本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及Bcl-xL抑制劑與溶瘤病毒的聯(lián)合在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

溶瘤病毒(oncolytic virus)是一類靶向性感染并殺傷腫瘤細(xì)胞，而不破壞正常細(xì)胞的可復(fù)制病毒。溶瘤病毒療法(oncolytic virotherapy)是一種創(chuàng)新的腫瘤靶向治療策略，它利用天然的或經(jīng)基因工程改造的病毒選擇性的感染腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，達(dá)到靶向性溶解、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但是對正常細(xì)胞沒有損傷。

M1病毒(Alphavirus M1)屬于甲病毒屬(Alphavirus)，其在制備抗腫瘤藥物方面具有較好的應(yīng)用效果。例如中國發(fā)明專利申請201410425510.3公開了M1病毒能選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡而不影響正常細(xì)胞存活。然而，不同腫瘤對M1病毒的敏感性不一，對于某些腫瘤，M1病毒單獨(dú)用藥時，溶瘤作用還不夠理想。例如中國發(fā)明專利申請201410425510.3所記載的，M1作為抗腫瘤藥物使用時，對于結(jié)直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明顯；而膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌則更其次；而胃癌則最不顯著。

篩選增加溶瘤病毒腫瘤治療效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤譜及抗瘤強(qiáng)度。發(fā)明人此前申請的專利201510990705.7中，將大黃酚及其衍生生物作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑，二者組合可以將腫瘤細(xì)胞的存活率降低至39.6％，但其抗癌強(qiáng)度存在很大的進(jìn)步空間。本發(fā)明的目的在于提供一種溶瘤病毒抗瘤增效劑，能夠起到更好的抗癌效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供Bcl-xl抑制劑在制備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗瘤藥物組合物，其可以使得溶瘤病毒發(fā)揮更好的抗瘤效果。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種針對溶瘤病毒不敏感的腫瘤，安全有效的溶瘤病毒增效藥物。

發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL抑制劑可以增強(qiáng)溶瘤病毒的溶瘤效果。

所述的Bcl-xL抑制劑為抑制Bcl-xL蛋白活性的物質(zhì)、或降解Bcl-xL蛋白的物質(zhì)、或降低Bcl-xL蛋白水平的基因工具。

Bcl-2家族基因表達(dá)的蛋白稱為Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族成員是進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)控制線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)，目前已知Bcl-2家族總共由25個基因組成，其中Bax,BAD,Bak和Bok等成員可以產(chǎn)生促細(xì)胞凋亡作用，而bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w等產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡途徑中一種重要的蛋白，在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。由于bcl-2、Bcl-xL和Bal-w等Bcl-2家族蛋白在癌細(xì)胞中高度表達(dá)，因此，Bcl-2家族蛋白抑制劑可以選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤的作用。

然而，難以預(yù)見的是，并不是所有的Bcl-2家族蛋白的抑制劑均可以起到協(xié)同增強(qiáng)溶瘤病毒的溶瘤效果。

發(fā)明人通過用Bcl-xL和Bcl-w干擾片段(Si RNA)抑制這兩個基因的表達(dá)，降低相應(yīng)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)干擾Bcl-xL和Bcl-w和未干擾并未引起細(xì)胞形態(tài)病變，同時單獨(dú)應(yīng)用M1病毒也不引起細(xì)胞形態(tài)病變，只有干擾Bcl-xL聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組引起了顯著細(xì)胞形態(tài)病變，干擾Bcl-w聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組不能引起顯著細(xì)胞形態(tài)病變。此外，發(fā)明人采用單獨(dú)bcl-2的抑制劑ABT-199聯(lián)合溶瘤病毒處理腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞存活率并沒有顯著性差異，說明抑制Bcl-2不能引起M1病毒溶瘤效應(yīng)的增加。

因此發(fā)明人推測，只有通過抑制Bcl-xL才可以顯著增強(qiáng)溶瘤病毒的溶瘤效應(yīng)。針對該推測，發(fā)明人采用了抑制Bcl-xL活性化合物ABT-263或ABT-737協(xié)同溶瘤病毒尤其是M1病毒作用于腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABT-263或ABT737或其組合，均可以協(xié)同溶瘤病毒增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。

ABT-263(Navitoclax)是Bcl-2家族蛋白抑制劑中的一種，它是Bcl-xL、Bcl-2和Bcl-w蛋白的抑制劑，K_i分別為≤0.5nM，≤1nM和≤1nM，但與Mcl-1和A1結(jié)合微弱。

