本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種肝干細(xì)胞注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
在20世紀(jì)早期，有學(xué)者通過一些實驗現(xiàn)象推測成熟的肝臟具有很強的再生能力,因為其中存在著一群可分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的“祖先”細(xì)胞。目前人們對肝干細(xì)胞的存在已形成廣泛共識，它是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可以通過自身對稱性和不對稱性分裂產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型與自身完全相同的干細(xì)胞，也能產(chǎn)生肝臟組織中不同發(fā)育階段和不同分化方向的細(xì)胞，如肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和胰腺上皮細(xì)胞等。隨著對其特性的深入了解，它將代替肝細(xì)胞移植和肝臟移植成為治療器官衰竭的一種重要細(xì)胞來源，在肝細(xì)胞移植、體外人工肝、基因治療方面均有著巨大的潛力，目前現(xiàn)有技術(shù)中已有利用流產(chǎn)胎兒的肝臟組織培養(yǎng)肝臟干細(xì)胞用于治療糖尿病的先例，病取得了良好的療效。
由肝干細(xì)胞制備的干細(xì)胞注射液在臨床上可以用于治療肝硬化或糖尿病等。然而與普通生物制品和藥品不同，干細(xì)胞注射液的活性物質(zhì)是細(xì)胞，細(xì)胞在離體環(huán)境中，活性會迅速下降，傳統(tǒng)方法用含人血白蛋白的氯化鈉注射液對肝干細(xì)胞進(jìn)行保存，在8-24h以內(nèi)，細(xì)胞活性即大幅下降，無法長期保證細(xì)胞活性，例如中國專利CN102948413B中公開的肝干細(xì)胞保存液，主要由人血白蛋白、氯化鈉、葡萄糖酸鈉、醋酸鈉、氯化鉀、氯化鎂和肝素鈣組成，將肝干 細(xì)胞重懸于所述保存液中即形成注射液，細(xì)胞保存能力較差。大量研究發(fā)現(xiàn)，用含有胎牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)基的保存液可以解決細(xì)胞活性下降的問題，但是細(xì)胞接觸胎牛血清時會內(nèi)吞胎牛血清，進(jìn)而引起細(xì)胞某些蛋白表達(dá)特性的變化，細(xì)胞回輸人體后可能引起過敏反應(yīng)，且血清中含有大量未知成分，不能臨床使用。
目前，肝臟干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及擴增研究尚處于起步階段，有關(guān)肝細(xì)胞的體外擴增及肝干細(xì)胞系的建設(shè)仍然是研究的重點。由于肝干細(xì)胞表面缺乏特異性標(biāo)志，給肝干細(xì)胞的分離和鑒定帶來一定的困難，因為分離純化技術(shù)目前很不成熟，使得肝臟干細(xì)胞通過分離技術(shù)得到的數(shù)量很低，所以體外培養(yǎng)及擴增很重要。但肝臟干細(xì)胞體外培養(yǎng)時生長緩慢且很容易為成熟肝細(xì)胞而失去增殖能力，故肝干細(xì)胞的系的建立仍然是目前研究工作的難點及重點。肝干細(xì)胞是維持自我復(fù)制還是分化為成熟的功能細(xì)胞依賴于微環(huán)境、細(xì)胞生長因子、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等多種因素的相互作用與平衡，雖然人們對肝干細(xì)胞的研究作出了巨大的努力，如中國專利申請CN104630135A公開的“大規(guī)模制備肝干細(xì)胞的方法與用途”，提供了肝干細(xì)胞體外擴增的一種方法；中國專利CN101851605B中公開了一種肝干細(xì)胞的選擇培養(yǎng)基，由液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加胎牛血清、人表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素組成，并公開了一種選擇性分離并擴增肝干細(xì)胞的方法；中國專利申請CN104818245A中公開的一種肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HGF、SCF和LIF，以及應(yīng)用該培養(yǎng)基培養(yǎng)肝干細(xì)胞的方法。但至今尚未建立安全可靠、功能完全和永生化的人肝干細(xì)胞系。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的特征在于在前人研究的基礎(chǔ)上，提供了一種肝干細(xì)胞注射液，能夠長時間維持肝干細(xì)胞的活性，以及肝干細(xì)胞體外培養(yǎng) 方法及專用培養(yǎng)基，達(dá)到抑制分化，同時給予適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)位置及生長因子以促進(jìn)增殖的目的。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明一方面提供了肝干細(xì)胞在治療糖尿病的注射液中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液，該注射液包括肝干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和注射混合液；每ml注射混合液含3×105-1×107個肝干細(xì)胞和1×103-1×104個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述注射混合液由以下質(zhì)量百分比成分組成：2-8％的聚乙二醇、2-5％的精氨酸、3-7％的賴氨酸、2-6％的甲硫氨酸、4-7％的纈氨酸、0.2-0.8％的冰醋酸、3-5％的膠原蛋白、2-5％的糖胺聚糖、0.3-0.5％的維甲酸和0.8-1.2％的乙醇胺；余量為生理鹽水。
