本發(fā)明為關(guān)于牛樟芝子實(shí)體萃取物的用途；具體而言，為用于治療紅血球和/或血小板低下。
背景技術(shù)：
：在癌癥治療上，化學(xué)治療藥物的使用扮演相當(dāng)重要的角色，然而化學(xué)治療藥物除了可毒殺癌細(xì)胞外，也對許多正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害，而造成許多副作用。一般而言，癌細(xì)胞是生長分裂速度快速的細(xì)胞，化學(xué)治療藥物的毒殺機(jī)制通常與抑制細(xì)胞分裂相關(guān)，而體內(nèi)許多正常的組織細(xì)胞的生長分裂速度也很快，因此化學(xué)治療藥物也會影響到這些細(xì)胞的生理功能，通常遭受化學(xué)治療藥物影響的細(xì)胞例如：骨髓造血細(xì)胞、消化道的表皮黏膜細(xì)胞、生殖系統(tǒng)的細(xì)胞、毛囊細(xì)胞。在前述易受化學(xué)治療藥物影響的細(xì)胞中，骨髓造血細(xì)胞為一種重要細(xì)胞，其為主要的造血組織，具有生長分裂快速的特性，依據(jù)骨髓造血細(xì)胞對化學(xué)治療藥物的感受度不同，在進(jìn)行化學(xué)藥物治療時幾乎都會出現(xiàn)程度不一的“骨髓抑制”副作用，其癥狀為白血球、紅血球及血小板數(shù)降低；其中白血球數(shù)的降低使病患容易受到感染；紅血球數(shù)降低則可能出現(xiàn)貧血，繼而出現(xiàn)虛弱、疲倦等癥狀；血小板數(shù)降低則使病患凝血功能下降。現(xiàn)階段臨床上根據(jù)骨髓抑制的態(tài)樣，而采不同的治療機(jī)制，例如針對白血球降低，使用顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，G-CSF)；針對紅血球降低則可服用鐵劑，必要時需輸血或給予紅血球生成激素(EPO)；針對血小板降低則需輸血小板來治療。然而前述處置如涉及血液制劑有安全性及供應(yīng)上的考慮，紅血球生成激素價格昂貴，使用顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子也會引起許多副作用，包括骨頭酸痛、肌肉酸痛、頭痛、疲倦、惡心、嘔吐、發(fā)燒、失眠等；在生化檢驗(yàn)上，可以發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶升高、肝功能指數(shù)升高、以及尿酸升高；此外，還對肌肉骨骼系統(tǒng)、皮膚、呼吸系統(tǒng)、心臟血管系統(tǒng)、腎功能等產(chǎn)生影響。因此在癌癥的化學(xué)藥物治療上仍須開發(fā)可妥善處理骨髓抑制副作用的藥品。牛樟芝(Antrodiacinnamomea)為中國臺灣特有真菌，屬于真菌分類學(xué)中擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的多年生菌類，僅生長于中國臺灣特有牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)的中空芯材內(nèi)壁，其子實(shí)體為一年生至多年生，呈鮮紅色、橘紅色或淡肉桂色，具有樟樹香氣。牛樟芝早期被中國臺灣原住民視為解酒良藥，具有解除宿醉的效果，含有三萜類化合物(Triterpenoids)、多醣體(Poly-saccharides)及β-葡聚糖(β-glucan)等成分，經(jīng)廣泛研究后，牛樟芝陸續(xù)證實(shí)具有抗B型肝炎病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗發(fā)炎、抗氧化、抗血管增生、降血壓、降血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、美白等功能。牛樟芝為一種真菌，其生長可分成菌絲、菌絲體、子實(shí)體、孢子體不同的階段，其栽培成本、成分組成、成分含量各不相同。菌絲及菌絲體可利用液體發(fā)酵或固體培養(yǎng)栽培，其中液體發(fā)酵成本低廉，培養(yǎng)時間短，固體發(fā)酵則能獲得與子實(shí)體外形相似的菌絲體，然而菌絲及菌絲體中所含的三萜類成分極低，在療效上遠(yuǎn)不及子實(shí)體；子實(shí)體以往僅能在野外采集，價格昂貴且付出的生態(tài)成本極大，現(xiàn)已發(fā)展出椴木栽培，利用牛樟芝宿主牛樟樹椴木為培養(yǎng)基栽培出子實(shí)體，為現(xiàn)今可與野外采集而得牛樟芝最相似、療效最佳的方式。因牛樟芝子實(shí)體所含生理活性成分種類繁多，開發(fā)其療效以擴(kuò)大牛樟芝的應(yīng)用仍為業(yè)界努力的目標(biāo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的用途，其用于制造治療紅血球和/或血小板低下的藥物，其中該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物包含牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物。前述用途優(yōu)選為用于制造治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)白血球低下的藥物或用于制造治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)體重減輕的藥物。本發(fā)明又提供一種治療紅血球和/或血小板低下的醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物，其中該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物包含牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物。前述醫(yī)藥組合物優(yōu)選用于治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)白血球低下的或用于治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)體重減輕。