本發(fā)明涉及一種靶向新型脂質(zhì)體骨架材料及其制備方法，特別是涉及適合癌癥靶點，具體說是以特定受體為目標(biāo)的主動靶向的新型脂質(zhì)體骨架材料及制備方法。

背景技術(shù)：

脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜，具體來說是仿細(xì)胞膜的新型制劑技術(shù)，利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合的特點，可以將藥物送入細(xì)胞內(nèi)部。脂質(zhì)體主要由具有親水親脂兩性的磷酸分子作為骨架材料組成。當(dāng)兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的的封閉囊泡，即為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體具有肝、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的被動靶向性，然而，普通脂質(zhì)體也極易在體循環(huán)中被肝、脾巨噬細(xì)胞迅速清除。1984年，通過酰胺鍵、羧基-PEG和純化的磷脂酰乙醇胺(PE)耦合成功使磷脂質(zhì)偶聯(lián)到PEG上被全球研究人員所知。從此，通過聚乙二醇修飾解決了可以使脂質(zhì)體在血液中保留較長時間，增加了藥物的被動靶向功能。由于聚乙二醇價廉易得、可以大規(guī)模生產(chǎn)、分子量易于控制、良好的物理化學(xué)性質(zhì)，同時可以事先將其制備成聚乙二醇－磷脂衍生物，制劑工藝相對簡單等優(yōu)點，成為目前高分子修飾脂質(zhì)體的研究重點，然而這樣的修飾并沒有改變脂質(zhì)體被動被“吞噬”，即被動到達(dá)靶器官這一特點。

除了磷脂外，膽固醇是是共同構(gòu)成細(xì)胞膜和脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物質(zhì)。膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用，故可稱為脂質(zhì)體“流動性緩沖劑”，對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性具有重要作用。相對于磷脂組成的雙分子層作為脂質(zhì)體主要骨架，膽固醇穿插于磷脂雙分子層之間，位置相對分散，且相對于磷脂來說，在脂質(zhì)體組成所占比例較低。近年來，也有通過PEG修飾膽固醇來達(dá)到長循環(huán)作用，例如公開號為CN102038640A的中國發(fā)明專利申請中披露，通過膽固醇的PEG化達(dá)到延長長春堿類藥物在體內(nèi)的滯留作用。同樣，這樣的修飾并沒有改變脂質(zhì)體被動被“吞噬”，即被動到達(dá)靶器官這一特點。近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的最大區(qū)別是過度增殖。換言之，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞都屬于人體自己細(xì)胞，這給治療惡性腫瘤帶來了挑戰(zhàn)。在目前治療惡性腫瘤的方法中，常用為手術(shù)、化療、放療及近年來探索性采用的腫瘤免疫療法等，除了手術(shù)治療外，化療和放療作為常規(guī)治療方法，在殺死腫瘤的同時對機體正常細(xì)胞也具有巨大殺傷作用，這是造成癌癥死亡率極高的主要原因之一。因此，如何靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，是目前治療的難題之一。

近二十多年來的研究表明，葉酸等受體在多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，其數(shù)量和活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常細(xì)胞，具有良好的腫瘤組織特異性，即腫瘤特異性受體。例如，非轉(zhuǎn)移性癌表面表達(dá)的葉酸水平較高度未分化的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞要低得多，說明中晚期腫瘤較早期腫瘤更易結(jié)合葉酸。因此，葉酸及其受體不斷成為癌癥診斷及治療研究的新熱點。相比于通常釆用的具有較大分子量的腫瘤特異性單克隆抗體，葉酸等作為小分子物質(zhì)，具有較高的化學(xué)生物穩(wěn)定性、組織相容性強、穿透能力強、達(dá)到靶點時間短、與受體親和力高、幾乎無免疫原性、價廉易得等優(yōu)點，因此，成為了引起廣泛關(guān)注的介導(dǎo)遞藥系統(tǒng)主動靶向腫瘤的尋靶分子。

