本發(fā)明涉及醫(yī)用配制品，尤其是眼科外用抗細(xì)菌感染的藥物。
背景技術(shù)：
：多種細(xì)菌均能侵襲人體眼部表面，造成眼部細(xì)菌感染，最常見的是細(xì)菌性結(jié)膜炎和細(xì)菌性角膜炎。此類患者若沒有接受及時(shí)而有效的治療或治療方法不當(dāng)，可導(dǎo)致眼結(jié)膜嚴(yán)重?fù)p傷、角膜潰瘍穿孔，使視力下降甚至失明。臨床研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物是治療這兩種眼部疾病較為有效的藥物。鹽酸左氧氟沙星是第三代喹諾酮類抗生素，它可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，破壞細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，使其DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制無法進(jìn)行，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的細(xì)胞本體凋亡。此外，鹽酸左氧氟沙星的抗菌譜較廣，涵蓋了大部分的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及丙酸桿菌等易誘發(fā)眼部感染性疾病的厭氧菌屬。因此，目前臨床常用鹽酸左氧氟沙星滴眼液治療敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性結(jié)膜炎、細(xì)菌性角膜炎。然而，目前臨床使用的不含增稠劑的鹽酸左氧氟沙星滴眼液不能在眼內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間停留，需要多次滴眼才能維持有效治療濃度；傳統(tǒng)左氧氟沙星滴眼液/鹽酸左氧氟沙星滴眼液/乳酸左氧氟沙星滴眼液等滴眼液均采用苯扎氯銨(BAC)作為防腐劑，防腐劑能抑制滴眼液儲(chǔ)存和使用過程的細(xì)菌污染，但是對(duì)于需要長(zhǎng)期使用滴眼劑的患者，滴眼液中的防腐劑可破壞角膜上皮脂質(zhì)層，改變細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致更多的活性化合物透過。防腐劑還會(huì)引起如結(jié)膜充血、流淚、畏光、灼燒或刺痛感等過敏反應(yīng)，防腐劑不僅損害眼表分泌黏液的細(xì)胞，導(dǎo)致淚腺功能退化，甚至?xí)p害眼睛導(dǎo)致盲目。因此，開發(fā)一種能在眼內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間停留，靠自身抑菌能力就能防止儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用過程的細(xì)菌污染的治療敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性結(jié)膜炎、細(xì)菌性角膜炎的藥物成為亟待解決的事情。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種局部作用效果好、生物利用度高、性質(zhì)穩(wěn)定、毒副作用較小、藥物主要在局部起作用的治療敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性結(jié)膜炎、細(xì)菌性角膜炎的藥物制劑。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液，是以鹽酸左氧氟沙星為藥效原料，配以玻璃酸鈉起增稠劑作用，再配以眼局部可以接受的藥劑學(xué)上所說的金屬離子絡(luò)合劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和pH調(diào)節(jié)劑，所制備成的眼用制劑，每100重量份成品制劑中鹽酸左氧氟沙星的含量為0.30～1.00重量份；每100重量份成品制劑中玻璃酸鈉的含量為0.1～1.00重量份；玻璃酸鈉的最佳用量為，每100重量份成品制劑中玻璃酸鈉的含量為0.488％重量份。所述金屬離子絡(luò)合劑為依地酸二鈉、葡萄糖酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、氨基三乙酸中任何一種或所述品種的任意組合。金屬離子絡(luò)合劑的用量以與鹽酸左氧氟沙星的重量比表示為，鹽酸左氧氟沙星∶金屬離子絡(luò)合劑＝1∶0.01～0.50。所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、硼酸、硼砂、甘油、甘露醇中的任何一種或所述品種的任意組合，調(diào)節(jié)滴眼液的滲透壓摩爾濃度為280～330mOsmol/kg。所述pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉、鹽酸、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、硼酸、硼砂中的任何一種或所述品種的任意組合，調(diào)節(jié)成品藥劑的pH值為5.0～7.0。