本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞注射液配方可以長時間維持肝干細(xì)胞活性，且無任何毒副成分，安全有效，成本低廉。
本發(fā)明另一方面還提供了注射液的制備方法，該方法包括如下步驟：
1)肝干細(xì)胞的培養(yǎng)；
2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；
3)將聚乙二醇、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、冰醋酸、膠原蛋白、糖胺聚糖、維甲酸和乙醇胺溶于生理鹽水中配制成復(fù)方溶液，4℃預(yù)冷備用；
4)將步驟1)所得的肝干細(xì)胞和步驟2)所得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于步驟3)所得的復(fù)方溶液中，制成單細(xì)胞懸液，使每毫升注射液中3×105-1×107個肝干細(xì)胞和1×103-1×104個臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞，得到所述注射液。
進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了培養(yǎng)所述肝干細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包含以下濃度組分：6-9mg/ml透明質(zhì)酸、60-80ng/ml肝細(xì)胞生長因子、50-75ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10-20μg/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、300-500μg/ml2′,3′-二脫氧腺苷-5-三磷酸酯、7-12mg/ml檸檬酸鐵、10-25mg/ml羧甲基纖維素鈉和3-7mg/ml左旋肉堿。
本發(fā)明所提供的肝干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，在能有效提高細(xì)胞擴增速度的同時保持肝干細(xì)胞的干性，不影響其分化性能，延長傳代次數(shù)。
另一方面，本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述肝干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)肝干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：
a.取12-16周離體胚胎，無菌取出肝臟，去掉血管，將獲得的肝臟剪碎成1-3mm3的碎塊，不斷漂洗，除去血細(xì)胞；加入含有5％雙抗的生理鹽水沖洗3遍，用膠原酶消化后，經(jīng)免疫磁珠法篩選，得到初始肝干細(xì)胞；
b.將步驟a得到的初始肝干細(xì)胞加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個/ml，接種到培養(yǎng)瓶中，于36.5℃、5％CO2的潮濕空氣條件中培養(yǎng)，每隔4天換新鮮培養(yǎng)液，15天后收獲細(xì)胞，得到原代肝干細(xì)胞；
c.當(dāng)細(xì)胞生長到密度90％時，采用胰酶消化法收集原代肝干細(xì)胞，并按照5×105的密度加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于明膠包被的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)液中加入1g/L的二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯，緩慢送氣混合均勻，于37℃、5％CO2的潮濕空氣的條件下培養(yǎng)5-7天，每隔天換新鮮培養(yǎng)液并緩慢送氣混合均勻，收獲后得到傳代肝干細(xì)胞。
其中，雙抗為細(xì)胞培養(yǎng)添加物：青霉素及鏈霉素溶液，是一種含有青霉素(10000IU)和鏈霉素(10000μg/mL)在100倍的工作濃度的混合液。
結(jié)合肝干細(xì)胞生長特性，通過大量試驗總結(jié)出上述肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及條件，能有效維持肝干細(xì)胞的最佳狀態(tài)，引導(dǎo)細(xì)胞增殖，且降低培養(yǎng)過程中肝干細(xì)胞的死亡率，縮短生長周期。
進(jìn)一步的，所述步驟b的培養(yǎng)方法中，第1-4天的培養(yǎng)基中含有3％新生牛血清；第5-12天培養(yǎng)基中含有5％羊血清。
經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)初級階段向培養(yǎng)基中加入3％新生牛血清，中后階段更換為5％的羊血清的培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)肝干細(xì)胞，能有效促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，產(chǎn)量可進(jìn)一步增加。
