本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域中AIDS免疫吸附治療儀的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血細胞內(nèi)、外艾滋病毒的清除，從而達到預防、控制和治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分。

HIV進入人體后，首先被巨噬細胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因為CD4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等)，在細胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進入其他正常的和再生的CD4+細胞內(nèi)復制，制造更多的病毒感染細胞，使外周血CD4+T細胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細胞凋亡，甚至感染HIV的T細胞表達的囊膜抗原也可啟動正常T細胞，通過細胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細胞缺損為中心的嚴重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細胞減少，T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細胞、巨噬細胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細胞因子合成減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細胞，整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進入宿主細胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)繁殖，這些細胞是體內(nèi)的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液，然后再進入其他細胞繼續(xù)感染過程。

HIV感染后可刺激機體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機理推測，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，如果要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補體，介導ADCC效應(yīng)溶解細胞性抗原，但HIV不是細胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細胞內(nèi)被保護、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細胞感染，對已感染的細胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時使用對抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進入宿主細胞，但對肝和心臟有副作用。(5)細胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細胞動態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進入II期臨床試驗階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動免疫療法：通過下調(diào)CD4+T細胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進展和減少HIV的擴散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細胞時會導致病毒大量擴增，增加病毒感染的CD4+T細胞數(shù)量，而回輸CD4+T細胞可能會增加體內(nèi)病毒復制的場所，導致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

CD4分子是HIV的受體，HIV易感于CD4+T細胞，CD4+T細胞是T淋巴細胞的一種，平均壽命一般為7天左右，但某些T細胞特別是經(jīng)永生化成細胞系(株)后可長期存活、無限擴增。國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉(zhuǎn)化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細胞株，構(gòu)建細胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株，構(gòu)建細胞模型來分析上皮細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。Miquel等用SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株，作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導的細胞粘附作用。Webber等用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經(jīng)Ad12-SV40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細胞株作為細胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下，細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質(zhì)疏松的機制。國外研究還表明，導入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對正常的生長特征。在口腔醫(yī)學領(lǐng)域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數(shù)達150次以上，細胞均表現(xiàn)原有的生物學特性，誘導培養(yǎng)后都可以表達來源細胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉(zhuǎn)基因細胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細胞模型、子宮內(nèi)膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型等。所以，可制備CD4+T細胞株，經(jīng)大量培養(yǎng)后，用于制備治療艾滋病的吸附器，以CD4+T細胞吸附、清除血漿中的HIV，同時通過輸給反應(yīng)器中產(chǎn)生的CD4+T細胞的細胞因子，來治療艾滋病患者。

人類的吞噬細胞有大、小兩種，小吞噬細胞是外周血中的中性粒細胞，大吞噬細胞是血中的單核細胞和多種器官、組織中的巨噬細胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細胞系統(tǒng)。單核細胞由骨髓中的單核細胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細胞總數(shù)的3％-8％，其體積較淋巴細胞略大，單核細胞在血液中僅停留12-24小時，然后進入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細胞，巨噬細胞是單核吞噬細胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細胞類型，具有較強的吞噬功能，游走巨噬細胞大于單核細胞數(shù)倍，壽命較長，可在組織中存活幾個月，定居的巨噬細胞有不同的名稱，在肝中為枯否細胞、在腦中為小膠質(zhì)細胞、在骨中為破骨細胞等，其表達Fc受體、C3b受體和CDl4，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細胞。巨噬細胞表達的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細胞。所以，可以常規(guī)雜交瘤細胞制備技術(shù)，制備巨噬細胞雜交瘤細胞，經(jīng)大量擴增后用于制備治療艾滋病的吸附器，以巨噬細胞的吞噬功能來清除血漿中的HIV。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內(nèi)的艾滋病毒，且價格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供AIDS免疫吸附治療儀；另一目的是要提供AIDS免疫吸附治療儀的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：制備能濾除多細胞結(jié)合而成的含有HIV的大體積細胞的血液分離器及能分離單個血細胞及血漿的血漿分離器、以外源基因轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建CD4+T細胞株和/或以CD4+T細胞表面特有分子抗體作為細胞生長刺激劑擴增、以雜交瘤技術(shù)制備既保留原巨噬細胞特性又能無限生長的雜交瘤巨噬細胞株并行擴增，取CD4+T細胞株和巨噬細胞株配制于細胞凍存液，灌注高生物相容性材料制成的容器而制備能防止細胞及其碎片濾出并能為細胞株吞噬、吸附HIV提供場所的HIV吸附器，其中CD4+T細胞株和巨噬細胞株均被固定在吸附器中，起吸附HIV的作用，所制備的HIV吸附器進而與血液、血漿分離器組合并附加計算機調(diào)控程序而制備AIDS免疫吸附治療儀，體外循環(huán)中的血液被治療儀中的血液分離器濾除大體積的多核血細胞，進而被血漿分離器分成血漿和單個血細胞，血漿經(jīng)吸附器濾除HIV后與單個血細胞匯合后回輸。

