本發(fā)明涉及一種心腦血管疾病治療藥物，具體涉及一種超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
超聲醫(yī)學(xué)技術(shù)不僅在傳統(tǒng)的診斷領(lǐng)域發(fā)展迅速，而且在治療領(lǐng)域也發(fā)展迅速，特別是在超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染治療心腦血管方面更是成為目前研究的熱門。
隨著人民生活水平提高和飲食習(xí)慣改變，心腦血管病死亡已占總死亡構(gòu)成的41％，動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心腦血管疾病是危害人類生命健康的重大疾病。實(shí)施有針對(duì)性的干預(yù)，研究有效的治療手段，將對(duì)保障人民健康有重大意義。
動(dòng)脈損傷特別是內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素，并貫穿動(dòng)脈粥樣硬化的全過程。目前針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化主要治療手段是藥物、動(dòng)脈內(nèi)支架植入術(shù)及動(dòng)脈搭橋外科手術(shù)治療。目前的藥物如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、他汀類藥物、鈣離子拮抗劑等都可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，但是這些藥物不可能使已有內(nèi)皮細(xì)胞缺損的區(qū)域重新覆蓋上內(nèi)皮細(xì)胞，而且這類藥物對(duì)于肝臟、腎臟功能造成傷害，長(zhǎng)期使用會(huì)引發(fā)肝臟、腎臟方面的疾病。目前的治療方法尚不能達(dá)到完全恢復(fù)血管結(jié)構(gòu)和功能的效果。如何使內(nèi)皮細(xì)胞缺損區(qū)域重新覆蓋上內(nèi)皮細(xì)胞是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性課題，探索新的修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞、恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞正常的生理功能是治療動(dòng)脈粥樣硬化等內(nèi)皮細(xì)胞損傷性血管疾病急待解決的問題。血管內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管功能和血管穩(wěn)態(tài)上起關(guān)鍵作用，動(dòng)脈粥樣硬化其病理生理基礎(chǔ)是血管內(nèi)膜損傷后引起內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，動(dòng)脈壁中層平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加是動(dòng)脈損傷時(shí)新生內(nèi)膜形成的主要原因。修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可以有效抑制新生內(nèi)膜的形成，恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞依賴的動(dòng)脈舒張功能。有研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈損傷的局部轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因或靜脈內(nèi)注射VEGF蛋白，可以使損傷動(dòng)脈新生內(nèi)膜厚度減少、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張功能改善。VEGF能誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的促血管生成因子，VEGFl65是5種亞型中促血管生成最重要的一個(gè)表型。因?yàn)閂EGFl65蛋白的生物半衰期短，費(fèi)用高，局部給藥困難等因素難以推廣應(yīng)用。Asahara等采用基因治療的方法，將VEGF165質(zhì)粒通過水凝膠球囊導(dǎo)管成功轉(zhuǎn)染到兔股動(dòng)脈的損傷部位，初步實(shí)現(xiàn)了減少損傷后再狹窄的發(fā)生。但是這種轉(zhuǎn)染是依賴球囊與血管壁間的壓力完成的，這種壓力可能會(huì)使血管內(nèi)膜再次受損，并增加了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，在治療的同時(shí)留下了潛在的隱患。如何有效地將外源性VEGF導(dǎo)入體內(nèi)，使高濃度VEGF定向黏附至受損血管內(nèi)皮并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，探索實(shí)現(xiàn)VEGF基因轉(zhuǎn)染血管壁的新途徑有重要的意義。