優(yōu)選，所述步驟b原代肝干細(xì)胞培養(yǎng)過程中PH值保持7.4-7.6，步驟c傳代肝干細(xì)胞培養(yǎng)過程中PH值保持7.2-7.4，所訴PH值由2M的NaOH調(diào)節(jié)。
進(jìn)一步優(yōu)選，所述培養(yǎng)皿的包被方法為：采用0.5％濃度的明膠去離子水溶液，37℃包被4h，吸棄溶液后加入含有5％雙抗的PBS緩沖液沖洗3遍，再加入DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗一遍，吹干即得所述明膠包被培養(yǎng)皿。
進(jìn)一步優(yōu)選，所述傳代肝干細(xì)胞收獲方法為：所述傳代肝干細(xì)胞收獲方法為：加入PH為7.3的含有0.04％膠原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)液于37℃恒溫消化7-9min，輕輕吹打后靜置，待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯沉降后，分離上層液體；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的無Ca+和Mg+離子的PBS溶液，37℃溫育15-20min，每隔2min攪拌一次，靜置待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分離上層液體并與前一次上層液體合并，離心棄上清液，沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，再次離心棄上清 液，凍存?zhèn)溆谩?/p>
采用上述收獲方法收獲傳代肝干細(xì)胞，可最大程度的收集細(xì)胞，且降低細(xì)胞收獲階段損傷率。
進(jìn)一步本發(fā)明還提供了所述的肝干細(xì)胞注射液在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞注射液，其中肝干細(xì)胞和少量臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相配合，對糖尿病的治療效果更佳；所述注射液配方可以長時間維持肝干細(xì)胞活性，4℃下條件下，可有效期長達(dá)3天，且無任何毒副成分，安全有效，成本低廉。
使用本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，能有效維持肝干細(xì)胞的最佳狀態(tài)，引導(dǎo)細(xì)胞增殖，且降低培養(yǎng)和收獲過程中肝干細(xì)胞的損傷率和死亡率，縮短生長周期；在能有效提高細(xì)胞擴增速度的同時保持肝干細(xì)胞的干性，不影響其分化性能，延長傳代次數(shù)。
具體實施方式
實施例1
一種治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液，每ml注射混合液含1×107個肝干細(xì)胞和1×103個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述注射混合液由以下質(zhì)量百分比成分組成：2％的聚乙二醇、2％的精氨酸、3％的賴氨酸、2％的甲硫氨酸、4％的纈氨酸、0.2％的冰醋酸、3％的膠原蛋白、2％的糖胺聚糖、0.3％的維甲酸和0.8％的乙醇胺；余量為生理鹽水。
實施例2
一種治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液，每ml注射混合液含3×105個肝干細(xì)胞和1×104個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述注射混合液由以下質(zhì)量百分比成分組成：8％的聚乙二醇、5％的精氨酸、7％的賴氨酸、6％的甲硫氨 酸、7％的纈氨酸、0.8％的冰醋酸、5％的膠原蛋白、5％的糖胺聚糖、0.3-0.5％的維甲酸和1.2％的乙醇胺；余量為生理鹽水。
制備方法：
1)肝干細(xì)胞的培養(yǎng)；
2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；
3)將聚乙二醇、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、冰醋酸、膠原蛋白、糖胺聚糖、維甲酸和乙醇胺溶于生理鹽水中配制成復(fù)方溶液，4℃預(yù)冷備用；
4)將步驟1)所得的肝干細(xì)胞和步驟2)所得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于步驟3)所得的復(fù)方溶液中，制成單細(xì)胞懸液，使每毫升注射液中含有3×105個肝干細(xì)胞和1×104個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所述治療糖尿病的注射液。
實施例3
一種肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包含以下濃度組分：6mg/ml透明質(zhì)酸、60ng/ml肝細(xì)胞生長因子、50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10μg/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、300μg/ml 2′,3′-二脫氧腺苷-5-三磷酸酯、7mg/ml檸檬酸鐵、10mg/ml羧甲基纖維素鈉和3mg/ml左旋肉堿。
實施例4
