本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病凈化治療儀的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血細(xì)胞內(nèi)、外艾滋病毒的清除，從而達(dá)到預(yù)防、控制和治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報(bào)告，自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，至今全球有208個(gè)國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時(shí)每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠(yuǎn)超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個(gè)人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價(jià)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因?yàn)镃D4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細(xì)胞凋亡，甚至感染HIV的T細(xì)胞表達(dá)的囊膜抗原也可啟動(dòng)正常T細(xì)胞，通過細(xì)胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細(xì)胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細(xì)胞缺損為中心的嚴(yán)重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細(xì)胞減少，T4/T8比例配置，對(duì)植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細(xì)胞因子合成減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個(gè)免疫系統(tǒng)就會(huì)遭到致命的打擊，對(duì)各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入其他細(xì)胞繼續(xù)感染過程。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測(cè)出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會(huì)被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個(gè)很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測(cè)，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，如果要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補(bǔ)體，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識(shí)別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細(xì)胞感染，對(duì)已感染的細(xì)胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨(dú)使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導(dǎo)致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時(shí)使用對(duì)抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進(jìn)入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細(xì)胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但對(duì)肝和心臟有副作用。(5)細(xì)胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導(dǎo)致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細(xì)胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動(dòng)免疫療法：通過下調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進(jìn)展和減少HIV的擴(kuò)散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細(xì)胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細(xì)胞時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，增加病毒感染的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，而回輸CD4+T細(xì)胞可能會(huì)增加體內(nèi)病毒復(fù)制的場(chǎng)所，導(dǎo)致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細(xì)胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

CD4分子是HIV的受體，HIV易感于CD4+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一種，平均壽命一般為7天左右，但某些T細(xì)胞特別是經(jīng)永生化成細(xì)胞系(株)后可長期存活、無限擴(kuò)增。國外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細(xì)胞株，構(gòu)建細(xì)胞模型以研究肝素對(duì)血管平滑肌的抑制作用機(jī)制。Su等利用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株，構(gòu)建細(xì)胞模型來分析上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。Miquel等用SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細(xì)胞株，作為細(xì)胞模型研究層粘連蛋白5介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用。Webber等用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞株作為細(xì)胞模型來研究前列腺上皮細(xì)胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經(jīng)Ad12-SV40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細(xì)胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞株作為細(xì)胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下，細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的雙向分化的潛能，進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的機(jī)制。國外研究還表明，導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對(duì)正常的生長特征。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型等。所以，可制備CD4+T細(xì)胞株，經(jīng)大量培養(yǎng)后，用于制備治療艾滋病的凈化器，以CD4+T細(xì)胞吸附、清除血漿中的HIV，同時(shí)通過輸給反應(yīng)器中產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子，來治療艾滋病患者。

人類的吞噬細(xì)胞有大、小兩種，小吞噬細(xì)胞是外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞是血中的單核細(xì)胞和多種器官、組織中的巨噬細(xì)胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細(xì)胞總數(shù)的3％一8％，其體積較淋巴細(xì)胞略大，單核細(xì)胞在血液中僅停留12-24小時(shí)，然后進(jìn)入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，具有較強(qiáng)的吞噬功能，游走巨噬細(xì)胞大于單核細(xì)胞數(shù)倍，壽命較長，可在組織中存活幾個(gè)月，定居的巨噬細(xì)胞有不同的名稱，在肝中為枯否細(xì)胞、在腦中為小膠質(zhì)細(xì)胞、在骨中為破骨細(xì)胞等，其表達(dá)Fc受體、C3b受體和CD14，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞。所以，可以常規(guī)雜交瘤細(xì)胞制備技術(shù)，制備巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)大量擴(kuò)增后用于制備治療艾滋病的凈化器，以巨噬細(xì)胞的吞噬功能來清除血漿中的HIV。

凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)能溶于水，冷卻后凝成凝膠，形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可允許大分子物質(zhì)(分子量可達(dá)百萬以上)自由通過，其孔徑的大小處決于瓊脂濃度，濃度越大，孔徑相對(duì)較小，濃度越小，孔徑相對(duì)較大，1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm。由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，是一種很好的擴(kuò)散介質(zhì)，以瓊脂凝膠為擴(kuò)散介質(zhì)的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是用已知抗體檢測(cè)相應(yīng)未知抗原的常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，也是《中國藥典》2010版中規(guī)定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)一種溶液通過半固體凝膠時(shí)，其中的大分子溶質(zhì)就被分子篩作用的凝膠孔阻留在凝膠中，當(dāng)患者經(jīng)體外循環(huán)分離出的血漿流經(jīng)凝膠時(shí)，血漿中100～120nm的HIV能被孔徑約為85nm的1％濃度的瓊脂凝膠阻留在凝膠中，由此可清除血漿中的HIV。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內(nèi)的艾滋病毒，且價(jià)格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病凈化治療儀；另一目的是要提供艾滋病凈化治療儀的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：制備能濾除多細(xì)胞結(jié)合而成的含有HIV的大體積細(xì)胞的血液分離器及能分離單個(gè)血細(xì)胞及血漿的血漿分離器；以外源基因轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建CD4+T細(xì)胞株和/或以CD4+T細(xì)胞表面特有分子抗體作為細(xì)胞生長刺激劑擴(kuò)增；以雜交瘤技術(shù)制備既保留原巨噬細(xì)胞特性又能無限生長的雜交瘤巨噬細(xì)胞株并行擴(kuò)增；取CD4+T細(xì)胞株和巨噬細(xì)胞株以高生物相容性材料包裹而制備能防止細(xì)胞及其碎片濾出并能為細(xì)胞株吞噬吸附HIV提供場(chǎng)所的血液凈化器；取起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的0.7～1.1％梯度濃度的瓊脂糖，按濃度從高至低依次加入血液凈化器，待冷卻至37℃成為半固體凝膠后再接著加下一次，使凈化器中的凝膠從上到下形成從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，有利于血漿灌流及分子篩和免疫清除的作用，其中CD4+T細(xì)胞株和巨噬細(xì)胞株均被固定在瓊脂糖凝膠中，起吸附HIV的作用，所制備的艾滋病血液凈化器進(jìn)而與血液、血漿分離器組合并附加計(jì)算機(jī)調(diào)控程序而制備艾滋病凈化治療儀，體外循環(huán)中的血液被治療儀中的血液分離器濾除大體積的多核血細(xì)胞，進(jìn)而被血漿分離器分成血漿和單個(gè)血細(xì)胞，血漿經(jīng)凈化器濾除HIV后與單個(gè)血細(xì)胞匯合后回輸。

本發(fā)明的技術(shù)核心由血液、血漿分離器和血漿凈化器構(gòu)成，其中血液分離器的孔徑型號(hào)為150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm，能濾除血液中HIV感染細(xì)胞形成的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體；血漿分離器能分離中等體積的單個(gè)血細(xì)胞和血漿；血漿凈化器中的凈化劑由固定于瓊脂凝膠的CD4+T細(xì)胞株和巨噬細(xì)胞株制成，因CD4+T細(xì)胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細(xì)胞，與HIV相遇時(shí)能吸附HIV，被吸附的HIV隨CD4+T細(xì)胞被固定于瓊脂凝膠，因雜交瘤巨噬細(xì)胞的天然吞噬特性，HIV與之相遇時(shí)能被吞噬而隨之也被固定于瓊脂凝膠，而且瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。所以在艾滋病血液凈化治療的體外循環(huán)中，含有大量HIV的大體積細(xì)胞首先被血液分離器濾除，而血漿中游離的HIV被血漿凈化器吸附清除，凈化后的血漿與中等體積的單個(gè)血細(xì)胞匯合后回輸，從而清除結(jié)合在細(xì)胞表面和/或細(xì)胞內(nèi)的HIV以及游離于血漿的HIV。本發(fā)明以體外機(jī)械濾除HIV的方法替代長期以來無法有效殺滅HIV的常規(guī)體內(nèi)抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療方法，實(shí)現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)機(jī)械清除的治療新方法。

具體實(shí)施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病凈化治療儀的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血液分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明提出的凈化器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素和血液泵(2)與含有廢液出口(5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)、循環(huán)管路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)與兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(11)和凈化器(12)相連，兩個(gè)凈化器的出口管路(13)與血漿分離器(8)的血細(xì)胞出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流體循環(huán)。

圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2中，分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個(gè)血細(xì)胞(5)進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。

圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的單個(gè)血細(xì)胞，5是能通過微孔(3)的血漿化學(xué)成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口。

圖4中，2、4分別為固定于瓊脂凝膠(6)中的巨噬細(xì)胞株和CD4+T細(xì)胞株；1是游離的HIV；3、5分別為HIV與巨噬細(xì)胞株和CD4+T細(xì)胞株結(jié)合后而被阻留在瓊脂凝膠(6)中的結(jié)合物，7為被瓊脂凝膠(6)分子篩阻留的較大體積的HIV。

下面結(jié)合圖1、圖2、圖3和圖4，對(duì)本發(fā)明提出的艾滋病凈化治療儀的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。

一、艾滋病血液凈化劑的制備

(一)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的制備

1、原代細(xì)胞來源

(1)單個(gè)核血液細(xì)胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。具體方法是：購買血液中心的濃縮白細(xì)胞或?yàn)榭蒲卸４娴哪殠а?，?mL標(biāo)本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個(gè)核組織細(xì)胞：由浙江大學(xué)組織工程研究平臺(tái)提供。實(shí)質(zhì)上屬于來自脾臟的巨噬細(xì)胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)：在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標(biāo)本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預(yù)冷4℃的無菌密封瓶?jī)?nèi)，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細(xì)胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺(tái)，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無菌。機(jī)械研磨脾臟組織，這時(shí)便有大量的組織細(xì)胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾懸混有組織細(xì)胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細(xì)胞混懸液(主要含紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)。③脾臟組織細(xì)胞混懸液中紅細(xì)胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時(shí)，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。④脾臟組織巨噬細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細(xì)胞原液，臺(tái)盼藍(lán)染色判定活力并計(jì)數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細(xì)胞貼壁，PBS反復(fù)吹打、消化，所得細(xì)胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細(xì)胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標(biāo)本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細(xì)胞：浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實(shí)驗(yàn)室備用。在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告后的剩余羊水、絨毛細(xì)胞，選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞留用。

2、細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞貼壁初步分選

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，但根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個(gè)核血液細(xì)胞(PBMC)或單個(gè)核組織細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h，待單個(gè)核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞(巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞，但還有少量其他貼壁細(xì)胞)。1 000r/min離心5min，棄上清。羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細(xì)胞生長克隆、細(xì)胞生長匯合率達(dá)到60～80％的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細(xì)胞懸液，配成合適細(xì)胞濃度。

3、CD4細(xì)胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細(xì)胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細(xì)胞免疫磁珠分選方法：細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個(gè)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè)：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。此時(shí)分選的細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。

4、CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分選

CD14為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，理論上如果從單個(gè)核組織細(xì)胞、羊水細(xì)胞及絨毛細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞為巨噬細(xì)胞；如果從單個(gè)核血液細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；但因單核細(xì)胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠(yuǎn)不如巨噬細(xì)胞易于貼壁生長，所以在本發(fā)明的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來的細(xì)胞基本為巨噬細(xì)胞。

基本方法類同于CD4細(xì)胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CD14免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細(xì)胞一單核細(xì)胞結(jié)合：每1×10⁸個(gè)PBMC加入200uL偶聯(lián)CD14抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預(yù)冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1～2mL預(yù)冷緩沖液，1 000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。(B)收集磁珠標(biāo)記的單核細(xì)胞：將細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細(xì)胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細(xì)胞懸液加人細(xì)胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細(xì)胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細(xì)胞分離柱，用針柱快速推動(dòng)，沖出在分離柱中與CD14抗體一磁珠相結(jié)合的細(xì)胞，即為CD14+的巨噬細(xì)胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％C0：的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h。待單核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞。1 000r/min離心5min，棄上清。②流式細(xì)胞術(shù)法：CD14標(biāo)記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入CD14+-FITC抗體100uL，4℃避光標(biāo)記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL。流式細(xì)胞儀分選：將制備的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD FAcsAriaII，美國)上分選，根據(jù)CD14抗體的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的相對(duì)大小以及細(xì)胞的相對(duì)顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，收集CD14+的細(xì)胞。

