本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療肝癌。

背景技術(shù)：

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、惡性程度高、藥物治療效果差、死亡率高且預(yù)后差的惡性腫瘤之一。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是原癌基因和抑癌基因由于遺傳學(xué)改變的一個(gè)多階段多步驟的復(fù)雜過程，除此之外，表觀遺傳學(xué)的改變也廣泛存在于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。腫瘤細(xì)胞的基因組基本都有著表觀遺傳學(xué)的改變，比如DNA甲基化、組蛋白的修飾、非編碼RNA的調(diào)控、以及某些表觀遺傳學(xué)因子上調(diào)等等。非編碼RNA作為表觀調(diào)控作用的一種，在目前的腫瘤研究中得到了極大的重視，尤其是發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)表達(dá)水平的改變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮了重要作用。研究證實(shí)miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控癌基因和/或抑癌基因的表達(dá)而廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲、遷移、血管生成等，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。

miRNA在肝癌干細(xì)胞中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請是基于發(fā)明人對以下問題和事實(shí)的發(fā)現(xiàn)而提出的：

發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞腫瘤球(tumor sphere)中miR-486與對照組貼壁細(xì)胞相比顯著下調(diào)，并且miR-486在肝癌標(biāo)本與同一病人的癌旁組織相比顯著下降。進(jìn)而，發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了miR-486高表達(dá)的肝癌細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)miR-486能夠顯著抑制肝癌干細(xì)胞球的形成和體內(nèi)腫瘤形成，并且miR-486能夠抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲。同時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR486高表達(dá)能夠顯著抑制干性基因Sox2、Oct4、CD13的表達(dá)，而當(dāng)抑制miR-486的表達(dá)時(shí)，上述干性基因Sox2、Oct4、CD13顯著上調(diào)表達(dá)。

為此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療肝癌，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

uccuguacugagcugccccgag(SEQ ID NO：1)。

SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列為miR-486(微小RNA-486)的核苷酸序列，如前所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-486能夠顯著抑制肝癌干細(xì)胞球的形成和體內(nèi)腫瘤形成，并且miR-486能夠抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲，利用miR-486的核酸所制備的藥物，可有效用于預(yù)防或治療肝癌。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述用途還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于抑制肝癌干細(xì)胞球的形成、抑制體內(nèi)肝癌腫瘤的形成、抑制肝癌干細(xì)胞的增殖或抑制肝癌細(xì)胞的增殖。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞過程中，miR-486能夠顯著抑制肝癌干細(xì)胞球的形成，在體實(shí)驗(yàn)中，miR-486能夠顯著抑制肝癌腫瘤的形成，這與miR-486具有抑制肝癌干細(xì)胞的增殖或抑制肝癌細(xì)胞的增殖分不開的。利用miR-486所制備的藥物，可有效用于抑制肝癌干細(xì)胞球的形成、抑制體內(nèi)肝癌腫瘤的形成、抑制肝癌干細(xì)胞的增殖或抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于抑制干性基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-486能夠顯著抑制干性基因的表達(dá)，干性基因在肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和遷移中發(fā)揮著重要作用，利用miR-486所制備的藥物，可有效用于抑制干性基因的表達(dá)，進(jìn)而有效用于抑制肝癌干細(xì)胞則增殖、分化或遷移，用于治療或預(yù)防肝癌的療效更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述干性基因包括Sox2、Oct4和CD13的至少之一。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-486具有對Sox2、Oct4和CD13基因的顯著抑制作用，利用miR-486所制備的藥物，用于抑制Sox2、Oct4和CD13基因表達(dá)，效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸是以包括選自下列至少之一的形式提供的：