一種肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包含以下濃度組分：8mg/ml透明質(zhì)酸、73ng/ml肝細(xì)胞生長因子、62ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、14μg/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、410μg/ml 2′,3′-二脫氧腺苷-5-三磷酸酯、10mg/ml檸檬酸鐵、21mg/ml羧甲基纖維素鈉和 5mg/ml左旋肉堿。
實施例5
一種肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括如下步驟：
a.取12-16周離體胚胎，無菌取出肝臟，去掉血管，將獲得的肝臟剪碎成1mm3的碎塊，不斷漂洗，除去血細(xì)胞；加入含有5％雙抗的生理鹽水沖洗3遍，用膠原酶消化后，經(jīng)免疫磁珠法篩選，得到肝干細(xì)胞；
b.將步驟a得到的肝干細(xì)胞加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個/ml，接種到培養(yǎng)瓶中，于36.5℃、5％CO2的潮濕空氣條件中培養(yǎng)，每隔4天換新鮮培養(yǎng)液，15天后收獲細(xì)胞，得到原代肝干細(xì)胞；
c.當(dāng)細(xì)胞生長到密度90％時，采用胰酶消化法收集原代肝干細(xì)胞，并按照5×105的密度加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于明膠包被的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)液中加入1g/L的二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯，緩慢送氣混合均勻，于37℃、5％CO2的潮濕空氣的條件下培養(yǎng)7天，每隔天換新鮮培養(yǎng)液并緩慢送氣混合均勻，收獲后得到傳代肝干細(xì)胞。
其中，
所述肝干細(xì)胞培養(yǎng)基為包含濃度組分為：含有9mg/ml透明質(zhì)酸、80ng/ml肝細(xì)胞生長因子、75ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20μg/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、500μg/ml 2′,3′-二脫氧腺苷-5-三磷酸酯、12mg/ml檸檬酸鐵、25mg/ml羧甲基纖維素鈉和7mg/ml左旋肉堿的DMEM/F12培養(yǎng)基。
實施例6
一種肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括如下步驟：
a.取12-16周離體胚胎，無菌取出肝臟，去掉血管，將獲得的肝臟剪碎成3mm3的碎塊，不斷漂洗，除去血細(xì)胞；加入含有5％雙抗的生理鹽水沖洗3遍，用膠原酶消化后，經(jīng)免疫磁珠法篩選，得到肝干細(xì)胞；
b.將步驟a得到的肝干細(xì)胞加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106個/ml，接種到培養(yǎng)瓶中，于36.5℃、5％CO2的潮濕空氣條件中培養(yǎng)，每隔4天換新鮮培養(yǎng)液，15天后收獲細(xì)胞，得到原代肝干細(xì)胞；期間由2M的NaOH調(diào)節(jié)PH值，保持7.4-7.6；
c.當(dāng)細(xì)胞生長到密度90％時，采用胰酶消化法收集原代肝干細(xì)胞，并按照5×105的密度加入肝干細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于明膠包被的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)液中加入1g/L的二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯，緩慢送氣混合均勻，于37℃、5％CO2的潮濕空氣的條件下培養(yǎng)5天，每隔天換新鮮培養(yǎng)液并緩慢送氣混合均勻，；期間由2M的NaOH調(diào)節(jié)PH值，保持7.2-7.4；收獲后得到傳代神經(jīng)干細(xì)胞。
其中，
所述肝干細(xì)胞培養(yǎng)基為：以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包含以下濃度組分：7mg/ml透明質(zhì)酸、70ng/ml肝細(xì)胞生長因子、62ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、13μg/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白、425μg/ml 2′,3′-二脫氧腺苷-5-三磷酸酯、8mg/ml檸檬酸鐵、13mg/ml羧甲基纖維素鈉和4mg/ml左旋肉堿。其中肝干細(xì)胞培養(yǎng)步驟b中，第1-4天的培養(yǎng)基中含有3％(v/v)新生牛血清；第5-12天培養(yǎng)基中含有5％(v/v)羊血清。
所述培養(yǎng)皿的包被方法為：采用0.5％濃度的明膠去離子水溶液，37 ℃包被4h，吸棄溶液后加入含有5％雙抗的PBS緩沖液沖洗3遍，再加入DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗一遍，吹干即得所述明膠包被培養(yǎng)皿。
實施例7
一種肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，與實施例6不同的是：