ABT-737是一種BH3模擬抑制劑，作用于Bcl-xL、Bcl-2和Bcl-w，EC50分別為78.7nM、30.3nM和197.8nM；但對Mcl-1、Bcl-B及Bfl-1沒有抑制作用。ABT-199(GDC-0199)是高效的Bcl-2選擇性抑制劑，Ki為0.01nM，比對Bcl-xL和Bcl-w的抑制性高4800倍以上，對Mcl-1無活性。

本發(fā)明則首次發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL抑制劑可以作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑。

本發(fā)明提供了Bcl-xL抑制劑在制備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應(yīng)用。

所述的Bcl-xL抑制劑包括但不限于(S)-Gossypol acetic acid(式1)、Apogossypol(式2)、A-1155463(式3)、AT-101(R-(-)-gossypol acetic acid，(式4)、WEHI-539及其鹽酸鹽((WEHI-539and WEHI-539hydrochloride)，(式5))、Gambogic Acid(式6)、A-1210477(式7)、ABT-263(式8)和ABT-737(式9)等抑制Bcl-xl蛋白活性的化合物?；衔锏墨@取方式可選但不限于：自己化學(xué)分離或合成或者從商業(yè)途徑購買。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，Bcl-xL抑制劑為ABT-263、ABT-737或他們的組合。

Bcl-xL抑制劑還包括針對Bcl-xl基因表達(dá)抑制工具，包括但不限于RNA干擾(RNAi)microRNA以及基因編輯或基因敲除等材料。

在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施例中，Bcl-xL蛋白抑制劑為Bcl-xL的干擾RNA片段。

所述的溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種；優(yōu)選地甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。本發(fā)明所述的甲病毒(例如M1病毒、蓋塔病毒)可以尤其地指目前已有的溶瘤病毒，但也不排除一些可能發(fā)生的自然變異或者進(jìn)行了突變、修飾、序列增加、減少等的病毒，只要這些變異、突變、修飾、序列增加或減少等的變化并不影響所說的溶瘤病毒發(fā)揮本發(fā)明所述的作用，則屬于本發(fā)明所述的同質(zhì)的病毒。所述的Bcl-xL抑制劑為能起到敲低或影響B(tài)cl-xL基因表達(dá)或者降低Bcl-xL蛋白量或蛋白活性的物質(zhì)(例如化合物、或氨基酸序列、核苷酸序列等)或工具等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對其抑制化合物或序列或者基因工具進(jìn)行修飾、替換、改變等，但只要起到上述抑制Bcl-xL的作用的，則屬于本發(fā)明的Bcl-xL抑制劑，屬于上述物質(zhì)、化合物或工具等的同質(zhì)替換。

本發(fā)明還提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含Bcl-xL抑制劑以及溶瘤病毒。本發(fā)明還提供用于治療腫瘤的藥品套裝，其包含Bcl-xL抑制劑，以及溶瘤病毒。藥品套裝區(qū)別于組合物的地方在于，在藥品套裝中，Bcl-xL抑制劑未必、并且通常不與溶瘤病毒混合存在，而是通常地被分開包裝。分開包裝的溶瘤病毒與Bcl-xL抑制劑也可含有其各自的佐劑。所述的佐劑是指在藥學(xué)中，可輔助藥物療效的手段。藥品套裝也可以包含獨(dú)立包裝的Bcl-xL抑制劑，以及獨(dú)立包裝的溶瘤病毒。藥物套裝中Bcl-xL抑制劑，以及溶瘤病毒的施用，可以是同時施用或者是以任意的前后順序施用，其中患者先用一種藥物治療，然后再給以另一種藥物。所述的患者是指哺乳動物受治療者，尤其是人類。

所述的Bcl-xL蛋白抑制劑包括但不限于(S)-Gossypol acetic acid(式1)、Apogossypol(式2)、A-1155463(式3)、AT-101(R-(-)-gossypol acetic acid，(式4)、WEHI-539及其鹽酸鹽(WEHI-539and WEHI-539hydrochloride，(式5)、Gambogic Acid(式6)、A-1210477(式7)、ABT-263(式8)和ABT-737(式9)等抑制Bcl-xl蛋白活性的化合物。或者針對Bcl-xl基因表達(dá)抑制工具，包括但不限于RNA干擾(RNAi)microRNA以及基因編輯或敲除等工具手段。優(yōu)選ABT-263、ABT-737或它們的組合。

所述的溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種；優(yōu)選地甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。在組合物或藥品套裝中，ABT-263或ABT-737與溶瘤病毒的配比可選地為：0.01～15mg:10³～10⁹PFU；優(yōu)選0.01～10mg:10⁴～10⁹PFU；進(jìn)一步優(yōu)選0.01～10mg:10⁵～10⁹PFU；