綴合物、脂質(zhì)體、前體、模擬物、表達(dá)所述核酸的構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用上述形式的至少之一，可實(shí)現(xiàn)核酸在患者體內(nèi)的特異性靶向到目標(biāo)和核酸在目標(biāo)區(qū)域發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述綴合物包括所述核酸以及包括納米顆粒、膽固醇、多肽的至少之一。納米顆粒、膽固醇、多肽與核酸所形成的綴合物，可實(shí)現(xiàn)核酸在患者體內(nèi)的特異性靶向到目標(biāo)和核酸在目標(biāo)區(qū)域發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，核酸以上述綴合物的形式提供，其穩(wěn)定性、靶向性進(jìn)一步提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述納米顆粒為聚乙烯亞胺、半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以聚乙烯亞胺、半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽作為納米顆粒結(jié)合核酸所獲得的納米顆粒-核酸綴合物的穩(wěn)定性和靶向性進(jìn)一步提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括控制序列，所述控制序列與所述核酸可操作的連接?？刂菩蛄锌捎行蚝透咝У卣{(diào)控核酸在受體細(xì)胞中的高效表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物功能發(fā)揮的有效性和有序性。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物成注射劑、緩釋微球制劑。藥物以注射劑或緩釋微球制劑的形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，可降低藥物在人體內(nèi)的降解速率，進(jìn)一步提高藥物在目標(biāo)治療位點(diǎn)的有效藥量和藥效。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物以注射、口服或灌腸原位給藥的方式給藥。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述給藥方式可進(jìn)一步提高藥物在目標(biāo)治療位點(diǎn)的有效藥量和藥效。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種用于預(yù)防或治療肝癌的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物包括：核酸，所述核酸如前面所述。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物，可實(shí)現(xiàn)對肝癌的有效治療或預(yù)防，可實(shí)現(xiàn)對肝癌干細(xì)胞球形成的有效抑制、可實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)肝癌腫瘤形成的有效抑制、可實(shí)現(xiàn)對肝癌干細(xì)胞的增殖或肝癌細(xì)胞的增殖的有效抑制，并可實(shí)現(xiàn)對干性基因，如Sox2、Oct4和CD13表達(dá)的有效抑制。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的貼壁細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞腫瘤球的形態(tài)圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的貼壁細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞腫瘤球中的包括miR-486在內(nèi)的不同miRNA的表達(dá)情況；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的不同患者的肝癌腫瘤組織及癌旁組織中miR-486的表達(dá)情況；

圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的miR-486顯著抑制肝癌腫瘤球及腫瘤體內(nèi)形成的結(jié)果圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的miR-486高表達(dá)顯著抑制干細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果圖；以及

圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的miR-486顯著抑制干性基因的表達(dá)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

需要說明的是，本發(fā)明所使用的術(shù)語“包含”為開放式表達(dá)，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其他方面的內(nèi)容。

用途

在本發(fā)明第一方面，本發(fā)明提出了核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療肝癌，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列為miR-486的核苷酸序列。

發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，肝癌干細(xì)胞腫瘤球(tumor sphere)中miR-486與對照組貼壁細(xì)胞相比顯著下調(diào)，并且發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，miR-486在肝癌標(biāo)本與同一病人的癌旁組織相比顯著下降。進(jìn)而，發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了miR-486高表達(dá)的肝癌細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)miR-486能夠顯著抑制肝癌干細(xì)胞球的形成和體內(nèi)腫瘤形成，并且miR-486能夠抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲。

利用miR-486的核酸所制備的藥物，可有效用于預(yù)防或治療肝癌。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-486能夠抑制肝癌干細(xì)胞球的形成、抑制體內(nèi)肝癌腫瘤的形成、抑制肝癌干細(xì)胞的增殖或抑制肝癌細(xì)胞的增殖。從機(jī)制的角度，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-486能夠顯著抑制干性基因的表達(dá)，如miR-486具有對Sox2、Oct4和CD13基因的顯著抑制作用，干性基因在肝癌干細(xì)胞的增殖、分化和遷移中發(fā)揮著重要作用，利用miR-486所制備的藥物，可有效用于抑制干性基因的表達(dá)，進(jìn)而有效用于抑制肝癌干細(xì)胞則增殖、分化或遷移，抑制肝癌干細(xì)胞球的形成、抑制體內(nèi)肝癌腫瘤的形成，進(jìn)而有效用于肝癌的治療或預(yù)防。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述核酸是以包括選自下列至少之一的形式提供的：綴合物、脂質(zhì)體、前體、模擬物、表達(dá)所述核酸的構(gòu)建體。