另外，由于腫瘤組織中缺乏淋巴系統(tǒng)，難以清除脂類等大分子物質(zhì)，因此對于葉酸介導(dǎo)的抗腫瘤藥物給藥系統(tǒng)通常采用脂質(zhì)體作為藥物載體，而且，脂質(zhì)體還可以通過增強滲透保留作用(EPR效應(yīng))，提高抗腫瘤藥物在腫瘤組織中的濃度和延長藥物半衰期。

因此，通過修飾新型脂質(zhì)體骨架材料，使之從被動靶向轉(zhuǎn)為主動靶向腫瘤等組織，是本發(fā)明研究的重點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要提供一種主動靶向新型脂質(zhì)體骨架材料，能夠加載特定靶向小分子的同時，保持脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，該新型脂質(zhì)體骨架材料具有如下結(jié)構(gòu)：

R₀-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂-R-R'

其中，R₀具有如下結(jié)構(gòu)：

其中，R₂、R₃、R₄、R₅為H含有取代或非取代C1-C10的直鏈或支鏈的小分子烷基取代，R₁為具有取代或非取代的酯鍵或酰胺結(jié)構(gòu)，具體為CO₂-或CO₂NH-。

其中，R₀與(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂部分通過R₁相連，R為碳鍵或酯鍵或酰胺鍵，R′的分子量為小于5000的靶向小分子化合物，n＝3-100。優(yōu)選地，n＝30-70。本發(fā)明n約等于70，進一步，優(yōu)選地，R為酰胺鍵。

發(fā)明人經(jīng)驗地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)n在3-100，R₀部分能夠很好地嵌入脂質(zhì)體的雙分子層中，使得脂質(zhì)體有很好的穩(wěn)定性，而R′部分通過中間(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂長鏈，能夠保持其作為游離分子的活性，即對靶部位的親和力。特別是30-70之間時，能夠更好得發(fā)揮R′部分的導(dǎo)向性同時又能保證磷脂雙分子層的穩(wěn)定性。

進一步，(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂平均分子量優(yōu)選為2000-3400。

進一步，R₀為膽固醇及結(jié)構(gòu)類似物。

進一步，R′包括但不限于特定靶點受體激動劑或抑制劑、特定信號通路信號因子、特定器官或組織(例如肝臟、脾臟、淋巴組織)特異性表達(dá)受體抑制劑或激動劑；進一步，優(yōu)選為腫瘤特異性受體抑制劑，例如葉酸、PD-L1、VEGFR、CD28等。本發(fā)明所述新型脂質(zhì)體骨架材料在制備成脂質(zhì)體后，由作為特定靶向的R′引導(dǎo)進入特定靶部位，即能夠?qū)⒅|(zhì)體及其載藥主動進入靶標(biāo)后再降解釋放藥物，避免了被動靶向的“吞噬”，達(dá)到預(yù)定靶向釋放藥物的作用，避免了對機體正常細(xì)胞的殺傷。

本發(fā)明還提供一種制備該新型脂質(zhì)體骨架材料的方法，發(fā)明人采用生物催化反應(yīng)，具體來說，是將靶向小分子化合物、膽固醇及其類似物的氯甲酸酯、不同分子量的雙氨基聚乙二醇經(jīng)不同生物酶促反應(yīng)生成。具體來說，是將R₀端酯或酰胺與雙氨基聚乙二醇及R端酯經(jīng)過生物催化反應(yīng)制得。所述生物酶為縮合酶或酯化酶或酰胺化酶。該反應(yīng)方法能夠一步完成，副反應(yīng)少甚至幾乎沒有。

進一步，所述反應(yīng)在恒溫條件，最好在30℃-80℃完成。

生物催化反應(yīng)過程中，選用Novozym 435、Lipozyme ^IM TL、Protease P、Protease N、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶PS1作為催化劑，其中，優(yōu)選地，所述生物酶為Novozym脂肪酶435。

本發(fā)明驚訝地發(fā)現(xiàn)，采用Novozym脂肪酶435能夠?qū)⒏咝У囟ㄏ虻貙₀端酯或酰胺與雙氨基聚乙二醇及R端酯鍵合，產(chǎn)物得率高。

