本發(fā)明涉及醫(yī)學領域中艾滋病免疫凈化器的制備及應用，主要用于艾滋病患者血漿艾滋病毒的清除，從而達到治療艾滋病的目的。

背景技術：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關報告，自1981年美國發(fā)現首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠超過100萬。艾滋病已經成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關注的嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。

HIV進入人體后，首先被巨噬細胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內繁殖。因為CD4是HIV的受體，所以經巨噬細胞內繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等)，在細胞內迅速增殖，每天產生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進入其他正常的和再生的CD4+細胞內復制，制造更多的病毒感染細胞，使外周血CD4+T細胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結合可直接激活受感染的細胞凋亡，甚至感染HIV的T細胞表達的囊膜抗原也可啟動正常T細胞，通過細胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細胞的大量破壞，結果造成以CD4+T細胞缺損為中心的嚴重免疫缺陷，患者主要表現：外周淋巴細胞減少，T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應消失，遲發(fā)型變態(tài)反應下降，NK細胞、巨噬細胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細胞因子合成減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細胞，整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現為長期潛伏而不表現出臨床癥狀，其基因組RNA反轉錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進入宿主細胞核內，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組內，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數月甚至多年不復制，造成AIDS數月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結的巨噬細胞和樹突狀細胞內繁殖，這些細胞是體內的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉染外周血中的CD4+T細胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內轉錄復制。經大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液，然后再進入新的CD4+T細胞，繼續(xù)感染過程。

HIV感染后可刺激機體生產囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應該是，根據抗體殺滅、清除抗原的機理推測，免疫性抗體與抗原結合后，要產生免疫效應，要么通過激活補體，介導ADCC效應溶解細胞性抗原，但HIV不是細胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細胞吞噬抗原，但HIV反而在吞噬細胞內被保護、增殖；要么抗體與抗原結合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結構多變，往往使抗體難以識別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細胞感染，對已感染的細胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產生，這類藥已不單獨使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產生耐藥變株，導致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產生藥物性肝損傷、脂質代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時使用對抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結合、阻斷HIV與輔助受體結合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進入宿主細胞，但對肝和心臟有副作用。(5)細胞因子治療：主要用于調節(jié)T細胞動態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術、RNA誘餌、RNA干擾、細胞內抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進入II期臨床試驗階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動免疫療法：通過下調CD4+T細胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進展和減少HIV的擴散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細胞時會導致病毒大量擴增，增加病毒感染的CD4+T細胞數量，而回輸CD4+T細胞可能會增加體內病毒復制的場所，導致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

凝膠中抗原-抗體沉淀反應于1905年首先應用于研究利澤甘氏現象，1932年應用于鑒定細菌菌株，1946年Oudin在試管中進行免疫擴散試驗，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向雙擴散法，用于同時鑒定、比較兩種以上抗原或抗體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應的介質凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時能溶于水，冷后凝成凝膠，內部形成一種多孔的網狀結構，而且孔徑很大，可允許大分子物質(分子量可達百萬以上)自由通過?？讖降拇笮∵€決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相對較小，瓊脂濃度小，孔徑相對較大。1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴散介質?？乖涂贵w的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域擴散時所受的阻力很小，基本上呈自由擴散形式。由于不同抗原分子的分子量、結構、形狀和電荷量不同，因此其擴散系數不同，在凝膠中擴散速度也就不同。當抗原與相應抗體經擴散后在凝膠中相遇，形成抗原抗體復合物，若兩者在相遇處比例適當，則形成最大的復合物。由于復合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴散而產生沉淀，呈現出線狀或帶狀，這種沉淀就形成了一個“特異性屏障”，凡在免疫學上與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質不同的那些分子可以通過這個屏障而繼續(xù)擴散，直到形成它們自己的復合物為止。這樣，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此種反應稱為瓊脂凝膠擴散，或瓊脂擴散，或免疫擴散，其形成的線狀或帶狀的“特異性屏障”稱為免疫沉淀線或免疫沉淀帶，簡稱沉淀線或沉淀帶。是目前用已知抗體檢測未知量相應抗原的常規(guī)實驗診斷項目，也是《中國藥典》2010版中規(guī)定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測的標準方法。通常將一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，待凝固后打孔，并在相應孔中加入待檢人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待檢血清在瓊脂板中向四周擴散，在抗原和抗體濃度比例合適處發(fā)生結合，形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)而不再擴散。由此可見，當一種溶液通過半固體凝膠時，其中的大分子溶質就被分子篩作用的凝膠孔阻留在凝膠中，特別是其中的抗原能被預先固定在凝膠中的抗體結合而被吸附在凝膠中。所以，可根據瓊脂凝膠擴散的原理，制備不同感染株的HIV抗體，將HIV抗體預先固定在凝膠中，當患者經體外循環(huán)分離出的血漿流經凝膠時，血漿中的HIV被預先固定在凝膠中的相應的抗體結合而阻留在凝膠中，同時因1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，也能阻留100～120nm的HIV，經如此抗體吸附和凝膠分子篩的作用，即可人工體外清除HIV。