按本發(fā)明方法制備的不含防腐劑的鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液，利用鹽酸左氧氟沙星自身的廣泛的抗菌殺菌能力，除了能治療敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性結(jié)膜炎、細(xì)菌性角膜炎之外，還能防止儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用過程中微生物的污染，降低長(zhǎng)期使用含防腐劑滴眼液對(duì)眼表的損害風(fēng)險(xiǎn)，提高生物安全性。配方中增稠劑玻璃酸鈉是一種存在于眼部和身體其他一些位置的天然物質(zhì)。玻璃酸鈉的特性是可以在眼睛表面形成一種規(guī)則、穩(wěn)定、長(zhǎng)效的水分膜，不易被洗去，而且不會(huì)引起視力模糊并可長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)眼睛不會(huì)有干澀和刺激感。玻璃酸鈉可使治療水平的活性藥物在眼表停留時(shí)間延長(zhǎng)，提高眼內(nèi)生物利用度，顯著減少給藥次數(shù)，有助于增加患者的依從性和治療成功率，且能減輕藥物對(duì)眼的刺激，促進(jìn)眼部創(chuàng)傷的愈合，緩解眼部不適癥狀。附圖說明圖1為實(shí)驗(yàn)例2插圖，圖的名稱為本發(fā)明滴眼液和參比制劑給藥后的平均藥-時(shí)曲線(n＝5)具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1-6制備不含防腐劑的鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液原料組分和用量按本發(fā)明技術(shù)方案，配制不含防腐劑的鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液可選用的輔料品種不限于上表所列品種，還可以有以下多種選擇：金屬離子絡(luò)合劑：可以采用藥劑學(xué)上常用的金屬離子絡(luò)合劑，如依地酸二鈉、葡萄糖酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、氨基三乙酸中任何一種或所述品種的任意組合；金屬離子絡(luò)合劑的用量以與左氧氟沙星的重量比表示為，鹽酸左氧氟沙星∶金屬離子絡(luò)合劑＝1∶0.01～0.50。使用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)成品滴眼液的滲透壓摩爾濃度為280～330mOsmol/kg；所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、硼酸、硼砂、甘油、甘露醇中的任何一種或所述品種的任意組合。使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)成品滴眼液的pH值為5.0～7.0；所述pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉、鹽酸、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、硼酸、硼砂中的任何一種或所述品種的任意組合，調(diào)節(jié)成品藥劑的pH值為5.0～7.0。制備方法為將增稠劑玻璃酸鈉用注射用水使其分散放冷，作為溶液1；用注射用水溶解金屬離子絡(luò)合劑，作為溶液2；合并二液，攪拌均勻，加入用注射用水溶解好的鹽酸左氧氟沙星，加注射用水至全量，攪勻。使用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)成品滴眼液的滲透壓摩爾濃度為260～340mOsmol/kg；使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)成品滴眼液的pH值為5.0～7.0，過濾，分裝，即得。所用制備器具及包裝容器均須滅菌。本發(fā)明不含防腐劑的鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液的有益效果通過以下實(shí)驗(yàn)例得以證明。實(shí)驗(yàn)例1藥效學(xué)試驗(yàn)按本發(fā)明實(shí)施例2記載的方法所制備的制劑作為試驗(yàn)品，采用0.3％鹽酸左氧氟沙星滴眼液(參比制劑Ⅰ，北京利祥制藥有限公司，商品名：朗悅，規(guī)格24mg：8ml)、0.3％鹽酸左氧氟沙星滴眼液(參比制劑Ⅱ，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，商品名：海倫，規(guī)格5ml：15mg)、生理鹽水作為對(duì)照品，通過藥效學(xué)試驗(yàn)，說明本發(fā)明鹽酸左氧氟沙星滴眼液具有緩釋效果，能提高治療效果。1.損傷型細(xì)菌性結(jié)膜炎模型的建立1.1感染菌懸液的制備：用0.9％氯化鈉注射液將培養(yǎng)2d的金黃色葡萄球菌液稀釋成5×109cfu·ml-1(采用標(biāo)準(zhǔn)比濁管確定)。1.2結(jié)膜損傷和結(jié)膜感染：用無菌6號(hào)針頭于兔子上瞼結(jié)膜劃4mm×4mm“+”，以剛劃破為宜，輕輕拉眼瞼成小杯形，小心地向結(jié)膜傷痕滴入2滴感染菌懸液，輕輕復(fù)原眼瞼，所有兔子的左、右眼都照同法進(jìn)行結(jié)膜感染。2.損傷型細(xì)菌性結(jié)膜炎的治療2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組：a.自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液+海倫滴眼液；b.