優(yōu)選使用劑量為：ABT-263或ABT-737使用范圍為0.01mg/kg至15mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10³至10⁹(PFU/kg)；優(yōu)選ABT-263或ABT-737使用范圍為0.01mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10⁴至10⁹(PFU/kg)；更優(yōu)選ABT-263使用范圍為0.1mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從10⁵至10⁹(PFU/kg)。

在一個實(shí)施方式中，所述溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種。

優(yōu)選地，所述溶瘤病毒為M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。M1病毒屬于蓋塔相似病毒，據(jù)報道在已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)病毒中，這兩者的同源性高達(dá)97.8％。。在一個實(shí)施例中，采用的溶瘤病毒為保藏編號CCTCC V201423(具體信息如中國專利104814984A所記載)的M1病毒。

所述腫瘤可以為實(shí)體瘤或血液瘤。優(yōu)選地所述實(shí)體瘤為肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌；或者優(yōu)選地，所述的腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的腫瘤；更優(yōu)選地，所述腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。更更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述腫瘤為對M1溶瘤病毒不敏感的腫瘤。

作為可選的實(shí)施方案，本發(fā)明所提供的ABT-263或ABT-737或其組合可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑、試劑盒等。作為優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的增效藥物是注射劑；優(yōu)選地，可采用靜脈注射。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了Bcl-xL抑制劑，例如ABT-263和ABT-737可以增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)，以提高溶瘤病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明M1病毒分別和ABT-263、ABT-737聯(lián)合應(yīng)用，可顯著引起腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)病變，從而顯著增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

我們聯(lián)合ABT-263或ABT-737與M1病毒作用于人肝細(xì)胞癌Hep3B株，出人意料的發(fā)現(xiàn)抗病毒化合物ABT-263或ABT-737和M1病毒聯(lián)合應(yīng)用時，顯著增加腫瘤細(xì)胞形態(tài)病變，顯著降低腫瘤細(xì)胞生存率。例如在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，當(dāng)M1病毒(MOI＝0.001)單獨(dú)處理肝癌細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞存活率為81.5％，而當(dāng)以100nM的ABT-263或ABT-737與同樣MOI的M1病毒聯(lián)用時，腫瘤細(xì)胞存活率大幅下降至25.2％。與單用M1病毒的抗腫瘤效果相比，ABT-263與M1聯(lián)用時，溶瘤效果顯著提升。

發(fā)明人此前將大黃酚及其衍生物作為M1病毒的抗癌增效劑，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50uM的大黃酚與(MOI＝0.001)M1病毒聯(lián)用后，腫瘤細(xì)胞的存活率下降至39.6％，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將100nM的ABT-263與M1病毒聯(lián)用后，腫瘤細(xì)胞的存活率顯著下降至25.2％。與大黃酚及其衍生物相比，本發(fā)明的M1抗腫瘤增效劑顯著提高了腫瘤的殺傷率，同時，ABT-263在藥物有效劑量上僅為大黃酚的千分之二，并且作用快速，用時為大黃酚的三分之二(大黃酚處理72h，ABT-263處理48h)，具備顯著優(yōu)越性。

盡管Bcl-2家族抑制劑如ABT-263、ABT-737、ABT-199等本身已經(jīng)報道，可通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl2，Bcl-xL，Bcl-w發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。然而，經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的Bcl-2家族抑制劑均能協(xié)同增強(qiáng)溶瘤病毒的溶瘤效果。Bcl-xl抑制劑非顯而易見的可以協(xié)同增強(qiáng)溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)，而Bcl-2或Bcl-w的抑制劑則不能協(xié)同增強(qiáng)溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，ABT-263或ABT-737與溶瘤病毒聯(lián)合應(yīng)用處理腫瘤細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著優(yōu)于單用相同濃度的ABT-263或ABT-737，例如當(dāng)同樣例如以100nM的ABT-263處理腫瘤細(xì)胞時，腫瘤細(xì)胞存活率仍高達(dá)88.8％，當(dāng)以100nM的ABT-263與M1病毒聯(lián)用時，腫瘤細(xì)胞存活率大幅下降至25.2％。可見，ABT-263與M1聯(lián)用時大幅提升的溶瘤效果，是得益于ABT-263與M1病毒之間的協(xié)同性機(jī)制，并非簡單地通過ABT-263的抗腫瘤機(jī)制發(fā)揮作用。