CD4分子是HIV的受體，HIV易感于CD4+T細胞，CD4+T細胞是T淋巴細胞的一種，平均壽命一般為7天左右，但某些T細胞特別是經永生化成細胞系(株)后可長期存活、無限擴增。國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因轉化來建立血管平滑肌細胞株，構建細胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經SV40轉化的角化上皮細胞株，構建細胞模型來分析上皮細胞內蛋白質合成的調控作用。Miquel等用SV40轉化的角化上皮細胞株，作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導的細胞粘附作用。Webber等用經SV40轉化的前列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經Ad12-SV40轉化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉化建立骨髓基質細胞株作為細胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下，細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質疏松的機制。國外研究還表明，導入外源性人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對正常的生長特征。在口腔醫(yī)學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導培養(yǎng)后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型等。所以，可制備CD4+T細胞株，經大量擴增后，用于吸附、清除血漿中的HIV。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內的艾滋病毒，且價格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術實現要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病免疫凈化器；另一目的是要提供艾滋病免疫凈化器的制備及應用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現的：制備能分離血細胞和血漿的分離器，制備HIVgp120和gp41抗體，再以gp120和gp41抗體為抗原制備羊抗gp120和gp41抗體，以外源基因轉染構建CD4+T細胞株并以其表面特有分子抗體為生長刺激劑擴增，以高生物相容性材料包裹CD4+T細胞而制備能防止細胞及其碎片濾出并能為清除HIV提供場所的凈化器，將gp120和gp41抗體以及羊抗gp120和gp41抗體混合，使羊抗gp120和gp41抗體被完全結合，但剩有高滴度的gp120和gp41抗體，將抗體以反向梯度滴度配入經100℃溶化后保溫在39～42℃的梯度濃度的瓊脂糖，按抗體滴度從低至高依次取瓊脂糖加入凈化器，待冷卻至半固體凝膠后再加下一次，使凈化器中的凝膠從上到下形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂濃度的分層分布，有利于血漿灌流及分子篩和免疫清除的作用，其中與羊抗HIV抗體結合和未結合的gp120及gp41抗體、CD4+T細胞均被固定在瓊脂糖凝膠而起吸附HIV的作用，所制備的凈化器進而與分離器及調控程序組合使用，體外循環(huán)中的血液被分離器分成血漿和血細胞，血漿經凈化器濾除HIV后與血細胞匯合，然后回輸。

本發(fā)明的技術核心由血漿分離器及凈化器構成，其中血漿分離器用于分離血細胞和血漿，凈化器中的凈化劑由固定于瓊脂凝膠的HIV抗體、與羊抗Ig結合的HIV抗體、CD4+T細胞株制成，其中與羊抗Ig結合的HIV抗體其結合物的分子量比未結合的HIV抗體分子量大，不易通過凝膠分子篩，以及所含羊抗Ig易與瓊脂凝膠固定結合的特點，HIV抗體也隨之更易被固定于瓊脂凝膠，血漿中的HIV與被固定于瓊脂凝膠的HIV抗體相遇時會發(fā)生結合反應而形成抗原抗體復合物，從而通過HIV抗體被固定于瓊脂凝膠，因CD4+T細胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細胞，與HIV相遇時能吸附HIV，被吸附的HIV隨CD4+T細胞被固定于瓊脂凝膠，而且瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體或細胞與HIV的結合反應；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療，所以在體外循環(huán)中，血液被分離器分離出血漿和血細胞后，血漿流經凈化器時其中的HIV被凈化劑吸附而清除，凈化后的血漿與血細胞匯合后回輸，本發(fā)明以體外機械濾除HIV的方法替代長期以來無法有效殺滅HIV的常規(guī)體內抗逆轉錄藥物治療方法，實現了人工將HIV從體內機械清除的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據本發(fā)明提出的艾滋病免疫凈化器的應用示意圖。

圖2是根據本發(fā)明提出的分離器的內部結構示意圖。

圖3是根據本發(fā)明提出的凈化器的內部結構示意圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個并聯(lián)的凈化器(8)、凈化器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內腔，3是血漿分離器內腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細胞，5是能通過微孔(3)的血漿及化學成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關閥門的血細胞出口。

圖3中，1是游離的HIV，2、4分別為固定于瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體、CD4+T細胞，3、5分別為HIV與HIV抗體、CD4+T細胞結合后而被阻留在瓊脂凝膠(6)中的結合物，7為被瓊脂凝膠(6)分子篩阻留的較大體積的HIV。

下面結合圖1、圖2和圖3，對本發(fā)明提出的艾滋病免疫凈化器的實施方案作詳細的描述。

一、艾滋病血液凈化劑的制備

(一)CD4+T細胞株的制備

1、原代淋巴細胞的來源

有以下種途經：①用于科研保存的傳染病實驗室樣本庫中凍存的淋巴細胞株(經滅活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴細胞)；②購買血站新鮮濃縮白細胞，然后進行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細胞；③從商家直接購買的T淋巴細胞系(株)；④用于科研保存的臍帶血淋巴細胞(經滅活HIV免疫)；⑤直接取自HIV-1感染者的外周血淋巴細胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細胞分離液分離單個核細胞(PBMC)。

2、CD4+T細胞的制備

①主要試劑與儀器：CD4、CD8免疫磁珠(德國美天旎生物技術有限公司)；異硫氰酸熒光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司)；淋巴細胞分離液(上海恒信生化試劑有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術服務公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術有限公司)；EpicsXL型流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司)。②單個核細胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法)：無菌取20mL血樣(500IU/mL2mL肝素鈉抗凝)；PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數板上顯微鏡下計數4個大方格內的細胞(PBMC)總數。③CD4+T細胞和CD8+T細胞的分離純化：PBMC細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細胞每80uLBuffer含細胞數10⁷個，每10⁷個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴細胞或非CD8+T淋巴細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4+T淋巴細胞或CD8+T淋巴細胞(細胞活力檢測：細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞，計算200個細胞中活細胞的百分比)。