超聲聯(lián)合微泡促基因轉(zhuǎn)染：
目前基因靶向治療的方法有：病毒載體基因治療、電穿孔、藥物耦聯(lián)以及手術(shù)局部注入血管生長(zhǎng)因子等，但是這些方法在臨床上應(yīng)用有很大的局限性。近年來超聲造影技術(shù)取得突破性進(jìn)展，而微泡外殼攜帶特異抗體、基因、藥物，達(dá)到靶向診斷或治療目的則更是研究熱點(diǎn)。超聲為細(xì)胞施藥以及治療性基因轉(zhuǎn)染提供了一種非化學(xué)性、非病毒、非侵入性的重要手段，為人們提供了一個(gè)較理想的新型無創(chuàng)基因運(yùn)載工具。所謂靶向超聲是指將微泡作為載體攜帶基因，當(dāng)微泡到達(dá)特定組織時(shí)，超聲定向破壞微泡，釋放基因從而達(dá)到在靶器官定向治療的目的。其靶向性可以通過以下幾點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)：①微泡到達(dá)靶組織后通過超聲照射的微泡擊破作用和聲致孔隙效應(yīng)使基因或藥物被靶組織攝取吸收；②將組織特異性抗體或配體與微泡表面結(jié)合，從而對(duì)靶組織特異性黏附；③將基因或藥物包裹入微泡內(nèi)，黏附至靶組織再通過超聲爆破微泡而使其釋放轉(zhuǎn)染。
超聲聯(lián)合微泡促基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制中超聲的正壓作用、超聲介導(dǎo)的DNA與細(xì)胞膜作用時(shí)間延長(zhǎng)、微泡的空化效應(yīng)以及熱效應(yīng)在基因轉(zhuǎn)染的過程中起著重要的作用。超聲介導(dǎo)的微泡轉(zhuǎn)染需要滿足兩個(gè)條件：第一，活性物質(zhì)能夠在靶區(qū)域釋放，使局部濃度增高。第二，周圍組織的細(xì)胞膜和微血管通透性增加。否則這種DNA跨膜轉(zhuǎn)染率會(huì)很低。
目前認(rèn)為超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染主要是利用微泡破裂時(shí)所產(chǎn)生的空化效應(yīng)。空化效應(yīng)是指存在于液態(tài)物質(zhì)中的微小空泡(空化核)在高強(qiáng)度超聲的作用下被激發(fā)，空化核急劇膨脹和收縮直至爆裂，此過程中空化核吸收大量的聲能，并將能量集中釋放在極小的區(qū)域，核內(nèi)局部溫度和壓力急劇升高，隨之產(chǎn)生強(qiáng)大沖擊波、內(nèi)切力、高速微束射流及自由基等二次效應(yīng)，不僅使直徑≤7um的微血管破裂、內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，微血管通透性增大，還可以使細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，產(chǎn)生暫時(shí)性、可逆性的小孔，增加了細(xì)胞膜的通透性，均能夠增強(qiáng)載藥微泡對(duì)基因或藥物的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，利用超聲波在特定時(shí)間和空間內(nèi)擊碎靶組織內(nèi)微泡，可提高治療的靶向性。研究發(fā)現(xiàn)在治療強(qiáng)度的超聲照射作用下，超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)能夠準(zhǔn)確的到達(dá)目的區(qū)域，并且不會(huì)引起細(xì)胞的急性死亡或者損傷。國(guó)內(nèi)外的研究表明，超聲聯(lián)合微泡可以使基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)明顯增高，有報(bào)道稱可以使裸DNA的轉(zhuǎn)染率提高3000倍。A1lanLawrie等研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下超聲可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染后目標(biāo)基因的表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)治療性超聲照射可抑制血管平滑肌的再生，但是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的活性無明顯影響。