本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病血液凈化器的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血漿艾滋病毒的清除，從而達(dá)到治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報(bào)告，自1981年美國(guó)發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，至今全球有208個(gè)國(guó)家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時(shí)每天約有300多人死于艾滋病。在中國(guó)HIV感染者正處于高速增長(zhǎng)期，目前已遠(yuǎn)超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個(gè)人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價(jià)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因?yàn)镃D4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細(xì)胞凋亡，甚至感染HIV的T細(xì)胞表達(dá)的囊膜抗原也可啟動(dòng)正常T細(xì)胞，通過細(xì)胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細(xì)胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細(xì)胞缺損為中心的嚴(yán)重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細(xì)胞減少，T4/T8比例配置，對(duì)植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細(xì)胞因子合成減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個(gè)免疫系統(tǒng)就會(huì)遭到致命的打擊，對(duì)各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長(zhǎng)期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫(kù)，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入新的CD4+T細(xì)胞，繼續(xù)感染過程。而且細(xì)胞被HIV感染后，表達(dá)于感染細(xì)胞表面的gp120和gp41能介導(dǎo)感染與未感染細(xì)胞間的融合，例如感染HIV的CD4+T細(xì)胞表達(dá)的gp120與未感染細(xì)胞的CD4結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞融合而形成多核巨細(xì)胞。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測(cè)出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會(huì)被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個(gè)很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測(cè)，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補(bǔ)體，介導(dǎo)A1)CC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識(shí)別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細(xì)胞感染，對(duì)已感染的細(xì)胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨(dú)使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導(dǎo)致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時(shí)使用對(duì)抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進(jìn)入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細(xì)胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但對(duì)肝和心臟有副作用。(5)細(xì)胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導(dǎo)致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細(xì)胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動(dòng)免疫療法：通過下調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進(jìn)展和減少HIV的擴(kuò)散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細(xì)胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細(xì)胞時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，增加病毒感染的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，而回輸CD4+T細(xì)胞可能會(huì)增加體內(nèi)病毒復(fù)制的場(chǎng)所，導(dǎo)致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細(xì)胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)于1905年首先應(yīng)用于研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應(yīng)用于鑒定細(xì)菌菌株，1946年Oudin在試管中進(jìn)行免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向雙擴(kuò)散法，用于同時(shí)鑒定、比較兩種以上抗原或抗體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)的介質(zhì)凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)能溶于水，冷后凝成凝膠，內(nèi)部形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且孔徑很大，可允許大分子物質(zhì)(分子量可達(dá)百萬以上)自由通過?？讖降拇笮∵€決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相對(duì)較小，瓊脂濃度小，孔徑相對(duì)較大。1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴(kuò)散介質(zhì)?？乖涂贵w的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域擴(kuò)散時(shí)所受的阻力很小，基本上呈自由擴(kuò)散形式。由于不同抗原分子的分子量、結(jié)構(gòu)、形狀和電荷量不同，因此其擴(kuò)散系數(shù)不同，在凝膠中擴(kuò)散速度也就不同。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇，形成抗原抗體復(fù)合物，若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則形成最大的復(fù)合物。由于復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀，這種沉淀就形成了一個(gè)“特異性屏障”，凡在免疫學(xué)上與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質(zhì)不同的那些分子可以通過這個(gè)屏障而繼續(xù)擴(kuò)散，直到形成它們自己的復(fù)合物為止。這樣，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此種反應(yīng)稱為瓊脂凝膠擴(kuò)散，或瓊脂擴(kuò)散，或免疫擴(kuò)散，其形成的線狀或帶狀的“特異性屏障”稱為免疫沉淀線或免疫沉淀帶，簡(jiǎn)稱沉淀線或沉淀帶。是目前用已知抗體檢測(cè)未知量相應(yīng)抗原的常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，也是《中國(guó)藥典》2010版中規(guī)定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。通常將一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，待凝固后打孔，并在相應(yīng)孔中加入待檢人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待檢血清在瓊脂板中向四周擴(kuò)散，在抗原和抗體濃度比例合適處發(fā)生結(jié)合，形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)而不再擴(kuò)散。由此可見，當(dāng)一種溶液通過半固體凝膠時(shí)，其中的大分子溶質(zhì)就被分子篩作用的凝膠孔阻留在凝膠中，特別是其中的抗原能被預(yù)先固定在凝膠中的抗體結(jié)合而被吸附在凝膠中。所以，可根據(jù)瓊脂凝膠擴(kuò)散的原理，設(shè)計(jì)治療艾滋病的凈化器，即制備不同感染株的HIV抗體，將HIV抗體預(yù)先固定在凝膠中，當(dāng)患者經(jīng)體外循環(huán)分離出的血漿流經(jīng)凈化器時(shí)，血漿中的HIV被預(yù)先固定在凝膠中的相應(yīng)的抗體結(jié)合而阻留在凈化器內(nèi)的凝膠中，同時(shí)因1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，也能將100～120nm的HIV阻留在凝膠中，經(jīng)如此抗體吸附和凝膠分子篩作用，可人工體外清除HIV。