進(jìn)一步限定的傳代肝干細(xì)胞收獲方法為：加入PH為7.3的含有0.04％膠原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)基溶液于37℃恒溫消化7min，輕輕吹打后靜置，待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯沉降后，分離上層液體；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的無Ca+和Mg+離子的PBS溶液，37℃溫育15min，每隔2min攪拌一次，靜置待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分離上層液體并與前一次上層液體合并，離心棄上清，沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，再次離心棄上清，凍存?zhèn)溆谩?/p>
實施例8
一種肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，與實施例7不同的是：
傳代肝干細(xì)胞收獲方法為：加入PH為7.3的含有0.04％膠原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)基溶液于37℃恒溫消化9min，輕輕吹打后靜置，待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯沉降后，分離上層液體；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的無Ca+和Mg+離子的PBS溶液，37℃溫育20min，每隔2min攪拌一次，靜置待二乙烯苯交聯(lián)的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分離上層液體并與前一次上層液體合并，在1200rmp的轉(zhuǎn)速下離心，棄上清，沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，再次離心棄上清，凍存?zhèn)溆谩?/p>
實施例9
一種治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液，每ml注射混合液含1×106個肝干細(xì)胞和7×103個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述注射混合液由以下質(zhì)量百分 比成分組成：6％的聚乙二醇、4％的精氨酸、5％的賴氨酸、3％的甲硫氨酸、5％的纈氨酸、0.5％的冰醋酸、4％的膠原蛋白、3％的糖胺聚糖、0.4％的維甲酸和0.9％的乙醇胺；余量為生理鹽水；
制備方法：
1)實施例4所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)肝干細(xì)胞；
2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；
3)復(fù)方溶液的配制：
將聚乙二醇、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、冰醋酸、膠原蛋白、糖胺聚糖、維甲酸和乙醇胺溶于生理鹽水中配制成復(fù)方溶液，4℃預(yù)冷備用；
4)肝干細(xì)胞注射液的配制：
將步驟1)所得的肝干細(xì)胞和步驟2)所得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于步驟3)所得的復(fù)方溶液中，制成單細(xì)胞懸液，使每毫升注射液中含有1×106個肝干細(xì)胞和7×103個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所述注射液。
對照實施例
一種治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液，每ml注射混合液含1×107個肝干細(xì)胞；所述注射混合液由以下質(zhì)量百分比成分組成：2％的聚乙二醇、2％的精氨酸、3％的賴氨酸、2％的甲硫氨酸、4％的纈氨酸、0.2％的冰醋酸、3％的膠原蛋白、2％的糖胺聚糖、0.3％的維甲酸和0.8％的乙醇胺；余量為生理鹽水。
試驗1：含有本發(fā)明方法獲得的肝干細(xì)胞注射液在糖尿病動物模型中的應(yīng)用
1)分組
A組：取實施例1所述的肝干細(xì)胞注射液；
B組：取對照實施例所述的肝干細(xì)胞注射液；
C組：中國專利CN101851605B中提供的肝干細(xì)胞注射液；
D組：空白組，0.9％的氯化鈉溶液。
2)試驗方法
將購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的I型糖尿病鼠模型，隨機分為A、B、C、D四組，每組10只。A、B和C兩組在第0天給鼠尾靜脈注射1ml注射液(內(nèi)含1×107個肝干細(xì)胞)，第7天和第14天以相同劑量再次注射；D組于相同時間點在尾靜脈注射同體積生理鹽水并計算鼠模型血糖大小。分別于最后一次注射后的第7天、第14天、第21天和第28天監(jiān)測鼠模型空腹血糖水平，結(jié)果如下表1所示。
表1 I型糖尿病鼠治療前后的血糖水平比較
從表1可已看出，與對照組C組相比可看出，A組、B組和C組均對I型糖尿病鼠模型具有良好的治療效果，說明肝干細(xì)胞在治療糖尿病方便有著較好的療效。與B組相比，A組療效更佳，說明本發(fā)明所述 的用于治療糖尿病的肝干細(xì)胞注射液中肝干細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相配合，對糖尿病的治療效果更佳；與C組相比，B組的療效更佳，說明本發(fā)明所述的注射液中對肝干細(xì)胞的保存和活性保持較好；經(jīng)試驗，本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞注射液靜脈注射小鼠未引起急性毒理及排斥反應(yīng)。