5、CD14雜交瘤細(xì)胞株(雜交瘤巨噬細(xì)胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購自Sigma公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；DMSO(--甲基亞砜)為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

(2)骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細(xì)胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用中考慮選擇同源細(xì)胞株，如上海復(fù)祥生物科技有限公司向ATCC細(xì)胞庫引進(jìn)的NCI-H929人骨髓瘤細(xì)胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時(shí)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。

(3)待雜交CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)準(zhǔn)備：本發(fā)明分選的單核巨噬細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細(xì)胞融合：將CD14細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的單核巨噬細(xì)胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長分裂，此時(shí)棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，選擇有生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測(cè)雜交瘤巨噬細(xì)胞(Mφ)株功能。

①雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬細(xì)菌功能檢測(cè)：將巨噬細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞數(shù)比例，以吞噬細(xì)菌功能強(qiáng)的巨噬細(xì)胞作為備選陽性克隆株。

②雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬HIV功能檢測(cè)：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，分離細(xì)胞株，PBS清洗3次，測(cè)定經(jīng)裂解的吞噬細(xì)胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生巨噬細(xì)胞因子檢測(cè)：以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細(xì)胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選具有較強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測(cè)功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的保存與復(fù)蘇：保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)，取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆谩?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細(xì)胞株治療細(xì)胞制備

即雜交瘤巨噬細(xì)胞株的擴(kuò)增培養(yǎng)。將上述細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細(xì)胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞株10代，檢測(cè)巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備，保存?zhèn)溆谩?/p>

(二)CD4+T細(xì)胞株的制備

1、原代淋巴細(xì)胞的來源

有以下種途經(jīng)：①用于科研保存的傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫中凍存的淋巴細(xì)胞株(經(jīng)滅活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴細(xì)胞)；②購買血站新鮮濃縮白細(xì)胞，然后進(jìn)行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細(xì)胞；③從商家直接購買的T淋巴細(xì)胞系(株)；④用于科研保存的臍帶血淋巴細(xì)胞(經(jīng)滅活HIV免疫)；⑤直接取自HIV-1感染者的外周血淋巴細(xì)胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

2、CD4+T細(xì)胞的制備

①主要試劑與儀器：CD4、CD8免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；異硫氰酸熒光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴細(xì)胞分離液(上海恒信生化試劑有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；EpicsXL型流式細(xì)胞儀(美國BeckmanCoulter公司)。②單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法)：無菌取20mL靜脈血，并肝素鈉(500IU/mL)2mL抗凝；PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。③CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分離純化：PBMC細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個(gè)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴細(xì)胞或非CD8+T淋巴細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4+T淋巴細(xì)胞或CD8+T淋巴細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè)：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。

3、體外擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞

有文獻(xiàn)報(bào)道利用T細(xì)胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細(xì)胞生長的刺激劑，大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細(xì)胞后，作為自身治療性細(xì)胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細(xì)胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖，增量T細(xì)胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。本發(fā)明以SV40和/或hTERT永生化CD4+T細(xì)胞，并以CD3單克隆抗體為細(xì)胞生長刺激劑，大量擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞。

以CD3單克隆抗體為細(xì)胞生長刺激劑的方法是：將抗CD3單抗(CD4+T細(xì)胞同時(shí)含有CD3分子)包被到培養(yǎng)板上刺激單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)生長，稱為抗CD3抗體包被法，可獲得很好的擴(kuò)增效果，應(yīng)用這種方法擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定的療效。國外文獻(xiàn)報(bào)道[Shimizu等]亦用此方法培養(yǎng)了5例晚期艾滋病患者的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)4周就可獲得1000倍的擴(kuò)增，且擴(kuò)增的細(xì)胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴(kuò)增(CD4+T細(xì)胞更明顯)。另一種是抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)法，即將抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)于滋珠上作為刺激劑培養(yǎng)HIV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，可以擴(kuò)增大量的CD4+T細(xì)胞，并且擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞具有對(duì)抗HIV感染的能力，其培養(yǎng)過程中病毒也低于檢測(cè)水平，之后發(fā)現(xiàn)這可能與CD28提供了第二信號(hào)，選擇性誘導(dǎo)分泌大量的Th1細(xì)胞因子和趨化因子有關(guān)，用此方法擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸，無風(fēng)險(xiǎn)但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T細(xì)胞的方法是：以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入離體傳代呈對(duì)數(shù)生長的T淋巴細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT永生化的CD4+T細(xì)胞。