本發(fā)明的技術(shù)核心由血液、血漿分離器和HIV吸附器構(gòu)成，其中血液分離器的孔徑型號為150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm，能濾除血液中HIV感染細胞形成的多核巨細胞或多細胞聚合體；血漿分離器能分離中等體積的單個血細胞和血漿；HIV吸附器中的吸附劑由CD4+T細胞株和巨噬細胞株制成，配制于細胞凍存液中可以長期低溫保存?zhèn)溆?，因CD4+T細胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細胞，與HIV相遇時能吸附HIV，被吸附的HIV隨CD4+T細胞被固定于吸附器中，又因雜交瘤巨噬細胞的天然吞噬特性，HIV與之相遇時能被吞噬而隨之也被固定于吸附器中，所以在艾滋病血液凈化治療的體外循環(huán)中，含有大量HIV的大體積細胞首先被血液分離器濾除，而血漿中游離的HIV被吸附器吸附清除，凈化后的血漿與中等體積的單個血細胞匯合后回輸，從而清除結(jié)合在細胞表面和/或細胞內(nèi)的HIV以及游離于血漿的HIV。本發(fā)明以體外濾除HIV的方法替代長期以來無法有效殺滅HIV的常規(guī)體內(nèi)抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療方法。

具體實施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的AIDS免疫吸附治療儀的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血液分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明提出的吸附器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素和血液泵(2)與含有廢液出口(5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)、循環(huán)管路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)與兩個并聯(lián)的吸附器(11)和吸附器(12)相連，兩個吸附器的出口管路(13)與血漿分離器(8)的血細胞出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流體循環(huán)。

圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2中，分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細胞(5)進入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細胞和血漿。

圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的單個血細胞，5是能通過微孔(3)的血漿化學成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關(guān)閥門的血細胞出口。

圖4中，2、4分別為固定于凈化器(6)中的巨噬細胞株和CD4+T細胞株；1是游離的HIV；3、5分別為HIV與巨噬細胞株和CD4+T細胞株結(jié)合后而被阻留在凈化器(6)中的結(jié)合物，7為未被結(jié)合而下行的HIV。

