本發(fā)明涉及一種敷料，具體涉及一種應(yīng)用于創(chuàng)面的毛發(fā)角蛋白復(fù)合細(xì)胞組織工程化敷料的制備方法。

背景技術(shù)：

人體和動(dòng)物體的創(chuàng)傷隨處可見(jiàn)，各種創(chuàng)傷均會(huì)造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損，必須通過(guò)細(xì)胞增生和細(xì)胞間基質(zhì)的形成來(lái)進(jìn)行組織修復(fù)。而目前主要是通過(guò)西藥等治療，臨床上還沒(méi)有通過(guò)生物材料等來(lái)修復(fù)創(chuàng)傷。

成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞，它在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中活化、增殖、合成膠原。本申請(qǐng)擬以角蛋白生物材料作為支架系統(tǒng)，復(fù)合成纖維細(xì)胞，構(gòu)建模擬機(jī)體組織和功能的組織工程化敷料，重建或恢復(fù)皮膚屏障，形成具有生物敷料性質(zhì)的創(chuàng)面覆蓋物，起到皮膚屏障功能的部分作用；同時(shí)，隨著創(chuàng)傷慢慢愈合和自身皮膚生長(zhǎng)，它能自行溶解被機(jī)體吸收，免除了解除時(shí)流血多及病人的痛苦，也不會(huì)留下碎屑而延緩傷口的愈合，為促進(jìn)皮膚的再生提供一個(gè)有利于創(chuàng)面愈合的環(huán)境。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種毛發(fā)角蛋白復(fù)合細(xì)胞組織工程化敷料的制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種毛發(fā)角蛋白復(fù)合細(xì)胞組織工程化敷料的制備方法，所述制備方法包括毛發(fā)角蛋白的制備、細(xì)胞懸液的制備以及敷料的制備，具體方法如下：

(1)毛發(fā)角蛋白的制備，該毛發(fā)角蛋白為毛發(fā)角蛋白顆?；蛎l(fā)角蛋白凝膠：

①毛發(fā)角蛋白顆粒的制備

S1：脫脂與軟化：稱取毛發(fā)進(jìn)行脫脂和軟化；

S2：脫色：將軟化后的毛發(fā)放置于脫色溶液中進(jìn)行脫色，所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉3～5重量份、過(guò)硫酸鉀1～2重量份、雙氧水70～90體積份、濃氨水22～33體積份以及水350～450體積份；

S3：清洗、烘干：將脫色后的毛發(fā)進(jìn)行清洗，并且干燥；

S4：粉末制備：在干燥后的毛發(fā)剪碎，并加入液氮冷凍研磨，得到長(zhǎng)度為0.1～2mm的毛發(fā)粗粉；將粗粉放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水，旋轉(zhuǎn)，球磨，直至粒徑50μm～90μm為止，則為毛發(fā)角蛋白顆粒勻漿；

S5：離心：在勻漿中加入生理鹽水進(jìn)行離心，棄去上清液，并去除沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的毛發(fā)角蛋白，加生理鹽水混勻繼續(xù)離心，重復(fù)上述操作2～4次，最后仍然取中段顆粒大小均勻的毛發(fā)角蛋白，則得到為高純度的毛發(fā)角蛋白泥；

S6：滅菌：包裝，密封，采用鈷⁶⁰輻照法滅菌，保存，待用；

②毛發(fā)角蛋白凝膠的制備

將步驟S6中滅菌后的毛發(fā)角蛋白泥加入水，充分混勻，放置于溫箱中孵育2-3小時(shí)，至呈現(xiàn)較為均一的顏色和性狀為止；滅菌，得到毛發(fā)角蛋白凝膠；

(2)細(xì)胞懸液的制備

A.骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離以及細(xì)胞原代培養(yǎng)：將骨髓血離心，吸取單核細(xì)胞層，離心，棄去上清，在培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞，接種，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)；