需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述綴合物包括所述核酸以及包括納米顆粒、膽固醇、多肽的至少之一。納米顆粒、膽固醇、多肽與核酸所形成的綴合物，可實(shí)現(xiàn)核酸在患者體內(nèi)的特異性靶向到目標(biāo)和核酸在目標(biāo)區(qū)域發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，核酸以上述綴合物的形式提供，其穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和靶向性進(jìn)一步提高。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實(shí)施例，所述納米顆粒為聚乙烯亞胺、半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽。聚乙烯亞胺、半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽可為線性結(jié)構(gòu)或分枝狀結(jié)構(gòu)，但其分子量并不受特別限制，聚乙烯亞胺、半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽作為納米顆粒結(jié)合核酸所獲得的納米顆粒-核酸綴合物的穩(wěn)定性和靶向性進(jìn)一步提高，且更有利于藥物的在體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)染功效。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本申請所述的脂質(zhì)體適于包裹miR-486，脂質(zhì)體的原料包括但不限于脂質(zhì)體、膽固醇和聚乙二醇磷脂。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述脂質(zhì)體具有毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、血液穩(wěn)定定高的特點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本申請所述的“前體”，代表一種物質(zhì)可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為miR-486。這樣的轉(zhuǎn)化受前體藥物在血液中水解或在血液或組織中經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為母體結(jié)構(gòu)的影響。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本申請所述的“模擬物”為miR-486的模擬物，其為miR-486雙鏈結(jié)構(gòu)，克服了單鏈容易降解和不易轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn)。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生同源重組以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括控制序列，所述控制序列與所述核酸可操作的連接?？刂菩蛄邪ǖ幌抻贑MV，EF-1，LTR或RSV，控制序列可有序和高效地調(diào)控核酸在受體細(xì)胞中的高效表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物功能發(fā)揮的有效性和有序性。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述藥物成注射劑、緩釋微球制劑。藥物以注射劑或緩釋微球制劑的形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，可降低藥物在人體內(nèi)的降解速率，進(jìn)一步提高藥物在目標(biāo)治療位點(diǎn)的有效藥量和藥效。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實(shí)施例，所述藥物以注射、口服或灌腸原位給藥的方式給藥。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述給藥方式可進(jìn)一步提高藥物在目標(biāo)治療位點(diǎn)的有效藥量和藥效。

藥物組合物

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種用于預(yù)防或治療肝癌的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物包括：核酸，所述核酸如前面所述。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的藥物組合物，可實(shí)現(xiàn)對肝癌的有效治療或預(yù)防，可實(shí)現(xiàn)對肝癌干細(xì)胞球形成的有效抑制、可實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)肝癌腫瘤形成的有效抑制、可實(shí)現(xiàn)對肝癌干細(xì)胞的增殖或肝癌細(xì)胞的增殖的有效抑制，并可實(shí)現(xiàn)對干性基因，如Sox2、Oct4和CD13表達(dá)的有效抑制。