下面結(jié)合圖1、圖2、圖3和圖4，對本發(fā)明提出的AIDS免疫吸附治療儀的實施方案作詳細的描述。

一、艾滋病血液凈化劑的制備

(一)雜交瘤巨噬細胞株的制備

1、原代細胞來源

(1)單個核血液細胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細胞和單核巨噬細胞。具體方法是：購買血液中心的濃縮白細胞或為科研而保存的臍帶血，取2mL標本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個核組織細胞：由浙江大學組織工程研究平臺提供。實質(zhì)上屬于來自脾臟的巨噬細胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運：在論理委員會批準和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預冷4℃的無菌密封瓶內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)運至細胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無菌。機械研磨脾臟組織，這時便有大量的組織細胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾懸混有組織細胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細胞混懸液(主要含紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等)。③脾臟組織細胞混懸液中紅細胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細胞的存活，此時，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細胞和淋巴細胞。④脾臟組織巨噬細胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細胞原液，臺盼藍染色判定活力并計數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細胞貼壁，PBS反復吹打、消化，所得細胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細胞：浙江大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實驗室備用。在論理委員會批準和患者知情同意下，取實驗診斷報告后的剩余羊水、絨毛細胞，選擇對數(shù)生長期細胞留用。

2、細胞培養(yǎng)及巨噬細胞貼壁初步分選

按常規(guī)細胞培養(yǎng)，但根據(jù)細胞性質(zhì)的不同，適當調(diào)整培養(yǎng)時間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個核血液細胞(PBMC)或單個核組織細胞(巨噬細胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h，待單個核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞(巨噬細胞以外的細胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI-1640培養(yǎng)基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞(主要為巨噬細胞，但還有少量其他貼壁細胞)。1 000r/min離心5min，棄上清。羊水細胞、絨毛細胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細胞生長克隆、細胞生長匯合率達到60～80％的對數(shù)生長期細胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細胞懸液，配成合適細胞濃度。

3、CD4細胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細胞免疫磁珠分選方法：細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細胞每80uLBuffer含細胞數(shù)10⁷個，每10⁷個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細胞(細胞活力檢測：細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞，計算200個細胞中活細胞的百分比)。此時分選的細胞主要為巨噬細胞。

4、CDl4細胞(巨噬細胞)分選

CDl4為單核細胞和巨噬細胞特有的表面標志，理論上如果從單個核組織細胞、羊水細胞及絨毛細胞中分選，則所得細胞為巨噬細胞；如果從單個核血液細胞中分選，則所得細胞包括單核細胞和巨噬細胞；但因單核細胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠不如巨噬細胞易于貼壁生長，所以在本發(fā)明的細胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來的細胞基本為巨噬細胞。

基本方法類同于CD4細胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CDl4免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細胞一單核細胞結(jié)合：每1×10⁸個PBMC加入200uL偶聯(lián)CDl4抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個細胞加入1～2mL預冷緩沖液，1 000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細胞懸液。(B)收集磁珠標記的單核細胞：將細胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細胞懸液加人細胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細胞分離柱，用針柱快速推動，沖出在分離柱中與CDl4抗體一磁珠相結(jié)合的細胞，即為CDl4+的巨噬細胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％C0：的細胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h。待單核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI-1640培養(yǎng)基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞。1 000r/min離心5min，棄上清。②流式細胞術(shù)法：CDl4標記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細胞懸液中加入CDl4+-FITC抗體100uL，4℃避光標記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細胞密度為2×107/mL。流式細胞儀分選：將制備的細胞在流式細胞儀(BD FAcsAria II，美國)上分選，根據(jù)CDl4抗體的熒光強度、細胞的相對大小以及細胞的相對顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復雜性，收集CDl4+的細胞。

5、CDl4雜交瘤細胞株(雜交瘤巨噬細胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購自Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責任有限公司；DMSO(-甲基亞砜)為國產(chǎn)分析純試劑。

(2)骨髓瘤細胞準備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細胞株，該細胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實際應(yīng)用中考慮選擇同源細胞株，如上海復祥生物科技有限公司向ATCC細胞庫引進的NCI-H929人骨髓瘤細胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復1次。將沉淀物移入細胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進行一次傳代或擴大培養(yǎng)，融合前24小時內(nèi)調(diào)整細胞狀態(tài)，保證融合前細胞形態(tài)良好、生長旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復洗滌細胞2次。