以SV40永生化CD4+T細(xì)胞的方法是：以T4DNA連接酶連接同時(shí)經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA，構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，以G418篩選的含陽性重組子的細(xì)胞，作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測(cè)、mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定及DNA序列測(cè)定結(jié)果符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細(xì)胞。

①以hTERT永生化CD4+T細(xì)胞的具體方法

(I)hTERT的提取：(i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。(ii)hTERT電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使hTERT向陽極移動(dòng)，然后在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。(iii)hTERT純化與回收：從瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)hTERT與pLXSNneo載體的連接：取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μl10mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。

(III)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl₂或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡(jiǎn)述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?ii)以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。(iii)篩選、擴(kuò)增重組子：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iv)重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增：挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4℃、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系：限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補(bǔ)足至20ul，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8％瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。

(IV)CD4+T細(xì)胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細(xì)胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)：將上述細(xì)胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補(bǔ)足到100％)，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重組子導(dǎo)入T淋巴細(xì)胞及擴(kuò)大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μl無血清培養(yǎng)液中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下靜置45min，用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細(xì)胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，滴加至上述T淋巴細(xì)胞中，加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代)，仍處于對(duì)數(shù)生長期，即細(xì)胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，死亡細(xì)胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況；通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來越多，直至細(xì)胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí)，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清后，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定：(i)觀察細(xì)胞形態(tài)：可見淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有淋巴母細(xì)胞化特征。(ii)觀察細(xì)胞生長曲線：取生長較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4×10⁴細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是：按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時(shí)，經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型；(iv)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說明是hTERT整合、表達(dá)的結(jié)果。(vii)DNA序列測(cè)定：按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè)，顯示hTERT基因序列。(v)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中hTERT檢測(cè)：如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi)；(vi)mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定：取100μl體系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測(cè)濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進(jìn)行測(cè)序。

(VIII)hTERT介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的不同世代的細(xì)胞，經(jīng)離心分離(1 200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/ml，加入凍存管，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化CD4+T細(xì)胞庫備用。

②以SV40永生化CD4+T細(xì)胞的具體方法

(I)SV40大T抗原DNA的提取：(i)SV40DNA酶切：從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加限制性內(nèi)切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。(ii)SV40DNA電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使DNA向陽極移動(dòng)，在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。(iii)從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4DNA連接酶(20～500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建成SV40T/pcDNA3.1重組子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl₂或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡(jiǎn)述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，應(yīng)在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。(ii)重組子的篩選、擴(kuò)增與提?。河脽o菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iii)重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T細(xì)胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細(xì)胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)：將上述細(xì)胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補(bǔ)足到100％)，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的導(dǎo)入及擴(kuò)大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將SV40T/pcDNA3.1溶于100μl無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min。用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細(xì)胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至上述T淋巴細(xì)胞中，然后加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)約6-8周(約第55代)，仍處于對(duì)數(shù)生長，即培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞增加數(shù)量呈倍增關(guān)系，死亡細(xì)胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況；通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來越多，直至細(xì)胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí)，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定：(i)觀察細(xì)胞形態(tài)：可見淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有淋巴母細(xì)胞化特征。(ii)觀察細(xì)胞生長曲線：取生長較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4×10⁴細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如沒有，說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是：按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時(shí)，經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型；(iv)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說明是SV40大T抗原整合、表達(dá)的結(jié)果。(viii)DNA序列測(cè)定：按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè)，顯示SV40大T抗原DNA序列。(v)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中SV40大T基因檢測(cè)：如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細(xì)胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測(cè)T抗原在細(xì)胞中的表達(dá)，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為268bp，擴(kuò)增條件為94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循環(huán)；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，擴(kuò)增體系為50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl；實(shí)驗(yàn)組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物-20℃保存)；陰性對(duì)照設(shè)兩個(gè)，分別以無菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板，陽性對(duì)照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因?yàn)镾V40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5μl進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余-20℃保存?zhèn)溆?；(vi)mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定：T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序：取100μl體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測(cè)濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進(jìn)行測(cè)序。