在超聲輻照下，載基因微泡靶向破裂釋放的基因只是被動(dòng)地穿過細(xì)胞間隙到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)染率仍然十分有限。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑及其制備方法，本發(fā)明的微泡造影劑既是超聲造影對(duì)比劑，又是一種新型的高效的有目的性的基因轉(zhuǎn)染治療工具。
一種超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑，由如下濃度的組分組成：
上述組分分散在緩沖液中，優(yōu)選分散在pH值7.2-7.4的PBS緩沖液中。
進(jìn)一步優(yōu)選，由如下濃度的組分組成：
最優(yōu)選地，由如下濃度的組分組成：
作為優(yōu)選，所述的微泡造影劑為全氟丙烷人血白蛋白微泡(全氟顯)、人血白蛋白八氟化丙烷微泡(Optison)或六氟化硫微泡(聲諾維)。均通過市購(gòu)獲得(全氟顯：國(guó)藥準(zhǔn)字S20083098，湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司；Optison：FS069,Mallinckralt Medical,St Louis,MO；SonoVue：BR-1,BRACCO,Milan,Italy)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微泡造影劑為全氟丙烷人血白蛋白微泡(全氟顯)。全氟顯大分子微泡造影劑較聲諾維等小分子微泡造影劑而言具有更好的包容性，能同時(shí)將多種生物制劑溶于其中。
作為優(yōu)選，所述的VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)為VEGF165cDNA、VEGF121cDNA、VEGF145cDNA或VEGF148cDNA。
VEGF-A是由兩個(gè)相同亞基(Mr 23000)以二硫鍵交聯(lián)結(jié)合成的二聚體糖蛋白，分子量40-45KD，其基因位于染色體6p21.3，全長(zhǎng)14kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。由于其mRNA的剪接方式不同，形成7種存在形式，即VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF183、VEGF165、VEGF189、VEGF206，分別含有121～206個(gè)氨基酸，以二硫鍵連接成同源二聚體。
VEGF189、VEGF206含有外顯子6、7編碼的氨基酸，與肝素、硫酸肝素、胞外基質(zhì)結(jié)合的能力比VEGF145、VEGF165更強(qiáng)，因此被隔阻在細(xì)胞表面的肝素、硫酸肝素上及胞外基質(zhì)里，體內(nèi)活性不如VEGF121、VEGF165強(qiáng)。
VEGF121、VEGF145、VEGF165均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和體內(nèi)新生血管形成，大多數(shù)表達(dá)VEGF-A的細(xì)胞能同時(shí)產(chǎn)生幾種VEGF-A變異體，以VEGF121、VEGF165最為常見。
肝素或硫酸肝素能增強(qiáng)VEGF-A與其受體的親和力。VEGF-A與細(xì)胞表面的肝素或胞外基質(zhì)的硫酸肝素蛋白聚糖結(jié)合，可釋放儲(chǔ)藏在蛋白聚糖上的新生血管因子如堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)；胞外硫酸肝素還可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的生物活性以及與受體的相互作用。VEGF121、VEGF165被氧化后則失去結(jié)合VEGFR-2的能力，細(xì)胞表面的硫酸肝素能儲(chǔ)藏被氧化的VEGF165，卻不能儲(chǔ)藏被氧化的VEGF121，提示VEGF121的功能可能不如VEGF165強(qiáng)，同時(shí)由于cDNA擴(kuò)增豐度中VEGF165最高，所以是在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的一種VEGF單體。