自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液+朗悅滴眼液；c.自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液+無菌生理鹽水。每組6只動(dòng)物，每只動(dòng)物左眼和右眼分別滴入試驗(yàn)品和對(duì)照品。對(duì)感染結(jié)膜炎動(dòng)物連續(xù)用藥7d，每天上、下午各1次，每次0.1ml，觀察眼部流淚及分泌物情況，結(jié)膜充血和水腫狀況。2.2觀察指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：體征(結(jié)膜、水腫、分泌物)根據(jù)病情程度分為無、輕度、中度、重度分別計(jì)分為0分、1分、2分、3分。結(jié)膜充血分為：無充血為0分；瞼結(jié)膜充血，色鮮紅為1分；瞼結(jié)膜及穹隆結(jié)膜充血，色介于鮮紅與紫紅為2分；瞼結(jié)膜及球結(jié)膜充血，色紫紅為3分。結(jié)膜水腫分為：無水腫為0分；可見結(jié)膜水腫為1分；水腫介于1～3分之間為2分；結(jié)膜水腫突出于眼球?yàn)?分。分泌物無為0分，較少為1分，較多為2分，甚多擦之即有為3分。3.細(xì)菌性結(jié)膜炎的治療效果金黃色葡萄球菌感染24h后，兔眼呈紫紅色，伴有明顯水腫并使眼呈半閉合狀，大量分泌物浸濕眼瞼、睫毛和眼周圍區(qū)域。細(xì)菌性結(jié)膜炎的具體治療效果見表1。表1試驗(yàn)各組眼損傷計(jì)分表結(jié)果表明，樣品組在d3水腫和分泌物消失，結(jié)膜有輕微充血，d5結(jié)膜充血消失；海倫組在d3仍有輕微結(jié)膜充血和水腫，分泌物消失，d4水腫消失，d5結(jié)膜充血消失；朗悅組在d6仍有輕微結(jié)膜充血，d7完全消失；生理鹽水在d7仍有輕微結(jié)膜充血和水腫。因此，自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液治療效果好于對(duì)照組，特別是明顯優(yōu)于朗悅和生理鹽水對(duì)照，和海倫對(duì)照藥效相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)例2在兔眼房水內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)按本發(fā)明實(shí)施例2記載的方法所制備的制劑作為試驗(yàn)品，采用0.3％鹽酸左氧氟沙星滴眼液(參比制劑Ⅰ，北京利祥制藥有限公司，商品名：朗悅，規(guī)格24mg：8ml)、0.3％鹽酸左氧氟沙星滴眼液(參比制劑Ⅱ，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，商品名：海倫，規(guī)格5ml：15mg)、生理鹽水作為對(duì)照品，通過兔眼房水內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，說明本發(fā)明鹽酸左氧氟沙星滴眼液具有緩釋效果，能提高藥物的生物利用度。1.給藥方法：采用自身對(duì)照、交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，清洗期7d。健康新西蘭兔25只，隨機(jī)分為5組，每組5只10眼，實(shí)驗(yàn)過程中不禁飲水。每組先后隨機(jī)給予自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液50μl，于給藥后0.17、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6和8h抽取房水100μl，經(jīng)HPLC測(cè)定給藥后兔眼房水中左氧氟沙星的含量。7d清洗期后，給予參比制劑Ⅰ，同法處理。再經(jīng)7d清洗期后給予參比制劑Ⅱ，同法處理。2.數(shù)據(jù)分析：用3p97、MicrosoftExcel2003和Origin6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，計(jì)算半衰期t1/2和平均滯留時(shí)間MRT，利用拋物線擬合法計(jì)算tmax和Cmax。AUC0-t以梯形面積法求得，AUC0-∞＝AUC0-t+Cn/λ，并計(jì)算相對(duì)生物利用度Fr。用成對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)自制滴眼液與參比制劑Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行相對(duì)生物利用度統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。以AUC0-t計(jì)算，得出自制滴眼液對(duì)參比制劑Ⅰ、Ⅱ的相對(duì)生物利用度為213.5％和110.4％，平均藥時(shí)曲線見圖1本發(fā)明滴眼液和參比制劑給藥后的平均藥-時(shí)曲線(n＝5)圖。表2自制滴眼液和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(x±s，n＝5)結(jié)果顯示，兔眼單次給藥后，藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示鹽酸左氧氟沙星在3種制劑中均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，本制劑的AUC為參比制劑Ⅰ的2倍，生物利用度顯著提高；給藥4h后，本制劑的房水藥物濃度顯著高于參比制劑Ⅰ，作用時(shí)間顯著延長(zhǎng)；與參比制劑Ⅱ相比生物利用度無顯著差異。