進一步，本發(fā)明提供一種采用上述新型材料制備的脂質(zhì)體。

進一步，該新型脂質(zhì)體骨架材料具有如下結(jié)構(gòu)：

具體地，該新型脂質(zhì)體

骨架材料具有如下結(jié)構(gòu)：

其中，取代基R₁、R₂、R₃為H或OH或C1-C4取代基；R₄或R₅為H或OH，優(yōu)先地，R₄為H，且R₅為OH。

進一步，n＝3-100。優(yōu)選地，n＝30-70。

進一步，該新型脂質(zhì)體骨架材料具有如下結(jié)構(gòu)：

進一步，上述靶向新型脂質(zhì)體骨架材料的制備方法，是用R端酯與膽固醇氯甲酸酯、雙氨基聚乙二醇經(jīng)生物催化反應(yīng)生成新型脂質(zhì)體骨架材料。所述生物催化反應(yīng)為酶促反應(yīng)，所述生物酶為Novozym脂肪酶435。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過上述新型脂質(zhì)體骨架材料制備的脂質(zhì)體，能夠與葉酸受體相結(jié)合，定向?qū)⑺幬飩鬟f至具有較高葉酸表達(dá)，比如癌細(xì)胞中。

進一步，本發(fā)明提供一種葉酸介導(dǎo)的靶向新型脂質(zhì)體骨架材料，結(jié)構(gòu)式如下：

其中，n＝3-100。優(yōu)選地，n＝30-70。

進一步，本發(fā)明提高一種制備該葉酸介導(dǎo)的靶向新型脂質(zhì)體骨架材料的方法：用葉酸與膽固醇氯甲酸酯、雙氨基聚乙二醇經(jīng)生物催化反應(yīng)生成新型脂質(zhì)體骨架材料。其中之一反應(yīng)路線如下：

具體來說，在制備過程中，在反應(yīng)瓶中加入溶劑，反應(yīng)物葉酸、膽固醇氯甲酸酯、雙氨基聚乙二醇和酶Novozym 435分別加入反應(yīng)瓶中，混合均勻，避光，水浴恒溫(40℃)振蕩器內(nèi)振蕩(250r/min)，反應(yīng)24h，該反應(yīng)經(jīng)一步完成。

本發(fā)明上述靶向新型脂質(zhì)體骨架材料，嵌入脂質(zhì)體雙分子層，制備成為能夠特定受體的主動靶向脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體的配方如下：

進一步，該脂質(zhì)體的配方(重量比)如下：

上述靶向脂質(zhì)體，因具有在膽固醇及其類似物端嵌合入在磷脂雙分子層中，而以特定長度的PEG為橋梁，能夠“跨越”磷脂雙分子層，將靶向分子露出在磷脂雙分子層外側(cè)，從而能夠“施展”其介導(dǎo)作用。

所述藥學(xué)上可以接受的輔料優(yōu)選為DSPE-PEG及其衍生物。

進一步，該脂質(zhì)體的配方(重量比)如下：

上述g/ml是指在上述重量比中，取1份，即1g時，加入PBS(7.4)1000份，即1000ml。

進一步，本發(fā)明提供一種靶向小分子化合物介導(dǎo)的載藥脂質(zhì)體，具體來說，該脂質(zhì)體以白樺脂酸為作為活性成分，借助具有R₀-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂-R-R'結(jié)構(gòu)的靶向新型脂質(zhì)體骨架材料，制備成脂質(zhì)體后能夠使得脂質(zhì)體“靶向”前往癌細(xì)胞組織，在癌細(xì)胞組織中逐步釋放白樺脂酸從而發(fā)揮其細(xì)胞毒作用，殺傷癌細(xì)胞，清除腫瘤。

該脂質(zhì)體的配方(重量比)如下：

進一步，該脂質(zhì)體的配方(重量比)如下：

下面通過具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明。

附圖說明

附圖1：葉酸-聚乙二醇-膽固醇IR圖譜

附圖2：葉酸-聚乙二醇-膽固醇質(zhì)譜圖

附圖3：白樺脂酸脂質(zhì)體透射電鏡照片(×25000)