(3)待雜交CDl4細胞(巨噬細胞)準備：本發(fā)明分選的單核巨噬細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細胞融合。以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細胞融合：將CDl4細胞(單核巨噬細胞)與骨髓瘤細胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細胞無顆粒狀沉淀，重復2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預熱離心管，取出后無菌條件下將預熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的單核巨噬細胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細胞克隆生長面積達到1/10個細胞孔時，去培養(yǎng)上清，選擇有生長狀態(tài)良好的雜交瘤細胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標記細胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標注的位置吸取細胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細胞或培養(yǎng)上清檢測雜交瘤巨噬細胞(Mφ)株功能。

①雜交瘤巨噬細胞株吞噬細菌功能檢測：將巨噬細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計數(shù)吞噬細菌和未吞噬細菌的巨噬細胞數(shù)比例，以吞噬細菌功能強的巨噬細胞作為備選陽性克隆株。

②雜交瘤巨噬細胞株吞噬HIV功能檢測：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細胞株混合培養(yǎng)后，分離細胞株，PBS清洗3次，測定經(jīng)裂解的吞噬細胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細胞株產(chǎn)生巨噬細胞因子檢測：以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測結(jié)果，挑選具有較強巨噬細胞功能的培養(yǎng)孔中的細胞克隆重復進行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復2-3輪，檢測功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細胞株的保存與復蘇：保存前12小時調(diào)整細胞生長狀態(tài)，取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細胞，適當消化后制成細胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆谩吞K前準備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細胞株治療細胞制備

即雜交瘤巨噬細胞株的擴增培養(yǎng)。將上述細胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復傳代擴增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細胞株10代，檢測巨噬細胞雜交瘤細胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶內(nèi)進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備，保存?zhèn)溆谩?/p>

(二)CD4+T細胞株的制備

1、原代淋巴細胞的來源

有以下種途經(jīng)：①用于科研保存的傳染病實驗室樣本庫中凍存的淋巴細胞株(經(jīng)滅活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴細胞)；②購買血站新鮮濃縮白細胞，然后進行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細胞；③從商家直接購買的T淋巴細胞系(株)；④用于科研保存的臍帶血淋巴細胞(經(jīng)滅活HIV免疫)；⑤直接取自HIV-1感染者的外周血淋巴細胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細胞分離液分離單個核細胞(PBMC)。

2、CD4+T細胞的制備

①主要試劑與儀器：CD4、CD8免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；異硫氰酸熒光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴細胞分離液(上海恒信生化試劑有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；EpicsXL型流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司)。②單個核細胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法)：無菌取20mL靜脈血，并肝素鈉(500IU/mL)2mL抗凝；PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞(PBMC)總數(shù)。③CD4+T細胞和CD8+T細胞的分離純化：PBMC細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細胞每80uLBuffer含細胞數(shù)10⁷個，每10⁷個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴細胞或非CD8+T淋巴細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4+T淋巴細胞或CD8+T淋巴細胞(細胞活力檢測：細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞，計算200個細胞中活細胞的百分比)。

3、體外擴增CD4+T細胞

有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑，大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細胞后，作為自身治療性細胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖，增量T細胞的回輸也導致了增量HIV的回輸。本發(fā)明以SV40和/或hTERT永生化CD4+T細胞，并以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑，大量擴增CD4+T細胞。

以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑的方法是：將抗CD3單抗(CD4+T細胞同時含有CD3分子)包被到培養(yǎng)板上刺激單個核細胞(淋巴細胞)生長，稱為抗CD3抗體包被法，可獲得很好的擴增效果，應(yīng)用這種方法擴增的淋巴細胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定的療效。國外文獻報道[Shimizu等]亦用此方法培養(yǎng)了5例晚期艾滋病患者的淋巴細胞，培養(yǎng)4周就可獲得1000倍的擴增，且擴增的細胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴增(CD4+T細胞更明顯)。另一種是抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)法，即將抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)于滋珠上作為刺激劑培養(yǎng)HIV感染者外周血單個核細胞(淋巴細胞)，可以擴增大量的CD4+T細胞，并且擴增的CD4+T細胞具有對抗HIV感染的能力，其培養(yǎng)過程中病毒也低于檢測水平，之后發(fā)現(xiàn)這可能與CD28提供了第二信號，選擇性誘導分泌大量的Th1細胞因子和趨化因子有關(guān)，用此方法擴增的CD4+T細胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸，無風險但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T細胞的方法是：以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入離體傳代呈對數(shù)生長的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產(chǎn)物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT永生化的CD4+T細胞。