因此，綜合考慮，所述VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)優(yōu)選為VEGF165cDNA、VEGF121cDNA、VEGF145cDNA或VEGF148cDNA；進(jìn)一步優(yōu)選，所述VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)基因?yàn)閂EGF165cDNA。
VEGF165cDNA含有441個(gè)堿基，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作為優(yōu)選，所述抗ICAM單克隆抗體為抗ICAM-1單克隆抗體、抗ICAM-2單克隆抗體或抗ICAM-3單克隆抗體。抗ICAM單克隆抗體均通過市購(gòu)獲得，購(gòu)于上海昕浩生物科技有限公司。
作為優(yōu)選，所述的穿膜肽為HIV-1Tat(GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO：3))、Tat48-60(GRKKRRQRRRPPQQ(SEQ ID NO：4))、Plsl(RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：5))、Transportan(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：6))。均通過市購(gòu)?fù)緩将@得，購(gòu)于上海昕浩生物科技有限公司。
細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)具有驚人的攜帶大分子物質(zhì)的能力，具有很大優(yōu)勢(shì)：與細(xì)胞膜的親和性高，穿膜速度快，可迅速被降解，最重要的是對(duì)細(xì)胞膜沒有破壞性。這些發(fā)現(xiàn)為研制一種高效、安全的載體，主動(dòng)介導(dǎo)基因跨越生物膜屏障來進(jìn)行基因治療提供了廣闊的前景，但缺乏靶向性。將靶向超聲微泡與穿膜肽聯(lián)合應(yīng)用，兩者將會(huì)取長(zhǎng)補(bǔ)短，既使穿膜肽具有靶向性，同時(shí)穿膜肽的存在既可保護(hù)、濃縮基因，又可介導(dǎo)基因主動(dòng)穿過生物屏障，提高基因的轉(zhuǎn)染效率。
抗ICAM單克隆抗體對(duì)受損血管內(nèi)膜有很好的靶向識(shí)別作用，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，內(nèi)皮功能損傷早于冠脈造影異常及臨床癥狀出現(xiàn)，因此內(nèi)皮功能異常的檢測(cè)是重要的早期診斷指標(biāo)。研究表明內(nèi)皮受損與內(nèi)皮細(xì)胞過多表達(dá)白細(xì)胞黏附因子有關(guān)，主要為細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)增多。ICAM-1是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白家族的一個(gè)成員，主要表達(dá)于活化內(nèi)皮細(xì)胞和其他抗原遞質(zhì)細(xì)胞上，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附反應(yīng)，促使內(nèi)皮損傷。由于ICAM-1在正常組織中幾乎不表達(dá)，所以抗ICAM-1標(biāo)記的載體可特異結(jié)合于損傷內(nèi)皮表面。將微泡造影劑與特異性抗體連接，便可得到能與特異性受體相結(jié)合的靶向微泡。
本發(fā)明中最優(yōu)選地組合組合為：所述微泡造影劑為全氟丙烷人血白蛋白微泡(全氟顯)；VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)基因?yàn)閂EGF165cDNA；抗ICAM單克隆抗體為抗ICAM-1單克隆抗體；穿膜肽為HIV-1Tat。
①微泡造影劑優(yōu)選采用全氟顯，全氟顯大分子微泡造影劑較聲諾維等小分子微泡造影劑而言具有更好的包容性，能同時(shí)將多種生物制劑溶于其中，因此VEGF165cDNA、抗ICAM-1單克隆抗體、穿膜肽-tat能更好的與全氟顯相結(jié)合；②VEGF能誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的促血管生成因子，VEGFl65是7種亞型中促血管生成最重要的一個(gè)表型，因此VEGF165cDNA能更有效的修復(fù)受損血管；③抗ICAM-1單克隆抗體可特異結(jié)合于損傷的血管內(nèi)皮表面，使超聲聯(lián)合微泡起到靶向治療的作用；④穿膜肽-tat的存在既可保護(hù)、濃縮基因，又可介導(dǎo)基因主動(dòng)穿過生物屏障，提高基因的轉(zhuǎn)染治療效率。因而此種超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑能夠?qū)κ軗p血管內(nèi)膜進(jìn)行高效基因轉(zhuǎn)染治療，以此來達(dá)到心腦血管疾病的治療目的。采用這些組分制成的超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑轉(zhuǎn)染率高，能達(dá)到對(duì)受損血管內(nèi)膜進(jìn)行高效基因轉(zhuǎn)染治療，以此來達(dá)到心腦血管疾病的有效治療目的。
