(xì)胞，隨后利用TGF-β1(2ng/ml)處理48小時。Western blot分別檢測FN、α-SMA以及type-I Collagen的表達(dá)，利用免疫熒光染色檢測FN以及α-SMA的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果分析：TGF-β1在NRK49F細(xì)胞中可以誘導(dǎo)FN，α-SMA以及type-ICollagen表達(dá)水平增高，而PP242可以明顯抑制TGF-β1引起的FN，α-SMA以及type-ICollagen的高表達(dá)，并且呈一個劑量依賴性。

實(shí)施例3 PP242抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎組織mTORC1以及mTORC2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

取體重20～22g的雄性CD1小鼠，分為等體積10％DMSO組以及PP242治療組。每組小鼠每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射兩天以后，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)作為腎間質(zhì)纖維化模型，手術(shù)后繼續(xù)每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242。于7天以及14天后將兩組小鼠處死，并留取對側(cè)以及UUO側(cè)腎組織。Western blot檢測了UUO術(shù)一周后，兩組小鼠腎組織mTORC1靶分子p-s6的表達(dá)以及UUO術(shù)兩周后，兩組小鼠腎組織mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果分析：UUO術(shù)后一周的腎組織中，PP242可以明顯抑制mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；而UUO術(shù)后兩周的腎組織中，mTORC2信號通路明顯活化，PP242可以明顯抑制mTORC2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(p＜0.05)。

實(shí)施例4 PP242抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎組織腎間質(zhì)纖維化

取體重20～22g的雄性CD1小鼠，分為等體積10％DMSO組以及PP242治療組。每組小鼠每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射兩天以后，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)作為腎間質(zhì)纖維化模型，手術(shù)后繼續(xù)每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242。于14天后將兩組小鼠處死，并留取對側(cè)以及UUO側(cè)腎組織。分別在10％DMSO或PP242組UUO兩周后UUO側(cè)腎組織以及其對側(cè)腎組織中行PAS，Masson以及天狼星紅染色，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果分析：染色的結(jié)果顯示UUO兩周后，腎組織出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化，而PP242組小鼠腎間質(zhì)纖維化較10％DMSO組明顯減輕。

實(shí)施例5 PP242抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠細(xì)胞外基質(zhì)沉積

取體重20～22g的雄性CD1小鼠，分為等體積10％DMSO組以及PP242治療組。每組小鼠每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射兩天以后，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)作為腎間質(zhì)纖維化模型，手術(shù)后繼續(xù)每日單次腹腔注射10％DMSO或PP242。于7天以及14天后將兩組小鼠處死，并留取對側(cè)以及UUO側(cè)腎組織。利用Western blot檢測10％DMSO或PP242組UUO一周后的腎組織以及其對側(cè)腎中Fibronectin的表達(dá)；利用Western blot以及免疫熒光染色檢測10％DMSO或PP242組UUO兩周后的腎組織以及其對側(cè)腎中Fibronectin以及α-SMA的表達(dá)，結(jié)果如圖5和圖6所示。

結(jié)果分析：UUO術(shù)后一周的腎組織中，F(xiàn)ibronectin的表達(dá)較對側(cè)腎明顯升高，表明有更多細(xì)胞外基質(zhì)沉積；而PP242可以顯著抑制UUO引起的Fibronectin的高表達(dá)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。UUO術(shù)后兩周的腎組織中，I型膠原、Fibronectin以及α-SMA的表達(dá)較對側(cè)腎都明顯升高；而PP242可以顯著抑制UUO引起的Fibronectin以及α-SMA的高表達(dá)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

本發(fā)明實(shí)施例中使用的方法簡單介紹如下：

(1)單側(cè)輸尿管梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎病模型：

選用CD1雄性小鼠，以45mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉后，于無菌條件下開放腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，于輸尿管上1/3處和下1/3處分別結(jié)扎輸尿管，然后逐層關(guān)閉腹腔。于術(shù)后7、14天處死小鼠，并留取手術(shù)側(cè)和對側(cè)腎組織標(biāo)本。

(2)腎組織PAS(Periodic Acid-Schiff)染色

1)常規(guī)乙醇脫水；

2)常規(guī)石蠟包埋，3um切片；

3)二甲苯脫蠟水化：二甲苯(I)5min---二甲苯(II)5min---100％乙醇2min---95％乙醇1min---80％乙醇1min---75％乙醇1min---蒸餾水洗2min；

4)組織切片用1％過碘酸處理10-15min，水洗；然后用Schiff氏液處理10-30min，水洗；

5)蘇木素染細(xì)胞核1-2min，水洗；

6)用1％鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗；

7)氨水返藍(lán)數(shù)秒；自來水沖洗，鏡下觀察細(xì)胞核染成藍(lán)色，基底膜染成粉紅色；

8)梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片；

9)正置顯微鏡下觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)改變，攝片。

(3)天狼星紅染色

3μm厚腎組織石蠟切片55℃烘干1h，依次浸于二甲苯、100％、95％、80％、60％乙醇中各2min脫蠟，水化。天狼星紅溶液(1％星紅10ml加飽和苦味酸90ml)常溫浸泡過夜，然后0.01N鹽酸浸泡2min，80％、95％、100％乙醇、二甲苯中依次浸泡2min、干燥、固定、封片、纖維鏡觀察并攝片。