另一方面，前述的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物另外包含芝麻萃取物。附圖說明圖1表示THP-1細(xì)胞給予不同濃度牛樟芝子實(shí)體萃取組合物(SR4)處理24小時后，對顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor)分泌的影響。圖2表示THP-1細(xì)胞給予不同濃度牛樟芝子實(shí)體萃取組合物(SR4s)處理24小時后，對顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子分泌的影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的用途，其用于制造治療紅血球和/或血小板低下的藥物，其中該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物包含牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物。包含牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的醫(yī)藥組合物可在一個體中治療紅血球和/或血小板低下，該醫(yī)藥組合物包含有效量的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物及視需要的藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。參考以下對本發(fā)明的各態(tài)樣、實(shí)例、及伴隨相關(guān)描述的化學(xué)圖式及表格的詳細(xì)描述，可更容易地了解本發(fā)明。在揭示及描述本發(fā)明的用途及萃取物之前，應(yīng)了解，除非由申請專利范圍另外特別地指出，否則本發(fā)明不受限于特定制備方法、載劑或調(diào)配物、或?qū)⒈景l(fā)明化合物調(diào)配成用于局部、經(jīng)口或非經(jīng)腸施用的產(chǎn)物或組合物的特定模式，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚該事情是可以加以變化的。還應(yīng)了解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定態(tài)樣的目的而不旨在用于限制本發(fā)明的范圍。除非另外指出，否則如本發(fā)明所用的以下術(shù)語應(yīng)解釋為具有以下含義。范圍在本文中通常表述為“約”一個特定值和/或至“約”另一個特定值。當(dāng)表述此類范圍時，一種態(tài)樣為包括一個特定值和/或至另一個特定值的范圍。類似地，當(dāng)通過使用字“約”表述為近似值時，應(yīng)了解特定值可形成另一種態(tài)樣。另外應(yīng)了解，每一范圍的各端點(diǎn)都有顯著性，一端點(diǎn)與另一端點(diǎn)既有相關(guān)性，也彼此獨(dú)立?！耙暻闆r”或“視情況地”是指隨后所述的事件或狀況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，且該描述包括該事件或狀況發(fā)生的情況及其未發(fā)生的情況。舉例而言，“視情況包含藥劑”是指該藥劑可能存在或可能不存在。必須指出，除非上下文另外清楚規(guī)定，否則如本說明書及隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一”及“該”包括復(fù)數(shù)個所指標(biāo)的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。如本文所用的術(shù)語“個體”表示任何動物，優(yōu)選為哺乳動物，且更優(yōu)選為人類。個體的實(shí)例包括人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、母牛、馬、狗及貓。術(shù)語如本文所提供的化合物的“有效量”是指該化合物的量足以提供對所需功能(諸如基因表現(xiàn)、蛋白質(zhì)功能或誘導(dǎo)特定類型的反應(yīng))的所需調(diào)節(jié)。如下文所指出，確切的需要量將在個體之間有變化，此視個體的疾病病況、身體狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物的特性及配方等而定。給藥方案可經(jīng)調(diào)整以誘導(dǎo)最佳治療反應(yīng)。舉例而言，可每日施用若干分次劑量，或可依治療情形的緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確切的“有效量”。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定適當(dāng)?shù)挠行Я?。如本文所用的術(shù)語“治療”表示逆轉(zhuǎn)、減輕或改善此術(shù)語所適用的病癥或病狀、或該病癥或病狀之一或多種癥狀，或抑制其進(jìn)展。如本文所用的術(shù)語“載劑”或“賦形劑”是指自身并不為治療劑，而是用作用于將治療劑傳遞至個體的載劑和/或稀釋劑和/或佐劑或媒劑，或添加至調(diào)配物中以改善調(diào)配物的處理或儲存性質(zhì)或允許或有助于組合物的劑量單位形成適于經(jīng)口施用的劑量單位(諸如膠囊或錠劑)的任何物質(zhì)。適合的載劑或賦形劑為了解制造醫(yī)藥調(diào)配物或食品的技術(shù)人員所熟知。載劑或賦形劑可包括(舉例而言但不限于)緩沖劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加的物質(zhì)、調(diào)味劑、染料、芳香劑及為改善組合物的外觀而添加的物質(zhì)?？