“治療”在本發(fā)明中包括預(yù)防、緩解、抑制或治愈缺陷、功能障礙、疾病或其他有害過程，包括干擾治療和/或由治療引起的過程。

由本文所述藥物或藥物組合物都可用于臨床以處理受試者?！笆茉囌摺笔羌棺祫游?，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括但不限于人、家畜、競技動物和寵物。需要用本發(fā)明的藥物或藥物組合物治療的受試者包括肝癌受試者。因此，在某些實(shí)施例中，所述核酸存在于適于給藥即生理上相容的組合物中。因此，組合物通常還包括一種或多種緩沖劑(例如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑例如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如氫氧化鋁)、使所述制劑與接體的血液相比等滲、低滲或稍微高滲的溶質(zhì)、助懸劑、增稠劑和/或防腐劑。在其他實(shí)施例中，所述核酸可以存在于適于冷凍或儲藏的組合物中。在許多實(shí)施例中，用于給予受試者的所述核酸的純度為約100％。在其他實(shí)施例中，其為95％-100％。在其他實(shí)施方式中，其為95％-100％。優(yōu)選地，對于與其他核酸的混合物，所述百分比可為約10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-95％。或者，分離/純度可以核酸倍增的形式表示，其中核酸已發(fā)生例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多倍的核酸倍增。給定體積的核酸數(shù)量可通過廣為人知的和常規(guī)的方法和儀器測定。給定體積的核酸混合物中的核酸的百分?jǐn)?shù)可通過幾乎一樣的方法測定?？墒謩踊蛲ㄟ^使用自動核酸計(jì)數(shù)器容易地對核酸進(jìn)行計(jì)數(shù)。給定體積的特定核酸可使用特異性染色和目測以及通過使用特異性結(jié)合試劑(一般為抗體)、熒光標(biāo)記和熒光激活核酸分選器的自動化方法而測定。倚賴多種因素選擇用于為給定用途給予所述核酸的劑型。在這些因素中，重要的是受試者的物種，待治療的病癥、功能障礙或疾病的性質(zhì)及其在受試者中的狀態(tài)和分布，其他待給予的療法和試劑的性質(zhì)，給藥的最佳途徑，經(jīng)過該途徑的殘存性，給藥方案以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的因素。例如，具體地，合適載體和其他添加劑的選擇會倚賴給藥的確切途徑和特定劑型的性質(zhì)。例如，核酸活性可為基于核酸的療法的效力的一個(gè)重要決定因素。這對于主要治療和輔助治療都是成立的當(dāng)。目標(biāo)位點(diǎn)不適于核酸接種時(shí)會產(chǎn)生另一個(gè)擔(dān)心。這可能會阻止治療性核酸到達(dá)該位點(diǎn)和/或移植到那里。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例包括增加核酸活力和/或克服因接種和/或生長屏障而引起的問題的措施。受體細(xì)胞/培養(yǎng)基的水性懸液的最終配制一般包括將所述懸液的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)到等滲(即約0.1-0.2)以及將pH調(diào)節(jié)到生理pH(即約pH 6.8-7.5)。所述最終制劑通常還含有液體潤滑劑，例如麥芽糖，其必須為身體所耐受。示例性潤滑劑成分包括甘油、糖原、麥芽糖等?；谟袡C(jī)聚合物的材料，例如聚乙二醇和透明質(zhì)酸以及非纖維狀膠原(優(yōu)選琥珀酸化的膠原)，也可用作潤滑劑。這些潤滑劑通常用于在注射位置上改善所注射生物材料的注射能力、潤透性和分散性，以及通過改變所述組合物的粘性來降低推動力(spiking)。最后的配制是將所述核酸限定在可藥用載體中。隨后將所述核酸置于注射器或其他注射裝置中以精確注射到組織缺損的位點(diǎn)上。術(shù)語“可注射”指所述制劑基本不需推動即可在正常壓力和正常條件下以帶有低至25號針頭的注射器中給予。推動可導(dǎo)致組合物從注射器溢出而非注射到組織中。對于這一精確布置，需要細(xì)至27號(200μI.D.)甚至30號(150μI.D.)的針頭?？赏ㄟ^這些針頭擠出的最大顆粒大小是至少具有以下參數(shù)的復(fù)雜函數(shù)：顆粒最大尺寸、顆粒長寬比(長：寬)、顆粒剛性、顆粒表面粗糙度和影響顆粒之間粘性的有關(guān)因素、懸浮液的粘彈性，以及通過針頭的流速。懸浮于牛頓流體種的剛性圓珠代表最簡單的情況，而在粘彈性流體中的纖維性或有分支的顆粒似乎復(fù)雜得多。所述組合物的理想等滲性可使用氯化鈉或其他可藥用劑,例如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、或其他無機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)實(shí)現(xiàn)。氯化鈉特別優(yōu)選用于含有鈉離子的緩沖液。如果需要，可使用可藥用的增稠劑將所述組合物的粘性保持在選定水平上。優(yōu)選甲基纖維素，因?yàn)樗煞奖愫徒?jīng)濟(jì)地獲得并且易于使用。其他合適的增稠劑包括例如黃原膠，羧甲基纖維素，羥丙基纖維素，卡波姆等。所述增稠劑的優(yōu)選濃度取決于所選擇的試劑。重要的是使用量可實(shí)現(xiàn)選定的濃度。粘性組合物通常是通過在溶液中加入所述增稠劑而制備的?？伤幱玫姆栏瘎┗蚍€(wěn)定劑可用于增加細(xì)胞/培養(yǎng)基組合物的壽命。如果加入所述防腐劑，那么選擇不影響所述核酸活性或效力的組合物完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到所述組合物的成分在化學(xué)上應(yīng)為惰性的。這在化學(xué)和藥學(xué)原理方面不對本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)成問題?？墒褂帽竟_內(nèi)容提供的信息、本文引用的和本領(lǐng)域通?？色@得的文獻(xiàn)，參考教科書或通過簡單實(shí)驗(yàn)(不包括過度試驗(yàn))可以容易地避免問題。無菌可注射溶液可通過以下方式制備：根據(jù)需要，將用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的所述核酸與不同量的其他成分摻入所需量的合適溶劑中。