人類的吞噬細(xì)胞有大、小兩種，小吞噬細(xì)胞是外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞是血中的單核細(xì)胞和多種器官、組織中的巨噬細(xì)胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細(xì)胞總數(shù)的3％一8％，其體積較淋巴細(xì)胞略大，單核細(xì)胞在血液中僅停留12-24小時(shí)，然后進(jìn)入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，具有較強(qiáng)的吞噬功能，游走巨噬細(xì)胞大于單核細(xì)胞數(shù)倍，壽命較長(zhǎng)，可在組織中存活幾個(gè)月，定居的巨噬細(xì)胞有不同的名稱，在肝中為枯否細(xì)胞、在腦中為小膠質(zhì)細(xì)胞、在骨中為破骨細(xì)胞等，其表達(dá)Fc受體、C3b受體和CD14，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞。所以，可采用雜交瘤技術(shù)，制備雜交瘤巨噬細(xì)胞株，經(jīng)大量擴(kuò)增后用于制備治療艾滋病的凈化器，以巨噬細(xì)胞的吞噬功能來清除血漿中的HIV。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內(nèi)的艾滋病毒，且價(jià)格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病血液凈化器；另一目的是要提供艾滋病血液凈化器的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：制備能分離血細(xì)胞和血漿的分離器，制備HIVgp120和gp41抗體，再以gp120和gp41抗體為抗原制備羊抗gp120和gp41抗體，以雜交瘤技術(shù)制備既保留原巨噬細(xì)胞特性又能無限生長(zhǎng)的雜交瘤巨噬細(xì)胞株并行擴(kuò)增，以高生物相容性材料包裹雜交瘤巨噬細(xì)胞株而制備能防止細(xì)胞及其碎片濾出并能為清除HIV提供場(chǎng)所的凈化器，將gp120和gp41抗體以及羊抗gp120和gp41抗體混合，使羊抗gp120和gp41抗體被完全結(jié)合，但剩有高滴度的gp120和gp41抗體，將抗體以反向梯度滴度配入經(jīng)100℃溶化后保溫在39～42℃的梯度濃度的瓊脂糖，按抗體滴度從低至高依次取瓊脂糖加入凈化器，待冷卻至半固體凝膠后再加下一次，使凈化器中的凝膠從上到下形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂濃度的分層分布，有利于血漿灌流及分子篩和免疫清除的作用，其中與羊抗HIV抗體結(jié)合和未結(jié)合的gp120及gp41抗體、雜交瘤巨噬細(xì)胞株均被固定在瓊脂糖凝膠而起吸附HIV的作用，所制備的凈化器進(jìn)而與分離器及調(diào)控程序組合使用，體外循環(huán)中的血液被分離器分成血漿和血細(xì)胞，血漿經(jīng)凈化器濾除HIV后與血細(xì)胞匯合，然后回輸。

本發(fā)明的技術(shù)核心由血漿分離器及凈化器構(gòu)成，其中血漿分離器用于分離血細(xì)胞和血漿，凈化器中的凈化劑由固定于瓊脂凝膠的HIV抗體、與羊抗Ig結(jié)合的HIV抗體、雜交瘤巨噬細(xì)胞株制成，其中與羊抗Ig結(jié)合的HIV抗體其結(jié)合物的分子量比未結(jié)合的HIV抗體分子量大，不易通過凝膠分子篩，以及所含羊抗Ig易與瓊脂凝膠固定結(jié)合的特點(diǎn)，HIV抗體也隨之更易被固定于瓊脂凝膠，血漿中的HIV與被固定于瓊脂凝膠的HIV抗體相遇時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)而形成抗原抗體復(fù)合物，從而通過HIV抗體被固定于瓊脂凝膠，因雜交瘤巨噬細(xì)胞的天然吞噬特性，HIV與之相遇時(shí)能被吞噬而隨之被固定于瓊脂凝膠，而且瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體或細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療，所以在體外循環(huán)中，血液被分離器分離出血漿和血細(xì)胞后，血漿流經(jīng)凈化器時(shí)其中的HIV被凈化劑吸附而清除，凈化后的血漿與血細(xì)胞匯合后回輸，本發(fā)明以體外機(jī)械清除HIV的方法替代長(zhǎng)期以來無法有效殺滅HIV的常規(guī)體內(nèi)抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療方法，實(shí)現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)機(jī)械清除的治療新方法。

具體實(shí)施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病血液凈化器的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的凈化器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(8)、凈化器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細(xì)胞，5是能通過微孔(3)的血漿及化學(xué)成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口。

圖3中，1是游離的HIV，2、4分別為固定于瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體、巨噬細(xì)胞，3、5分別為HIV與HIV抗體、巨噬細(xì)胞結(jié)合后而被阻留在瓊脂凝膠(6)中的結(jié)合物，7為被瓊脂凝膠(6)分子篩阻留的較大體積的HIV。

下面結(jié)合圖1、圖2和圖3，對(duì)本發(fā)明提出的艾滋病血液凈化器的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。