3、體外擴增CD4+T細胞

有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑，大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細胞后，作為自身治療性細胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內增殖，增量T細胞的回輸也導致了增量HIV的回輸。本發(fā)明以SV40和/或hTERT永生化CD4+T細胞，并以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑，大量擴增CD4+T細胞。

以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑的方法是：將抗CD3單抗(CD4+T細胞同時含有CD3分子)包被到培養(yǎng)板上刺激單個核細胞(淋巴細胞)生長，稱為抗CD3抗體包被法，可獲得很好的擴增效果，應用這種方法擴增的淋巴細胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定的療效。國外文獻報道[Shimizu等]亦用此方法培養(yǎng)了5例晚期艾滋病患者的淋巴細胞，培養(yǎng)4周就可獲得1000倍的擴增，且擴增的細胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴增(CD4+T細胞更明顯)。另一種是抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)法，即將抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)于滋珠上作為刺激劑培養(yǎng)HIV感染者外周血單個核細胞(淋巴細胞)，可以擴增大量的CD4+T細胞，并且擴增的CD4+T細胞具有對抗HIV感染的能力，其培養(yǎng)過程中病毒也低于檢測水平，之后發(fā)現這可能與CD28提供了第二信號，選擇性誘導分泌大量的Th1細胞因子和趨化因子有關，用此方法擴增的CD4+T細胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸，無風險但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T細胞的方法是：以內切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入離體傳代呈對數生長的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT永生化的CD4+T細胞。

以SV40永生化CD4+T細胞的方法是：以T4DNA連接酶連接同時經BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA，構建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質粒，轉化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入體外培養(yǎng)的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，以G418篩選的含陽性重組子的細胞，作傳代、擴大培養(yǎng)，篩選細胞形態(tài)、細胞生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產物測定及DNA序列測定結果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細胞。

①以hTERT永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)hTERT的提?。?i)酶切pClneo-hTERT：hTERT位于質粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解于適量的超凈H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加限制性內切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液終止反應，按常規(guī)PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備電泳。(ii)hTERT電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約Imm，用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，然后在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min)，關閉電源。(iii)hTERT純化與回收：從瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)hTERT與pLXSNneo載體的連接：取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μl 10mmol/LATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15℃溫育24h，構建pLXSNneo-hTERT重組子。

(III)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，轉到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉搖床200～300r/min)，每隔20～30min測量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉頭以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?ii)以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴增pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200μl)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/LMgSO4和相應抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現菌落。(iii)篩選、擴增重組子：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iv)重組質粒的鑒定與擴增：挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4℃、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質粒反應體系：限制性內切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重組質粒10ul、加水補足至20ul，37℃酶切1h。酶切產物于80V電壓條件下進行0.8％瓊脂糖電泳，時間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質粒的序列；重組質粒經酶切、測序鑒定準確后，將含有該質粒的細菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴增培養(yǎng)，按大劑量質粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質粒抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。

(IV)CD4+T細胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預培養(yǎng)：將上述細胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補足到100％)，置于37℃，體積分數5％CO2培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重組子導入T淋巴細胞及擴大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μl無血清培養(yǎng)液中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下靜置45min，用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，滴加至上述T淋巴細胞中，加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進行等量換液。當總量達到14ml時轉移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代)，仍處于對數生長期，即細胞增加數量與培養(yǎng)時間呈倍增關系，死亡細胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數量的增加情況；通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞)。此后隨著培養(yǎng)代數的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞數量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘，棄上清后，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細胞懸浮液(細胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學特性的鑒定：(i)觀察細胞形態(tài)：可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象，具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線：結果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數)，描繪在半對數座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉化；(iv)流式細胞術檢測：檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT整合、表達的結果。(vii)DNA序列測定：按常規(guī)測序儀檢測，顯示hTERT基因序列。(v)轉染細胞DNA中hTERT檢測：如以免疫組織化學檢測，hTERT轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細胞內；(vi)mRNA表達產物測定：取100μl體系的PCR擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)hTERT介導CD4+T細胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數生長期的不同世代的細胞，經離心分離(1 200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細胞，細胞密度為5×10⁵個/ml，加入凍存管，經4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構建生物學特性穩(wěn)定的永生化CD4+T細胞庫備用。

