本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03的應用。

背景技術：

水霉病是咸淡水養(yǎng)殖生產中一種常見的真菌寄生性疾病，它具有流行范圍廣、時間跨度大、無寄主選擇性、難治愈等特點，因此水霉病的爆發(fā)常常導致魚類大量死亡，從而給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失。水霉屬(Saprolegnia spp.)真菌是引起水霉病的重要致病菌，因此，只有從源頭上抑殺水體中的水霉菌，才能達到防治目的。

孔雀石綠曾經被廣泛用于水產養(yǎng)殖中水霉病的防治，但是孔雀石綠不易降解，在水產動物體內存在高殘留現(xiàn)象，而且對哺乳動物和人類存在致畸、致癌、致突變的風險，故從上世紀90年代起就陸續(xù)被各國禁用于漁業(yè)生產中。盡管甲醛、高錳酸鉀、二氧化氯和過氧化氫等化學藥物對水霉病也具有一定防治效果，但是這些化學藥物的使用也存在殘留風險和污染環(huán)境等問題。因此，尋找一種安全、高效、環(huán)保的選擇性抑殺水霉菌的技術變得愈發(fā)重要。

微生物防治，是利用微生物之間的相互作用關系來抑殺病原菌，從而保護宿主免受病原菌的侵染，具有安全、高效和環(huán)保的優(yōu)點，日本比嘉照夫教授的EM技術就是一個良好的實例。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種假單胞菌IAS03的應用。其胞內存在抗水霉菌的活性物質，為進一步開發(fā)成微生態(tài)制劑奠定基礎。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03在預防水霉菌感染中的應用。

所述的假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03在制備抑制水霉菌的產品中的應用。

所述的假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03是通過對池塘底泥中的菌株進行分離純化后獲得的。其保藏信息：保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年11月27日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學，保藏編號：CCTCC NO:M 2015711。已經在專利“申請?zhí)枺?01510856000.6、名稱：一種假單胞菌菌株及其應用”中公開。

所述的假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03，通過如下方法分離得到：

將采集的池塘底泥用無菌水溶解后，取上清稀釋液在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進行劃線分離，重復2～3次，直到分離到形態(tài)、大小均一的菌落，然后將該菌落在KB固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并在波長為366nm的紫外燈下曝光，肉眼觀察菌落的形態(tài)。

經過華大基因公司對該菌落16S rDNA基因的測序及EzTaxon數(shù)據(jù)庫的比對，本發(fā)明所分離得到的假單胞菌IAS03的分類地位屬于：假單胞菌屬protegens菌(Pseudomonas protegens)。

所述的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏3.0g/L、氯化鈉5.0g/L、瓊脂粉15.0～20.0g/L，pH 7.0～7.2，121℃、20min高溫滅菌處理；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉即可。

該菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板上，菌落圓形，向上隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，呈淡黃色，大小均一，而且在KB固體培養(yǎng)基上，在波長為366nm的紫外燈下，發(fā)出藍色的熒光。

所述的假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03可以有效的抑制水霉菌的生長，從而保護魚類免受水霉菌的侵染。

假單胞菌菌株IAS03，是從池塘底泥中分離純化的一株細菌，它對水霉菌具有高效的抑殺作用，而且它來自水體環(huán)境，用于水體環(huán)境將不存在生態(tài)安全問題，因此，選用假單胞菌IAS03來防治由水霉屬真菌所引起的水霉病將是一種綠色、高效并且可行的方式。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明中假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03的無菌細胞破碎上清在平板上能顯著抑制水霉菌絲的生長，其對菌絲的最小有效抑制濃度為6.25mg/mL，而對孢子萌發(fā)的最小有效抑制濃度為3.125mg/L。通過菌株的毒性實驗，發(fā)現(xiàn)假單胞菌IAS03對草魚是安全的。

(2)假單胞菌IAS03從池塘底泥篩選得到，不會對周圍環(huán)境與生態(tài)平衡造成危害，符合生物安全法規(guī)。

(3)假單胞菌IAS03能夠抑殺水產病原菌：水霉菌。

(4)假單胞菌IAS03僅須單一菌株即可應用于防治水霉病，相對于傳統(tǒng)的抗生素和消毒劑防治措施，具有安全、高效、環(huán)保的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是假單胞菌IAS03的熒光現(xiàn)象；其中，圖A為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；圖B為KB固體培養(yǎng)基。