VEGF基因在臨床上能誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的促血管生成因子。本發(fā)明得到的載有VEGF基因的微泡造影劑可以通過超聲成像對(duì)內(nèi)膜受損的血管進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和診斷，更重要的是超聲擊碎微泡釋放基因進(jìn)行受損區(qū)域的轉(zhuǎn)染治療。
本發(fā)明對(duì)載有VEGF基因的微泡造影劑中加入抗ICAM單克隆抗體及穿膜肽形成的復(fù)合物，使得VEGF基因轉(zhuǎn)染更具有目的性、主動(dòng)性，從而來實(shí)性基因轉(zhuǎn)染治療的高效性。本發(fā)明為受損血管的診治提供了一種新的基因藥物與療法，具有較大的臨床意義。
本發(fā)明還提供了一種所述超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑的制備方法，包含以下步驟：
(1)將VEGF基因及抗ICAM單克隆抗體與微泡造影劑按配比在2～4℃下混合1.5～2.5h，得混合液，混合液中VEGF基因濃度為5～15mg/ml、抗ICAM單克隆抗體濃度為5～15mg/ml、微泡造影劑為6～8×109個(gè)/ml；VEGF基因和抗ICAM單克隆抗體黏附于微泡造影劑外殼表面形成混合物；
(2)取步驟(1)所得混合液，加入穿膜肽，室溫孵育25～35min，洗滌去除未與混合物結(jié)合的穿膜肽，重懸于緩沖液中，重懸后的混合液與所取步驟(1)混合液體積相同，重復(fù)操作使穿膜肽終濃度達(dá)到0.5～2mg/ml即得超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑。
洗滌和重懸所用緩沖液均為PBS緩沖液，PBS緩沖液的pH為7.2-7.4。
加入穿膜肽孵育后PBS洗滌，去除未與混合物結(jié)合的穿膜肽，即洗滌過程中混合物中VEGF基因及抗ICAM單克隆抗體與微泡造影劑不會(huì)流失，洗滌后懸浮在PBS緩沖液中，懸浮后的體積與步驟(2)所取步驟(1)的混合液的體積相同，檢測(cè)穿膜肽濃度，如濃度未達(dá)標(biāo)，繼續(xù)添加穿膜肽、洗滌、懸浮，反復(fù)操作直至穿膜肽終濃度達(dá)到0.5～2mg/ml，由于洗滌過程中沒有VEGF基因及抗ICAM單克隆抗體與微泡造影劑的流失，洗滌結(jié)束重懸所得混合液體積與最初所取步驟(1)混合液體積相同，因此，步驟(2)中所得超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑中VEGF基因濃度為5～15mg/ml、抗ICAM單克隆抗體的濃度為5～15mg/ml、微泡造影劑6～8×109個(gè)/ml、穿膜肽濃度為0.5～2mg/ml。
進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)的得到的混合液中VEGF基因濃度為10～15mg/ml、抗ICAM單克隆抗體的濃度為5～10mg/ml、微泡造影劑濃度為6～8×109個(gè)/ml，步驟(2)中加入穿膜肽后穿膜肽終濃度達(dá)到0.5～1.5mg/ml；更進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)的得到的混合物中VEGF基因濃度為12mg/ml、抗ICAM單克隆抗體的濃度為9mg/ml、微泡造影劑為7×109個(gè)/ml，步驟(2)中加入穿膜肽后穿膜肽終濃度達(dá)到1mg/ml。
本發(fā)明的制備方法，最優(yōu)選地，包括如下步驟：
(1)將VEGF基因、抗ICAM單克隆抗體與微泡造影劑以1：1：3的體積比例在4℃下混合2h得混合液，混合液中VEGF基因濃度為12mg/ml，抗ICAM單克隆抗體的濃度為9mg/ml、微泡造影劑為7×109個(gè)/ml；VEGF基因及抗ICAM單克隆抗體黏附于微泡造影劑的外殼形成混合物；
(2)取步驟(1)所得混合液，加入穿膜肽，室溫孵育30min，PBS洗滌5min共三次，洗滌去除未與混合物結(jié)合的穿膜肽，每次洗滌后重懸于緩沖液中，重懸后的混合液與所取步驟(1)混合液體積相同，穿膜肽終濃度達(dá)到1mg/ml即得超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑。