以SV40永生化CD4+T細胞的方法是：以T4DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA，構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入體外培養(yǎng)的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，以G418篩選的含陽性重組子的細胞，作傳代、擴大培養(yǎng)，篩選細胞形態(tài)、細胞生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細胞。

①以hTERT永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)hTERT的提取：(i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備電泳。(ii)hTERT電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，然后在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min)，關(guān)閉電源。(iii)hTERT純化與回收：從瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)hTERT與pLXSNneo載體的連接：取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μ110mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。

(III)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預冷的CaCl₂或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?ii)以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴增pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。(iii)篩選、擴增重組子：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iv)重組質(zhì)粒的鑒定與擴增：挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4℃、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系：限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補足至20ul，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進行0.8％瓊脂糖電泳，時間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序鑒定準確后，將含有該質(zhì)粒的細菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度及純度后備用。

(IV)CD4+T細胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預培養(yǎng)：將上述細胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補足到100％)，置于37℃，體積分數(shù)5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重組子導入T淋巴細胞及擴大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μl無血清培養(yǎng)液中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下靜置45min，用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，滴加至上述T淋巴細胞中，加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L-¹，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進行等量換液。當總量達到14ml時轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代)，仍處于對數(shù)生長期，即細胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時間呈倍增關(guān)系，死亡細胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數(shù)量的增加情況；通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi)；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù)，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清后，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細胞懸浮液(細胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學特性的鑒定：(i)觀察細胞形態(tài)：可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線：取生長較好的轉(zhuǎn)染細胞，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)，分別取1.4×10⁴細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是：按5mL培養(yǎng)液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時，經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型；(iv)流式細胞術(shù)檢測：檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT整合、表達的結(jié)果。(vii)DNA序列測定：按常規(guī)測序儀檢測，顯示hTERT基因序列。(v)轉(zhuǎn)染細胞DNA中hTERT檢測：如以免疫組織化學檢測，hTERT轉(zhuǎn)染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細胞內(nèi)；(vi)mRNA表達產(chǎn)物測定：取100μl體系的PCR擴增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)hTERT介導CD4+T細胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的細胞，經(jīng)離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細胞，細胞密度為5×10⁵個/ml，加入凍存管，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學特性穩(wěn)定的永生化CD4+T細胞庫備用。

②以SV40永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)SV40大T抗原DNA的提?。?i)SV40DNA酶切：從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加限制性內(nèi)切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。(ii)SV40DNA電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關(guān)閉電源。(iii)從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4 DNA連接酶(20～500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建成SV40T/pcDNA3.1重組子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預冷的CaCl₂或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，應(yīng)在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。(ii)重組子的篩選、擴增與提?。河脽o菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iii)重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T細胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預培養(yǎng)：將上述細胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補足到100％)，置于37℃，體積分數(shù)5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的導入及擴大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將SV40T/pcDNA3.1溶于100μl無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min。用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至上述T淋巴細胞中，然后加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進行等量換液。當總量達到14ml時轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)約6-8周(約第55代)，仍處于對數(shù)生長，即培養(yǎng)時間與細胞增加數(shù)量呈倍增關(guān)系，死亡細胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數(shù)量的增加情況；通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi)；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù)，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細胞懸浮液(細胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學特性的鑒定：(i)觀察細胞形態(tài)：可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線：取生長較好的轉(zhuǎn)染細胞，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)，分別取1.4×10⁴細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如沒有，說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是：按5mL培養(yǎng)液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時，經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型；(iv)流式細胞術(shù)檢測：檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是SV40大T抗原整合、表達的結(jié)果。(viii)DNA序列測定：按常規(guī)測序儀檢測，顯示SV40大T抗原DNA序列。(v)轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測：如以免疫組織化學檢測，SV40轉(zhuǎn)染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’；擴增產(chǎn)物長度為268bp，擴增條件為94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循環(huán)；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，擴增體系為50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl；實驗組以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物-20℃保存)；陰性對照設(shè)兩個，分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5μl進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20℃保存?zhèn)溆?；(vi)mRNA表達產(chǎn)物測定：T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測序：取100μl體系的擴增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)SV40LT基因介導CD4+T細胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的細胞，經(jīng)離心分離(1 200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細胞，細胞密度為5×10⁵個/ml，加入凍存管，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學特性穩(wěn)定的CD4+T細胞庫備用。