B.傳代細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：移去培養(yǎng)液，胰酶消化，骨髓干細(xì)胞呈圓形時(shí)終止消化；制成單細(xì)胞懸液，以1:2傳代，待梭形細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層并達(dá)到70～90％融合時(shí)，胰酶消化，按1:2或1:4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液；

(3)敷料的制備：將步驟(1)中制備的毛發(fā)角蛋白與步驟(2)中得到的細(xì)胞懸液混合均勻，得到工程輔料。

進(jìn)一步地，所述毛發(fā)角蛋白與細(xì)胞懸液的重量比為1～2:3～5。

進(jìn)一步地，步驟(1)的S1中，所述脫脂和軟化的方法為：用乙醇浸泡20～60分鐘，浸泡過(guò)程中每間隔3～10分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗；沖洗后，將毛發(fā)放置于次氯酸鈉與水配制的溶液中浸泡20～60分鐘，在該浸泡過(guò)程中間隔3～10分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗。

進(jìn)一步地，步驟(1)的S2中，將軟化后的毛發(fā)放置于脫色溶液中2-3個(gè)小時(shí)，在脫色過(guò)程中間隔10～30分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗，洗掉脫色溶液為止；所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉4重量份、過(guò)硫酸鉀1.5重量份、雙氧水80體積份、濃氨水27.5體積份以及水400體積份。

進(jìn)一步地，步驟(1)的S3中，將脫色后的毛發(fā)在水中浸泡，浸泡完畢用水沖洗，過(guò)濾，在鼓風(fēng)干燥箱中37℃烘干過(guò)夜。

進(jìn)一步地，步驟(1)的S1中，所述次氯酸鈉與水的體積比為1～5:9，所述次氯酸鈉為10％次氯酸鈉；

進(jìn)一步地，步驟(1)的S2中，將放置有毛發(fā)的脫色溶液置于37℃恒溫中進(jìn)行脫色；所述焦磷酸鈉為99％焦磷酸鈉，過(guò)硫酸鉀為99.5％過(guò)硫酸鉀，雙氧水為30％雙氧水，濃氨水為25％濃氨水。

進(jìn)一步地，步驟(1)的S4中，球磨：將粗粉2g，放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水10ml，球磨1～3小時(shí)，在顯微鏡下觀察粒徑大小，再加入生理鹽水5ml繼續(xù)研磨，直至形成粒徑約60μm-80μm；所述瑪瑙珠的數(shù)量：直徑1cm瑪瑙珠20顆，直徑60mm瑪瑙珠100顆；

進(jìn)一步地，步驟(1)的S6中，將得到的高純度的毛發(fā)角蛋白泥包裝采用鈷60輻照法滅菌，劑量12Kg。

進(jìn)一步地，步驟(1)的②中，毛發(fā)角蛋白泥加入水充分混勻，放置于37℃溫箱孵育2-3小時(shí)。

進(jìn)一步地，所述毛發(fā)角蛋白凝膠還能夠通過(guò)以下方法制備：(1)毛發(fā)角蛋白成鹽：①稱取毛發(fā)，在毛發(fā)中加入乙醇和水的混合溶液，加熱，逐漸升高溫度至溶液開(kāi)始回流，邊回流邊滴加堿溶液，至pH值為6.5～7.5時(shí)，回流與滴加同時(shí)結(jié)束，結(jié)束后，繼續(xù)攪拌，使反應(yīng)完全，得到成鹽毛發(fā)角蛋白；②將所得到的成鹽毛發(fā)角蛋白濾出，洗液沖洗，洗滌至不呈堿性，干燥，得到毛發(fā)角蛋白磺酸鹽；③將所得到的毛發(fā)角蛋白磺酸鹽粉碎至微米級(jí)，凍干，得到毛發(fā)角蛋白磺酸鹽粉末；(2)毛發(fā)角蛋白凝膠的制備：稱取毛發(fā)角蛋白磺酸鹽粉末，加入水，充分混勻，放置于溫箱中，至呈現(xiàn)較為均一的顏色和性狀為止，采用鈷60 輻照法滅菌，得到毛發(fā)角蛋白凝膠。