一、艾滋病血液凈化劑的制備

(一)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的制備

1、原代細(xì)胞來源

(1)單個(gè)核血液細(xì)胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。具體方法是：購(gòu)買血液中心的濃縮白細(xì)胞或?yàn)榭蒲卸４娴哪殠а?，?mL標(biāo)本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個(gè)核組織細(xì)胞：由浙江大學(xué)組織工程研究平臺(tái)提供。實(shí)質(zhì)上屬于來自脾臟的巨噬細(xì)胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)：在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標(biāo)本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預(yù)冷4℃的無菌密封瓶?jī)?nèi)，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細(xì)胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺(tái)，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無菌。機(jī)械研磨脾臟組織，這時(shí)便有大量的組織細(xì)胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾懸混有組織細(xì)胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細(xì)胞混懸液(主要含紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)。③脾臟組織細(xì)胞混懸液中紅細(xì)胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時(shí)，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。④脾臟組織巨噬細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細(xì)胞原液，臺(tái)盼藍(lán)染色判定活力并計(jì)數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細(xì)胞貼壁，PBS反復(fù)吹打、消化，所得細(xì)胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細(xì)胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標(biāo)本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細(xì)胞：浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實(shí)驗(yàn)室備用。在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告后的剩余羊水、絨毛細(xì)胞，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞留用。

2、細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞貼壁初步分選

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，但根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個(gè)核血液細(xì)胞(PBMC)或單個(gè)核組織細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h，待單個(gè)核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞(巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞，但還有少量其他貼壁細(xì)胞)。1 000r/min離心5min，棄上清。羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)克隆、細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到60～80％的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細(xì)胞懸液，配成合適細(xì)胞濃度。

3、CD4細(xì)胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細(xì)胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細(xì)胞免疫磁珠分選方法：細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個(gè)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè)：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。此時(shí)分選的細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。

4、CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分選

CD14為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，理論上如果從單個(gè)核組織細(xì)胞、羊水細(xì)胞及絨毛細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞為巨噬細(xì)胞；如果從單個(gè)核血液細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；但因單核細(xì)胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠(yuǎn)不如巨噬細(xì)胞易于貼壁生長(zhǎng)，所以在本發(fā)明的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來的細(xì)胞基本為巨噬細(xì)胞。

基本方法類同于CD4細(xì)胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CD14免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國(guó))，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細(xì)胞一單核細(xì)胞結(jié)合：每1×10⁸個(gè)PBMC加入200uL偶聯(lián)CD14抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預(yù)冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1～2mL預(yù)冷緩沖液，1 000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。(B)收集磁珠標(biāo)記的單核細(xì)胞：將細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細(xì)胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細(xì)胞懸液加人細(xì)胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細(xì)胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細(xì)胞分離柱，用針柱快速推動(dòng)，沖出在分離柱中與CD14抗體一磁珠相結(jié)合的細(xì)胞，即為CD14+的巨噬細(xì)胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％C0：的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h。待單核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞。1 000r/min離心5min，棄上清。②流式細(xì)胞術(shù)法：CD14標(biāo)記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入CD14+-FITC抗體100uL，4℃避光標(biāo)記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL。流式細(xì)胞儀分選：將制備的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD FAcsAria II，美國(guó))上分選，根據(jù)CD14抗體的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的相對(duì)大小以及細(xì)胞的相對(duì)顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，收集CD14+的細(xì)胞。

5、CD14雜交瘤細(xì)胞株(雜交瘤巨噬細(xì)胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)白天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；DMSO(--甲基亞砜)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

(2)骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細(xì)胞的最高生長(zhǎng)刻度為9×10⁵/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用中考慮選擇同源細(xì)胞株，如上海復(fù)祥生物科技有限公司向ATCC細(xì)胞庫(kù)引進(jìn)的NCI-H929人骨髓瘤細(xì)胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時(shí)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。

(3)待雜交CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)準(zhǔn)備：本發(fā)明分選的單核巨噬細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細(xì)胞融合：將CD14細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的單核巨噬細(xì)胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)分裂，此時(shí)棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長(zhǎng)面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，選擇有生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長(zhǎng)的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測(cè)雜交瘤巨噬細(xì)胞(Mφ)株功能。

①雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬細(xì)菌功能檢測(cè)：將巨噬細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞數(shù)比例，以吞噬細(xì)菌功能強(qiáng)的巨噬細(xì)胞作為備選陽(yáng)性克隆株。

②雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬HIV功能檢測(cè)：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，分離細(xì)胞株，PBS清洗3次，測(cè)定經(jīng)裂解的吞噬細(xì)胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生巨噬細(xì)胞因子檢測(cè)：以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選具有較強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測(cè)功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的保存與復(fù)蘇：保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取一瓶生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細(xì)胞株治療細(xì)胞制備

即雜交瘤巨噬細(xì)胞株的擴(kuò)增培養(yǎng)。將上述細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細(xì)胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株10代，檢測(cè)巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備，保存?zhèn)溆谩?/p>

(二)HIV-1gp120抗體的制備

本發(fā)明所涉及的抗體可以委托專業(yè)商家制備，或直接從專業(yè)商家購(gòu)買，如上海瑞齊生物科技有限公司及上海領(lǐng)潮生物科技有限公司等單位都專業(yè)從事HIV-1gp120抗體、gp41抗體及羊抗人IgG等各種抗體的制備和銷售。方法包括雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體、EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)制備單克隆抗體、雜交瘤技術(shù)與EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合制備單克隆抗體和基因工程抗體，具體列舉如下。