因此，在普通滴眼液內(nèi)加入增稠劑，可增加房水濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，提高鹽酸左氧氟沙星在眼部的療效，減少滴眼次數(shù)。實(shí)驗(yàn)例3體外細(xì)胞毒性、急性毒性、皮膚刺激性試驗(yàn)按本發(fā)明實(shí)施例2記載的方法所制備的制劑作為試驗(yàn)品。參考GB/T16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》中試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)該滴眼液的體外細(xì)胞毒性；參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，評(píng)價(jià)其急性毒性和皮膚刺激反應(yīng)。1.體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)1.1樣品的制備：a.試驗(yàn)樣品：將0.1ml自制鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴在直徑10mm的8層濾紙圓片上；b.陰性對(duì)照：直徑為10mm的高密度聚乙烯圓片；c.陽性對(duì)照：涂有鄰苯二甲酸二辛酯的直徑為10mm的聚氯乙烯圓片；d.生理鹽水對(duì)照：將0.1ml生理鹽水滴在直徑10mm的8層濾紙圓片上。1.2操作步驟：采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)細(xì)胞毒性。取正常傳代的小鼠成纖維細(xì)胞(簡(jiǎn)稱L-929細(xì)胞)10ml，接種于直徑為90mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿接種細(xì)胞3×106個(gè)，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液，加入10ml瓊脂培養(yǎng)基(3％瓊脂與2倍的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶1混合)，待其凝固后，每一平皿內(nèi)放陰、陽性及生理鹽水對(duì)照各1片、試驗(yàn)樣品2片、平行操作5皿，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24h，棄去所有樣品(試驗(yàn)樣品，陰、陽性及生理鹽水對(duì)照)，用0.01％中性紅染色20min后進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。1.3評(píng)定指標(biāo)：用倒置顯微鏡觀察試驗(yàn)樣品和陰、陽性及生理鹽水對(duì)照?qǐng)A片下及周圍褪色區(qū)域，并按表3所示指標(biāo)評(píng)價(jià)每一樣品的褪色指數(shù)和溶解指數(shù)，再按表4確定各組細(xì)胞毒性反應(yīng)的分級(jí)。表3褪色指數(shù)和溶解指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表4細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)褪色指數(shù)溶解指數(shù)說明000無細(xì)胞毒性111輕度細(xì)胞毒性22～32～3中度細(xì)胞毒性34～54～5重度細(xì)胞毒性1.4試驗(yàn)結(jié)果：各組褪色指數(shù)和溶解指數(shù)結(jié)果詳見表5。表5各組細(xì)胞褪色指數(shù)和溶解指數(shù)結(jié)果由表5分析可知，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、生理鹽水對(duì)照、試驗(yàn)樣品的細(xì)胞毒性反應(yīng)分別為0、2、1、1級(jí)。2.急性毒性試驗(yàn)2.1選小鼠20只，平均分為供試品組和空白對(duì)照組，每組10只，均采用靜脈注射方式給藥，供試品組以鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液按15mg·kg－1給藥1次，相當(dāng)于成人臨床日用量的(成人每日鹽酸左氧氟沙星為4.5mg，按成人體質(zhì)量60kg計(jì)算，劑量為0.075mg·kg－1)200倍；空白對(duì)照組給相同體積的生理鹽水。注射完畢后，觀察14d小鼠的一般狀態(tài)和死亡數(shù)，并記錄體質(zhì)量變化。2.2試驗(yàn)結(jié)果：注射后小鼠在觀察期狀況良好，活動(dòng)、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、癱瘓和死亡等毒性反應(yīng)，小鼠體質(zhì)量日漸增加。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件將空白對(duì)照組和供試品組每天的體質(zhì)量進(jìn)行組間t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表6。