(VIII)SV40LT基因介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的不同世代的細(xì)胞，經(jīng)離心分離(1 200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/ml，加入凍存管，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞庫備用。

(4)與CD4+T細(xì)胞相似功能顆粒的制備：可將CD4分子、基因重組的CD4分子及類似功能的分子通過常規(guī)化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆粒，或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細(xì)胞應(yīng)用。本發(fā)明的CD4+T細(xì)胞代表其他CD4+細(xì)胞，包括用其他方法制備永生化CD4+T細(xì)胞。

二、艾滋病血液凈化器的制備

1、凈化劑的充填

以無菌生理鹽水清洗所制雜交瘤巨噬細(xì)胞株和CD4+T細(xì)胞株，1000r/min離心，洗凈后再次離心沉淀，直接取沉淀細(xì)胞，或按雜交瘤巨噬細(xì)胞株和CD4+T細(xì)胞株之比為1∶0.5～3的比例取沉淀細(xì)胞，裝入丙烯酸酯之類高生物相容性材料制成的200ml圓柱形容器內(nèi)，充填至4/5以上，制成血液凈化細(xì)胞柱，封口備用。另取起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的瓊脂糖C1-4B生理鹽水，按高濃度至低濃度依次取40ml瓊脂糖加入細(xì)胞柱內(nèi)，要求在先加入的瓊脂糖冷卻至37℃成為半固體后才接著加下一次，使細(xì)胞柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中雜交瘤巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。

2、凈化器的規(guī)格

上述制備的細(xì)胞柱即為凈化器，為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

3、凈化器的材料

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或凈化器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實(shí)現(xiàn)無肝素化。將肝素共價(jià)結(jié)合到聚醚砜表面，能提高凈化器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價(jià)固化亞油酸膜都可增加組織相容性和抗凝血效果。

三、分離器的制備

(一)血液分離器的制備

1、制備原理：①血細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的分子大?。喝梭w血液中有形成份(細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。細(xì)菌的大小為：球菌的直徑約在0.75-1.25μm之間，桿菌長度約在2-5μm，螺旋菌長約100-200μm。病毒的大小以納米(nm)為單位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯(lián)體病毒(Geminiviruses)直徑僅18-20nm，最大的動(dòng)物痘病毒(Poxviruses)大小達(dá)300-450nm×170-260nm，最長的如絲狀病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小為80nm×790-14000nm，多數(shù)單個(gè)病毒粒子的直徑在100nm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相關(guān)成份：多核巨細(xì)胞(HIV感染細(xì)胞表面的gp120與CD4+細(xì)胞結(jié)合而成的大體積的HIV感染細(xì)胞)、gp120細(xì)胞(表面有g(shù)p120但以單個(gè)細(xì)胞存在的HIV感染細(xì)胞)、基因整合細(xì)胞(艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細(xì)胞表面沒有g(shù)p120的HIV感染細(xì)胞)、正常白細(xì)胞(未感染HIV的單個(gè)細(xì)胞存在的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、血小板、化學(xué)成份(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、電解質(zhì)等)、游離的HIV、細(xì)菌及其他微生物。③多核巨細(xì)胞為天然的大體積細(xì)胞；gp120細(xì)胞和基因整合細(xì)胞可通過抗原和抗體的免疫反應(yīng)使細(xì)胞凝集為大體積多細(xì)胞聚合體；游離的HIV可通過載體顆粒/免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇篌w積成份。④根據(jù)上述3點(diǎn)，可以制備能通過單個(gè)細(xì)胞但不能通過大體積細(xì)胞或顆粒的血液分離器。⑤選用具有選擇性吸附功能的材料，經(jīng)本發(fā)明的體外血液循環(huán)支路篩除血液中的HIV感染細(xì)胞。

2、血液分離器的材料與要求：同本發(fā)明的凈化器，選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、C3a、C5a的改變。

3、血液分離器的型號(hào)與規(guī)格：血液分離器的外形制備成柱形結(jié)構(gòu)(以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯)、扁平結(jié)構(gòu)(以聚醋無紡布等材料作濾芯)等形狀；孔徑制備成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm等型號(hào)。