②以SV40永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)SV40大T抗原DNA的提?。?i)SV40DNA酶切：從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uLH₂O，加限制性內切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應以備電泳。(ii)SV40DNA電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源。(iii)從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20℃過夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4DNA連接酶(20～500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15℃溫育24h，構建成SV40T/pcDNA3.1重組子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定：(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預冷的CaCl₂或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉搖床200～300r/min)，每隔20～30min測量OD600值≈0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，應在每管中加DNA或連接反應混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/LMgSO4和相應抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現菌落。(ii)重組子的篩選、擴增與提?。河脽o菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1500g離心10min，加入2mL 70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iii)重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T細胞：從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預培養(yǎng)：將上述細胞接種于含5～10nmol/L胰島素、20％胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，-般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補足到100％)，置于37℃，體積分數5％CO2培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的導入及擴大培養(yǎng)：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：管A，將SV40T/pcDNA3.1溶于100μl無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)中；管B，將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min。用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至上述T淋巴細胞中，然后加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進行等量換液。當總量達到14ml時轉移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)約6-8周(約第55代)，仍處于對數生長，即培養(yǎng)時間與細胞增加數量呈倍增關系，死亡細胞少于10％(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數量的增加情況；通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數1000個細胞總數，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞數量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘，棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細胞懸浮液(細胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學特性的鑒定：(i)觀察細胞形態(tài)：可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象，具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線：取生長較好的轉染細胞，制成細胞懸液，經計數，分別取1.4×10⁴細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數)，描繪在半對數座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；(iii)檢查染色體：通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現異常的DNA群體，如沒有，說明細胞系未出現瘤性特征)。染色體核型分析方法是：按5mL培養(yǎng)液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時，經離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型；(iv)流式細胞術檢測：檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是SV40大T抗原整合、表達的結果。(viii)DNA序列測定：按常規(guī)測序儀檢測，顯示SV40大T抗原DNA序列。(v)轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測：如以免疫組織化學檢測，SV40轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細胞內；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’；擴增產物長度為268bp，擴增條件為94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循環(huán)；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，擴增體系為50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl；實驗組以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產物-20℃保存)；陰性對照設兩個，分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40 DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5μl進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20℃保存?zhèn)溆?；(vi)mRNA表達產物測定：T抗原mRNA RT-PCR產物測序：取100μl體系的擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)SV40LT基因介導CD4+T細胞庫：篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數生長期的不同世代的細胞，經離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5～1ml重懸細胞，細胞密度為5×10⁵個/ml，加入凍存管，經4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜，入-196℃液氮凍存，以此法構建生物學特性穩(wěn)定的CD4+T細胞庫備用。

(4)與CD4+T細胞相似功能顆粒的制備：可將CD4分子、基因重組的CD4分子及類似功能的分子通過常規(guī)化學偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆粒，或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細胞應用。本發(fā)明的CD4+T細胞代表其他CD4+細胞，包括用其他方法制備永生化CD4+T細胞。

(二)HIV-1gp120抗體的制備

本發(fā)明所涉及的抗體可以委托專業(yè)商家制備，或直接從專業(yè)商家購買，如上海瑞齊生物科技有限公司及上海領潮生物科技有限公司等單位都專業(yè)從事HIV-1gp120抗體、gp41抗體及羊抗人IgG等各種抗體的制備和銷售。方法包括雜交瘤技術制備單克隆抗體、EB病毒轉化技術制備單克隆抗體、雜交瘤技術與EB病毒轉化技術相結合制備單克隆抗體和基因工程抗體，具體列舉如下。

1、采用淋巴細胞EB病毒轉化與雜交瘤技術相結合制備HIV-1gp120單克隆抗體

標本來源有以下幾種途經：取傳染病實驗室樣本庫中凍存的淋巴細胞株(經滅活HIV免疫和EBV轉染的淋巴細胞)；購買血站新鮮濃縮白細胞，然后進行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細胞；取自作為科研而保存的臍帶血淋巴細胞(經滅活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴細胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細胞分離液分離單個核細胞(PBMC)，調節(jié)濃度為2x 10⁶后加入適量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培養(yǎng)過夜，制備待雜交B細胞，用ELISA方法篩選抗HIV-1外膜蛋白(gp120)陽性孔，轉移細胞至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)2周，重復用ELISA法測定抗gpl20確認陽性者，連續(xù)克隆二次并大量擴增培養(yǎng)。將陽性細胞株與人鼠異質骨髓瘤細胞(由浙江大學免疫系購得)混合(3∶1)后，加入1ml50％PEG使二者融合，然后重懸細胞在IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)過液，第二天加入小鼠腹腔細胞(由浙江大學免疫系購得)作為滋養(yǎng)細胞，繼續(xù)培養(yǎng)3周后用ELISA篩選抗gpl20抗體，挑選強陽性孔雜交瘤細胞擴增培養(yǎng)，并進行多次克隆直至獲得穩(wěn)定的細胞系，以此細胞系培養(yǎng)、制備HIV-1抗體，采用ELISA檢測試劑盒，按說明書操作，測定抗體的Ig亞類，并以常規(guī)ELISA法測定抗體的效價和特異性，選出特異性強、效價高的抗體。

2、采用基因重組HIV-1gp120結合雜交瘤技術制備抗體

(1)試劑與重組抗原：涉及試劑：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纖維膜條由北京萬泰藥業(yè)公司提供BamH I內切酶Xho I內切酶、核酸共沉淀劑、T4DNALigase購自寶生物有限公司；Liagen膠回收試劑盒購自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司；優(yōu)級新生牛血清購自明海生物工程有限公司；SupersignalWest Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit購自Pierce公司；小鼠Ig亞類檢測試劑盒、福氏佐劑及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem購自Sigma公司。HIV-抗體診斷試劑盒購自上?？迫A生物有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自博士德有限公司。重組質粒構建及鑒定：載體質粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase連接gp120基因片段，重組質粒轉化入大腸桿菌XL1-blue，進行測序。重組蛋白的誘導表達及鑒定：重組質粒轉化入XL1-Blue大腸桿菌中，在IPTG誘導劑作用下25℃，190r/min震蕩，過夜，4 000r/min離心10min，收集細菌，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。融合蛋白純化和鑒定：表達產物離心收集沉淀經PBS懸起，用30W超聲粉碎儀裂解細菌后，將其離心收集上清過濾，濾液用AKTA PURIFYER100蛋白純化儀、GST柱純化，得到融合蛋白GST-HIV，濃縮離心管進行濃縮，S21型生物分光光度計測量濃度，SDS-PAGE對純化蛋白進行鑒定。