1、采用淋巴細(xì)胞EB病毒轉(zhuǎn)化與雜交瘤技術(shù)相結(jié)合制備HIV-1gp120單克隆抗體

標(biāo)本來源有以下幾種途經(jīng)：取傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫(kù)中凍存的淋巴細(xì)胞株(經(jīng)滅活HIV免疫和EBV轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞)；購(gòu)買血站新鮮濃縮白細(xì)胞，然后進(jìn)行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細(xì)胞；取自作為科研而保存的臍帶血淋巴細(xì)胞(經(jīng)滅活HIV免疫)；直接取自HIV-1感染者自身的外周血淋巴細(xì)胞(用于自身)，采用Histopaque淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)節(jié)濃度為2x 10⁶后加入適量的EB病毒(EBV)原液，置于370C，5％CO2培養(yǎng)過夜，制備待雜交B細(xì)胞，用ELISA方法篩選抗HIV-1外膜蛋白(gp120)陽(yáng)性孔，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)2周，重復(fù)用ELISA法測(cè)定抗gp120確認(rèn)陽(yáng)性者，連續(xù)克隆二次并大量擴(kuò)增培養(yǎng)。將陽(yáng)性細(xì)胞株與人鼠異質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞(由浙江大學(xué)免疫系購(gòu)得)混合(3∶1)后，加入1ml50％PEG使二者融合，然后重懸細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)過液，第二天加入小鼠腹腔細(xì)胞(由浙江大學(xué)免疫系購(gòu)得)作為滋養(yǎng)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3周后用ELISA篩選抗gp120抗體，挑選強(qiáng)陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，并進(jìn)行多次克隆直至獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，以此細(xì)胞系培養(yǎng)、制備HIV-1抗體，采用ELISA檢測(cè)試劑盒，按說明書操作，測(cè)定抗體的Ig亞類，并以常規(guī)ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)和特異性，選出特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗體。

2、采用基因重組HIV-1gp120結(jié)合雜交瘤技術(shù)制備抗體

(1)試劑與重組抗原：涉及試劑：HIV-1gp120基因片段，HIV-1gp120抗原、HIV抗原硝酸纖維膜條由北京萬泰藥業(yè)公司提供BamH I內(nèi)切酶Xho I內(nèi)切酶、核酸共沉淀劑、T4DNALigase購(gòu)自寶生物有限公司；Liagen膠回收試劑盒購(gòu)自QIAquick公司；RPMI 1640干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；優(yōu)級(jí)新生牛血清購(gòu)自明海生物工程有限公司；SupersignalWest Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit購(gòu)自Pierce公司；小鼠Ig亞類檢測(cè)試劑盒、福氏佐劑及PEG、Hy-poxanthine、Thymidine和Aminoptem購(gòu)自Sigma公司。HIV-抗體診斷試劑盒購(gòu)自上海科華生物有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自博士德有限公司。重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定：載體質(zhì)粒PEGX-4T-2用BamH I、Xho I酶切，T4DNA Ligase連接gp120基因片段，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-blue，進(jìn)行測(cè)序。重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入XL1-Blue大腸桿菌中，在IPTG誘導(dǎo)劑作用下25℃，190r/min震蕩，過夜，4 000r/min離心10min，收集細(xì)菌，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。融合蛋白純化和鑒定：表達(dá)產(chǎn)物離心收集沉淀經(jīng)PBS懸起，用30W超聲粉碎儀裂解細(xì)菌后，將其離心收集上清過濾，濾液用AKTA PURIFYER100蛋白純化儀、GST柱純化，得到融合蛋白GST-HIV，濃縮離心管進(jìn)行濃縮，S21型生物分光光度計(jì)測(cè)量濃度，SDS-PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行鑒定。

(2)動(dòng)物免疫：BALB/c小鼠6周齡，雌性，4只，免疫前取小鼠靜脈血，分離血清留做陰性血清。將50-100μg的GST-HIV融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合、乳化后腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，每隔2周使用弗氏不完全佐劑與融合蛋白乳化后加強(qiáng)免疫小鼠，免疫劑量和途徑同前，重復(fù)免疫2-3次，最后一次加強(qiáng)免疫直接腹腔注射50-100μg的GST-HIV融合蛋白。