4、血液分離器的應(yīng)用原則：根據(jù)艾滋病患者的病情選用不同型號(hào)的分離器，原則上先選用大孔徑型號(hào)做預(yù)篩濾，然后選用較小孔徑的型號(hào)。重度艾滋病患者常發(fā)生嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細(xì)胞及其他異物，則選用孔徑為150～250μm或50～150μm的分離器；如為篩濾HIV感染的單核巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、多細(xì)胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質(zhì)，以及為了置換易受HIV感染的CD4+細(xì)胞，則選用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之類的型號(hào)。這幾種型號(hào)近似或小于血液中單個(gè)紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞的體積，但紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具有變形運(yùn)動(dòng)的特性，能通過比自身體積更小的微孔。

(二)血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號(hào)與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

四、艾滋病凈化治療儀的構(gòu)件

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血液分離器：用于按體積大小篩除以多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體狀態(tài)存在的HIV感染細(xì)胞，即用于清除血細(xì)胞內(nèi)的HIV；(2)血漿分離器：用于分離單個(gè)血細(xì)胞和血漿；(3)血漿凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動(dòng)靜脈壓和空氣監(jiān)測(cè)、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、超濾監(jiān)測(cè)和漏血監(jiān)測(cè)等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來推動(dòng)血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測(cè)功能，以監(jiān)測(cè)病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會(huì)造成血流檢測(cè)不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會(huì)造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動(dòng)靜脈壓監(jiān)測(cè)：動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測(cè)體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)升高；靜脈壓監(jiān)測(cè)用來監(jiān)測(cè)管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí)，靜脈壓就會(huì)下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí)，靜脈壓就會(huì)升高。(4)空氣監(jiān)測(cè)(Air Detector)：用來監(jiān)測(cè)血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測(cè)的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測(cè)到有空氣氣泡時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險(xiǎn)的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計(jì)算機(jī)調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個(gè)性化、設(shè)計(jì)的安全性，以及模塊化、自動(dòng)監(jiān)測(cè)及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、艾滋病凈化治療儀的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血漿凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動(dòng)脈血路管(1)接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

5、啟動(dòng)：將動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，將靜脈管路(15)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)、肝素和血液泵(2)進(jìn)入血液分離器(3)時(shí)，因HIV感染而形成的大體積多核巨細(xì)胞被阻留在血液分離器(3)內(nèi)，單個(gè)血細(xì)胞和血漿依次經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)和循環(huán)管路(7)流入血漿分離器(8)，分離的血漿依次經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)流入此時(shí)開放的凈化器(11)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)出口管路(13)流出，同步向凈化器(12)灌注血漿，在凈化器(11)內(nèi)的血漿將近流完時(shí)，再次開始灌注血漿，此時(shí)凈化器(12)開始放出血漿，兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(11)和(12)交替進(jìn)行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖2，血液分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個(gè)血細(xì)胞(5)及血漿進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。如表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖3，血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通過微孔(3)的單個(gè)血細(xì)胞(4)經(jīng)具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口(8)流出，進(jìn)入圖1所示的血細(xì)胞出口管路(14)；能通過微孔(3)的血漿及其化學(xué)成分(5)進(jìn)入血漿分離器外腔(6)，然后經(jīng)血漿流出口(7)、圖1所示的血漿泵(9)和血路管(10)進(jìn)入凈化器。如表示圖1中凈化器(11)和(12)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖4，當(dāng)含有HIV(1)的血漿進(jìn)入凈化器時(shí)，其中的HIV(1)分別被固定在瓊脂凝膠(6)中的巨噬細(xì)胞(2)、CD4+T細(xì)胞(4)結(jié)合成巨噬細(xì)胞吞噬體(3)、CD4+T細(xì)胞結(jié)合物(5)，被結(jié)合后的HIV不再往下移動(dòng)，另外未被結(jié)合的較大體積的HIV又被因濃度更高而微孔更小的下層瓊脂凝膠分子篩微孔阻擋在(7)處。被吸附HIV后的凈化血漿經(jīng)圖1所示的出口管路(13)與血漿分離器(8)分離的單個(gè)細(xì)胞在出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流。如此凈化血液、清除HIV，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。整個(gè)治療過程均由電腦控制，并可隨時(shí)檢測(cè)工作狀態(tài)，使用方便、自動(dòng)化和安全。

