本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的中藥組合物，屬中藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景
惡性腫瘤嚴(yán)重影響人類健康，化療是目前治療惡性腫瘤的三大手段之一，臨床應(yīng)用中常常出現(xiàn)化療不敏感或化療達(dá)不到預(yù)期效果等實際問題，或者患者在開始化療階段尚敏感，而化療進(jìn)行過程中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，耐藥導(dǎo)致在手術(shù)后化療常常出現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等，最終導(dǎo)致死亡。腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致腫瘤化學(xué)藥物治療失敗的常見因素，同時腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象也包括腫瘤細(xì)胞不單對原來使用過的藥物產(chǎn)生耐藥，對未接觸過、結(jié)構(gòu)無關(guān)、機制各異的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。目前國內(nèi)腫瘤患病率呈上升趨勢，90％的腫瘤患者死亡在不同程度上受腫瘤耐藥影響，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥是當(dāng)今腫瘤治療亟待解決問題，由此也急切尋求理想的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
研究結(jié)果表明多種機制參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥形成，主要包括：細(xì)胞膜P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白過度表達(dá)形成藥物外輸泵，使抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積下降；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶單獨或與谷胱甘肽一起參與多種細(xì)胞毒代謝及解毒過程；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子及基因如bcl-2，P53等異常。國內(nèi)外針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行了廣泛研究，以尋求拮抗和/或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，體外證實具有逆轉(zhuǎn)耐藥活性的化合物或生物制劑很多，但真正進(jìn)入臨床研究的只有異博定、環(huán)孢菌素A等極少數(shù)藥物，且臨床療效不理想。目前還沒有一種藥物或方法在臨床被廣泛接受原因在于：現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)劑大多為“老藥新用”，逆轉(zhuǎn)耐藥往往不是其主要功能，臨床使用禁忌癥多，毒副作用大；生物制劑在體內(nèi)不穩(wěn)定，難以作用到靶點且毒副反應(yīng)多；臨床耐藥往往數(shù)種機制同時參與，只對單一機制起作用的逆轉(zhuǎn)劑難以發(fā)揮顯著效應(yīng)。某些中藥協(xié)同化療起到很好的增效作用，能起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，從而提高化療效果，具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景；對于有些中藥或有效單體成分研究結(jié)果而言，大多體外實驗效果較好，真正能結(jié)合臨床療效和中醫(yī)藥理論的甚少；因此，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合腫瘤化療多藥耐藥發(fā)病機制，采用中藥復(fù)方作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用，體現(xiàn)臨床療效優(yōu)勢。
中國發(fā)明專利CN200710143393.1公開了“青蒿素在制備抗腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用”，中國發(fā)明專利CN200710070320.4公開了“姜黃素在制備腫瘤多藥耐藥預(yù)防劑中的用途”，中國發(fā)明專利CN1463701公開“聯(lián)苯雙酯作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的新用途”；這類藥物為中藥單體成分作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑。中國發(fā)明專利CN102603692A公開了“一種抗腫瘤多藥耐藥抑制劑色滿和色烯衍生物及其制備方法和應(yīng)用”，中國發(fā)明專利CN101780068A公開了“片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用”，中國發(fā)明專利CN102274220A公開了“索拉菲尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應(yīng)用”；這類藥物為化學(xué)藥物或拓展了原藥物的新用途。目前有關(guān)制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的發(fā)明專利報道基本集中在化學(xué)藥物和中藥單體成分，結(jié)合中醫(yī)藥理論和臨床療效的中藥復(fù)方組合物不多。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明上述具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法包括如下步驟：
1)稱取各原料藥火絨草、化香樹、紅頭草、紅背葉、虎耳草備用。
2)按上述重量配比的火絨草、化香樹、紅頭草、紅背葉、虎耳草，按照上述重量比混合，加3-5倍量水浸泡1-2小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2-3倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液。
3)上清液濃縮至相對密度1.08-1.10，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制120-130℃，出風(fēng)溫度105-120℃，霧化器轉(zhuǎn)速20-30轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為3-5ml/分鐘，得噴霧干燥粉。
4)粉碎噴霧干燥粉，過篩后得細(xì)粉，即該中藥組合物的活性組分。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