附圖4：白樺脂酸脂質(zhì)體的粒徑分布

附圖5：白樺脂酸脂質(zhì)體細(xì)胞毒性評價

附圖6：蟾酥提取物脂質(zhì)體透射電鏡照片

附圖7：蟾酥提取物脂質(zhì)體粒徑分布

附圖8：葉酸修飾的蟾酥提取物脂質(zhì)體Zeta電位

附圖9：蟾酥提取物脂質(zhì)體細(xì)胞毒性評價

附圖10：PA-PEG-CHOL的IR圖譜

附圖11：PA-PEG-CHOL質(zhì)譜圖

具體實施方式

下面列舉一部分具體實施例對本發(fā)明進行說明，有必要在此指出的是以下具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1葉酸受體介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體骨架材料的合成

方法：在15mL帶塞三角瓶中加入10mL二甲基亞砜、25μmol葉酸、25μmol膽固醇氯甲酸酯、25μmol雙氨基聚乙二醇和Novozym 435，混合均勻，避光，水浴恒溫(40℃)振蕩器內(nèi)振蕩(250r/min)，反應(yīng)24h，反應(yīng)混合物經(jīng)過濾除酶，分離后得到的反應(yīng)液置透析袋(MWCO 2000Da)中透析48小時，將透析袋內(nèi)液體凍干得黃色固體。

合成產(chǎn)物鑒定

紅外掃描分析：稱取純化后的產(chǎn)物1～2mg，在瑪瑙研缽中研細(xì)后加入約100～200mg溴化鉀粉末，一起研磨至2μm以下且混合均勻，轉(zhuǎn)移至模具中，按順序放好各部件后，置于壓片機中抽真空5min，然后邊抽氣邊加壓，當(dāng)達(dá)到68.6Mpa時，停止加壓，維持5min后，解壓至壓力表指針為“0”，取出模具，即得到直徑1cm、厚度約為1mm透明的晶片。以空氣為對照，在樣品架上插入產(chǎn)物樣品置于紅外光譜儀上分析，產(chǎn)物譜圖見附圖1。

質(zhì)譜(MS)分析：產(chǎn)物用適量二甲基亞砜溶解后，用質(zhì)譜分析儀(MS)分析，質(zhì)參數(shù)：ESI源(+)模式，見附圖2。

由于合成材料中PEG為聚合物，其平均分子量為3400，因此合成的葉酸PEG衍生物平均分子量約為4,175Da，在質(zhì)譜圖中，得到一系列以4,175Da為中心的正態(tài)分布分子離子峰，與合成產(chǎn)物分子量吻合，證明合成化合物為目標(biāo)化合物。

實施例2白樺脂酸脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法注入法制備白樺脂酸脂質(zhì)體。定量稱取0.1g卵磷脂、0.010g白樺脂酸、0.033g膽固醇、0.033g采用實施例1方法制備的葉酸-聚乙二醇-膽固醇溶于適量氯仿中，真空旋轉(zhuǎn)蒸去除氯仿，于前形瓶壁形成脂均勻的薄膜。真空干燥24h后再加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH＝7.4)，55℃水浴振蕩2h，45℃孵育30min，探頭超聲15min，依次擠壓通過0.45、0.22μm微孔濾膜，即得。

脂質(zhì)體形態(tài)觀察：取脂質(zhì)體混懸液適當(dāng)稀釋后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的磷鎢酸負(fù)染，于透射電鏡下觀察形態(tài)。由電鏡照片可知，白樺脂酸脂質(zhì)體外觀圓整，多為球形及類球形粒子，大小較均一，見附圖3。

粒徑及其分布考察：取脂質(zhì)體混懸液，適當(dāng)稀釋后，用激光粒徑分析儀測定粒徑。結(jié)果脂質(zhì)體平均體粒徑為(235±8)nm，多分散系數(shù)為0.182，粒徑分布見附圖4。