進(jìn)一步地，所述毛發(fā)包括人頭發(fā)或動(dòng)物毛發(fā)；步驟(2)的A中所述的骨髓血包括豬骨髓血和鼠骨髓血中的任意一種，則相應(yīng)地，所述骨髓間充質(zhì)細(xì)胞包括豬骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的任一種。

進(jìn)一步地，步驟(2)的A的原代培養(yǎng)中，吸取單核細(xì)胞層后，加入LG-DMEM，常溫離心，洗滌，棄去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5％CO₂，相對(duì)濕度70％的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，步驟(2)的B的傳代培養(yǎng)中，：原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合為單層，細(xì)胞融合率達(dá)80％時(shí)，移去培養(yǎng)液，洗滌，加入0.25％胰酶消化，骨髓干細(xì)胞呈圓形時(shí)終止消化；用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以1∶2傳代，每隔2-3天換液一次，逐漸除去血細(xì)胞，待梭形細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層并達(dá)到80％融合時(shí)，0.25％胰酶消化，按1：2或1：4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。

本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于創(chuàng)傷部位的毛發(fā)角蛋白復(fù)合細(xì)胞懸液工程化敷料的制備方法，其主要具有的有益效果為：

本發(fā)明的工程敷料是一種效果極佳的創(chuàng)面覆蓋物，(1)其有效阻止細(xì)菌感染，(2)加速創(chuàng)面愈合，(3)具有良好的生物相容性，(4)控制和吸收創(chuàng)面滲液，(5)透氣性強(qiáng)，適合氣體和水蒸氣透過(guò)，(6)保護(hù)新生組織，(7)無(wú)毒副作用，無(wú)免疫原性，不會(huì)過(guò)敏等優(yōu)勢(shì)；更重要的是，該工程敷料能自行溶解被機(jī)體吸收，免除了解除時(shí)流血多及病人的痛苦，也不會(huì)留下碎屑而延緩傷口的愈合，為促進(jìn)皮膚的再生提供一個(gè)有利于創(chuàng)面愈合的環(huán)境。該工程敷料能夠極好的應(yīng)用于人體或動(dòng)物體的創(chuàng)傷面處。

附圖說(shuō)明

下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例所述的將工程敷料敷于創(chuàng)面的動(dòng)物模型示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例所述的21天以后創(chuàng)面恢復(fù)后的示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例所述的第8周后填充部位皮膚免疫組織化學(xué)染色觀察情況示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例所述的10％凝膠化的毛發(fā)角蛋白的性狀示意圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例所述的4％凝膠化的毛發(fā)角蛋白的性狀示意圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例所述的健康成纖維細(xì)胞狀態(tài)的示意圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例所述的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞P0代的生長(zhǎng)狀況示意圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例所述的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞P2代的生長(zhǎng)狀況示意圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例所述的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞P3代的生長(zhǎng)狀況示意圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例所述的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞P5代的生長(zhǎng)狀況示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例所述的一種工程化敷料的制備方法。下面以具體實(shí)驗(yàn)案例為例來(lái)說(shuō)明具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一種工程化敷料的制備方法，所述制備方法包括毛發(fā)角蛋白的制備、細(xì)胞懸液的制備以及敷料的制備，具體方法如下：

(1)毛發(fā)角蛋白的制備：

S1：脫脂與軟化：稱取毛發(fā)進(jìn)行脫脂和軟化；

S2：脫色：將軟化后的毛發(fā)放置于脫色溶液中進(jìn)行脫色，所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉3～5重量份、過(guò)硫酸鉀1～2重量份、雙氧水70～90體積份、濃氨水22～33體積份以及水350～450體積份；

S3：清洗、烘干：將脫色后的毛發(fā)在水中浸泡，浸泡完畢用水沖洗，過(guò)濾，在鼓風(fēng)干燥箱中37℃烘干過(guò)夜

S4：粉末制備：在干燥后的毛發(fā)剪碎，并加入液氮冷凍研磨，得到長(zhǎng)度為0.1～2mm的毛發(fā)粗粉；將粗粉放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水，旋轉(zhuǎn)，球磨，直至粒徑50μm～90μm為止，則為毛發(fā)角蛋白顆粒勻漿；