山邮艿妮d劑或賦形劑包括檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、碳酸氫鹽緩沖劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸的鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明膠、纖維素物質(zhì)(諸如烷酸的纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點(diǎn)蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞砜(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質(zhì)體、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)、及其他藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。載劑不應(yīng)破壞治療劑的藥理學(xué)活性，且在以足以傳遞治療量的藥劑的劑量施用時應(yīng)無毒性。優(yōu)選地，該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物包含于一種組合物中。根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選為食品組合物或醫(yī)藥組合物。該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可在食品制造過程中，添加于常用的食品組合物中(也即可食用的食品或飲品或其前驅(qū)物)。幾乎所有的食品組合物都可添加根據(jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物?？商砑痈鶕?jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的食品組合物包含，但不限于糖果、烘焙食品、冰淇淋、乳制品、甜品及風(fēng)味小點(diǎn)、小吃、肉類替代產(chǎn)品、快餐食品、湯類、面食、面條、罐頭食品、冷凍食品、干制食品、冷藏食品、油脂、嬰兒食品、軟食物、或面包涂醬或其混合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可通過本發(fā)明領(lǐng)域中已知的任何方法局部或全身施用，包括但不限于通過肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)口、黏膜或外部途徑施用。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩?、調(diào)配方法及施用時程可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來決定。在本發(fā)明中，醫(yī)藥組合物可根據(jù)相應(yīng)施用途徑以多種方式調(diào)配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放調(diào)配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。在必要時，其可經(jīng)滅菌或與任何藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑混合，其中有許多藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。本文中所稱的“牛樟芝子實(shí)體萃取組合物”一詞是指包含牛樟芝子實(shí)體萃取物的組合物，特定地為包含牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物。本發(fā)明所稱的“牛樟芝”為中國臺灣特有真菌，屬真菌分類學(xué)中擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)的多年生菌類，其學(xué)名為Antrodiacinnamomea、Ganodermacomphoratum、Antrodiacamphorata或Taiwanofunguscamphoratus。本發(fā)明所稱的“牛樟芝子實(shí)體”是指牛樟芝產(chǎn)生的多細(xì)胞有性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，其上附有產(chǎn)孢的子囊、擔(dān)子等構(gòu)造，子實(shí)體是牛樟芝生活史中的有性階段，為一年生至多年生，呈鮮紅色、橘紅色或淡肉桂色，具有樟樹香氣。根據(jù)本發(fā)明的牛樟芝子實(shí)體可自牛樟樹采集而得或自牛樟樹椴木培養(yǎng)而得，優(yōu)選地，為自牛樟樹椴木培養(yǎng)而得。根據(jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物是指以二氧化碳超臨界流體萃取牛樟芝子實(shí)體所得的萃取物。超臨界流體是指當(dāng)超過臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質(zhì)會趨近于類似，最后會達(dá)成一個均勻相(homogenous)的流體狀態(tài)。超臨界流體類似氣體具有可壓縮性，兼具有類似液體的流動性，可用于萃取，也有商用的超臨界流體萃取設(shè)備可供使用，例如NATEX、SEPAREX、UHDE及臺超科都提供有商用的超臨界流體萃取設(shè)備，其型號規(guī)格一般都以萃取槽能處理的容量表示，自500g至2000kg可供選擇，可依所需選取合適的超臨界流體萃取設(shè)備。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的萃取壓力為約150bar至約1000bar；優(yōu)選為約200bar至約800bar；更優(yōu)選為約350bar至約600bar。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的萃取溫度為約25℃至約80℃；優(yōu)選為約35℃至約70℃；更優(yōu)選為約40℃至約65℃。