(4)與CD4+T細胞相似功能顆粒的制備：可將CD4分子、基因重組的CD4分子及類似功能的分子通過常規(guī)化學偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆粒，或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細胞應(yīng)用。本發(fā)明的CD4+T細胞代表其他CD4+細胞，包括用其他方法制備永生化CD4+T細胞。

二、艾滋病血液吸附器的制備

1、吸附劑的充填

取本發(fā)明制備的雜交瘤巨噬細胞株和CD4+T細胞株，以無菌生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低速短時離心)，按雜交瘤巨噬細胞株和CD4+T細胞株之比為1∶0.5～3的比例取沉淀細胞，裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同)制成的圓柱形吸附器，至4/5，然后加細胞凍存液(含30％胎牛血清、12％二甲亞砜的1640培養(yǎng)液)，使細胞濃度達80％，輕輕搖勻，封口，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存?zhèn)溆?。解凍使用時，需迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的37℃水浴中，并不斷搖動，使管中的液體迅速融化，然后以無菌生理鹽水清洗后使用。

2、吸附器的規(guī)格

所制備的吸附器可為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進出口均設(shè)有細胞篩網(wǎng)，進口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當于4微米)的細胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細胞；液體進出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

3、吸附器的材料

血液吸附器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或吸附器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實現(xiàn)無肝素化。將肝素共價結(jié)合到聚醚砜表面，能提高吸附器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價固化亞油酸膜都可增加組織相容性和抗凝血效果。

三、分離器的制備

(一)血液分離器的制備

1、制備原理：①血細胞、細菌、病毒的分子大小：人體血液中有形成份(細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。細菌的大小為：球菌的直徑約在0.75-1.25μm之間，桿菌長度約在2-5μm，螺旋菌長約100-200μm。病毒的大小以納米(nm)為單位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯(lián)體病毒(Geminiviruses)直徑僅18-20nm，最大的動物痘病毒(Poxviruses)大小達300-450nm×170-260nm，最長的如絲狀病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小為80nm×790-14000nm，多數(shù)單個病毒粒子的直徑在100nm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相關(guān)成份：多核巨細胞(HIV感染細胞表面的gp120與CD4+細胞結(jié)合而成的大體積的HIV感染細胞)、gp120細胞(表面有g(shù)p120但以單個細胞存在的HIV感染細胞)、基因整合細胞(艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細胞表面沒有g(shù)p120的HIV感染細胞)、正常白細胞(未感染HIV的單個細胞存在的粒細胞、單核細胞、淋巴細胞)、紅細胞、血小板、化學成份(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、電解質(zhì)等)、游離的HIV、細菌及其他微生物。③多核巨細胞為天然的大體積細胞；gp120細胞和基因整合細胞可通過抗原和抗體的免疫反應(yīng)使細胞凝集為大體積多細胞聚合體；游離的HIV可通過載體顆粒/免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇篌w積成份。④根據(jù)上述3點，可以制備能通過單個細胞但不能通過大體積細胞或顆粒的血液分離器。⑤選用具有選擇性吸附功能的材料，經(jīng)本發(fā)明的體外血液循環(huán)支路篩除血液中的HIV感染細胞。