本發(fā)明制備了一種VEGF基因靶向治療受損血管內(nèi)膜的微泡造影劑，并且采用了具有主動(dòng)轉(zhuǎn)染功能的穿膜肽來促使VEGF基因進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)染。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不以任何形式限制本發(fā)明涉及的內(nèi)容。
實(shí)施例1
全氟顯7×109個(gè)/ml
VEGF165cDNA 12mg/ml
抗ICAM-1單克隆抗體 9mg/ml
穿膜肽(HIV-1Tat) 1mg/ml
將VEGF165cDNA基因及抗ICAM-1單克隆抗體與全氟顯以1：1：3的體積比例在4℃下混合2h得混合液，混合液中VEGF165cDNA基因濃度為12mg/ml、抗ICAM-1單克隆抗體的濃度為9mg/ml、全氟顯7×109個(gè)/ml，VEGF165cDNA基因及抗ICAM-1單克隆抗體黏附于微泡造影劑的外殼所形成的混合物。
所得到的混合液中加入穿膜肽(HIV-1Tat)室溫孵育30min后，PBS洗滌5min共三次，去除未結(jié)合的穿膜肽，每次洗滌后重懸于PBS緩沖液中，重懸后的混合液與最初所取混合液體積相同，使穿膜肽終濃度達(dá)到1mg/ml，即可制成產(chǎn)品。
實(shí)施例2
全氟顯7×109個(gè)/ml
VEGF165cDNA 12mg/ml
抗ICAM-1單克隆抗體 9mg/ml
將VEGF165cDNA基因及抗ICAM-1單克隆抗體與全氟顯以1：1：3的體積比例在4℃下混合2h得混合液，混合液中VEGF165cDNA基因濃度為12mg/ml、抗ICAM-1單克隆抗體的濃度為9mg/ml、全氟顯7×109個(gè)/ml，VEGF165cDNA基因及抗ICAM-1單克隆抗體黏附于微泡造影劑的外殼所形成混合物。
實(shí)施例3
全氟顯7×109個(gè)/ml
VEGF165cDNA12mg/ml
穿膜肽(HIV-1Tat)1mg/ml
將VEGF165cDNA基因與全氟顯以1：3的體積比例在4℃下混合2h，得混合液，混合液中VEGF165cDNA基因濃度為12mg/ml，VEGF165cDNA基因黏附于微泡造影劑的外殼形成混合物。
所得到的混合液中加入穿膜肽(HIV-1Tat)室溫孵育30min后，PBS洗滌5min共三次，去除未結(jié)合的穿膜肽，每次洗滌后重懸于PBS緩沖液中，重懸后的混合液與最初所取混合液體積相同，使穿膜肽終濃度達(dá)到1mg/ml，即可制成產(chǎn)品。
實(shí)施例4VEGF165cDNA基因轉(zhuǎn)染率測(cè)定
將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3各1ml分別加入FITC標(biāo)記，置入37℃恒溫箱，1h后PBS洗4次，每次5min，通過建模成功的新西蘭大白兔耳緣靜脈注入FITC標(biāo)記的實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3，再在大白兔腹主動(dòng)脈段采用超聲擊破實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制得成品微泡來釋放基因，14d后處死新西蘭大白兔進(jìn)行解剖截取腹主動(dòng)脈段血管制成標(biāo)本，最后進(jìn)行共聚焦激光顯微鏡觀察。用FITC標(biāo)記后，表達(dá)VEGF165cDNA的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見特異性的綠色熒光，計(jì)數(shù)10個(gè)250倍視野的細(xì)胞數(shù)及每個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，二者之比即為轉(zhuǎn)染率。
測(cè)得實(shí)施例1的轉(zhuǎn)染率為(46.32±2.81)％；測(cè)得實(shí)施例2的轉(zhuǎn)染率為(31.26±3.17)％；測(cè)得實(shí)施例3的轉(zhuǎn)染率為(24.13±4.25)％。
本實(shí)施例動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑椋航⒏怪鲃?dòng)脈內(nèi)膜損傷的動(dòng)物模型：健康新西蘭大白兔，平均體質(zhì)量2.2kg，每日給予1％膽固醇顆粒2g喂養(yǎng)4周，采用高脂飲食損傷血管內(nèi)皮。