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的二氧化碳流量為約20kg/h至約70kg/h；優(yōu)選為約30kg/h至約60kg/h；尤其優(yōu)選為約35kg/h至約55kg/h。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的萃取時間為約40分鐘至約120分鐘；優(yōu)選為約50分鐘至約100分鐘。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物為在共溶劑的存在下進(jìn)行萃取，該共溶劑例如約1％至約10％的95％乙醇。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的萃取中，牛樟芝子實(shí)體與二氧化碳超臨界流體的重量比例為約10：1至約1：10；優(yōu)選為約5：1至約1：5；更優(yōu)選為約3：1至1：3。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體先粉碎為小塊，更優(yōu)選地，將小塊攪碎為粉末。切塊和/或攪碎的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選地，該超臨界流體萃取方法進(jìn)一步包含一濃縮步驟。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物是在二氧化碳超臨界流體萃取后，以一模擬移動床(SimulatedMovingBed，簡稱SMB)及碳18固體吸附劑濃縮，并收集亨利常數(shù)為2.8以上的組份。根據(jù)本發(fā)明的模擬移動床，是根據(jù)牛樟芝活性成分的極性特性(亨利常數(shù)H)，將該牛樟芝的活性成分分離并濃縮，其實(shí)施方式如中國臺灣專利第I487531號中“濃縮步驟”所述，其相關(guān)內(nèi)容以引用方式并入本文。根據(jù)本發(fā)明的紅血球和/或血小板低下是指任何原因所引起的紅血球和/或血小板低下，例如先天性或后天性所引起，或是因其他疾病、藥物所引起。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該紅血球和/或血小板低下是因藥物導(dǎo)致的紅血球和/或血小板低下；優(yōu)選地，該藥物為治療腫瘤且具有骨髓抑制副作用的藥物，例如治療癌癥的化學(xué)治療藥物。本發(fā)明所稱的“化學(xué)治療藥物”是指抑制癌細(xì)胞分裂的藥物。本發(fā)明所稱的“骨髓抑制”是指因使用化學(xué)治療藥物，而使骨髓造血細(xì)胞正常生理狀況受影響的一種副作用，其癥狀包含白血球、紅血球和/或血小板數(shù)降低。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該腫瘤包含但不限于惡性淋巴瘤、Wilm's氏瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、骨轉(zhuǎn)移型病變的高血鈣癥或睪丸癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該藥物包含但不限于苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、阿糖胞苷(Cytarabine)、更生霉素(Dactinomycin)、博來霉素(Bleomycin)、普卡霉素(Pilcamycin)、依托泊苷(Etoposide)、亞硝基脲(nitrosourea)或環(huán)磷酰胺(cyclophosphamid)；優(yōu)選為環(huán)磷酰胺。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物另外包含芝麻萃取物。本發(fā)明所稱的“芝麻”又稱胡麻、脂麻、油麻，為胡麻科胡麻屬植物，其學(xué)名為Sesamumindicum，優(yōu)選地，是指芝麻植株的種子。本發(fā)明所稱的“芝麻萃取物”是指將芝麻種子的活性成分萃取所得的混合物，其萃取方法包含但不限于溶劑萃取、超臨界流體萃取、熱萃取、固相萃取，優(yōu)選為超臨界流體萃取，更優(yōu)選為二氧化碳超臨界流體萃取。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該芝麻萃取物為芝麻素(sesamin)，本發(fā)明所稱的“芝麻素”是指芝麻中脂溶性抗氧化群芝麻木酚素(lignans)的成份。根據(jù)本發(fā)明的芝麻與牛樟芝可分別萃取再合并為該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物，例如分別制備芝麻萃取物及牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物，再視需要添加載劑/賦形劑制得該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該芝麻萃取物及牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界流體萃取物的混合重量比例為約1：3至約3：1；更優(yōu)選為約1：2至約2：1。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的芝麻與牛樟芝子實(shí)體可合并共同使用二氧化碳超臨界流體萃取，再視需要添加載劑/賦形劑制得該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該芝麻及牛樟芝子實(shí)體的混合重量比例為約1：3至約3：1；更優(yōu)選為約1：2至約2：1。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)白血球低下，以全方位治療骨髓抑制的副作用，并改善熟知使用顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子時，雖提高周邊血內(nèi)中性球、單核球及淋巴球數(shù)目，但卻降低血色素和血小板數(shù)目的問題，也避免使用顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子所引起的副作用。