附圖說明

圖1 ABT-263與M1病毒顯著增加人肝細(xì)胞癌株形態(tài)學(xué)病變；

圖2 ABT-263/ABT-737與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人肝細(xì)胞癌株生存率。

圖3 Bcl-xL蛋白抑制劑在協(xié)同溶瘤病毒抗腫瘤的機(jī)理研究。

圖4 ABT-263與M1病毒聯(lián)合處理顯著抑制人肝細(xì)胞癌株移植瘤生長。

圖標(biāo)說明：

ABT-263：ABT-263處理組；ABT-737：ABT-737處理組；M1+ABT-263：M1病毒與ABT-263聯(lián)用處理組；M1+ABT-737：M1病毒與ABT-737聯(lián)用處理組。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施方式是對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不局限于以下的實(shí)施例介紹，凡依照本發(fā)明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應(yīng)視為本發(fā)明保護(hù)的范疇。

在沒有特別指明的情況下，本發(fā)明采用的材料及實(shí)驗(yàn)方法為常規(guī)材料及方法。

實(shí)施例1ABT-263與M1病毒顯著增加人肝細(xì)胞癌株形態(tài)學(xué)病變

材料：

人肝細(xì)胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡。

方法：

a)細(xì)胞的培養(yǎng)：人肝細(xì)胞癌Hep3B生長在含10％FBS、100U/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中；所有細(xì)胞株均置于5％CO₂,37℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95％)內(nèi)培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2～3天傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于正式實(shí)驗(yàn)。

b)細(xì)胞處理和形態(tài)學(xué)觀察：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以2.5×10⁴/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用ABT-263(100nM)單獨(dú)處理、M1病毒(MOI＝0.001)感染細(xì)胞、M1病毒(MOI＝0.001)聯(lián)合ABT-263(100nM)處理細(xì)胞，以不加M1病毒和ABT-263為對照，48時后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

結(jié)果：

如圖1所示,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，Hep3B細(xì)胞是單層貼壁生長，并且細(xì)胞緊密排列，表型一致。而ABT-263(100nM)與M1病毒(MOI＝0.001)處理48h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，較對照組細(xì)胞，與M1單獨(dú)處理組與單獨(dú)處理組比較，聯(lián)合處理組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強(qiáng)，呈死亡病變樣。

實(shí)施例2ABT-263或ABT-737與M1病毒聯(lián)合處理顯著降低人癌細(xì)胞株生存率

材料：

人肝細(xì)胞癌Hep3B，人膀胱細(xì)胞癌T24，人結(jié)直腸細(xì)胞癌LoVo，M1病毒，高糖DMEM培養(yǎng)基，自動酶聯(lián)檢測酶標(biāo)儀。

方法：

a)接種細(xì)胞、給藥處理：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，以每孔4×10³/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)。12小時后見細(xì)胞完全貼壁，實(shí)驗(yàn)分對照組，單獨(dú)ABT-263組，M1感染組和ABT-263/M1聯(lián)用組或者ABT-737/M1聯(lián)用組。所用劑量為：M1病毒感染細(xì)胞；M1病毒設(shè)不同的劑量梯度。

b)MTT與細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)：培養(yǎng)至48h時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細(xì)胞內(nèi)形成的顆粒狀藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。

c)溶解甲臜顆粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結(jié)晶，在微型振蕩器上震蕩5min，然后在酶聯(lián)檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝藥物處理組OD值/對照組OD值×100％。

結(jié)果:

如圖2a所示，M1病毒單獨(dú)處理對腫瘤細(xì)胞Hep3B具有較小的生存率抑制作用，腫瘤細(xì)胞存活率達(dá)到81.5％，100nM的ABT-263處理組腫瘤細(xì)胞存活率仍高達(dá)88.8％，然而，當(dāng)?shù)椭?00nM的ABT-263與同樣MOI的M1病毒聯(lián)用(ABT-263+M1)時，腫瘤細(xì)胞存活率大幅下降至25.2％。同樣。與M1病毒單獨(dú)處理組或單獨(dú)的ABT-263處理組相比，各劑量組ABT-263/M1聯(lián)合處理后的腫瘤細(xì)胞存活率均顯著下降。類似的結(jié)果ABT-737/M1聯(lián)合應(yīng)用在Hep3B中同樣觀察到(圖2b)，另外Bcl-xL抑制劑ABT-737與M1連用也顯著降低腫瘤細(xì)胞T24(圖2c和d)以及LoVo(圖2e和2f)的存活率。

然而，與M1病毒單獨(dú)處理組或單獨(dú)的Bcl-2選擇性抑制劑ABT-199處理組相比，各劑量組ABT-199/M1聯(lián)合處理后的腫瘤細(xì)胞存活率并沒有顯著性差異，說明抑制Bcl-2不能引起M1病毒溶瘤效應(yīng)的增加(圖2g和2h)。