S5：離心：在勻漿中加入生理鹽水進(jìn)行離心，棄去上清液，并去除沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的毛發(fā)角蛋白，加生理鹽水混勻繼續(xù)離心，重復(fù)上述操作2～4次，最后仍然取中段顆粒大小均勻的毛發(fā)角蛋白，則得到為高純度的毛發(fā)角蛋白泥；

S6：滅菌：包裝，密封，采用鈷⁶⁰輻照法滅菌，劑量12Kg，保存，得到顆粒狀或粉末狀的毛發(fā)角蛋白，待用；

(2)細(xì)胞懸液的制備

A.骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離以及細(xì)胞原代培養(yǎng)：將骨髓血離心，吸取單核細(xì)胞層，離心，棄去上清，在培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞，接種，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)；

B.傳代細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：移去培養(yǎng)液，胰酶消化，骨髓干細(xì)胞呈圓形時(shí)終止消化；制成單細(xì)胞懸液，以1:2傳代，待梭形細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層并達(dá)到70～90％融合時(shí)，胰酶消化，按1:2或1:4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液；

(3)敷料的制備：將步驟(1)中制備的毛發(fā)角蛋白與步驟(2)中得到的細(xì)胞懸液混合均勻，得到工程輔料。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，所述毛發(fā)角蛋白與細(xì)胞懸液的重量比為1～2:3～5，優(yōu)選1:4。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(1)的S1中，所述脫脂和軟化的方法為：用乙醇浸泡20～60分鐘，浸泡過(guò)程中每間隔3～10分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗；沖洗后，將毛發(fā)放置于次氯酸鈉與水配制的溶液中浸泡20～60分鐘，在該浸泡過(guò)程中間隔3～10分鐘攪拌一次,浸泡完畢后流水沖洗；

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(1)的S2中，將軟化后的毛發(fā)放置于脫色溶液中2-3個(gè)小時(shí)，在脫色過(guò)程中間隔10～30分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗，洗掉脫色溶液為止；所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉4重量份、過(guò)硫酸鉀1.5重量份、雙氧水80體積份、濃氨水27.5體積份以及水400體積份。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(1)的S1中，所述次氯酸鈉與水的體積比為1～5:10，優(yōu)選1:9，所述次氯酸鈉為10％次氯酸鈉。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(1)的S2中，將放置有毛發(fā)的脫色溶液置于37℃恒溫中進(jìn)行脫色；所述焦磷酸鈉為99％焦磷酸鈉，過(guò)硫酸鉀為99.5％過(guò)硫酸鉀，雙氧水為30％雙氧水，濃氨水為25％濃氨水。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(1)的S4中，球磨：將粗粉2g，放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水10ml，球磨1～3小時(shí)，在顯微鏡下觀察粒徑大小，再加入生理鹽水5ml繼續(xù)研磨，直至形成粒徑約60μm-80μm，優(yōu)選70μm；所述瑪瑙珠的數(shù)量：直徑1cm瑪瑙珠20顆，直徑60mm瑪瑙珠100顆。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(2)的A的原代培養(yǎng)中，吸取單核細(xì)胞層后，加入LG-DMEM，常溫離心，洗滌，棄去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5％CO₂，相對(duì)濕度70％的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，步驟(2)的B的傳代培養(yǎng)中，：原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合為單層，細(xì)胞融合率達(dá)80％時(shí)，移去培養(yǎng)液，洗滌，加入0.25％胰酶消化，骨髓干細(xì)胞呈圓形時(shí)終止消化；用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以1∶2傳代，每隔2-3天換液一次，逐漸除去血細(xì)胞，待梭形細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層并達(dá)到80％融合時(shí)，0.25％胰酶消化，按1：2或1：4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。