在某些實(shí)施例中，所述核酸可被制成單位劑量的可注射形式，例如溶液、懸液或乳液。適于注射的藥物制劑通常為無菌水性溶液和分散體系。用于可注射制劑的載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它們的合適混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定將在本發(fā)明方法中給予的組合物中的細(xì)胞和可選添加劑、媒介(vehicle)和/或載體的量。通常，任何添加劑(除所述細(xì)胞以外)都以0.001wt％-50wt％的量存在于溶液例如磷酸緩沖鹽水中。所述活性組分以微克至毫克量級存在，例如約0.0001wt％到約5wt％，優(yōu)選約0.0001wt％到約1wt％，最優(yōu)選約0.0001wt％到約0.05wt％，或者約0.001wt％到約20wt％，優(yōu)選約0.01wt％到約10wt％，最優(yōu)選0.05wt％到約5wt％。在某些實(shí)施例中，將細(xì)胞封裝以給藥，特別是當(dāng)膠囊化可提高治療效力時(shí)或者提供處理和/或貯藏壽命上的優(yōu)點(diǎn)時(shí)。在某些實(shí)施例中，當(dāng)膠囊化增加細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制的效力時(shí)，它也因此降低對免疫抑制藥物治療的需要。此外，在某些實(shí)施例中，膠囊化提供可進(jìn)一步降低受試者對所述細(xì)胞(通常在同種異體移植中不是免疫原性的或者只是微弱免疫原性的)的免疫反應(yīng)的針對受試者免疫系統(tǒng)的屏障，從而減輕由于給予所述核酸而可能發(fā)生的任何移植排斥或炎癥。核酸可在植入前通過膜以及膠囊進(jìn)行封裝。應(yīng)考慮到，可使用可用于核酸膠囊化的多種方法中的任意一種。在某些實(shí)施例中，所述核酸被單獨(dú)封裝。在某些實(shí)施例中，許多核酸被封裝在同一膜內(nèi)。在其中所述核酸在植入后被取出的實(shí)施例中，一個(gè)例如在單個(gè)膜內(nèi)封裝許多核酸的較大尺寸的結(jié)構(gòu)可提供方便的回收方法。在微囊化核酸的多種實(shí)施例中可使用多種材料。這些材料包括例如聚合物膠囊，藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽微膠囊、聚-L-賴氨酸藻酸鋇膠囊、藻酸鋇膠囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纖維以及聚醚砜(PES)中空纖維。某些實(shí)施例將所述核酸加入聚合物中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的實(shí)例包括但不限于纖維連接蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、膠原和蛋白多糖。其他因子例如上面討論的細(xì)胞因子也可被加入所述聚合物中。在其他實(shí)施例中，核酸可被加入三維凝膠的空隙中。大的聚合物或凝膠通常通過手術(shù)植入?？膳渲瞥勺銐蛐〉念w?；蚶w維的聚合物或凝膠可通過其他常規(guī)的、更方便的、非手術(shù)的途徑給予。具體地，對于治療肝癌的情況，所述核酸可被封裝在一個(gè)可植入受試者的裝置中。核酸可被植入到肝臟中或肝臟附近或其他位置以取代或補(bǔ)充肝臟功能。核酸也可不在裝置中而植入，例如現(xiàn)有的肝臟組織中。

組合物可根據(jù)諸如具體患者的年齡、性別、體重和病癥，以及將給藥的制劑(例如固體或液體)等因素，按劑量并通過醫(yī)藥和獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)給藥。人類或其他哺乳動物的劑量可由技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容、本文引用的文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域的知識，不需過度實(shí)驗(yàn)而得出。適用于本發(fā)明多個(gè)實(shí)施例的核酸劑量取決于多種因素。其對于不同的情況可發(fā)生相當(dāng)大的變動。可確定主要和輔助治療的最佳給藥劑量的參數(shù)包括下面的一些或全部：要治療的疾病及其階段；受試者的物種、它們的健康、性別、年齡、體重和代謝速率；受試者的免疫活性；其他正在給予的療法；以及根據(jù)受試者的歷史或基因型預(yù)測的可能并發(fā)癥。所述參數(shù)還可包括：所述細(xì)胞是同基因的、自體的、同種異體的還是異種的；它們的效能(具體活性)；使所述核酸有效而必須靶向的位點(diǎn)和/或分布；以及所述位點(diǎn)的這些特性例如核酸的可達(dá)性和/或核酸的植入性。其他參數(shù)包括與其他因子(例如生長因子和細(xì)胞因子)的共給藥。給定情況下的最佳劑量還要考慮將核酸制劑的方式、給予它們的方式、給藥后核酸定位到靶標(biāo)位點(diǎn)的程度。最后，最佳劑量的確定必須提供這樣的有效劑量，即所述劑量既不低于最大有益效果的閾值也不高于劑量相關(guān)的有害作用超過增加劑量的益處的閾值。對于某些實(shí)施例，核酸的最佳劑量處在用于自體、單核骨髓移植的劑量范圍內(nèi)。對于非常純的核酸制劑，在不同實(shí)施例中，每次給藥的最佳劑量可為10⁴～10⁸個(gè)細(xì)胞/kg接受者質(zhì)量。在某些實(shí)施例中，每次給藥的最佳劑量為10⁵～10⁷個(gè)細(xì)胞/kg。在許多實(shí)施例中，每次給藥的最佳劑量為5×10⁵～5×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg。應(yīng)理解，單份劑量可一次、分份或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)遞送。也可將整份劑量遞送到一個(gè)位置或分散到若干個(gè)位置。