(2)動物免疫：BALB/c小鼠6周齡，雌性，4只，免疫前取小鼠靜脈血，分離血清留做陰性血清。將50-100μg的GST-HIV融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐劑與融合蛋白乳化后加強免疫小鼠，免疫劑量和途徑同前，重復免疫2-3次，最后一次加強免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

(3)單抗檢測方法的建立：第三次免疫后一周尾靜脈采血，用方陣法確定陽性血清的最佳工作濃度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被濃度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100四個稀釋度，使用包被緩沖液稀釋抗原，縱向包被96孔酶標板，每孔100μL，4℃包被過夜，洗滌3次，每次間隔3分鐘。將陽性血清和陰性血清分別由1∶1000開始作倍比稀釋，橫向加樣到第10孔，每孔100μL，置于濕盒中37℃溫育1h，洗滌3次，每次間隔3分鐘。酶標抗體HRP-羊抗鼠IgG按照說明書作1∶10000稀釋，每孔100μL，37℃溫育1h，洗滌3次。加人現配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反應適當時間，每孔加100μL終止液終止反應，檢測其OD492值。陽性雜交瘤細胞篩選方法建立。按照方陣法中實驗條件和方法，分別以GST-HIV融合蛋白為實驗組，誘導表達后重組菌(含質粒pET-32a)蛋白為對照組，篩選陽性克隆。操作步驟如下：在96孔酶標板上以最適包被濃度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被過夜。取出包被板后加入洗滌液洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加待測細胞上清(1∶5稀釋)100μL，37℃溫箱孵育50min，之后洗滌3次，每次洗滌3min；每孔再加入二抗100μl，37℃溫箱孵育30min，洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加入現配的OPD底物液100μL，室溫避光反應10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4終止液100μl用于終止反應；將檢測板放在酶標儀上測OD492值。對照組的設立：陽性對照組為適當稀釋的陽性血清，陰性對照組是和一抗有相同稀釋度的無關單抗的細胞上清。間接ELISA篩選結果判定。每組檢測OD492值，以P(樣品值)/N(陰性值)≥2.0者判為陽性值。篩選陽性克隆標準：細胞上清與正篩選組(純化后融合蛋白包被)反應呈陽性，同時與負篩選組(誘導后的含pET-32a質粒的菌體蛋白)反應呈陰性的檢測孔為陽性樣品。

(4)細胞融合：骨髓瘤細胞準備：融合前一周從液氮罐內取出一管凍存的骨髓瘤細胞，立即放入熱水解凍。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/min離心3min；重復1次。將沉淀物移入細胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進行一次傳代或擴大培養(yǎng)，融合前24小時內調整細胞狀態(tài)，保證融合前細胞形態(tài)良好、生長旺盛。融合前使用適量胰酶消化后使用離心管收集，加入適量基礎培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/min離心5-10min，重復洗滌細胞2次。脾細胞準備：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉頸處死，在75％乙醇中浸濕。取出后仰放固定于解剖板上，無菌環(huán)境下取脾臟，將脾臟移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基礎培養(yǎng)基，用平口鑷子反復擠壓破碎后，使用無菌注射器反復抽吸吹打，制成單細胞懸液。計活細胞數后1000r/min離心10min，加入基礎培養(yǎng)基調整總細胞數到1×10⁸～2×10⁸用于細胞融合。細胞融合：將脾細胞與骨髓瘤細胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/min離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細胞無顆粒狀沉淀，重復2次。在37℃水浴中輕輕旋轉預熱離心管，取出后無菌條件下將預熱的1000μL的50％PEG3000在60s內沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉離心管，之后將預熱的25mL的基礎培養(yǎng)基在3-5min內也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HAT培養(yǎng)基。適當混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)陽性克隆株的篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細胞克隆生長面積達到1/10個細胞孔時，去培養(yǎng)上清，通過之前建立的單抗篩選方法篩選陽性雜交瘤細胞克隆。采用改進的有限稀釋法——梯度有限稀釋法連續(xù)對間接ELISA初步篩選出的陽性細胞孔進行3-4輪的亞克隆。選擇有生長狀態(tài)良好的陽性雜交瘤細胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標記細胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標注的位置吸取細胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內，然后依次倍比稀釋到后面數孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細胞培養(yǎng)上清進行抗體檢側。對檢測結果為陽性的培養(yǎng)孔中的細胞克隆重復進行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復2-3輪，檢測上清效價穩(wěn)定后取出，轉入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤細胞株的保存與傳代培養(yǎng)：保存與復蘇：保存前12小時調整細胞生長狀態(tài)。取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細胞，適當消化后制成細胞懸液，1000r/m離心5min，去上清液，輕彈管底使細胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆谩吞K前準備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細胞解凍，解凍后在1000r/m離心5min，超凈工作臺內無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/m離心5min，棄去上清，細胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細胞連續(xù)傳10代，采用間接ELISA的方法測定培養(yǎng)上清抗體效價，觀察效價的變化，觀察此陽性雜交瘤細胞株是否能穩(wěn)定分泌抗體。