MTT法檢測白樺脂酸脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性：HepG2細(xì)胞用含有10％胎牛血清、50U/ml的青鏈霉素和10mmol/L HEP ES的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。作用前24h,所有細(xì)胞以1×10⁴/孔的密度種植在96孔板內(nèi),每種細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔。24h后,細(xì)胞獲得75％～85％的融合度。立即去掉原有培養(yǎng)基,用PBS洗滌1遍,更換含有常規(guī)方法制備的白樺脂酸(定量稱取0.1g磷脂、0.010g白樺脂酸、0.021g膽固醇、0.012gDSEP-PEG-2000)和采用實施例2方法葉酸受體介導(dǎo)的白樺脂酸脂質(zhì)體(CR為7.5％)溶液20l的100μL完全培養(yǎng)基。作用24h后,每孔更換200μL的完全培養(yǎng)基。孵育過夜后,MTT法檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(％)＝處理細(xì)胞D₅₇₀/陰性對照D₅₇₀×100％。見附圖5。

實施例3蟾酥提取物脂質(zhì)體

將處方量藥物、磷脂、膽固醇及葉酸-PEG-CHOL用適量氯仿溶解，減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，保持水浴溫度40℃，形成均勻白色薄膜后加入10mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液，50℃水化過夜，呈乳白色混懸液，過0.45、0.2μm微孔濾膜，即得。

脂質(zhì)體配方如下：

透射電鏡形態(tài)考察：采用磷鎢酸負(fù)染色法，觀察脂質(zhì)體微粒的微觀形態(tài)，具體操作方法如下：脂質(zhì)體混懸液適當(dāng)稀釋后，取1滴滴于噴膜的銅網(wǎng)上，靜置5分鐘，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％磷鎢酸負(fù)染色約30秒，用濾紙吸去大部分染色液，在電鏡下觀察脂質(zhì)體微粒的形態(tài)和大小，并攝相，電鏡觀察照片見附圖6。由透射電鏡照片可見脂質(zhì)體外觀圓整，多為球形及類球形粒子，大小較均一，分散性好。

粒徑及其分布考察：樣品粒徑的測定方式如下：樣品用水稀釋成適當(dāng)濃度，激光粒度測定儀測定樣品粒徑，結(jié)果葉酸修飾的脂質(zhì)體平均體粒徑為(161±15)nm，呈單峰分布，粒徑分布范圍較窄且符合正態(tài)分布，多分散系數(shù)別為0.154±0.013，見附圖7。

表面電位測定：脂質(zhì)體混懸液用水適當(dāng)稀釋，激光粒徑分析儀測定脂質(zhì)體的Zeta電位。結(jié)果葉酸修飾的脂質(zhì)體的Zeta電位值為(4.2±1.2)mV，見附圖8。

包封率測定：精密量取3批蟾酥脂質(zhì)體樣品各0.2mL，置高速離心機中，25000轉(zhuǎn)/min離心2.5小時，取上清液20μL測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算C_u。另取0.2mL置10mL量瓶中，加入適量甲醇充分振搖破乳，用流動相定容，微孔濾膜過濾后取20μL進樣測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算C_t。根據(jù)下面公式計算脂質(zhì)體的包封率。包封率計算公式：包封率＝(1-C_u/C_t)×100％，C_u為未被脂質(zhì)體包封的游離藥物(或濃度)，C_t為總的藥物濃度。結(jié)果葉酸修飾的脂質(zhì)體中BL、CBG、RBG的包封率分別為93.52±0.56％、97.94％±0.04％、96.29±0.51。

表1包封率測定

MTT法檢測脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性：HepG2細(xì)胞用含有10％胎牛血清、50U/ml的青鏈霉素和10mmol/L HEP ES的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。作用前24h,所有細(xì)胞以1×10⁴/孔的密度種植在96孔板內(nèi),每種細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔。24h后,細(xì)胞獲得75％～85％的融合度。立即去掉原有培養(yǎng)基,用PBS洗滌1遍,更換含有采用實施例3方法制備的葉酸受體介導(dǎo)的蟾酥脂質(zhì)體(CR為7.5％)溶液20l的100μL完全培養(yǎng)基。作用24h后,每孔更換200μL的完全培養(yǎng)基。孵育過夜后,MTT法檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(％)＝處理細(xì)胞D₅₇₀/陰性對照D₅₇₀×100％。