2、血液分離器的材料與要求：同本發(fā)明的吸附器，選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應(yīng)和白細胞、血小板、血氧分壓、C3a、C5a的改變。

3、血液分離器的型號與規(guī)格：血液分離器的外形制備成柱形結(jié)構(gòu)(以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯)、扁平結(jié)構(gòu)(以聚醋無紡布等材料作濾芯)等形狀；孔徑制備成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等型號。

4、血液分離器的應(yīng)用原則：根據(jù)艾滋病患者的病情選用不同型號的分離器，原則上先選用大孔徑型號做預篩濾，然后選用較小孔徑的型號。重度艾滋病患者常發(fā)生嚴重的機會性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細胞及其他異物，則選用孔徑為150～250μm或50～150μm的分離器；如為篩濾HIV感染的單核巨噬細胞、多核巨細胞、多細胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質(zhì)，以及為了置換易受HIV感染的CD4+細胞，則選用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之類的型號。這幾種型號近似或小于血液中單個紅細胞、中性粒細胞、小淋巴細胞的體積，但紅細胞、中性粒細胞及巨噬細胞具有變形運動的特性，能通過比自身體積更小的微孔。

(二)血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成分。

四、AIDS免疫吸附治療儀的構(gòu)件

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血液分離器：用于按體積大小篩除以多核巨細胞或多細胞聚合體狀態(tài)存在的HIV感染細胞，即用于清除血細胞內(nèi)的HIV；(2)血漿分離器：用于分離單個血細胞和血漿；(3)HIV吸附器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動靜脈壓和空氣監(jiān)測、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來推動血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準；也不可太緊，否則會造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。(4)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅(qū)動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計算機調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個性化、設(shè)計的安全性，以及模塊化、自動監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、AIDS免疫吸附治療儀的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血漿吸附器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、吸附器及各循環(huán)管路，排除分離器、吸附器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動脈血路管(1)接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

5、啟動：將動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，將靜脈管路(15)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當動脈血液經(jīng)動脈血路管(1)、肝素和血液泵(2)進入血液分離器(3)時，因HIV感染而形成的大體積多核巨細胞被阻留在血液分離器(3)內(nèi)，單個血細胞和血漿依次經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)和循環(huán)管路(7)流入血漿分離器(8)，分離的血漿依次經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)流入此時開放的吸附器(11)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)出口管路(13)流出，同步向吸附器(12)灌注血漿，在吸附器(11)內(nèi)的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時吸附器(12)開始放出血漿，兩個并聯(lián)的吸附器(11)和(12)交替進行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖2，血液分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細胞(5)及血漿進入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細胞和血漿。如表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖3，血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通過微孔(3)的單個血細胞(4)經(jīng)具有可開關(guān)閥門的血細胞出口(8)流出，進入圖1所示的血細胞出口管路(14)；能通過微孔(3)的血漿及其化學成分(5)進入血漿分離器外腔(6)，然后經(jīng)血漿流出口(7)、圖1所示的血漿泵(9)和血路管(10)進入吸附器。如表示圖1中吸附器(11)和(12)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖4，當含有HIV(1)的血漿進入吸附器時，其中的HIV(1)分別被固定在吸附器(6)中的巨噬細胞(2)、CD4+T細胞(4)結(jié)合成巨噬細胞吞噬體(3)、CD4+T細胞結(jié)合物(5)，被結(jié)合后的HIV不再往下移動，被吸附HIV后的凈化血漿經(jīng)圖1所示的出口管路(13)與血漿分離器(8)分離的單個細胞在出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流。如此凈化血液、清除HIV，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用方便、自動化和安全。