實(shí)施例5超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑介導(dǎo)腦梗死治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
將建模成功后的60只白兔隨機(jī)分為試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組、對(duì)照組，每組20只，分別采用不同方法進(jìn)行治療。①試驗(yàn)A組采用實(shí)施例1，通過白兔耳緣靜脈注入，初始計(jì)量為1ml左右，之后每4分鐘左右給藥0.5ml，除首次給藥外，間隔給藥8次，間隔給藥累計(jì)4ml；同時(shí)采用超聲介導(dǎo)治療，儀器選取Philips iU 22彩色多譜勒超聲診斷儀，啟用二次諧波模式，并將發(fā)射頻率和接受頻率分別調(diào)整為1.5MHz、3.5MHz，將機(jī)械指數(shù)調(diào)至最大，超聲強(qiáng)度為2至2.5W/cm2。②試驗(yàn)B組采用愛通立靜脈注射，使用劑量0.9mg/kg，前1/10劑量立即靜脈注射，剩余劑量藥物緩慢勻速靜脈注射。③對(duì)照組采用生理鹽水靜脈注射，具體注射方法及用量與試驗(yàn)A組相同。三組均于治療后14d對(duì)白兔進(jìn)行相關(guān)檢查，并處死白兔。結(jié)果本試驗(yàn)?zāi)X梗死區(qū)質(zhì)量占比分別為A組13.8±3.2、B組18.8±4.1ab、對(duì)照組25.1±4.6a，明顯優(yōu)于試驗(yàn)B組及對(duì)照組(P＜0.05)，說明給予穿膜肽-tat介導(dǎo)VEGF165cDNA基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染效果良好，有利于促進(jìn)梗死血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，并促使生成新的側(cè)支循環(huán)血管，改善梗死區(qū)血液供應(yīng)，改善腦缺氧情況。
實(shí)施例6不同濃度組分的基因轉(zhuǎn)染率測(cè)定
將建模成功后的12只白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)A組(全氟顯：6×109個(gè)/ml，VEGF165cDNA：10mg/ml，抗ICAM-1單克隆抗體：5mg/ml，穿膜肽(HIV-1Tat)：0.5mg/ml)、B組(全氟顯：7×109個(gè)/ml，VEGF165cDNA：12mg/ml，抗ICAM-1單克隆抗體：9mg/ml，穿膜肽(HIV-1Tat)：1mg/ml)、C組(全氟顯：8×109個(gè)/ml，VEGF165cDNA：15mg/ml，抗ICAM-1單克隆抗體：10mg/ml，穿膜肽(HIV-1Tat)：1.5mg/ml)，每組4只，分別采用不同濃度組分進(jìn)行轉(zhuǎn)染率測(cè)定。將A組、B組、C組各1ml分別加入FITC標(biāo)記，置入37℃恒溫箱，1h后PBS洗4次,每次5min，通過新西蘭大白兔耳緣靜脈注入FITC標(biāo)記的A組、B組、C組，再在大白兔腹主動(dòng)脈段采用超聲擊破微泡來釋放基因，14d后處死新西蘭大白兔進(jìn)行解剖截取腹主動(dòng)脈段血管制成標(biāo)本，最后進(jìn)行共聚焦激光顯微鏡觀察。用FITC標(biāo)記后，表達(dá)VEGF165cDNA的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見特異性的綠色熒光，計(jì)數(shù)10個(gè)250倍視野的細(xì)胞數(shù)及每個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，二者之比即為轉(zhuǎn)染率。
分別測(cè)得A組的轉(zhuǎn)染率為(32.61±3.12)％；B組的轉(zhuǎn)染率為(46.32±2.81)％；C組轉(zhuǎn)染率為(33.57±4.28)％；轉(zhuǎn)染率而言B組轉(zhuǎn)染最優(yōu)，因此B組濃度配置為最優(yōu)濃度配置。
本實(shí)施例動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑椋航⒏怪鲃?dòng)脈內(nèi)膜損傷的動(dòng)物模型：健康新西蘭大白兔，平均體質(zhì)量2.2kg，每日給予1％膽固醇顆粒2g喂養(yǎng)4周，采用高脂飲食損傷血管內(nèi)皮。
以上所述僅為本發(fā)明專利的具體實(shí)施案例，但本發(fā)明專利的技術(shù)特征并不局限于此，任何相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專利范圍之中。