作為進(jìn)一步優(yōu)選地實(shí)施方式，所述毛發(fā)包括人頭發(fā)或動(dòng)物毛發(fā)，所述動(dòng)物毛發(fā)包括羊毛等；所述骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，包括豬和鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的任一種。

實(shí)施例1

一種工程化敷料的制備方法，所述制備方法包括毛發(fā)角蛋白的制備、細(xì)胞懸液的制備以及敷料的制備，具體方法如下：

(1)毛發(fā)角蛋白的制備：

S1：脫脂：稱取5g頭發(fā)，放在1000ml燒杯中。加入99.7％無(wú)水乙醇浸泡30分鐘，間隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次，流水沖洗；

S2：軟化：將清洗后的頭發(fā)放置于≥10％次氯酸鈉10ml和蒸餾水90ml配置的溶液中，常溫浸泡30分鐘，間隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次,流水沖洗；

S3：脫色：按5g頭發(fā)的重量，稱取99％焦磷酸鈉(Na₄P₂O₇)4g，99.5％過(guò)硫酸鉀(K₂S₂O₈)1.5g，30％雙氧水(H₂O₂)80ml，25％濃氨水27.5ml，蒸餾水400ml，配置成脫色溶液，將軟化的頭發(fā)置于此溶液中，放置37℃恒溫水槽中，每隔20分鐘用玻璃棒攪拌1次，觀察頭發(fā)顏色至淺黃色，這一過(guò)程用時(shí)一般2-3個(gè)小時(shí)，比傳統(tǒng)方法短很多；將脫色后的頭發(fā)放置在篩網(wǎng)上，流水沖洗，直至洗掉脫色溶液。

S4：清洗、烘干：取去離子水浸泡上述脫色后的頭發(fā)12小時(shí)以上，去除殘留試劑；去離子水沖洗，過(guò)濾后放置在鼓風(fēng)干燥箱中37℃烘干過(guò)夜；

S5：研磨：將烘干后的頭發(fā)用剪刀剪碎后放在陶瓷研缽中，加入液氮冷凍研磨，至頭發(fā)成1mm長(zhǎng)，得到頭發(fā)粗粉；

S6：球磨：稱取頭發(fā)粗粉2g，放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水10ml,460轉(zhuǎn)/min，球磨2小時(shí)，倒置電子顯微鏡下觀察粒徑的大小，再加入生理鹽水5m繼續(xù)研磨1-2個(gè)小時(shí)，直至形成粒徑約60μm-80μm的人發(fā)角蛋白顆粒勻漿，優(yōu)選70μm；上述的瑪瑙珠的數(shù)量：直徑1cm瑪瑙珠20顆，直徑60mm瑪瑙珠100顆；

S7：裝管：在上述勻漿中加入生理鹽水30ml，將球磨罐中的液體清洗轉(zhuǎn)移至50ml離心管中；

S8：離心：將離心管放在離心機(jī)的離心杯中，離心速度3000轉(zhuǎn)/min，離心20min，棄去上清液，用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，加生理鹽水40ml混勻，繼續(xù)離心一次，棄去上清液，再用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，再加生理鹽水40ml混勻，再次離心，棄上清液，再用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，得到高純度的角蛋白泥，即毛發(fā)角蛋白顆粒；暫時(shí)放置在4℃保存；

S9：滅菌：將得到的高純度角蛋白泥裝于塑料袋中，密封好，用紙箱包裝后送到輻射中心進(jìn)行Co⁶⁰照射滅菌，劑量12Kg，照射完成后拿回實(shí)驗(yàn)室，放置在4℃冰箱，待用；

(2)細(xì)胞懸液的制備

①豬骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離以及細(xì)胞原代培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，將豬骨髓血5ml(1：50肝素抗凝)與同體積Ficoll淋巴細(xì)胞分離液置于15ml的離心管中(注意將骨髓血輕置于分離液的上層)，常溫離心20min，離心后管中混合物分為四層，從下至上依次為：紅細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液、單核細(xì)胞層和血清層。用5ml無(wú)菌吸頭吸取單核細(xì)胞層，置于另一個(gè)15ml的離心管中，加入5mlLG-DMEM，常溫離心5min(1500rpm)，洗滌2次，棄去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5％CO²，相對(duì)濕度70％的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察。3天后首次換液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2～3天換液一次。