實施例4鈣黃綠素脂質(zhì)體

制備方法:分別精密稱取0.06g卵磷脂、0.015膽固醇、0.01g實施例1制備的靶向脂質(zhì)體骨架材料、0.01gDSPE-PEG于小燒杯中。加入約適量無水乙醇(預(yù)熱至55℃)溶解。取約5mL 0.454mol/L硫酸銨溶液于小燒杯中，將燒杯置于恒溫攪拌器中，溫度調(diào)節(jié)為55℃，用1mL注射器，將上述小燒杯中的混合溶液緩慢注入到硫酸銨溶液中。待注入完畢后，繼續(xù)恒溫攪拌約半小時，揮走乙醇。待乙醇揮發(fā)后，將其放入再生纖維素透析袋(分子截留量1000)中，在500mLPBS緩沖溶液(pH＝7.4)中透析24h，期間更換3次透析液?？傻猛庥^均勻的乳白色脂質(zhì)體混懸液。

取出透析袋中的脂質(zhì)體于小燒杯中，加入0.5mL 1mg/mL的鈣黃綠素溶液，在磁力攪拌器中45℃恒溫孵育30分鐘，用PBS緩沖溶液(pH＝7.4)定容至10mL，混勻。依次用0.45μm，0.22μm的微孔濾膜過濾整粒，置西林瓶中密封避光，放冰箱(4℃)備用，即得葉酸修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體。同法制備鈣黃綠素脂質(zhì)體(處方中不含靶向新型脂質(zhì)體骨架材料)

人口腔表皮癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)攝取率的定量分析:

利用鈣黃綠素具有綠色熒光的特性，將其作為熒光標(biāo)記物包裹至脂質(zhì)體內(nèi)來考查葉酸受體過度表達(dá)人口腔表皮癌細(xì)胞(KB)細(xì)胞攝取非靶向和葉酸靶向脂質(zhì)體的差異性，從而驗證所制備的靶向新型脂質(zhì)體骨架材料的葉酸受體靶向攝取性能。

(1)KB細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，棄原細(xì)胞培養(yǎng)液，加2mLPBS洗滌1次，再加1.5ml胰蛋白酶進行消化，消化完成后加5mL無葉酸的RPMI-1640培養(yǎng)液進行吹打，至細(xì)胞從培養(yǎng)瓶瓶壁脫落，收集細(xì)胞至離心管中；

(2)1000X g離心5min，棄上清，加PBS 2mL洗漆1次，除去殘留的胰蛋白酵。再加4.5mL無葉酸的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為Ix10⁶個/ml,分裝置4支1.5mL Eppendorf管中，每管加0.69mL無葉酸的RPMI-1640培養(yǎng)液；

(3)每管分別加入PBS(空白對照組)、15μM鈣黃綠素脂質(zhì)體(非靶向組)、15μM葉酸修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體(葉酸受體靶向組)、15μM葉酸修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體+1mM·L^-1葉酸(葉酸阻斷組)，使其終體積為ImL，每組設(shè)3個復(fù)孔，再在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)Ih；

(4)培養(yǎng)結(jié)束后，1000X g離心5mim棄上清，加1mL預(yù)冷的PBS洗漆3次以除去未被細(xì)胞攝取的藥物，每管加0.3mLPBS重懸細(xì)胞；

(5)重懸后的KB細(xì)胞用激發(fā)波長為488nm的激發(fā)光進行流式細(xì)胞術(shù)定量分析來確定細(xì)胞攝取葉酸靶向脂質(zhì)體的效率。

結(jié)果具體熒光強度數(shù)值分別如下：PBS空白對照組的熒光強度為2.35；鈣黃綠素脂質(zhì)體(非靶向組)的熒光強度為18.92；葉酸修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體(靶向組)的熒光強度為614.48；FR阻斷組的熒光強度為35.24。結(jié)果顯示，葉酸修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體組的熒光強度比鈣黃綠素脂質(zhì)體提高了32倍，含靶向新型脂質(zhì)體骨架材料的葉酸靶向脂質(zhì)體能更多的被葉酸受體高表達(dá)的KB細(xì)胞所攝取，而未鏈接葉酸靶向材料的非靶向脂質(zhì)體幾乎無攝取，而且，攝取的效率幾乎完全能夠被1mM游離葉酸所阻斷。因此，葉酸受體靶向脂質(zhì)體和KB腫瘤細(xì)胞的結(jié)合是通過葉酸受體介導(dǎo)的通路來實現(xiàn)的。