火絨草Leontopodium leontopodiaoides(Willd)Beauv.為菊科植物火絨草的地上部分，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；化香樹Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.為胡桃科化香樹屬植物化香樹的葉，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；紅頭草為菊科艾納香屬植物見霜黃Blumea lacera DC.的全草，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；紅背葉為大戟科山麻桿屬植物紅背山麻桿Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根，味甘、性涼，具有清熱散瘀作用；虎耳草為虎耳草科植物虎耳草Saxifraga stolonifera Meerb.的全草，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，上述中藥材配伍，體現(xiàn)其清熱解毒化瘀功效；本發(fā)明中藥組合物應(yīng)用在腫瘤多藥耐藥治療中起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，且該中藥組合物無毒副作用。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述
實施例1本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草100克、化香樹100克、紅頭草50克、紅背葉50克和虎耳草50克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.08時，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制120℃，出風(fēng)溫度105℃，霧化器轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為3ml/分鐘，得噴霧干燥粉18克，粉碎過篩后可得細(xì)粉。
實施例2本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草300克、化香樹300克、紅頭草250克、紅背葉250克和虎耳草200克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.10時，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制130℃，出風(fēng)溫度120℃，霧化器轉(zhuǎn)速30轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為5ml/分鐘，得噴霧干燥粉70克，粉碎過篩后可得細(xì)粉。
實施例3本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草120克、化香樹120克、紅頭草100克、紅背葉100克和虎耳草100克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.09時，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制125℃，出風(fēng)溫度110℃，霧化器轉(zhuǎn)速25轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為4ml/分鐘，得噴霧干燥粉30克，粉碎過篩后可得細(xì)粉。
實驗例1本發(fā)明中藥組合物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥細(xì)胞株HL60/ADR耐藥性研究
白血病細(xì)胞株HL60/S為敏感株，HL60/ADR為白血病細(xì)胞阿霉素耐藥株；HL60/ADR是由HL60/S細(xì)胞接觸遞增濃度的ADR誘導(dǎo)而成，具有典型多藥耐藥性。細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機數(shù)目表隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按40g/kg灌胃給藥，中劑量組按20g/kg灌胃給藥，低劑量組按10g/kg灌胃給藥，空白對照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對數(shù)生長期HL60/ADR細(xì)胞以1×105/ml、HL60/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調(diào)零組和對照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處調(diào)零組調(diào)零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(IR)＝[1-(試驗孔A均值/對照孔A均值)]×100％；計算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實驗重復(fù)3次；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝空白對照組IC50/用藥組IC50。
表1本發(fā)明中藥組合物對HL60/ADR耐藥株逆轉(zhuǎn)作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對HL60/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對HL60/ADR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.56-4.38，且呈濃度正相關(guān)，提示本發(fā)明中藥組合物對HL60/ADR耐藥株具有逆轉(zhuǎn)作用。
實驗例2本發(fā)明中藥組合物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥細(xì)胞株K562/ADR耐藥性研究
白血病細(xì)胞株K562/S為敏感株，K562/ADR為白血病細(xì)胞阿霉素耐藥株；K562/ADR是由K562/S細(xì)胞接觸遞增濃度的ADR誘導(dǎo)而成，具有典型多藥耐藥性。細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機數(shù)目表隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按40g/kg灌胃給藥，中劑量組按20g/kg灌胃給藥，低劑量組按10g/kg灌胃給藥，空白對照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對數(shù)生長期K562/ADR細(xì)胞以1×105/ml、K562/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調(diào)零組和對照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處調(diào)零組調(diào)零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(IR)＝[1-(試驗孔A均值/對照孔A均值)]×100％；計算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實驗重復(fù)3次；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝空白對照組IC50/用藥組IC50。
表1本發(fā)明中藥組合物對K562/ADR耐藥株逆轉(zhuǎn)作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對K562/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對K562/ADR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.44-3.20，且呈濃度正相關(guān)，提示本發(fā)明中藥組合物對K562/ADR耐藥株具有逆轉(zhuǎn)作用。