表6各組小鼠體質(zhì)量比較(g，x±s，n＝10)時(shí)間/d供試品組空白對(duì)照組117.5±0.617.7±0.5218.3±1.018.5±0.8319.7±1.120.2±0.8521.3±1.321.9±0.8722.8±1.323.6±0.81025.6±1.526.6±0.71430.4±1.531.6±0.6由表6可知，供試品組與空白對(duì)照組小鼠在14d內(nèi)體質(zhì)量變化沒有明顯差異，表明該滴眼液對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。3.皮膚刺激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)步驟：選用大耳白兔12只，實(shí)驗(yàn)前24h剪剃其背部脊柱兩側(cè)被毛備皮，去毛范圍為3cm×3cm，隨機(jī)分為皮膚完好組和皮膚破損組，每組6只，另在皮膚破損組兔的脊柱兩側(cè)用無菌針頭劃成“#”，以滲血為準(zhǔn)。采用同體左右側(cè)自身對(duì)照，將鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴到2.5cm×2.5cm的紗布?jí)K上，敷貼在左側(cè)背部，陰性對(duì)照將生理鹽水滴到2.5cm×2.5cm的紗布?jí)K上，敷貼在右側(cè)背部，用半封閉性包扎帶固定6h，每次用量均為1.5mg·d－1，每天1次，連續(xù)用藥7d。末次用藥24h后，用溫水去除殘留藥物，分別于1、24、48、72h連續(xù)觀察并記錄涂藥部位有無紅斑及水腫等情況。3.2評(píng)定指標(biāo)：紅斑和水腫按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：無紅斑0分，紅斑勉強(qiáng)可見為1分，紅斑明顯可見2分，嚴(yán)重紅斑3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成4分；無水腫0分，水腫勉強(qiáng)可見1分，邊緣高出周圍皮膚的水腫2分，皮膚隆起約1mm、輪廓清楚的水腫為3分，皮膚隆起1mm以上范圍擴(kuò)大的水腫4分。平均分值＝(紅斑反應(yīng)總分+水腫反應(yīng)總分)/每組動(dòng)物數(shù)，按平均分值進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)，皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表7。表7皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分值反應(yīng)類型0.0～0.49無刺激性0.5～2.99輕度刺激性3.0～5.99中度刺激性6.0～8.0強(qiáng)刺激性3.3試驗(yàn)結(jié)果：除去敷貼物后1、24、48、72h，觀察各部位皮膚組織反應(yīng)情況，皮膚完好組兔用藥側(cè)、對(duì)照側(cè)皮膚均未發(fā)現(xiàn)紅斑及水腫，皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)均為無刺激性(平均分值為0)。破損皮膚組1、24h時(shí)僅有1只出現(xiàn)紅斑和水腫，48h后反應(yīng)平均分值均為0，5d后傷口均愈合，基本恢復(fù)正常狀態(tài)，皮膚刺激評(píng)價(jià)均為無刺激性(平均分值均小于0.50)，具體結(jié)果見表8。表8各組小鼠皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果自制的不含防腐劑鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液的體外細(xì)胞毒性、急性毒性和皮膚刺激反應(yīng)均符合相關(guān)國(guó)家規(guī)范和要求。本實(shí)驗(yàn)研究證明了該滴眼液用藥的安全性，降低滴眼液對(duì)眼部的損傷作用和刺激作用。實(shí)驗(yàn)例4抑菌效力研究試驗(yàn)按本發(fā)明實(shí)施例3記載的方法所制備的制劑作為試驗(yàn)品，0.3％鹽酸左氧氟沙星滴眼液(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，商品名：海倫，規(guī)格5ml：15mg)作為對(duì)照品，通過抑菌效力研究試驗(yàn)，說明不含防腐劑的鹽酸左氧氟沙星滴眼液能利用自身抑菌作用，抑制儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用過程中可能造成的微生物污染，提高其生物安全性。研究試驗(yàn)參考《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1121抑菌效力檢查法。1.菌液制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)24h的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的TSA斜面培養(yǎng)物適量，另取經(jīng)25℃培養(yǎng)48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物適量，分別加入適量的無菌0.9％氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)約為108cfu·ml－1的菌懸液(此菌懸液用于抑菌效力實(shí)驗(yàn))。