在各種實(shí)施例中，核酸可以一個(gè)初始劑量給藥，然后通過再次給藥保持。核酸可在開始通過一種方法給藥，然后通過相同方法或者一種或多種不同方法給藥。水平可通過繼續(xù)給予所述核酸而保持。各種實(shí)施例通過靜脈注射在開始時(shí)給予所述核酸和/或保持它們在受試者中的水平。在多種實(shí)施例中，可根據(jù)患者的病情和本文其他地方討論的其他因素使用其他給藥形式。應(yīng)注意，人類受試者接受治療的時(shí)間通常長于實(shí)驗(yàn)動物，然而，治療的長度通常與疾病過程和治療效果的長度成比例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會考慮使用在人和/或動物(諸如大鼠、小鼠、非人靈長類等)中實(shí)行的其他方法的結(jié)果，以確定用于人的合適劑量。基于這些考慮并根據(jù)本公開內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)所提供的指導(dǎo)的，這種確定可使技術(shù)人員不需過度實(shí)驗(yàn)而確定劑量。初始給藥和再次給藥或連續(xù)給藥的合適方案可以都相同或者可以是變化的。合適方案可由技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容、本文引用的文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域的知識，不需過度實(shí)驗(yàn)而得出。治療的劑量、頻率和持續(xù)時(shí)間取決于許多因素，包括疾病的性質(zhì)、受試者以及可能給予的其他療法。因此，多種方案可用于給予所述核酸的受體細(xì)胞/培養(yǎng)基。在某些實(shí)施例中，將所述核酸以一個(gè)劑量給予受試者。在其他一些實(shí)施例中，將所述核酸以一系列的兩個(gè)劑量或多個(gè)劑量連續(xù)給予受試者。在其中以一個(gè)劑量、兩個(gè)劑量和/或多于兩個(gè)的劑量給予細(xì)胞的其他一些實(shí)施例中，劑量可相同或不同，并且給藥之間的間隔可相同或不同。核酸可在各種不同時(shí)間內(nèi)以多種頻率給藥。在某些實(shí)施例中，核酸在小于1天的時(shí)間內(nèi)給藥。在其他實(shí)施例中，它們在2、3、4、5或6天的時(shí)間內(nèi)給藥。在某些實(shí)施例中，核酸在數(shù)周的時(shí)間內(nèi)以每周一次或多次給藥。在其他實(shí)施例中，核酸在數(shù)周的時(shí)間內(nèi)給藥持續(xù)一到數(shù)月。在多種實(shí)施例中，核酸可在數(shù)月的時(shí)間內(nèi)給藥。在其他實(shí)施例中，核酸可在一或數(shù)年的時(shí)間內(nèi)給藥。通常治療長度是與疾病過程的長度、所用療法的效果以及要治療的受試者的情況和反應(yīng)成比例的。

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，需要說明的是下面的實(shí)施例，僅僅是為了說明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明。另外，在下面實(shí)施例中所采用的試劑和材料也均是市售可得的，如果未明確說明，則所采用的方法和條件，也均按照公知的方法和條件進(jìn)行相關(guān)處理。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了miR-486的定量過程。

1、總RNA的提取

(1)將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以及對照組細(xì)胞消化后，PBS清洗一次，直接加入1ml Trizol試劑，反復(fù)吹打至澄清，室溫放置5min；-70℃保存。

(2)融化后的Trizol處理的細(xì)胞，加入0.2ml氯仿(1/5Trizol體積)，蓋緊離心管蓋劇烈振蕩15s，室溫放置2～3min，4℃，12000g，離心15min；

(3)可見上層水相，中間混合相，下層紅色的酚相，將上層水相(約0.5ml)轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的DEPC處理的1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇后顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃，12000rpm，離心10min；

(4)棄上清，留下膠樣粘液，加入75％的乙醇(DEPC水配置)1ml搖振洗滌后，4℃，7500rpm，離心5min；

(5)棄上清，室溫真空干燥5～10min，以20μl DEPC水反復(fù)抽吸溶解RNA，RNA濃度測定后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