(3)單抗檢測(cè)方法的建立：第三次免疫后一周尾靜脈采血，用方陣法確定陽(yáng)性血清的最佳工作濃度和GST-HIV融合蛋白的最佳包被濃度。操作如下：按照1∶1000、1∶500、1∶200、1∶100四個(gè)稀釋度，使用包被緩沖液稀釋抗原，縱向包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃包被過夜，洗滌3次，每次間隔3分鐘。將陽(yáng)性血清和陰性血清分別由1∶1000開始作倍比稀釋，橫向加樣到第10孔，每孔100μL，置于濕盒中37℃溫育1h，洗滌3次，每次間隔3分鐘。酶標(biāo)抗體HRP-羊抗鼠IgG按照說明書作1∶10000稀釋，每孔100μL，37℃溫育1h，洗滌3次。加人現(xiàn)配的OPD底物液，每孔100μL，37℃避光反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間，每孔加100μL終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)其OD492值。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選方法建立。按照方陣法中實(shí)驗(yàn)條件和方法，分別以GST-HIV融合蛋白為實(shí)驗(yàn)組，誘導(dǎo)表達(dá)后重組菌(含質(zhì)粒pET-32a)蛋白為對(duì)照組，篩選陽(yáng)性克隆。操作步驟如下：在96孔酶標(biāo)板上以最適包被濃度包被抗原，100μl/孔，4℃冰箱包被過夜。取出包被板后加入洗滌液洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加待測(cè)細(xì)胞上清(1∶5稀釋)100μL，37℃溫箱孵育50min，之后洗滌3次，每次洗滌3min；每孔再加入-抗100μl，37℃溫箱孵育30min，洗滌3次，每次洗滌3min；每孔加入現(xiàn)配的OPD底物液100μL，室溫避光反應(yīng)10-15min；在每孔中加入2mol/L H2SO4終止液100μl用于終止反應(yīng)；將檢測(cè)板放在酶標(biāo)儀上測(cè)OD492值。對(duì)照組的設(shè)立：陽(yáng)性對(duì)照組為適當(dāng)稀釋的陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照組是和一抗有相同稀釋度的無關(guān)單抗的細(xì)胞上清。間接ELISA篩選結(jié)果判定。每組檢測(cè)OD492值，以P(樣品值)/N(陰性值)≥2.0者判為陽(yáng)性值。篩選陽(yáng)性克隆標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞上清與正篩選組(純化后融合蛋白包被)反應(yīng)呈陽(yáng)性，同時(shí)與負(fù)篩選組(誘導(dǎo)后的含pET-32a質(zhì)粒的菌體蛋白)反應(yīng)呈陰性的檢測(cè)孔為陽(yáng)性樣品。

(4)細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞，立即放入熱水解凍。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/min離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時(shí)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛。融合前使用適量胰酶消化后使用離心管收集，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/min離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。脾細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前，取一只Balb/c小鼠，摘取眼球取血，放血完全后拉頸處死，在75％乙醇中浸濕。取出后仰放固定于解剖板上，無菌環(huán)境下取脾臟，將脾臟移入平皿中。然后在平皿加入10mL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用平口鑷子反復(fù)擠壓破碎后，使用無菌注射器反復(fù)抽吸吹打，制成單細(xì)胞懸液。計(jì)活細(xì)胞數(shù)后1000r/min離心10min，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。細(xì)胞融合：將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/min離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)陽(yáng)性克隆株的篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)分裂，此時(shí)棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長(zhǎng)面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，通過之前建立的單抗篩選方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞克隆。采用改進(jìn)的有限稀釋法——梯度有限稀釋法連續(xù)對(duì)間接ELISA初步篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行3-4輪的亞克隆。選擇有生長(zhǎng)狀態(tài)良好的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長(zhǎng)的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢側(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測(cè)上清效價(jià)穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤細(xì)胞株的保存與傳代培養(yǎng)：保存與復(fù)蘇：保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。取一瓶生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/m離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/m離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/m離心5min，棄去上清，細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳10代，采用間接ELISA的方法測(cè)定培養(yǎng)上清抗體效價(jià)，觀察效價(jià)的變化，觀察此陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株是否能穩(wěn)定分泌抗體。

(7)單抗小鼠腹水的制備：低速離心收集培養(yǎng)后的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞數(shù)為1×10⁷/mL。小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹部明顯臌起，用針頭穿刺腹腔，離心管收集腹水。采集完畢，對(duì)小鼠腹腔注射適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，間隔2-3天，同樣方法再取腹水。收集到的腹水，10000r/m離心5min，吸取上清液，分裝，-20℃保存。

(8)單抗的特性鑒定：特異性：Weston-Blotting實(shí)驗(yàn)參照《分子克隆》方法進(jìn)行，半干法轉(zhuǎn)印，程序如下：首先以純化的CD4融合蛋白和誘導(dǎo)后重組菌蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE，一組用做對(duì)照，一組用做轉(zhuǎn)印。電泳完畢，將膠切割后和同樣大小的6張濾紙放入陰極緩沖液中；將NC膜先用乙醇浸泡3-5min，然后放入去離子水中，1-3min后再與6張同樣大小大的濾紙一起放入陽(yáng)極液中；用陰極緩沖液將電泳槽的陰極板涂抹濕潤(rùn)，取出陰極緩沖液中的濾紙和凝膠依次放在陰極板，輕輕壓出氣泡。再將陽(yáng)極緩沖液中NC膜和6張濾紙從陽(yáng)極液中取出依次鋪在凝膠上，輕輕壓出氣泡。最后輕輕蓋上電泳槽陽(yáng)極板。接通電源后，根據(jù)NC膜的面積，2mA/cm2電流大小，轉(zhuǎn)印2h；轉(zhuǎn)印結(jié)束后，膠取出后進(jìn)行染色，轉(zhuǎn)移膜取出后，用PBS稀釋的5％脫脂奶粉封閉，4℃冰箱靜置過夜。封閉過夜后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。洗滌過后，加入1∶10稀釋的單抗細(xì)胞上清，在搖床上輕搖，室溫反應(yīng)60min。棄去一抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。根據(jù)Dot-ELISA摸索的條件，加入1∶5000稀釋度的二抗，在搖床上輕搖，室溫反應(yīng)50min。棄去二抗，再用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min。將有蛋白條帶的NC膜做好標(biāo)記，加入DAB顯色劑，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后用去離子水沖洗終止反應(yīng)。效價(jià)以純化的CD4融合蛋白為檢測(cè)抗原，采用間接ELISA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞上清和單抗腹水的效價(jià)。單抗亞類鑒定選用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗即用試劑盒測(cè)定，按照試劑盒操作說明書來操作，步驟如下：將適當(dāng)稀釋的純化后CD4融合蛋白包被于酶標(biāo)板，每孔100uL，置4℃冰箱過夜。將酶標(biāo)板中的包被液拍干，然后用洗滌緩沖液洗一次，3min。然后將待測(cè)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入孔中，每孔100μL，置37℃溫箱溫育30min。拍干后用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。將本試劑盒中的6種酶標(biāo)記物分別加入孔中，每孔100μL，置于37℃溫育30min。繼續(xù)用洗滌緩沖液洗五次，3min/次。加OPD底物液避光顯色15分鐘后加入終止液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD492值，OD492值明顯高出其它孔的類型即為HIV-1gp120單抗Ig類別。