六、AIDS免疫吸附治療儀功效的驗證

1、血液分離器濾除HIV感染細胞功效的驗證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗：取疾控中心和傳染病實驗室生物樣本庫保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數(shù)份相同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托浙江省醫(yī)院中心血站按成份輸血的血液成份分離方法，經(jīng)血液成份分離系統(tǒng)分離出白細胞、紅細胞、血漿，取白細胞成份按常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細胞沉淀，然后加入合適比例的gp120抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，然后以孔徑為20～30um的血液成份分離系統(tǒng)分離出大體積的白細胞(稱為大白細胞)，對濾過的白細胞濾液再進一步以孔徑為15～25um的血液成份分離系統(tǒng)分離出中等體積的白細胞(稱為中白細胞)，濾液中的白細胞為小體積的白細胞(稱為小白細胞)，分別收集大、中、小白細胞分離懸液，常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細胞沉淀，常規(guī)方法(機械或細胞裂解液)裂解細胞(如用同種裂解液，需加量相等)，離心沉淀后取上清液，然后根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結(jié)果(表1)說明，AIDS患者不同體積大小的白細胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細胞中HIV-p24的平均含量分別為275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白細胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，減少了54.4％；在大、中、小白細胞中HIV-P24的總含量分別為1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白細胞中HIV-p24總含量相差742.9pg/ml，減少了54.3％，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，t＝2.43，p＜0.05。說明AIDS患者體內(nèi)的大體積白細胞或經(jīng)gp120抗體作用后而形成的大體積白細胞中含有較高含量的HIV，能通過實施本發(fā)明的技術(shù)方案被分離清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白細胞中HIV-p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

2、HIV吸附器(劑)清除HIV功效的驗證

(1)CD4+T細胞株吸附清除HIV功效的驗證

為了驗證CD4+T細胞株吸附清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計了簡易的測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T細胞至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細胞流出但不會阻止小分子的水和化學成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實驗室樣本庫保存的艾滋病患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的CD4+T細胞層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結(jié)果(表1)說明，AIDS血漿濾過含CD4+T細胞的簡易凈化裝置后，部分HIV已被CD4+T細胞吸附，經(jīng)第1次濾過后，HIV總清除率為22.84％，經(jīng)第2次濾過后，總清除率為35.31％，經(jīng)第3次濾過后，總清除率為41.9％。說明隨著濾過次數(shù)的增加，HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含CD4+T細胞的簡易凈化裝置前后p24檢測結(jié)果(pg/ml)

(2)雜交瘤巨噬細胞株吸附清除HIV功效的驗證

為了驗證雜交瘤巨噬細胞株吸附清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計了簡易的測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬細胞雜交瘤細胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達到約10mm長刻度，置血沉管冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細胞流出但不會阻止小分子的水和化學成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實驗室樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡易凈化裝置)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對檢測，按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測靈敏度、血漿長期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測結(jié)果均為陽性。說明巨噬細胞雜交瘤細胞株在此過程產(chǎn)生了MIF細胞因子。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡易吸附器前后MIF配對檢測的同時，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對檢測，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，結(jié)果(表2)說明AIDS血漿濾過簡易吸附裝置后，部分HIV已被巨噬細胞雜交瘤細胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有明顯的效果，說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細胞的簡易吸附裝置前后MIF檢測結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細胞的簡易吸附裝置前后p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，上述簡易驗證實驗表明，已被HIV感染的外周血白細胞易融合成大體積的多核巨細胞或多細胞聚合體，能被血液分離器分離清除；而血漿中游離的HIV，能被本發(fā)明的吸附劑(雜交瘤巨噬細胞株、CD4+T細胞株)吸附清除。表明以血液分離器和HIV吸附器(劑)為關(guān)鍵部件構(gòu)成的AIDS免疫吸附治療儀具有顯著的清除血液細胞內(nèi)、外HIV病毒的治療功效。