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，該治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)白血球低下包含但不限于促進(jìn)白血球總數(shù)增加、促進(jìn)顆粒性白血球數(shù)增加、促進(jìn)嗜中性球數(shù)增加、促進(jìn)淋巴球數(shù)增加、促進(jìn)單核球數(shù)增加、增加顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor)分泌。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可治療紅血球和/或血小板低下并發(fā)體重減輕。由于癌癥病患幾乎都合并體重減輕，根據(jù)本發(fā)明的該牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可在治療骨髓抑制的同時一并治療體重減輕，從而更廣泛地輔助癌癥化學(xué)藥物的治療。在本發(fā)明的BALB/c小白鼠動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校槍εＵ林プ訉?shí)體萃取組合物對環(huán)磷酰胺(CTX)誘發(fā)的骨髓抑制副作用進(jìn)行功效測試，實(shí)驗(yàn)小鼠在第0天依體重分別以IP腹腔注射方式給予化學(xué)治療藥CTX300mg/kg，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生骨髓抑制的模型﹔牛樟芝子實(shí)體萃取組合物則分別在第1天到第4天開始以口服(PO)方式施用測試物質(zhì)。結(jié)果顯示施用CTX其化學(xué)治療藥毒性會造成各組小鼠在第4天紅血球數(shù)目降至低點(diǎn)，而口服牛樟芝子實(shí)體萃取組合物則可提升紅血球數(shù)目達(dá)1.19倍，在第7天也持續(xù)提升紅血球數(shù)目達(dá)1.23倍；另一方面，施用CTX在第7天會使小鼠血小板數(shù)目顯著性下降，相較于第0天，CTX會造成血小板數(shù)目下降約為50％﹔管喂不同濃度的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物具有保護(hù)血小板數(shù)目的能力。針對白血球低下而言，當(dāng)小鼠施用單一劑量的CTX(300mg/kg)，會使得小鼠的白血球數(shù)目在第4天顯著性下降至最低點(diǎn)﹔在第7天白血球數(shù)目則開始上升。針對此兩個觀察點(diǎn)(Day4、Day7)進(jìn)行分析，管喂牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的各組小鼠白血球數(shù)目也都在第4天降至最低點(diǎn)(白血球下降比例范圍約為86.7～91.5％)﹔各組小鼠在第0天施用CTX后都在第7天白血球數(shù)目開始上升。CTX組白血球在第7天上升約3倍，牛樟芝子實(shí)體萃取組合物處理下具有顯著促進(jìn)白血球數(shù)目增加的趨勢。進(jìn)一步分析牛樟芝子實(shí)體萃取組合物次族群顆粒性白血球、嗜中性球、單核球及淋巴球血球變化的影響評估。結(jié)果顯示，在第0天施用單一劑量的CTX(300mg/kg)，會造成小鼠在第4天的顆粒性白血球、嗜中性球數(shù)目降至最低點(diǎn)﹔在第7天可觀察到顆粒性白血球數(shù)目開始上升﹔而測試物牛樟芝子實(shí)體萃取組合物具有2倍的顯著性促進(jìn)顆粒性白血球上升的能力；另一方面，在第7天牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可提升嗜中性球數(shù)目達(dá)2.93倍；另外，施用化學(xué)治療藥CTX也會在第4天造成淋巴球、單核球數(shù)目顯著性減少，同時也發(fā)現(xiàn)在第7天口服牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可提升淋巴球數(shù)目達(dá)2.49倍；在單核球數(shù)目的表現(xiàn)，牛樟芝子實(shí)體萃取組合物在第7天其有促使單核球上升的潛力。針對體重減輕而言，施用單一劑量的CTX(300mg/kg)的各組小鼠，和空白組相較之下，施用CTX的小鼠在第三天其體重開始下降(約10％左右的降幅)﹔而管喂牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的小鼠則觀察到體重回升，因此本發(fā)明的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可治療體重低下。針對增加顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子分泌而言，以LPS誘發(fā)單核球細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞激素GM-CSF，作為正控制組。利用此測試平臺，探討牛樟芝子實(shí)體萃取組合物對于細(xì)胞激素GM-CSF生成量的影響，用ELISA將所測得的O.D.450nm吸光值轉(zhuǎn)換成百分比，以THP-1細(xì)胞株本身分泌的GM-CSF生成量當(dāng)作100％，正控制組則因THP-1細(xì)胞通過LPS刺激其細(xì)胞激素GM-CSF生成量平均約可增加1.6倍，當(dāng)THP-1細(xì)胞處理不同濃度的測試樣品牛樟芝子實(shí)體萃取組合物，發(fā)現(xiàn)隨著牛樟芝子實(shí)體萃取組合物濃度增加，其GM-CSF生成量也相對增加。由此結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測試物牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的濃度與GM-CSF生成量呈現(xiàn)劑量效應(yīng)(dose-dependent)的關(guān)系，高濃度100μg/ml的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物約可誘發(fā)GM-CSF生成量增加約1.3倍。