(9)HIV-1gp120單抗經(jīng)進(jìn)一步精制后應(yīng)用(可委托專業(yè)商家完成)。

(三)HIV-1gp41抗體的制備

同HIV-1gp120抗體的制備

(四)羊抗人-Ig的制備

將所制HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原，免疫羊制備抗體。

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用的是浙江大學(xué)動(dòng)物學(xué)院雜交白山羊，體重30斤左右的健康青壯年母羊二只，免疫前用染料涂沫在動(dòng)物的背部，作出明確的標(biāo)記。采用隨群圈養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，每天保證羊只得到適量的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間在傍晚，每次運(yùn)動(dòng)大概半小時(shí)左右，這樣利于身體健壯，避免羊只過肥，增加機(jī)體的免疫力，飲水充足，并給予適量的精料、青草、玉米、麩皮、小麥、維生素等等，使其營(yíng)養(yǎng)均衡。經(jīng)常查看實(shí)驗(yàn)羊只健康狀況。

2、HIV-1gp120抗體和gp41抗體為抗原：本發(fā)明制備的HIV-1gp120抗體和gp41抗體(IgG)濃度分別為2.5mg/mL(可由商家提供)，接種前混合0.1mL抗原、1.9mL無菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐劑制成免疫原乳劑備用。

3、山羊的免疫：選取兩只山羊，標(biāo)記為山羊A、山羊B，接種抗原(HIV-1gp120抗體和HIV-1gp41抗體)。免疫部位為前后腹股溝，每處腹股溝分2個(gè)點(diǎn)注射，總共有8個(gè)注射點(diǎn)。注射方式為皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每個(gè)注射點(diǎn)注射免疫原0.5mL，約含32μg抗原。免疫前兩只山羊分別抽血10mL，標(biāo)記為0dP1，-20℃保存；第一次免疫即一4、免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+弗氏完全佐劑2mL(CFA)；免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP1，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存。3～4周開始第二次免疫，二免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP2，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存。第三次免疫時(shí)間為6-8周后，三免免疫原：0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP3，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存。如果此時(shí)血清效價(jià)沒達(dá)到1∶10⁶以上，則需要再免一次；如果血清效價(jià)已達(dá)10⁶以上則不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分離血清，-20℃保存。

4、血清制備：一般每次免疫后7～10天即可于羊頸靜脈采血檢測(cè)。由助手協(xié)助保定動(dòng)物，使其保持站立姿勢(shì)，頸部剪毛、無菌棉球擦拭消毒后，尋找到頸靜脈手持注射器采血，將注射器位置固定取血5-10mL。分離出血清后進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。在第三次免疫后7～10天，經(jīng)效價(jià)檢測(cè)合格后一次可取血30-50mL。在無菌條件下分離血清，待收集于平皿或三角瓶?jī)?nèi)的血液凝固之后，用無菌滴管在無菌環(huán)境(例如超凈工作臺(tái))中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出(不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血)，經(jīng)離心沉淀分出血清，放進(jìn)低溫冰箱保存。使用前須經(jīng)過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

5、抗血清效價(jià)的測(cè)定：抗血清效價(jià)是采用ELISA測(cè)定方法：包被時(shí)是將樣品用包被液稀釋到1∶1000的濃度后，在酶標(biāo)板上每孔加100μL，然后放在鋁盒中放入4℃冰箱里過夜。第二天早上拿出來拍干包被液，用PBST洗滌三次，每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入10％血清的封閉液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h。然后再拿出來拍干封閉液，用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀釋，用4％牛血清的PBST稀釋，放入37℃，水浴1～2h)。然后再拿出來拍干一抗液，PBST洗滌酶標(biāo)板三次，每次間隔5分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h。再拿出來拍干二抗液用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，每孔加50μL底物顯色液，閉光顯色10-20分鐘后加入2M的H SO溶液50μL終止反應(yīng)，后用酶標(biāo)儀測(cè)OD值(半小時(shí)內(nèi))。

二、艾滋病血液凈化器的制備

1、血液凈化細(xì)胞柱的制備

以無菌生理鹽水清洗本發(fā)明制備的雜交瘤巨噬細(xì)胞，1000r/min離心，洗凈后再以1000r/min離心5min，取細(xì)胞沉淀裝入丙烯酸酯之類高分子材料制成的200ml圓柱形容器內(nèi)，充填至4/5，將細(xì)胞柱封口備用。