取上述菌懸液用無菌0.9％氯化鈉溶液倍量稀釋制成含菌數(shù)約為50～100cfu·ml－1的菌懸液(此菌懸液用于微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))；取經(jīng)25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液洗下孢子，制成含菌數(shù)約為107～108cfu·ml－1的孢子懸液(此孢子懸液用于抑菌效力實(shí)驗(yàn))。用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液倍量稀釋制成含孢子數(shù)約為50～100cfu·ml－1的孢子懸液(此孢子懸液用于微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))。2.微生物計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)抑菌劑及左氧氟沙星具較強(qiáng)的抗菌活性，因此，細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用薄膜過濾法削除抑菌活性。同時(shí)，氟喹諾酮藥物與金屬離子(Ca2+、Mg2+、Al3+)可發(fā)生絡(luò)合并引起其抗菌活性下降，故選擇在pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液中加入0.05mol·L－1硫酸錳。真菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)時(shí)采用直接接種法。2.1細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證方法：分別取試驗(yàn)品和對(duì)照品1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(含硫酸錳0.05mol·L－1)稀釋至100ml，全量通過薄膜過濾器后，再用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(含硫酸錳0.05mol·L－1)沖洗濾膜4次(每次400ml)，將濾膜貼至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板，測(cè)定菌數(shù)。2.2真菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證方法：分別取試驗(yàn)品和對(duì)照品1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入同一平皿中，立即傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。按直接接種法測(cè)定其菌落數(shù)。結(jié)果見表9。表9計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果3.抑菌效力測(cè)定方法3.1樣品制備：分別取試驗(yàn)品和對(duì)照品(裝量5ml)4支，轉(zhuǎn)移內(nèi)容物至具塞無菌玻璃試管中，混勻，備用。同法共制備5份。3.2樣品接種：取“1”項(xiàng)下制成的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌菌懸液(菌懸液含菌數(shù)約為108cfu·ml－1)及黑曲霉孢子懸液(孢子懸液含孢子數(shù)約為108cfu·ml－1)，分別直接接種試驗(yàn)菌0.1ml于上述5份樣品中，每一容器接種1種試驗(yàn)菌，充分混合，使樣品中的試驗(yàn)菌均勻分布。然后將接種的樣品在試驗(yàn)期間置25℃培養(yǎng)箱中，避光貯存。3.3存活菌數(shù)測(cè)定在供試品剛接種0h、6h、24h、7d、14d、28d，分別從上述每個(gè)樣品容器中取樣品1ml，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級(jí)。菌數(shù)測(cè)定方法按“2”項(xiàng)下微生物計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。其中測(cè)定細(xì)菌采用薄膜過濾法及胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；測(cè)定真菌采用直接接種法及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。測(cè)定每份供試品中所含的菌數(shù)。3.4抑菌效力試驗(yàn)結(jié)果見表10。表10抑菌效力菌量計(jì)數(shù)結(jié)果結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均能達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。因此，可利用鹽酸左氧氟沙星自身的充分抗菌效力，防止多劑量包裝的滴眼液在正常儲(chǔ)存或使用過程由于微生物的污染和繁殖對(duì)使用者造成的危害。當(dāng)前第1頁1 2 3