②傳代細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)10天左右，待細(xì)胞融合為單層，細(xì)胞融合率達(dá)80％，移去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入0.25％胰酶消化。倒置顯微鏡下觀察，骨髓干細(xì)胞呈圓形時(shí)終止消化；用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以1∶2傳代分為2瓶，即為P1。以后每隔2-3天換液一次，逐漸除去血細(xì)胞，待梭形細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層并達(dá)到80％融合時(shí)，0.25％胰酶消化，按1∶2或1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如圖7～10所示，圖7～10不同周期骨髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)圖片。

敷料的制備：將步驟(1)中制備的毛發(fā)角蛋白與步驟(2)中得到的細(xì)胞懸液按照1:4的重量比混合，制備組織工程敷料。

本實(shí)施例中的豬骨髓血可用鼠骨髓血代替，則得到的是鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，具體方法與上述方法一樣，這里不再重復(fù)限定。

實(shí)施例2

本發(fā)明中的毛發(fā)角蛋白的制備方法(如實(shí)施例1)還可以通過(guò)下述方法代替：

將實(shí)施例1中步驟S9中滅菌后得到的高純度角蛋白泥加入水，充分混勻，放置于溫箱中孵育2-3小時(shí)，至呈現(xiàn)較為均一的顏色和性狀為止；滅菌，得到凝膠化的毛發(fā)角蛋白；

然后該凝膠化的毛發(fā)角蛋白與本發(fā)明的細(xì)胞懸液復(fù)合，制成本發(fā)明的工程敷料。例如：含有5×10⁵Fbs的200ulPBS與200ul凝膠的毛發(fā)角蛋白混合組成。

采用該方法與實(shí)施例1中的方法的原料相同，所起作用以及達(dá)到的效果均類似，可相互替換。

實(shí)施例3

本發(fā)明中的毛發(fā)角蛋白的制備方法，如實(shí)施例1中的方法，還可以通過(guò)下述方法代替：

S1：稱取10g羊毛或人頭發(fā)，放入裝有180ml無(wú)水乙醇和20ml蒸餾水的混合溶液的三口燒瓶中，加熱15分鐘后升溫至75℃，溶液開(kāi)始回流；然后，邊回流邊滴加2ml的NaOH溶液，至氧化角蛋白的pH值為7，回流與滴加同時(shí)結(jié)束，時(shí)間持續(xù)90分鐘；滴加和回流結(jié)束后，在25℃繼續(xù)攪拌5小時(shí)，使反應(yīng)完全，得到成鹽毛發(fā)角蛋白。

S2：將成鹽毛發(fā)角蛋白濾出，并用洗液沖洗，該洗液為無(wú)水乙醇與等量蒸餾水混合，除去未反應(yīng)的NaOH，用pH試紙檢測(cè)是否呈堿性，洗滌至不呈堿性，放入60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥6小時(shí)，得到干燥的毛發(fā)角蛋白磺酸鹽；

S3：經(jīng)過(guò)上述處理而得到的毛發(fā)角蛋白磺酸鹽呈脆性，在流星式球磨罐中粉碎得到角蛋白粉末，控制球磨條件(球料比，研磨時(shí)間，轉(zhuǎn)速等)使毛發(fā)角蛋白磺酸鹽粉末的顆粒在50μm左右，凍干；