2、血液凈化凝膠抗體的配備

將gp120和gp41抗體分別與羊抗gp120和gp41抗體混合，使混合液中的羊抗gp120和gp41抗體均被完全結(jié)合，但剩有足夠高滴度的游離的gp120和gp41抗體，然后將含有結(jié)合型和游離型gp120抗體的混合抗體以及含有結(jié)合型和游離型gp41抗體的混合抗體再次以等效價(jià)混合，配成最終混合抗體，分別以梯度濃度的瓊脂糖C1-4B溶液配制5種凝膠混合抗體，使HIVgp120和gp41抗體的效價(jià)均為1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100而對(duì)應(yīng)的瓊脂糖濃度依次為0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％，按抗體效價(jià)從低到高以均等體積灌注備用的血液凈化細(xì)胞柱，使凝膠從上到下形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布。瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗體或細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物。凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。

配方一：將gp120和gp41抗體與起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～42℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的瓊脂糖C1-4B生理鹽水配成反向?qū)?yīng)的1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100的梯度滴度的凝膠抗體，按低滴度至高滴度依次取40ml凝膠抗體加入血液凈化細(xì)胞柱內(nèi)，要求在先加入的凝膠抗體冷卻至37℃成為半固體瓊脂凝膠后才接著加下一次，使血液凈化細(xì)胞柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結(jié)合的和未結(jié)合的gp120抗體、gp41抗體以及雜交瘤巨噬細(xì)胞均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方二：將gp120和gp41抗體以起載體作用的經(jīng)100℃溶化后冷卻至39～42℃的1％含量的瓊脂糖C1-4B按倍比配成1∶50～1000的滴度梯度后，再灌注血液凈化細(xì)胞柱，使血液凈化細(xì)胞柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從高到低的抗體滴度而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中與羊抗HIV(gp120和gp41)抗體結(jié)合的和未結(jié)合的gp120抗體、gp41抗體以及雜交瘤巨噬細(xì)胞均被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。

配方三：分別標(biāo)示不同的HIV感染株所制備的抗體及其對(duì)應(yīng)的按倍比配成的滴度梯度的效價(jià)值，比如HIV感染株1滴度1∶100管、1∶200管……；HIV感染株2滴度1∶100管、1∶200管……，依此類推，然后將感染株1滴度1∶100管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化細(xì)胞柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將感染株1滴度1∶200管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細(xì)胞柱的凝膠上層，依此類推。在實(shí)際應(yīng)用中要按組合制備，比如某地區(qū)某時(shí)期的HIV感染株有A、B、C共3株，制備的抗體有A株1∶100管、1∶200管……；B株1∶100管、1∶200管……；C株1∶100管、1∶200管……；經(jīng)組合后就是ABC株1∶100管、ABC株1∶200管……ABC株1∶1000管，然后將ABC株1∶1000管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻后放入血液凈化細(xì)胞柱，待放置冷卻成半固體凝膠后，再將ABC株1∶900管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細(xì)胞柱內(nèi)已冷卻成半固體的凝膠上層，依此類推，中間可以間隔選用，比如接著選ABC株1∶500管與10ml39～42℃保溫的液態(tài)瓊脂糖C1-4B混勻，混勻液放入血液凈化細(xì)胞柱內(nèi)已冷卻成半固體的凝膠上層，液態(tài)瓊脂糖C1-4B的用量也可以在1ml～10ml內(nèi)調(diào)整(按這樣制成的血液凈化細(xì)胞柱，從進(jìn)口至出口形成從低到高的梯度抗體含量，鑒于抗原和抗體只有在合適比例時(shí)才會(huì)起免疫反應(yīng)、形成沉淀線而阻止同類抗體或抗原的前行，所以不同HIV含量的血漿通過凈化劑時(shí)，HIV就在不同的層面上被吸附阻留，而且本發(fā)明的HIV感染株可以函蓋當(dāng)時(shí)幾乎所有的感染株，以及吸附劑中與羊抗Ig結(jié)合的和未結(jié)合的gp120和gp41抗體都是預(yù)先固定于凝膠瓊脂中的HIV配基，HIV抗體特別是結(jié)合有羊抗HIV的HIV抗體與HIV結(jié)合所形成的免疫復(fù)合物分子量更大，完全能被阻留在凝膠瓊脂中而被清除，再加上孔徑約為85nm的凝膠瓊脂本身就能阻留直徑為100～120nm的HIV，所以從理論上推斷幾乎不會(huì)有治療無效的艾滋病患者)。

3、血液凈化器的規(guī)格與材料

血液凈化細(xì)胞柱或血液凈化器為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變。可通過共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。在凈化器內(nèi)表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有較高的血液和細(xì)胞相容性。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或凈化器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實(shí)現(xiàn)無肝素化。如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，效果可能會(huì)更好，并可減少凈化期間的過敏反應(yīng)，固化殼聚糖和肝素共價(jià)物的聚丙烯腈表面也顯示了良好的血液相容性，并可抑制銅綠假單孢菌的活性，降低細(xì)胞毒性反應(yīng)。將肝素共價(jià)結(jié)合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力學(xué)性能，又能提高凈化器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價(jià)固化亞油酸膜，或?qū)⒐矁r(jià)結(jié)合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。隨著高分子材料和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，與人類血管內(nèi)皮接近的材料在不久的將來將會(huì)出現(xiàn)。