(4)免疫印跡(Western blot)法：

1)組織和細(xì)胞樣品處理：

使用RIPA裂解液在冰上使用玻璃勻漿器研磨組織(約100mg)或使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，之后將勻漿液吸入至相應(yīng)的EP管中，以16000轉(zhuǎn)/分×30min離心后取上清，取蛋白勻漿上清以1∶50比例稀釋，BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為1mg/ml。然后用4×SDS樣品緩沖液(125mM Tris-Hcl，4％SDS，20％甘油，100mM二硫蘇糖醇，0.2％溴酚藍(lán))和去離子水調(diào)整至相同濃度，按目的蛋白不同，組織上樣量為50-100ug/孔，細(xì)胞標(biāo)本為10-20ug/孔。RAPA裂解液配方：1XPBS，1％NP-40，0.1％sodiμm deoxycholate，1μm sodiμm orthovanadate，100nM PMSF，Protease Inhibitor Cocktail(1∶100稀釋)，Phosphatase Inhibitor Cocktail2(1∶100稀釋)，Phosphatase Inhibitor Cocktail3(1∶100稀釋)。

2)免疫印跡操作過程：

電泳：取樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，使用80V電壓分離出不同大小的蛋白分子；

轉(zhuǎn)膜：在4℃的轉(zhuǎn)移緩沖液(含48mM Tris-Hcl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇)中使用100V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，根據(jù)目的蛋白分子量的不同，轉(zhuǎn)膜時間為60-75min；

封閉：在室溫下用含有2％BSA的TBST孵育1h，以封閉膜上的非特異性區(qū)域；

一抗孵育：用含2％BSA的TBST稀釋一抗，然后4℃孵育過夜；

洗膜：室溫下用TBST洗膜3次，每次15min；

二抗孵育：用含有5％脫脂牛奶TBST稀釋二抗，室溫孵育1h；

洗膜：室溫下用TBST洗膜3次，每次15min；

顯色及掃描分析：用ECL液顯色檢測蛋白信號，在暗盒中用X片光將目的顯出，掃描儀掃描圖像，最后用Image J軟件分析蛋白信號的相對含量。

(5)小鼠腎臟組織免疫組化染色：

1)組織切片常規(guī)脫蠟水化：二甲苯20min×2---100％乙醇---95％乙醇---85％乙醇---70％乙醇---蒸餾水，各3分鐘。

2)切片滴加新鮮配制3％過氧化氫，室溫10min以消除內(nèi)源性過氧化酶活性，蒸餾水洗3min×3次

3)熱修復(fù)抗原：切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(PH 6.0)，微波爐熱修復(fù)，中高火加熱3分鐘左右至沸騰后停止加熱，5分鐘后重復(fù)加熱。熱修復(fù)抗原共加熱3次。冷卻后0.01M PBS漂洗3次，每次3分鐘；

4)用含2％BSA的TBST孵育1h，以封閉膜上非特異性區(qū)域；

5)甩去多余液體，滴加一抗，室溫孵育2h，0.01M PBS漂洗3次，每次3分鐘；

6)滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，0.01M PBS漂洗3次，每次3分鐘；

7)滴加辣跟酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫孵育45min，0.01M PBS漂洗3次，每次3分鐘。

8)DAB顯色：取1ml蒸餾水，加試劑盒中的A、B、C試劑各一滴，然后滴加至蓋玻片上，室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間。

9)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂片。

10)攝像：用尼康Eclipse E600型熒光顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。

(6)間接免疫熒光染色(組織冰凍切片)：

1)固定：甲醇-丙酮溶液(1∶1)于-20℃固定10min；

2)洗滌：室溫下用含有0.1BSA的PBS液洗滌2次，每次15min；

3)破膜：用0.5％TritonX-100處理10min，再用含0.1％BSA的PBS液洗滌2次，每次15min；

4)小鼠組織冰凍切片，并且一抗為鼠源性單克隆抗體時用MOM mouse Ig Blocking Reagent室溫孵育1h；

5)封閉：用含有0.1％Triton X-100和2％BSA的PBS溶液室溫封閉45min；

6)一抗孵育：用含2％BSA的PBS溶液稀釋特異性一抗，并在4℃孵育過夜；

7)洗滌：PBS液室溫洗滌3次，每次15min；

8)二抗孵育：含2％BSA的PBS溶液稀釋的二抗(1∶50-1∶100)，室溫孵育1h，避光；

9)洗滌：用含0.1％BSA的PBS液室溫洗滌3次，每次20min；

10)胞核復(fù)染及固定封片：使用VECTASHELD HardSet Mounting Mediμm with DAPI染核并封片；

11)攝像：用尼康Eclipse E600型熒光顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。