(7)單抗小鼠腹水的制備：低速離心收集培養(yǎng)后的雜交瘤細胞，經過基礎培養(yǎng)基稀釋細胞數為1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后觀察小鼠腹水產生情況，待腹部明顯臌起，用針頭穿刺腹腔，離心管收集腹水。采集完畢，對小鼠腹腔注射適量基礎培養(yǎng)基，間隔2-3天，同樣方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m離心5min，吸取上清液，分裝，-20℃保存。

(8)單抗的特性鑒定：特異性：Weston-Blotting實驗參照《分子克隆》方法進行，半干法轉印，程序如下：首先以純化的CD4融合蛋白和誘導后重組菌蛋白經12％SDS-PAGE，一組用做對照，一組用做轉印。電泳完畢，將膠切割后和同樣大小的6張濾紙放入陰極緩沖液中；將NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去離子水中，1-3min后再與6張同樣大小大的濾紙一起放入陽極液中；用陰極緩沖液將電泳槽的陰極板涂抹濕潤，取出陰極緩沖液中的濾紙和凝膠依次放在陰極板，輕輕壓出氣泡。再將陽極緩沖液中NC膜和6張濾紙從陽極液中取出依次鋪在凝膠上，輕輕壓出氣泡。最后輕輕蓋上電泳槽陽極板。接通電源后，根據NC膜的面積，2mA/cm2電流大小，轉印2h；轉印結束后，膠取出后進行染色，轉移膜取出后，用PBS稀釋的5％脫脂奶粉封閉，4℃冰箱靜置過夜。封閉過夜后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。洗滌過后，加入1∶10稀釋的單抗細胞上清，在搖床上輕搖，室溫反應60min。棄去一抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。根據Dot-ELISA摸索的條件，加入1∶5000稀釋度的二抗，在搖床上輕搖，室溫反應50min。棄去二抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。將有蛋白條帶的NC膜做好標記，加入DAB顯色劑，反應適當時間后用去離子水沖洗終止反應。效價以純化的CD4融合蛋白為檢測抗原，采用間接ELISA方法測定雜交瘤細胞上清和單抗腹水的效價。單抗亞類鑒定選用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標二抗即用試劑盒測定，按照試劑盒操作說明書來操作，步驟如下：將適當稀釋的純化后CD4融合蛋白包被于酶標板，每孔100uL，置4℃冰箱過夜。將酶標板中的包被液拍干，然后用洗滌緩沖液洗一次，3min。然后將待測的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清加入孔中，每孔100μL，置37℃溫箱溫育30min。拍干后用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。將本試劑盒中的6種酶標記物分別加入孔中，每孔100μL，置于37℃溫育30min。繼續(xù)用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。加OPD底物液避光顯色15分鐘后加入終止液，用酶標儀檢測OD492值，OD492值明顯高出其它孔的類型即為HIV-1gp120單抗Ig類別。

(9)HIV-1gp120單抗經進一步精制后應用(可委托專業(yè)商家完成)。

(三)HIV-1gp41抗體的制備

同HIV-1gp120抗體的制備

(四)羊抗人-Ig的制備

將所制HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原，免疫羊制備抗體。

1、實驗動物：免疫用實驗動物選用的是浙江大學動物學院雜交白山羊，體重30斤左右的健康青壯年母羊二只，免疫前用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標記。采用隨群圈養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，每天保證羊只得到適量的運動，運動時間在傍晚，每次運動大概半小時左右，這樣利于身體健壯，避免羊只過肥，增加機體的免疫力，飲水充足，并給予適量的精料、青草、玉米、麩皮、小麥、維生素等等，使其營養(yǎng)均衡。經常查看實驗羊只健康狀況。

2、HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原：本發(fā)明制備的HIV-1gp120抗體和gp41抗體(IgG)濃度分別為2.5mg/mL(可由商家提供)，接種前混合0.1mL抗原、1.9mL無菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐劑制成免疫原乳劑備用。

3、山羊的免疫：選取兩只山羊，標記為山羊A、山羊B，接種抗原(HIV-1gp120抗體和HIV-1gp41抗體)。免疫部位為前后腹股溝，每處腹股溝分2個點注射，總共有8個注射點。注射方式為皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每個注射點注射免疫原0.5mL，約含32μg抗原。免疫前兩只山羊分別抽血10mL，標記為OdP1，-20℃保存；第一次免疫即一4、免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+弗氏完全佐劑2mL(CFA)；免疫7天后抽血10mL，分離血清，標記為7dP1，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。3～4周開始第二次免疫，二免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標記為7dP2，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。第三次免疫時間為6-8周后，三免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標記為7dP3，ELISA檢測血清效價，剩余血清-20℃保存。如果此時血清效價沒達到1∶10⁶以上，則需要再免一次；如果血清效價已達10⁶以上則不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分離血清，-20℃保存。

4、血清制備：一般每次免疫后7～10天即可于羊頸靜脈采血檢測。由助手協(xié)助保定動物，使其保持站立姿勢，頸部剪毛、無菌棉球擦拭消毒后，尋找到頸靜脈手持注射器采血，將注射器位置固定取血5-10mL。分離出血清后進行效價檢測。在第三次免疫后7～10天，經效價檢測合格后一次可取血30-50mL。在無菌條件下分離血清，待收集于平皿或三角瓶內的血液凝固之后，用無菌滴管在無菌環(huán)境(例如超凈工作臺)中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出(不能冰凍，否則產生溶血)，經離心沉淀分出血清，放進低溫冰箱保存。使用前須經過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