試驗2：注射液中肝干細(xì)胞活率檢測
1)分組
試驗組：取實施例1、2和9所述的肝干細(xì)胞注射液；
對照組：中國專利CN102948413B制成的肝干細(xì)胞重懸液。
2)試驗方法
取試驗組和對照組的肝干細(xì)胞注射液，檢測在4℃下保存24h，48h，72h的細(xì)胞活率；并將本發(fā)明所述的注射液凍存1年后，在37℃水浴復(fù)蘇，測試細(xì)胞活率；檢測方法為臺盼藍(lán)經(jīng)典染色法，檢測結(jié)果見表2。
表2肝干細(xì)胞注射液中肝干細(xì)胞的活率檢測結(jié)果
由表2可以看出，本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞注射液和對照組在0h時，細(xì)胞活率相差不大，但對照組在4℃下保存24h后降低到接近國家最低標(biāo)準(zhǔn)，48h后細(xì)胞活率已經(jīng)不能達(dá)到國家的86％標(biāo)準(zhǔn)；而本發(fā)明所述的 肝干細(xì)胞注射液在4℃下條件下，可有效期長達(dá)3天，大大方便臨床使用；另外本發(fā)明所述肝干細(xì)胞注射液無常用細(xì)胞凍存液DMSO，毒性小，但在凍存條件下也可以較好的保持肝干細(xì)胞的生命力，長時間保持細(xì)胞高存活率，各組間無差異。
試驗3：肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增情況
1)分組
試驗組：本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞培養(yǎng)基；
對照組：中國專利申請CN104818245A中所提供的肝干細(xì)胞培養(yǎng)基；2)試驗方法
體外培養(yǎng)擴增方法，選實施例6所述的方法。
3.1肝干細(xì)胞的干性和分化情況
取第10代肝干細(xì)胞，采用實施例6所述的方法收集細(xì)胞沉淀，沉淀用1mL PBS重懸計數(shù)。取6份50μL(每份含1×106個細(xì)胞)上述的傳代得到細(xì)胞懸液，分別接種在六孔培養(yǎng)板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養(yǎng)基后用PBS洗滌一次，加入2％甲醛固定3分鐘，用0.5％曲通100(Triton-100)的PBS溶液洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入PBS以及用PBS稀釋的DAPI、PBS稀釋的鼠抗人ALB單抗、PBS稀釋的鼠抗人CK19單抗、PBS稀釋的鼠抗人AFP單抗和PBS稀釋的鼠抗人Nestin單抗，在4℃冰箱過夜進(jìn)行染色/結(jié)合。染色/結(jié)合后用0.5％Triton-100的PBS洗滌3次，向鼠抗人ALB單抗的孔中加入用PBS稀釋的二抗IgG1-FITC，并向鼠抗人CK19單抗、鼠抗人AFP單抗、鼠抗人Nestin單抗的孔中加入用PBS稀釋的二抗IgG1-PE，在37 ℃下孵育1h，孵育后用PBS輕輕洗滌3次，洗滌完之后用90％甘油封閉。
熒光顯微鏡下觀測，結(jié)果顯示，試驗組95％以上的細(xì)胞呈現(xiàn)DAPI、CK19、AFP和Nestin為陽性，ALB為陰性，符合肝干細(xì)胞的特異性特征，因而證明使用本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)的肝干細(xì)胞第10代也較少出現(xiàn)分化變性的現(xiàn)象，保持了原代肝干細(xì)胞的細(xì)胞性狀；而對照組只有62％以上的細(xì)胞呈現(xiàn)上述特性，傳10代后肝干細(xì)胞分化相對嚴(yán)重。
3.2肝干細(xì)胞體外擴增情況
采用臺盼藍(lán)經(jīng)典染色法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，按照實施例6的方法培養(yǎng)擴增肝干細(xì)胞，接種時細(xì)胞為5×106個/ml，分別統(tǒng)計原代干細(xì)胞、第3代、第6代和第9代干細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果見表3。
表3肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增細(xì)胞數(shù)量
由表4可以看出，本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以有效的體外培養(yǎng)肝干細(xì)胞，而本發(fā)明所提供的肝干細(xì)胞專用培養(yǎng)基對肝干細(xì)胞的擴增培養(yǎng)非常高效，較對照組有非常顯著的差異。
結(jié)論
由上述試驗可知，本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞注射液可有效保持肝干細(xì)胞活性，4℃下條件下，可有效期長達(dá)3天，且在凍存條件下也可以較好的保持肝干細(xì)胞的生命力，長時間保持細(xì)胞高存活率，大大方便臨床使用。
使用本發(fā)明所述的肝干細(xì)胞培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，可以有效的體外培養(yǎng)肝干細(xì)胞，而本發(fā)明所提供的肝干細(xì)胞專用培養(yǎng)基對肝干細(xì)胞的擴增培養(yǎng)非常高效，而且有效保持肝干細(xì)胞未分化狀態(tài)，第10代也較少出現(xiàn)分化變性的現(xiàn)象，保持了原代肝干細(xì)胞的細(xì)胞性狀。