注意：操作過程中戴口罩手套并注意更換，以防止RNA被RNA酶降解。

2、熒光實(shí)時(shí)定量PCR

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品以40倍比例稀釋后，使用miScriptSYBR Green PCR Kit配置如下PCR反應(yīng)體系：

引物序列如下：

U6上游引物：5＇－CGCTTCGGCAGCACATATACTA－3＇(SEQ ID NO：2)；

miR-486上游引物：5＇TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAG－3＇(SEQ ID NO：3)；

通用下游引物(miUniv3)：5'-GATTGAATCGAGCACCAGTTAC-3'(SEQ ID NO：4)。

將8聯(lián)管內(nèi)容物離心混勻后放置于BioRad IQ5PCR儀中運(yùn)行?？寺iR-486的PCR反應(yīng)條件為：95℃15min，(95℃15s，57℃30s，72℃30s)×40cycles，72℃7min，4℃∝。U6基因?yàn)閮?nèi)參，PCR條件：95℃15min，(95℃15s，57℃30s，72℃30s)×40cycles，72℃7min，4℃∝。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)平行管，重復(fù)3次。

數(shù)據(jù)分析：以U6作為內(nèi)參標(biāo)定miR-486的表達(dá)量，計(jì)算方法為2^－△ΔCt相對定量方法。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了攜帶有miR-486的慢病毒感染肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過程、肝癌干細(xì)胞腫瘤球的形成情況以及干性基因的表達(dá)情況。

(1)培養(yǎng)293T細(xì)胞。選擇生長狀態(tài)良好，長至80％匯合時(shí)即可轉(zhuǎn)染，傳代超過20代后不應(yīng)使用。

(2)制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物。在一個(gè)無菌的5ml管中，加入1.5ml無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，并依次加入4.2μg pLP1，2μg pLP2，2.8μg pLP/VSVG和5μg熒光素酶和GFP雙標(biāo)記慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，輕輕混勻。在另一個(gè)無菌的5ml管中，將42μl Lipofectamine^TM2000稀釋于1.5ml無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置5min。(注意，吸取Lipofectamine^TM 2000前要輕輕混勻。)混合以上2管液體，輕輕混勻。室溫孵育20min以形成DNA-Lipofectamine^TM 2000復(fù)合物。

(3)在DNA-lipid復(fù)合物形成過程中，將已生長至80％融合的293T細(xì)胞更換9ml新鮮的含血清的生長培養(yǎng)基。(注意：培養(yǎng)基中不能含有抗生素。)

(4)將DNA-Lipofectamine^TM 2000復(fù)合物加入到含有新鮮生長培養(yǎng)基的10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。(注意：培養(yǎng)基中不能含有抗生素。)

(5)輕輕地前后移動培養(yǎng)皿混勻。將細(xì)胞置于37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-10h。

(6)用10ml包含丙酮酸鈉的完全培養(yǎng)基(高糖DMEM，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1％青-鏈霉素，1mM丙酮酸鈉)更換含有DNA-Lipofectamine復(fù)合物的培養(yǎng)基。VSVG糖蛋白會使293T融合形成多核合胞體，這種形態(tài)上的改變是正常的，不影響慢病毒的產(chǎn)生。

(7)轉(zhuǎn)染48h～72h后收集上清于15ml無菌離心管中。(注意：此時(shí)操作的是有感染性的病毒，請帶口罩和手套。)

(8)4℃，1000rpm離心5min去除細(xì)胞碎片，0.45μm濾膜過濾，按毒液/40％PEG體積比3：1的比例加入15ml塑料離心管，4℃轉(zhuǎn)式搖床搖動混勻5-6h。

(9)4℃，3000rpm離心30min，用1ml含血清的新鮮培養(yǎng)基重懸病毒凍存于-70℃冰箱備用。

(10)病毒感染肝癌Huh7和PLC細(xì)胞。

取生長狀態(tài)良好的Huh7和PLC細(xì)胞，加入上述制備的熒光素酶載體的慢病毒毒液，同時(shí)加入8μg/ml的Polybrene，置于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24h后去除毒液，添加完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長80～90％匯合時(shí)，傳代擴(kuò)增至75cm²培養(yǎng)瓶后，進(jìn)行流式分選GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