以下的非限制性的實(shí)例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。這些實(shí)例不應(yīng)視為過度地限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下對本文所討論的實(shí)施例進(jìn)行修改及變化，而仍屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例牛樟芝子實(shí)體萃取組合物牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界萃取物(SR4)取105克的牛樟芝子實(shí)體，破碎成顆粒大小約為5毫米見方的顆粒，置于超臨界流體萃取設(shè)備的萃取槽中，設(shè)定該萃取槽的內(nèi)部壓力為350bar，內(nèi)部溫度為50℃，輔溶劑為95％乙醇，并以每分鐘3毫升的速率進(jìn)料，其中牛樟芝子實(shí)體與二氧化碳超臨界流體的重量比例為20：80至40：60，二氧化碳超臨界流體量為35至55kg/h)，由于該牛樟芝萃取液呈膏狀，其中仍包含有95％乙醇，另以溫度設(shè)定為30～35℃烘箱將該膏狀牛樟芝萃取液中的乙醇去除，以便進(jìn)行后續(xù)的濃縮步驟。濃縮步驟為以模擬移動床作為一種連續(xù)進(jìn)料式的純化平臺，對該牛樟芝萃取液中不同亨利常數(shù)的成份進(jìn)行群組分離；本實(shí)例模擬移動床的固定相(Stationaryphase，簡稱SP)為碳18管柱，本實(shí)例的移動相(Mobilephase，簡稱MP)為水及甲醇的混合液，該水含有0.05％的醋酸，以該移動相溶解該牛樟芝萃取物，該水及甲醇的重量比例優(yōu)選為20：80至40：60，該水及甲醇更優(yōu)選的重量比例為22：78，使該移動相的選擇因子(Selectivefactor)為大于1.3，能夠更有效地分離出不同極性特性的組份A及組份B。本實(shí)施例的模擬移動床包含至少三分離區(qū)域，其依序?yàn)棣?、β及γ區(qū)域，其中該α區(qū)域的后端設(shè)有一第一出料口Oα(稱作Extractoutlet)，該γ區(qū)域的后端設(shè)有一第二出料口Oγ(稱作Raffinateoutlet)，該進(jìn)料口I(稱作Feedinlet)則設(shè)于該β及γ區(qū)域之間。該三分離區(qū)域α、β及γ分別由二管柱c組成，該三分離區(qū)域的管柱c相互連通，該管柱c內(nèi)填充該固定相，特別地該固定相的顆粒間具有孔隙供該移動相通過，并使該移動相朝同一方向依序流經(jīng)該α、β及γ區(qū)域的管柱c內(nèi)，該固定相則以一進(jìn)料口切換裝置在一進(jìn)料口切換時間Tsw后改變該進(jìn)料口I在該三分離區(qū)域的相對位置，使該固定相相對該移動相朝另一方向模擬移動。根據(jù)模擬移動床的三角理論，所欲分離組份包括：亨利常數(shù)為2.8以上的組份A及亨利常數(shù)為2.8以下的組份B，各三分離區(qū)域α、β及γ中，該組份A的凈質(zhì)量通量FA及該組份B的凈質(zhì)量通量FB符合表1的條件，使該組份A往該區(qū)域α移動，該組份B往該區(qū)域γ移動，且各該三分離區(qū)域α、β及γ的流速比值n(各分離區(qū)域α、β及γ的流速比值分別為nα、nβ及nγ)為與所欲分離組份的極性(即組份A的亨利常數(shù)為HA，組份B的亨利常數(shù)為HB)相關(guān)，各流速比值nα、nβ及nγ應(yīng)符合如表1的條件，其中，各組份的亨利常數(shù)H為根據(jù)公式Ⅰ計算而得，T0為不被固定相吸附的物質(zhì)流經(jīng)管柱的滯留時間(T0＝1.71)，Tr為欲分離組份的滯留時間，ε為本實(shí)例所使用管柱的孔隙度(0.412)。表1：本實(shí)例各分離區(qū)域的凈質(zhì)量通量F、流速比值n與亨利常數(shù)H的條件設(shè)定區(qū)域αβγ凈質(zhì)量通量FFB>0；FA>0FB>0；FA<0FB>0；FA<0流速比值nnα>HA>HBHA>nβ>HBHA>nγ>HB本實(shí)例的模擬移動床由一液泵(HITACHIL-2130)進(jìn)行加壓，使移動相在各區(qū)域的管柱內(nèi)朝向同一方向流動，設(shè)定本實(shí)例的進(jìn)料口切換時間Tsw，以模擬該固定相朝向與該移動相流向相反的條件，并以第2表所示的條件分離該牛樟芝萃取物，并在該第一出料口Oα獲得該亨利常數(shù)為2.8以上的組份A，該第二出料口Oγ獲得該亨利常數(shù)為2.8以下的組份B，即為牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界萃取物(SR4)。牛樟芝子實(shí)體萃取組合物(SR4s)包含牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界萃取物及芝麻萃取物取250克的芝麻，置于超臨界流體萃取設(shè)備的萃取槽中，設(shè)定該萃取槽的內(nèi)部壓力為350bar，內(nèi)部溫度為50℃，輔溶劑為95％乙醇，并以每分鐘3毫升的速率進(jìn)料，其中芝麻與二氧化碳超臨界流體的重量比例為50：91，由于該芝麻萃取液呈膏狀，其中仍包含有95％乙醇，另以溫度設(shè)定為30～35℃烘箱將該膏狀芝麻萃取液中的乙醇去除，以制得芝麻萃取物。將前述所得的芝麻萃取物與牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界萃取物(SR4)依重量比7：9調(diào)配，以獲得牛樟芝子實(shí)體萃取組合物(SR4s)。牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的療效試驗(yàn)材料與方法[動物模型]以化學(xué)治療藥物環(huán)磷酰胺(CTX)施用BALB/c公鼠(mouse)，使動物產(chǎn)生因化學(xué)治療藥物誘發(fā)的骨髓抑制，觀察受試物質(zhì)是否改善由化學(xué)治療藥物所產(chǎn)生的骨髓抑制作用。