5、抗血清效價的測定：抗血清效價是采用ELISA測定方法：包被時是將樣品用包被液稀釋到1∶1000的濃度后，在酶標板上每孔加100μL，然后放在鋁盒中放入4℃冰箱里過夜。第二天早上拿出來拍干包被液，用PBST洗滌三次，每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干酶標板，加入10％血清的封閉液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h。然后再拿出來拍干封閉液，用PBST洗滌酶標板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀釋，用4％牛血清的PBST稀釋，放入37℃，水浴1～2h)。然后再拿出來拍干一抗液，PBST洗滌酶標板三次，每次間隔5分鐘，最后一次用紗布拍干酶標板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h。再拿出來拍干二抗液用PBST洗滌酶標板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，每孔加50μL底物顯色液，閉光顯色10-20分鐘后加入2M的H SO溶液50μL終止反應，后用酶標儀測OD值(半小時內)。

二、血液凈化器的制備

1、血液凈化細胞柱的制備

以無菌生理鹽水清洗所制CD4+T細胞，1000r/min離心，洗凈后再以1000r/min離心5min，取細胞沉淀裝入丙烯酸酯之類高分子材料制成的200ml圓柱形容器內，充填至4/5以上，將細胞柱封口備用。

2、血液凈化凝膠抗體的配備

將gp120和gp41抗體分別與羊抗gp120和gp41抗體混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗體均被完全結合，但剩有足夠高滴度的游離的gp120和gp41抗體，然后將含有結合型和游離型gp120抗體的混合抗體以及含有結合型和游離型gp41抗體的混合抗體再次以等效價混合，配成最終混合抗體，分別以梯度濃度的瓊脂糖C1-4B溶液配制5種凝膠混合抗體，使HIVgp120和gp41抗體的效價均為1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100而對應的瓊脂糖濃度依次為0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％，按抗體效價從低到高以均等體積灌注備用的血液凈化細胞柱，使凝膠從上到下形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布但CD4+T細胞占4/5以上。瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體或細胞與HIV的結合反應；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結合物。凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。

配方一：將gp120和gp41抗體與起載體作用的經100℃溶化后保溫在39～42℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的瓊脂糖C1-4B生理鹽水配成反向對應的1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100的梯度滴度的凝膠抗體，按低滴度至高滴度依次取40ml凝膠抗體加入血液凈化細胞柱內，要求在先加入的凝膠抗體冷卻至37℃成為半固體瓊脂凝膠后才接著加下一次，使血液凈化細胞柱從上到下(從進口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結合的和未結合的gp120抗體、gp41抗體以及CD4+T細胞均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方二：將gp120和gp41抗體以起載體作用的經100℃溶化后冷卻至39～42℃的1％含量的瓊脂糖C1-4B按倍比配成1∶50～1000的滴度梯度后，再灌注血液凈化細胞柱，使血液凈化細胞柱從上到下(從進口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結合的和未結合的gp120抗體、gp41抗體以及CD4+T細胞均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方三：分別標示不同的HIV感染株所制備的抗體及其對應的按倍比配成的滴度梯度的效價值，比如HIV感染株1滴度1∶100管、1∶200管……；HIV感染株2滴度1∶100管、1∶200管……，依此類推，然后將感染株1滴度1∶100管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化細胞柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將感染株1滴度1∶200管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細胞柱的凝膠上層，依此類推。在實際應用中要按組合制備，比如某地區(qū)某時期的HIV感染株有A、B、C共3株，制備的抗體有A株1∶100管、1∶200管……；B株1∶100管、1∶200管……；C株1∶100管、1∶200管……；經組合后就是ABC株1∶100管、ABC株1∶200管……ABC株1∶1000管，然后將ABC株1∶1000管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化細胞柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將ABC株1∶900管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細胞柱內已冷卻成半固體的凝膠上層，依此類推，中間可以間隔選用，比如接著選ABC株1∶500管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細胞柱內已冷卻成半固體的凝膠上層，液態(tài)瓊脂糖C1-4B的用量也可以在1ml～10ml內調整(按這樣制成的血液凈化細胞柱，從進口至出口形成從低到高的梯度抗體含量，鑒于抗原和抗體只有在合適比例時才會起免疫反應、形成沉淀線而阻止同類抗體或抗原的前行，所以不同HIV含量的血漿通過凈化劑時，HIV就在不同的層面上被吸附阻留，而且本發(fā)明的HIV感染株可以函蓋當時幾乎所有的感染株，以及吸附劑中與羊抗Ig結合的和未結合的gp120和gp41抗體都是預先固定于凝膠瓊脂中的HIV配基，HIV抗體特別是結合有羊抗HIV的HIV抗體與HIV結合所形成的免疫復合物分子量更大，完全能被阻留在凝膠瓊脂中而被清除，再加上孔徑約為85nm的凝膠瓊脂本身就能阻留直徑為100～120nm的HIV，所以從理論上推斷幾乎不會有治療無效的艾滋病患者)。