實(shí)施例3抑制Bcl-xL協(xié)同M1溶瘤病毒抗腫瘤效應(yīng)

材料：

M1病毒，人肝癌細(xì)胞Hep3B，膀胱癌細(xì)胞T24，Bcl-xL和Bcl-w RNA干擾片段，MTT(甲基偶氮唑藍(lán))，相差顯微鏡。

Bcl-xL干擾片段(Si RNA)：

正義鏈(SEQ ID NO.1)

5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUdTdT-3’

反義鏈(SEQ ID NO.2)

5’-ACUGACUCCAGCUGUAUCCdTdT-3’；

Bcl-w干擾片段(Si RNA)：

正義鏈(SEQ ID NO.3)

5’-CAGCUGUAUUCCAUUACAUdTdT-3’

反義鏈(SEQ ID NO.4)

5’-AUCUAAUGGAAUACAGCUGdTdT-3’

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁵的密度接種在6孔板內(nèi)。24小時后，加入脂質(zhì)體包裹的Si RNA目標(biāo)基因片段24時后，感染M1病毒。感染48小時后，處理樣本。

(1)相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)病變；

(2)收集蛋白質(zhì)樣本，進(jìn)行Western blot檢測干擾效率以及M1病毒蛋白E1、NS3。

(3)MTT法計算細(xì)胞存活率；

結(jié)果:

在分別干擾Bcl-xL和Bcl-w之后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-xL和Bcl-w(圖3b)基因表達(dá)顯著下降。但是單獨(dú)干擾Bcl-xL和Bcl-w和未干擾(CTL)或亂碼干擾組(NC)相比并未引起細(xì)胞形態(tài)病變，同時單獨(dú)應(yīng)用M1病毒也不引起細(xì)胞形態(tài)病變，只有干擾Bcl-xL聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組((siBcl-xL+M1))引起了顯著細(xì)胞形態(tài)病變，干擾Bcl-w聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組(siBcl-w+M1)不能引起顯著細(xì)胞形態(tài)病變(圖3a)；同時，MTT檢測表明(圖3c)，數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計，***表示p<0.001，數(shù)據(jù)表明只有干擾Bcl-xL聯(lián)合應(yīng)用M1病毒組引起了人肝癌細(xì)胞Hep3B，以及膀胱癌細(xì)胞T24存活率顯著下降。

以上表明，只有通過抑制Bcl-xL才可以顯著增強(qiáng)M1的溶瘤效應(yīng)，抑制Bcl-w并不能協(xié)同增強(qiáng)M1的溶瘤效應(yīng)。

實(shí)施例4ABT-263與M1病毒聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制人肝細(xì)胞癌株移植瘤生長。材料：

M1病毒、肝癌細(xì)胞株Hep3B、結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、4周齡雌性BALB/c裸鼠。

方法：

本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)的、單盲的設(shè)計。將5×10⁶Hep 3B或者LoVo細(xì)胞注入到4周齡BALB/c裸鼠背側(cè)皮下。

當(dāng)腫瘤大小達(dá)到50mm³時分組，包括不處理的對照組、單獨(dú)應(yīng)用ABT-263組(腹腔注射10mg/kg/d)、單獨(dú)應(yīng)用M1感染組(尾靜脈注射M1病毒2×10⁶PFU/次)和ABT-263/M1聯(lián)用組(相同方式給予相同劑量的ABT-263和M1病毒)，連續(xù)注射3次。每兩天測量腫瘤的長寬和體重，腫瘤的體積依據(jù)公式(長×寬2)/2。測量腫瘤體積后進(jìn)行One way ANOVA統(tǒng)計，***表示p<0.001,**表示p<0.01。結(jié)果:

在兩種腫瘤細(xì)胞移植瘤動物體內(nèi)，病理解剖測定腫瘤體積表明，和對照組比較，單獨(dú)應(yīng)用ABT-263組和單獨(dú)M1感染組只能引起腫瘤體積輕微的縮小，而ABT-263/M1聯(lián)用組能引起腫瘤體積顯著地縮小(圖4b和4d)，并且One way ANOVA統(tǒng)計表明具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4a和 4c)。這種協(xié)同性的作用在對單獨(dú)用藥敏感性低的腫瘤中被放大得尤其明顯，腫瘤體積的減小幅度驚人(圖4a)。

本發(fā)明所記載的實(shí)施方式僅為闡釋性例子，本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等同的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。