三、血漿分離器的制備

1、制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

3、型號(hào)與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長(zhǎng)度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

四、艾滋病血液凈化器的應(yīng)用構(gòu)件及用途

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血漿分離器：用于分離單個(gè)血細(xì)胞和血漿；(2)血液凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動(dòng)靜脈壓和空氣監(jiān)測(cè)、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、超濾監(jiān)測(cè)和漏血監(jiān)測(cè)等部分組成。

(1)血泵(Blood Pump)：用來推動(dòng)血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測(cè)功能，以監(jiān)測(cè)病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會(huì)造成血流檢測(cè)不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會(huì)造成管路破裂。

(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。

(3)動(dòng)靜脈壓監(jiān)測(cè)：動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測(cè)體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)升高；靜脈壓監(jiān)測(cè)用來監(jiān)測(cè)管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí)，靜脈壓就會(huì)下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí)，靜脈壓就會(huì)升高。

(4)空氣監(jiān)測(cè)(Air Detector)：用來監(jiān)測(cè)血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測(cè)的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測(cè)到有空氣氣泡時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險(xiǎn)的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計(jì)算機(jī)調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個(gè)性化、設(shè)計(jì)的安全性，以及模塊化、自動(dòng)監(jiān)測(cè)及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、艾滋病血液凈化器的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括分離器、凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動(dòng)脈血路管(1)接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500U或20～30U/kg。

5、啟動(dòng)：將動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，將靜脈管路(5)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)進(jìn)入血漿分離器(4)，分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達(dá)凈化器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)循環(huán)管路(10)流出，同步向凈化器(9)灌注血漿，在凈化器(8)內(nèi)的血漿將近流完時(shí)，再次開始灌注血漿，此時(shí)凈化器(9)開始放出血漿，兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(8)、凈化器9)交替進(jìn)行，凈化后的血漿經(jīng)循環(huán)管路(10)與血漿分離器(4)所分離的血細(xì)胞匯合后經(jīng)靜脈管路(5)回輸。如圖2，當(dāng)待分離的血液進(jìn)入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時(shí)，經(jīng)閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進(jìn)入分離器的外腔(6)，然后經(jīng)血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細(xì)胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3，當(dāng)含有HIV(1)的血漿進(jìn)入凈化器時(shí)，其中的HIV(1)分別被固定在瓊脂凝膠(6)中的HIV抗體(2)、巨噬細(xì)胞(4)結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物(3)、巨噬細(xì)胞吞噬體(5)，被結(jié)合后的HIV不再往下移動(dòng)，另外未被結(jié)合的100～120nm的HIV又被因濃度更高而孔徑更小的約為85nm的1％濃度的下層瓊脂凝膠分子篩阻留在(7)處。如此清除HIV，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束，整個(gè)治療過程均由電腦控制，并可隨時(shí)檢測(cè)工作狀態(tài)，使用方便、自動(dòng)化和安全。

六、艾滋病血液凈化器功效的驗(yàn)證

1、HIV-1gp120抗體、gp41抗體清除HIV功效的驗(yàn)證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡(jiǎn)易驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取HIV-1gp120抗體、gp41抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)，加入到經(jīng)100℃溶化后保溫在50℃?zhèn)溆玫?.0％瓊脂糖C1-4B中，混合后滴度為1∶300～500，取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取1.0％瓊脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷卻后瓊脂糖成為半固體。另取疾控中心和傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫(kù)保存的5例艾滋病患者的標(biāo)本，去細(xì)胞后的血漿各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的含有抗體的1.0％瓊脂糖C1-4B并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果(表1)說明，AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化裝置后，部分HIV已被相應(yīng)抗體吸附，經(jīng)第1次濾過后，HIV總清除率為20.01％，經(jīng)第2次濾過后，總清除率為27.99％，經(jīng)第3次濾過后，總清除率為37.36％。說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。表1 AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化裝置前后p24檢測(cè)結(jié)果(pg/ml)

2、雜交瘤巨噬細(xì)胞株清除HIV功效的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證雜交瘤巨噬細(xì)胞株清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易的測(cè)試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～42℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長(zhǎng)刻度，置血沉管冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫(kù)保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡(jiǎn)易凈化裝置)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細(xì)胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對(duì)檢測(cè)，按說明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測(cè)結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測(cè)靈敏度、血漿長(zhǎng)期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。說明巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株在此過程產(chǎn)生了MIF細(xì)胞因子。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化器前后MIF配對(duì)檢測(cè)的同時(shí)，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對(duì)檢測(cè)，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性，結(jié)果(表2)說明AIDS血漿濾過簡(jiǎn)易凈化裝置后，部分HIV已被巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有明顯的效果，說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后MIF檢測(cè)結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

上述簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)表明，血漿中的HIV能被血液凈化劑(HIVgp120抗體、HIVgp41抗體、雜交瘤巨噬細(xì)胞株、瓊脂凝膠微孔)吸附清除，表明本發(fā)明的艾滋病血液凈化器具有顯著的清除血漿HIV病毒的治療功效。