3、血液凈化器的規(guī)格與材料

血液凈化細胞柱或血液凈化器為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進出口均設有細胞篩網，進口處頂徑篩網目數為800目；出口處底徑篩網目數為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌；液體出口處設置目數為100目(相當于4微米)的細胞濾網，用以阻擋可能濾出的細胞；液體進出口與網篩之間設有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變。可通過共價、接枝、聚合等方法改進材料的結構、調節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。在凈化器內表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有較高的血液和細胞相容性。將某些具有抗凝作用的物質固化在載體或凈化器內表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實現無肝素化。如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，效果可能會更好，并可減少凈化期間的過敏反應，固化殼聚糖和肝素共價物的聚丙烯腈表面也顯示了良好的血液相容性，并可抑制銅綠假單孢菌的活性，降低細胞毒性反應。將肝素共價結合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力學性能，又能提高凈化器內表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價固化亞油酸膜，或將共價結合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。隨著高分子材料和納米技術的不斷發(fā)展，與人類血管內皮接近的材料在不久的將來將會出現。

三、血漿分離器的制備

1、制備原理：根據血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結構、調節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

3、型號與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結構、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結構等形狀；按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成分。

四、凈化器的應用構件及用途

1、關鍵構件：(1)血漿分離器：用于分離單個血細胞和血漿；(3)血液凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構件：包括血泵、肝素泵、動靜脈壓和空氣監(jiān)測、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來推動血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進行，通常血泵部分往往具有轉速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉輪與凹槽間距設定要精確，并需要經常調整，根據血路泵管的情況，一般將間距設定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準；也不可太緊，否則會造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當于臨床上應用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。(4)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設置。當監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關鍵構件和附加構件的基礎上，引入計算機調控而制成操作的人性化、治療的個性化、設計的安全性，以及模塊化、自動監(jiān)測及調控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、免疫凈化器的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括分離器、凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動脈血路管(1)接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500U或20～30U/kg。

5、啟動：將動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，將靜脈管路(5)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，動脈血液經動脈血路管(1)進入血漿分離器(4)，分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經循環(huán)管路(7)到達凈化器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經循環(huán)管路(10)流出，同步向凈化器(9)灌注血漿，在凈化器(8)內的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時凈化器(9)開始放出血漿，兩個并聯(lián)的凈化器(8)、凈化器9)交替進行，凈化后的血漿經循環(huán)管路(10)與血漿分離器(4)所分離的血細胞匯合后經靜脈管路(5)回輸。如圖2，當待分離的血液進入血漿分離器(1)的內腔(2)時，經閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進入分離器的外腔(6)，然后經血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細胞(4)經閥門(8)流出。如圖3，當含有HIV(1)的血漿進入凈化器時，其中的HIV(1)分別被固定在瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體(2)、CD4+T細胞(4)結合成抗原抗體復合物(3)、CD4+T細胞結合物(5)，被結合后的HIV不再往下移動，另外未被結合的100～120nm的HIV又被因濃度更高而孔徑更小的約為85nm的1％濃度的下層瓊脂凝膠分子篩阻留在(7)處。如此清除HIV，直至事先設定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結束，整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用方便、自動化和安全。

六、艾滋病免疫凈化器功效的驗證

1、CD4+T細胞株清除HIV功效的驗證

為了驗證CD4+T細胞株吸附清除HIV的功效，本發(fā)明設計了簡易的測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經離心(1000r/min，5min)沉淀的CD4+T細胞至200mm刻度，接著吸取經100℃溶化后保溫在39～42℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內細胞流出但不會阻止小分子的水和化學成份之類的物質通過。另取疾控中心及傳染病實驗室樣本庫保存的艾滋病患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經血沉管下層的CD4+T細胞層并從血沉管內流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結果(表1)說明，AIDS血漿濾過含CD4+T細胞的簡易凈化裝置后，部分HIV已被CD4+T細胞吸附，經第1次濾過后，HIV總清除率為22.84％，經第2次濾過后，總清除率為35.31％，經第3次濾過后，總清除率為41.9％。說明隨著濾過次數的增加，HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含CD4+T細胞的簡易凈化裝置前后p24檢測結果(pg/ml)

2、HIV-1gp120抗體、gp41抗體清除HIV功效的驗證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗：取HIV-1gp120抗體、gp41抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)，加入到經100℃溶化后保溫在50℃?zhèn)溆玫?.0％瓊脂糖C1-4B中，混合后滴度為1∶300～500，取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取1.0％瓊脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷卻后瓊脂糖成為半固體。另取疾控中心和傳染病實驗室樣本庫保存的5例艾滋病患者的標本，去細胞后的血漿各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經血沉管下層的含有抗體的1.0％瓊脂糖C1-4B并從血沉管內流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結果(表1)說明，AIDS血漿濾過簡易凈化裝置后，部分HIV已被相應抗體吸附，經第1次濾過后，HIV總清除率為20.01％，經第2次濾過后，總清除率為27.99％，經第3次濾過后，總清除率為37.36％。說明隨著濾過次數的增加HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過簡易凈化裝置前后p24檢測結果(pg/ml)

上述簡易實驗表明，血漿中游離的HIV能被本發(fā)明的凈化劑(HIVgp120抗體、HIVgp41抗體、CD4+T細胞株、瓊脂凝膠微孔)清除，表明本發(fā)明的艾滋病免疫凈化器具有顯著的清除血漿HIV的治療功效。