[試驗(yàn)方法]實(shí)驗(yàn)動物以口服(PO)方式施用受試物，主要分析其白血球及次族群顆粒性白血球、淋巴球、紅血球及血小板數(shù)目的變化。[試驗(yàn)物質(zhì)]前述所制得的牛樟芝子實(shí)體的二氧化碳超臨界萃取物(SR4)及牛樟芝子實(shí)體萃取組合物(SR4s)。[實(shí)驗(yàn)設(shè)計]試驗(yàn)藥品及配置化學(xué)治療藥CTX(SigmaChemicalCo.CASNumber:6500-19-2(StLouis,MO,USA))、顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子(G-CSF，F(xiàn)ilgrastim,Cat.08502A,KirinBreweryCo.Ltd.,Japan)。CTX加入生理食鹽水配置終濃度為45mg/mL作為腹腔注射(IP)劑型，每只小鼠每公斤體重施用300mg。測試物SR4s、SR4分別溶于DMSO(Dimethylsulfoxide，購自sigma)，其濃度為125mg/mL﹔各組測試物濃度為12.5mg/mL以二次水稀釋十倍終濃度為1.25mg/mL的口服試劑，每公斤體重為10mg/Kg。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及分組本試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物為BALB/c小白鼠：6-8周大，雄性，所有動物購自樂斯科生物科技股份有限公司，飼育于25±2℃，濕度范圍40-70％，12小時光照/黑暗交替，其飲水不限制。購入后給予小鼠一周的適應(yīng)期，秤重后以隨機(jī)分組方式，讓各組間的平均體重?zé)o差異，動物共分十二組每組五只。化學(xué)治療藥CTX與測試物質(zhì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)小鼠于第0天依體重分別以IP腹腔注射方式施用化學(xué)治療藥CTX300mg/kg，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生骨髓抑制的模型﹔各試驗(yàn)組SR4s、SR4則分別在第1天到第4天開始以口服(PO)方式施用測試物質(zhì)。試驗(yàn)過程中，每隔三天秤重并記錄觀察小鼠的體重變化﹔在第0、4及7天進(jìn)行采血并觀察血項變化。血液學(xué)分析將實(shí)驗(yàn)動物徒手固定以臉頰采血(Lancet，facialveininMice)方式，利用采血針扎進(jìn)小鼠面部的下頜骨的后面，以離心管收集流出的血液，采得足夠的血量后以無菌紗布壓住出血口10-30sec進(jìn)行止血。將已收集的小鼠周邊微量血輕拍搖勻，取出20μL的血液，并由細(xì)胞稀釋液進(jìn)行五倍稀釋后，通過XT-1800i血液分析儀(SYSMEX)進(jìn)行血液細(xì)胞定量檢測。結(jié)果SR4s、SR4治療CTX誘發(fā)的紅血球及血小板數(shù)目低下如表1及表2所示，施用CTX其化學(xué)治療藥毒性會造成各組小鼠在第4天紅血球數(shù)目降至低點(diǎn)，而口服SR4s可提升紅血球數(shù)目達(dá)1.19倍，SR4可提升紅血球數(shù)目達(dá)1.18倍，在第7天也持續(xù)提升紅血球數(shù)目，口服SR4s可提升紅血球數(shù)目達(dá)1.17倍，SR4可提升紅血球數(shù)目達(dá)1.23倍。施用單一劑量的CTX(300mg/kg)對于小鼠的血小板數(shù)目的影響。如表2所示，施用CTX在第7天會使小鼠血小板數(shù)目顯著性下降，相較于第0天，CTX會造成血小板數(shù)目下降約為50％﹔管喂不同濃度的測試物SR4s、SR4各組都具有保護(hù)血小板數(shù)目的潛力，尤其以測試物SR4對于保護(hù)血小板數(shù)目的能力表現(xiàn)最佳。表1：第4天的血液分析結(jié)果表2：第7天的血液分析結(jié)果SR4s、SR4治療CTX誘發(fā)的白血球及其次族群顆粒性白血球、嗜中性球、單核球及淋巴球數(shù)目降低由表1及2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠施用單一劑量的CTX(300mg/kg)，會使得小鼠的白血球數(shù)目在第4天顯著性下降至最低點(diǎn)﹔在第7天白血球數(shù)目則開始上升。針對此兩個觀察點(diǎn)(Day4、Day7)進(jìn)行分析，管喂測試物SR4s、SR4的各組小鼠白血球數(shù)目也都在第4天降至最低點(diǎn)(白血球下降比例范圍約為86.7～91.5％)﹔各組小鼠在第0天施用CTX后都在第7天白血球數(shù)目開始上升。由結(jié)果得知，CTX組白血球在第7天上升約3倍，測試物SR4s、SR4處理下具有顯著性促進(jìn)白血球數(shù)目增加的趨勢(血球上升分別為7、5倍)。進(jìn)一步分析測試物SR4s、SR4對次族群顆粒性白血球、嗜中性球、單核球及淋巴球血球變化的影響評估。由表1及2結(jié)果顯示，在第0天施用單一劑量的CTX(300mg/kg)，會造成小鼠在第4天的顆粒性白血球、嗜中性球數(shù)目降至最低點(diǎn)﹔在第7天可觀察到顆粒性白血球數(shù)目開始上升﹔而測試物SR4s具有2倍的顯著性促進(jìn)顆粒性白血球上升的能力；另一方面，在第7天口服SR4可提升嗜中性球數(shù)目達(dá)2.93倍，SR4s可提升嗜中性球數(shù)目達(dá)1.99倍。另外，施用化學(xué)治療藥CTX也會在第4天造成淋巴球、單核球數(shù)目顯著性減少，在第7天口服SR4可提升淋巴球數(shù)目達(dá)2.49倍；在單核球數(shù)目的表現(xiàn)，測試物SR4s在第7天其有促使單核球上升的潛力。SR4s、SR4治療CTX誘發(fā)的體重減輕試驗(yàn)動物施用化學(xué)治療藥對體重的影響，結(jié)果顯示，施用單一劑量的CTX(300mg/kg)的各組小鼠，和空白組相較之下，施用CTX的小鼠在第三天其體重開始下降(約10％左右的降幅)，因而單一劑量的CTX(300mg/kg)其化學(xué)治療藥的毒性會造成試驗(yàn)動物小鼠體重有下降趨勢﹔而管喂測試物SR4的小鼠則觀察到體重回升，因此本發(fā)明的牛樟芝子實(shí)體萃取組合物可治療體重低下。