六、艾滋病凈化治療儀功效的驗(yàn)證

1、血液分離器濾除HIV感染細(xì)胞功效的驗(yàn)證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡(jiǎn)易驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取疾控中心和傳染病實(shí)驗(yàn)室生物樣本庫保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數(shù)份相同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托浙江省醫(yī)院中心血站按成份輸血的血液成份分離方法，經(jīng)血液成份分離系統(tǒng)分離出白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿，取白細(xì)胞成份按常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細(xì)胞沉淀，然后加入合適比例的gp120抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，然后以孔徑為20～30um的血液成份分離系統(tǒng)分離出大體積的白細(xì)胞(稱為大白細(xì)胞)，對(duì)濾過的白細(xì)胞濾液再進(jìn)一步以孔徑為15～25um的血液成份分離系統(tǒng)分離出中等體積的白細(xì)胞(稱為中白細(xì)胞)，濾液中的白細(xì)胞為小體積的白細(xì)胞(稱為小白細(xì)胞)，分別收集大、中、小白細(xì)胞分離懸液，常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細(xì)胞沉淀，常規(guī)方法(機(jī)械或細(xì)胞裂解液)裂解細(xì)胞(如用同種裂解液，需加量相等)，離心沉淀后取上清液，然后根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽性，檢測(cè)結(jié)果(表1)說明，AIDS患者不同體積大小的白細(xì)胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24的平均含量分別為275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，減少了54.4％；在大、中、小白細(xì)胞中HIV-P24的總含量分別為1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24總含量相差742.9pg/ml，減少了54.3％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，t＝2.43，p＜0.05。說明AIDS患者體內(nèi)的大體積白細(xì)胞或經(jīng)gp120抗體作用后而形成的大體積白細(xì)胞中含有較高含量的HIV，能通過實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案被分離清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

2、血漿凈化器(劑)清除HIV功效的驗(yàn)證

(1)CD4+T細(xì)胞株吸附清除HIV功效的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證CD4+T細(xì)胞株吸附清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易的測(cè)試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T細(xì)胞至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫保存的艾滋病患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的CD4+T細(xì)胞層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽性，檢測(cè)結(jié)果(表1)說明，AIDS血漿濾過含CD4+T細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置后，部分HIV已被CD4+T細(xì)胞吸附，經(jīng)第1次濾過后，HIV總清除率為22.84％，經(jīng)第2次濾過后，總清除率為35.31％，經(jīng)第3次濾過后，總清除率為41.9％。說明隨著濾過次數(shù)的增加，HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含CD4+T細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后p24檢測(cè)結(jié)果(pg/ml)

(2)雜交瘤巨噬細(xì)胞株吸附清除HIV功效的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證雜交瘤巨噬細(xì)胞株吸附清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易的測(cè)試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長刻度，置血沉管冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡(jiǎn)易凈化裝置)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細(xì)胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對(duì)檢測(cè)，按說明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測(cè)結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測(cè)靈敏度、血漿長期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測(cè)結(jié)果均為陽性。說明巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株在此過程產(chǎn)生了MIF細(xì)胞因子。MIF是集細(xì)胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化器前后MIF配對(duì)檢測(cè)的同時(shí)，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對(duì)檢測(cè)，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽性，結(jié)果(表2)說明AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化裝置后，部分HIV已被巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有明顯的效果，說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后MIF檢測(cè)結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，上述簡(jiǎn)易驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，已被HIV感染的外周血白細(xì)胞易融合成大體積的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，能被本發(fā)明的血液分離器分離清除；而血漿中游離的HIV，能被本發(fā)明的血液凈化劑(雜交瘤巨噬細(xì)胞株、CD4+T細(xì)胞株、瓊脂凝膠微孔)吸附清除。表明以血液分離器和血漿凈化器(劑)為關(guān)鍵部件構(gòu)成的艾滋病凈化治療儀具有顯著的清除血液細(xì)胞內(nèi)、外HIV病毒的治療功效。