S4：凝膠化的毛發(fā)角蛋白：在超凈臺(tái)里操作，取40mg步驟S3中得到的凍干后的毛發(fā)角蛋白磺酸鹽粉中加入5ml無(wú)菌水，先采用攪拌器手工混勻材料，再用斡旋混勻機(jī)充分混勻，放置于37℃溫箱孵育約2-3小時(shí)，則得到顏色和性狀較為均一的毛發(fā)角蛋白凝膠，然后，采用鈷60輻照法滅菌，得到凝膠化的毛發(fā)角蛋白，圖4為10％凝膠化的毛發(fā)角蛋白的性狀，圖5是濃度為4％的凝膠化的毛發(fā)角蛋白的性狀；毛發(fā)角蛋白的濃度越低，其性狀越稀，本實(shí)施例的濃度顯示的凝膠化的毛發(fā)角蛋白基本呈糊狀。

然后該凝膠化的毛發(fā)角蛋白與本發(fā)明的細(xì)胞懸液混合制成本發(fā)明的工程敷料。

采用該方法與實(shí)施例1中的方法的原料相同，所起作用以及達(dá)到的效果均類似，可相互替換。

實(shí)施例4

本發(fā)明的細(xì)胞懸液能夠通過(guò)動(dòng)物皮膚細(xì)胞代替，該動(dòng)物包括豬或鼠，該動(dòng)物皮膚細(xì)胞的細(xì)胞組織制備方法如下：

①細(xì)胞原代培養(yǎng)：A：將豬或鼠的皮膚組織置于含有雙抗的PBS緩沖液(即保護(hù)液)；操作時(shí)，從保存液中取出皮膚組織塊，置于玻璃器皿中，加生理鹽水沖洗3遍，去掉多余的脂肪和血液；轉(zhuǎn)移至直徑35mm的培養(yǎng)皿中，加入分離酶酶消化液(含4％的分離酶)4℃過(guò)夜；B：去表皮，得組織塊，將組織塊置于直徑60mm培養(yǎng)皿中，并將組織塊剪成小塊，加膠原酶消化液(含7％的I型膠原酶)5ml 37℃消化；消化2.5小時(shí)后，吹打消化液并將消化液轉(zhuǎn)移置15ml離心管中，1200轉(zhuǎn)/min 12min離心。C：離心后去掉上清液，用含15％血清DMEM懸浮細(xì)胞，種在新直徑60mm培養(yǎng)皿中，每隔2天換液一次。

②傳代細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

A：去掉培養(yǎng)皿中的上清液，生理鹽水沖洗細(xì)胞2次，加0.1％胰蛋白酶2ml消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮至圓球形時(shí)，去掉消化酶，加入含10％血清的DMEM懸浮細(xì)胞，以1:3的比例擴(kuò)增細(xì)胞至相應(yīng)的培養(yǎng)皿中。每隔2天換含血清5％DMEM一次。B：傳代細(xì)胞擴(kuò)增至培養(yǎng)皿面積的70％左右時(shí)(一般7天左右)，再繼續(xù)傳代培養(yǎng)，按照(7個(gè)大皿/毫升細(xì)胞，每個(gè)大皿的培養(yǎng)液體積約為8～10mL)的標(biāo)準(zhǔn)直至傳夠要求的大皿數(shù)量，每隔兩天換含液血清5％DMEM一次，間隔兩周左右可以收集細(xì)胞，即為得到的豬或鼠的真皮成纖維細(xì)胞懸液，健康成纖維細(xì)胞狀態(tài)如圖6所示。

采用該方法與實(shí)施例1中的方法所起作用以及達(dá)到的效果均類似，可相互替換。

實(shí)施例5：

一、創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)

取健康SD大鼠，戊巴比妥麻醉(30mg/kg)，在其背部脊柱一側(cè)旁開(kāi)1cm，利刀全層切除皮膚，形成一個(gè)直徑1.8cm、面積2.54cm²的圓形全層皮膚切除創(chuàng)面，對(duì)側(cè)對(duì)稱部位皮膚作為正常自身對(duì)照。將制備的毛發(fā)角蛋白和成纖維細(xì)胞懸液復(fù)合而成的本發(fā)明的工程敷料均勻敷于創(chuàng)面，紗布覆蓋創(chuàng)面，打包法處理傷口，如圖1所示。

觀察：實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物傷后3d天創(chuàng)面有所縮小，可見(jiàn)新生肉芽組織生成。傷后21－28d，大部分創(chuàng)面愈合，如圖2所示。