牛樟芝子實(shí)體萃取組合物的增加顆粒性巨噬細(xì)胞株刺激因子功效實(shí)驗(yàn)材料與方法[實(shí)驗(yàn)材料]細(xì)胞株：THP-1細(xì)胞株[ATCC-TIB-202]。細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)相關(guān)所需試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetalcalfserum，F(xiàn)CS)及2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)。脂多醣(lipopolysaccharide﹔LPS，購自Sigma)、HumanGM-CSFELISAkit(Biolegend)等。[試驗(yàn)方法]THP-1細(xì)胞株培養(yǎng)：THP-1細(xì)胞是一種懸浮性-人類單核球急性白血癌細(xì)胞株(humanmonocyticleukemiacellline)，培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基含10％FCS及2-巰基乙醇，培養(yǎng)在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。約每2-3天更換一次培養(yǎng)基溶液，當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長滿約8成，則進(jìn)行繼代培養(yǎng)(subculture)。實(shí)驗(yàn)時，以Vi-cell細(xì)胞計數(shù)器計算細(xì)胞數(shù)量，再取適當(dāng)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)材料制備SR4、SR4s都溶于DMSO，濃度為125mg/ml，存放于4℃?zhèn)溆?，使用時再稀釋至所需的濃度。LPS的配制(濃度為10mg/ml)，將LPS溶于1xPBS，分裝后儲存于-20℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時，再稀釋至所需的濃度。利用THP-1細(xì)胞作為平臺進(jìn)行細(xì)胞激素GM-CSF的測試THP-1細(xì)胞4×105個/孔，種至12孔盤，培養(yǎng)六小時后，分為控制組(0μg/ml)、LPS組(1μg/ml)及實(shí)驗(yàn)組(分別加入各種不同濃度的藥物處理，0.01，0.1，1，10，100μg/ml)，各做三重復(fù)，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時。次日，將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，收集細(xì)胞上清液，并利用GM-CSFELISAkit測其細(xì)胞內(nèi)所釋放的細(xì)胞激素GM-CSF的含量。人類GM-CSFELISA檢測利用HumanGM-CSFELISA試劑盒(Biolegend)進(jìn)行細(xì)胞激素GM-CSF分析。先于96孔盤上涂覆捕捉抗體100μl/孔，4℃靜置12-16小時﹔次日，將反應(yīng)劑及待測樣品置于室溫中，回溫備用﹔將先前已涂覆的96孔盤以清洗緩沖液進(jìn)行清洗，并進(jìn)行阻斷200μl/孔，室溫靜置1小時，再以清洗緩沖液進(jìn)行清洗﹔配置標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為500，250，125，62.5，31.2，15.6，7.8pg/ml﹔再將待測樣品和已系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入96孔盤，室溫靜置2小時﹔清洗后，加入偵測抗體，室溫靜置1小時﹔清洗后，加入100μl/孔的受質(zhì)溶液(著色反應(yīng)劑A+B)，在室溫下避光反應(yīng)30分鐘，再加入終止溶液終止反應(yīng)。以ELISA讀取儀測其O.D.450nm的吸光值，并將所測得的O.D.值利用其標(biāo)準(zhǔn)曲線的R-squared，以內(nèi)插法計算其細(xì)胞激素GM-CSF的濃度。結(jié)果以LPS誘發(fā)單核球細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞激素GM-CSF，作為正控制組。利用此測試平臺，探討測試樣品SR4s、SR4對于細(xì)胞激素GM-CSF生成量的影響，其結(jié)果示于圖1及圖2。利用ELISA將所測得的O.D.450nm吸光值轉(zhuǎn)換成百分比，以THP-1細(xì)胞株本身分泌的GM-CSF生成量當(dāng)作100％，正控制組則因THP-1細(xì)胞經(jīng)由LPS刺激其細(xì)胞激素GM-CSF生成量平均約可增加1.6倍，當(dāng)THP-1細(xì)胞處理不同濃度的測試樣品SR4s，發(fā)現(xiàn)隨著SR4s濃度增加，其GM-CSF生成量也相對增加。由此結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測試物SR4s的濃度與GM-CSF生成量呈現(xiàn)劑量效應(yīng)(dose-dependent)的關(guān)系，高濃度100μg/ml的SR4s約可誘發(fā)GM-CSF生成量增加約1.3倍。上述實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的原理及其功效，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對上述實(shí)施例所做的修改及變化仍不違背本發(fā)明的精神。本發(fā)明的權(quán)利范圍應(yīng)如權(quán)利要求書所列。當(dāng)前第1頁1 2 3