發(fā)明人進(jìn)一步觀察了上述轉(zhuǎn)染了攜帶有miR-486的慢病毒的肝癌細(xì)胞的肝癌干細(xì)胞球的形成情況，結(jié)果如圖4A所示，結(jié)果顯示，miR-486外源高表達(dá)顯著抑制肝癌干細(xì)胞腫瘤球的形成。

更進(jìn)一步地，發(fā)明人分析了攜帶有miR-486的慢病毒的肝癌細(xì)胞和對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞)中干性基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示，miR-486顯著抑制干性基因Sox2、Oct4和CD13的表達(dá)，而抑制miR-486的表達(dá)則上調(diào)Sox2、Oct4和CD13基因的表達(dá)。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了肝癌干細(xì)胞腫瘤球的培養(yǎng)過程和不同細(xì)胞和組織中miR-486表達(dá)量的分析過程。

消化肝癌細(xì)胞Huh7和PLC，計(jì)數(shù)后按1000個(gè)細(xì)胞/ml接種于低吸附的六孔板中，培養(yǎng)基為干細(xì)胞腫瘤球培養(yǎng)基，每隔三天補(bǔ)入1ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)6-8天后，在顯微鏡下觀察腫瘤球(tumor sphere)的體積和計(jì)數(shù)tumor sphere的數(shù)量。

其中，圖1顯示了貼壁細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞腫瘤球的形態(tài)。

發(fā)明人進(jìn)一步對貼壁細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞腫瘤球中的包括miR-486在內(nèi)的不同miRNA的表達(dá)情況，依據(jù)實(shí)施例1所述的方法，進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯所示，miR-486在肝癌干細(xì)胞腫瘤球中低表達(dá)。

更進(jìn)一步地，發(fā)明人對取自不同患者的肝癌腫瘤組織及癌旁組織中miR-486，依據(jù)實(shí)施例1所述的方法，進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-486的表達(dá)顯著下調(diào)。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了裸鼠皮下成瘤模型的構(gòu)建過程和成瘤情況的觀察。

操作過程如下：

1)常規(guī)培養(yǎng)所用的對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞)或轉(zhuǎn)染了攜帶有miR-486的慢病毒載體的肝癌細(xì)胞，擴(kuò)增足夠數(shù)量，準(zhǔn)備接種。

2)胰酶消化細(xì)胞，離心收集后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含有20％Matrigel的PBS重懸細(xì)胞。一般接種量是0.2ml/只，其中含有4×10⁶個(gè)腫瘤細(xì)胞。將準(zhǔn)備注射的細(xì)胞置于冰上。

3)待注射的裸鼠用乙醚進(jìn)行短暫昏迷，用1ml注射器將細(xì)胞懸液打到側(cè)腹部皮下，或者肩背部皮下。每只裸鼠左右兩側(cè)分別為對照組和實(shí)驗(yàn)組。

4)實(shí)驗(yàn)裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)約一個(gè)月，定時(shí)觀察腫瘤變化，如用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積并記錄數(shù)值，取出瘤體后測量重量并記錄數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B所示，結(jié)果顯示，miR-486外源高表達(dá)顯著抑制肝癌體內(nèi)腫瘤形成。

實(shí)施例5

在本實(shí)施例中，發(fā)明人詳細(xì)介紹了Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過程。

(1)制備侵襲小室：Matrigel膠在常溫下很快會凝固，因此，將其從-20℃取出后置于4℃融解，且整個(gè)過程都置于冰上操作。用無血清培養(yǎng)基稀釋(1：5～1：8)后，取400μl鋪到Transwell膜上，將Transwell小室放在6孔板中，于37℃孵箱放置3h使其凝固。

(2)接種細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞(包括對照細(xì)胞，即轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了攜帶有miR-486的慢病毒質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞)消化離心后，用無血清培養(yǎng)基重懸。在小室內(nèi)加入1ml腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為3×10⁵～6×10⁵(依腫瘤細(xì)胞侵襲能力選擇合適的細(xì)胞數(shù))。小室外加入3ml含1.5％胎牛血清的培養(yǎng)基。

(3)培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)24～48h(依腫瘤細(xì)胞侵襲能力而定)。

(4)固定及染色：取出Transwell小室，PBS洗一次，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，用1％結(jié)晶紫-甲醛溶液進(jìn)行固定并染色20～30min，吸去染色液，然后用自來水緩慢洗去殘留染色液，空氣干燥。

(5)鏡檢：在倒置顯微鏡下拍照，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示，miR-486高表達(dá)顯著抑制干細(xì)胞侵襲能力。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。