實施例5pazopanib(PA)介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體

PA-PEG-CHOL的合成：在15mL帶塞三角瓶中加入10mL二甲基亞砜、25μmol pazopanib、25μmol雙羧基聚乙二醇、25μmol膽固醇和Novozym 435，混合均勻，避光，水浴恒溫(40℃)振蕩器內(nèi)振蕩(250r/min)，反應(yīng)24h，反應(yīng)混合物經(jīng)過濾除酶，分離后得到的反應(yīng)液置透析袋(MWCO 2000Da)中透析48小時，將透析袋內(nèi)液體凍干得白色固體。

用pazopanib與雙羧基聚乙二醇、膽固醇反應(yīng)，反應(yīng)路線如下：

合成產(chǎn)物鑒定

紅外掃描分析：稱取純化后的產(chǎn)物1～2mg，在瑪瑙研缽中研細(xì)后加入約100～200mg溴化鉀粉末，一起研磨至2μm以下且混合均勻，轉(zhuǎn)移至模具中，按順序放好各部件后，置于壓片機中抽真空5min，然后邊抽氣邊加壓，當(dāng)達(dá)到68.6Mpa時，停止加壓，維持5min后，解壓至壓力表指針為“0”，取出模具，即得到直徑1cm、厚度約為1mm透明的晶片。以空氣為對照，在樣品架上插入產(chǎn)物樣品置于紅外光譜儀上分析，產(chǎn)物譜圖見附圖10。

表2PA-PEG-CHOL的紅外特征吸收峰

質(zhì)譜(MS)分析：產(chǎn)物用適量二甲基亞砜溶解后，用質(zhì)譜分析儀(MS)分析，質(zhì)參數(shù)：ESI源(+)模式，見附圖11。

由于合成材料中PEG為聚合物，雙羧基聚乙二醇的平均分子量為2000，因此合成的葉酸PEG衍生物平均分子量約為2,700Da，在質(zhì)譜圖中，得到一系列以2,700Da為中心的正態(tài)分布分子離子峰，與合成產(chǎn)物分子量吻合，證明合成化合物為目標(biāo)化合物。

實施例6不同來源的酶促反應(yīng)考察

計算方法:

(1)初速度V₀值

根據(jù)反應(yīng)初始階段單位時間內(nèi)底物的減少量來計算初始反應(yīng)速度：

反應(yīng)初速度V₀＝(C₀－C_t)/t

其中：C₀、C_t分別表示反應(yīng)前后葉酸的濃度(mmol/L)，t為反應(yīng)時間(h)。

(2)底物轉(zhuǎn)化率

根據(jù)底物的減少量與反應(yīng)前底物的量的比值來計算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率C(％)＝(C₀－C_t)/C₀×100％

其中：C₀、C_t分別表示反應(yīng)前后葉酸的濃度(mmol/L)。

實驗方法：在15mL帶塞三角瓶中加入10mL二甲基亞砜、25μmol葉酸、25μmol膽固醇氯甲酸酯、25μmol雙氨基聚乙二醇和不同來源的水解酶(Novozym 435、Lipozyme^IM TL、Protease P、Protease N、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶PS1)，混合均勻，避光，水浴恒溫(40℃)振蕩器內(nèi)振蕩(250r/min)，反應(yīng)24h，取樣1mL，離心(10,000r/min)10min后，取上清液20μL，供高效液相色譜分析。結(jié)果見下表。

表3不同來源的酶促反應(yīng)

由上表可知，在所考察的酶中，均能催化葉酸、膽固醇氯甲酸酯、雙氨基聚乙二醇反應(yīng)，Novozym 435底物轉(zhuǎn)化率最高，反應(yīng)初速度V₀最大。