HE染色組織切片觀察：測(cè)真皮層增厚，4周時(shí)平均厚度約0.58mm，可見(jiàn)大量的角蛋白顆粒真皮下聚集，角蛋白之間有細(xì)胞及纖維組織生長(zhǎng)，有少量多核巨細(xì)胞，內(nèi)吞噬有角蛋白顆粒。

免疫組織化學(xué)染色觀察：切片中鼠真皮成纖維細(xì)胞大量分泌Ⅰ型膠原蛋白，膠原纖維排列緊密，染色呈褐色，Ⅰ型膠原蛋白與組織細(xì)胞交錯(cuò)分布；第8周后填充部位皮膚免疫組織化學(xué)染色觀察圖如圖3所示，圖中染色顯示Ⅰ型膠原蛋白分泌情況。

細(xì)菌感染觀察：在受傷至痊愈后未見(jiàn)明顯細(xì)菌感染情況。

結(jié)論：本發(fā)明的角蛋白和成纖維細(xì)胞懸液工程敷料效果非常顯著，在沒(méi)有任何用藥的情況下，未出現(xiàn)明顯發(fā)炎，且傷后21－28d，絕大部分創(chuàng)面愈合，12周時(shí)角蛋白凝膠可基本降解。

具體地，成纖維細(xì)胞通過(guò)有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開(kāi)始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)傷口組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。

毛發(fā)角蛋白生物材料具有利于細(xì)胞滲入、粘附和增殖的三維支架結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞粘附和增殖方面具有明顯優(yōu)于其他材料的特性，同時(shí)具有神經(jīng)誘導(dǎo)性，在止血方面也顯示出很好的效果。

二、研究結(jié)果

毛發(fā)角蛋白顆粒毒性及相容性的體外實(shí)驗(yàn)研究：

試樣浸提液制備：毛發(fā)漂白試樣取1g加入10ml生理鹽水中，經(jīng)液氮冷凍固化后粉碎，取1g加入10ml生理鹽水中，振蕩混勻后在細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中37℃放置7d，離心后吸出上清液，制備毛發(fā)浸提液原液(初始100％濃度毛發(fā)材料100mg∶浸液1ml＝100mg/ml)，過(guò)濾除菌，備用。

體外急性全身毒性試驗(yàn)：對(duì)制備的組織工程敷料制備過(guò)程中可能造成的急性毒性加以初步評(píng)價(jià)。

結(jié)果顯示：按照急性毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方案，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行常規(guī)灌胃，并與術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，小鼠一般情況較好，7天觀察期內(nèi)無(wú)死亡，72h觀察期內(nèi)各組動(dòng)物未見(jiàn)中毒癥狀或不良反應(yīng)，無(wú)死亡，體重增長(zhǎng)正常，方差分析表明兩試驗(yàn)組與生理鹽水組之間小鼠體重變化不存在明顯差異，這表明毛發(fā)角蛋白顆粒和凝膠化的毛發(fā)角蛋白兩種形式材料浸提液均無(wú)急性毒性作用。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)：MTT法法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力：

表1粉體MTT結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示：毛發(fā)角蛋白顆粒形式材料的不同濃度浸提液在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的細(xì)胞相對(duì)增殖率均達(dá)80％以上，細(xì)胞毒性分級(jí)為一級(jí)，具有良好的細(xì)胞相容性，無(wú)細(xì)胞毒性，說(shuō)明在加工過(guò)程中并為造成毛發(fā)自身性質(zhì)和相容性的改變。見(jiàn)表1：

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)：評(píng)價(jià)材料可能的遺傳毒性。微核率指含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，以千分率(‰)表示。

結(jié)果顯示：粉體勻漿組的微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),而與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，受試物小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)呈陰性，說(shuō)明毛發(fā)角蛋白顆粒組無(wú)致染色體畸變毒性作用。見(jiàn)表2

表2骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)結(jié)果

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述的各實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。