圖2是假單胞菌IAS03的分子生物學鑒定；其中，圖A為16S rDNA的電泳圖；圖B為16S rDNA基因的系統(tǒng)進化樹。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1假單胞菌菌株IAS03的分離。

試驗材料：池塘底泥。

培養(yǎng)基的配制：

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂粉15.0～20.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，121℃高溫滅菌處理20min(牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基不加入瓊脂粉)。

KB固體培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，甘油10.0mL，K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄.7H₂O1.5g，瓊脂粉15.0g～20.0g，去離子水1000mL，pH 7.2，121℃高溫滅菌20min。

試驗方法：

(1)稱取池塘的底泥10g于三角燒瓶中，加90mL滅菌水，28℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)30min后，靜置5min后取上清，采用梯度稀釋法將上清稀釋至10³倍，取0.15mL稀釋液于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板均勻涂布，28℃恒溫培養(yǎng)16h。

(2)挑取步驟(1)中平板上的單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8h，直到OD₆₀₀值達到0.8時，用移液槍吸取10μL的菌液，通過梯度稀釋至10⁴倍，取0.1mL于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板均勻涂布，28℃恒溫培養(yǎng)16h，觀察菌落是否單一，重復2～3次。

(3)將單一的菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8h后，菌液作為活化種子液。

(4)用接種環(huán)取步驟(3)的種子液通過劃線的方式接種于KB固體培養(yǎng)基上，28℃，恒溫培養(yǎng)24h后，肉眼觀察菌落形態(tài)，同時在波長為366nm紫外燈下觀察熒光現(xiàn)象，結果見圖1。由圖1A可見，該菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板上，菌落圓形，向上隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，呈淡黃色，大小均一，但在KB固體培養(yǎng)基上，在波長為366nm的紫外燈下，發(fā)出藍色的熒光(圖1B)。

實施例2假單胞菌菌株IAS03的16S rDNA種屬鑒定

試驗材料：細菌通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由廣州華大基因公司合成。

試驗方法：

(1)16S rDNA的擴增。假單胞菌IAS03菌株的種子液的準備同實施例1。取該菌株的種子液進行菌落PCR，其引物為通用引物(濃度10μM)：27F和1492R；反應體系為25μL，包括ddH₂O 15.00μL，KOD-Plus buffer 2.5μL，dNTP mix(200mmol/L)2.5μL，引物27F為1.0μL，引物1492R為1.0μL，菌液1.0μL，KOD-Plus酶0.5μL，MgSO₄(25mmol/L)1.5μL。反應過程如下：預變性：95℃，5min；變性：94℃，1min；退火：54℃，1min；延伸：72℃，90s；再延伸：72℃，10min。PCR產物進行1.2％的瓊脂糖核酸電泳(100v、30min)，16S rDNA片段大約為1500bp，見圖2A，選擇條帶單一且明亮的產物送華大基因測序。

(2)系統(tǒng)進化樹的建立。將16S rDNA的基因序列導入EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行在線序列比對，并用Cluxtalx 1.83軟件進行多序列匹配排列，分析結果采用Mega 5.0軟件中的鄰位相連法(Neighbor-joining method)作出系統(tǒng)進化樹，并自舉分析(Bootstrap)進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集1000次。初步確定拮抗菌株可能的屬和種。結果見圖2B。

由圖2A可見，假單胞菌ISA03的16S rDNA基因全長約1500bp，而測序結果得到長度為1408bp的序列，在EzTaxon專業(yè)數(shù)據(jù)庫中比對結果顯示，與假單胞菌Pseudomonas protegens 16S rDNA基因序列的相似度為99％，比對序列長度占16S rDNA基因序列全長的96.51％，由此初步鑒定菌株ISA03為Pseudomonas protegens。命名為假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03。

所述的假單胞菌(Pseudomonas protegens)IAS03菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示(1408bp)。

實施例3菌株的毒性實驗

實驗材料：草魚105尾(體重30.0±5.5g，體長12±2.5cm)，0.9％的無菌生理鹽水。

培養(yǎng)基的配制：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制同實施例1。

注射菌液的制備：

取假單胞菌IAS03菌株，用接種環(huán)在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進行劃線活化，28℃恒溫培養(yǎng)16h后，用接種環(huán)挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃、160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h后，然后進行7500r/min、15min的4℃離心，并用0.9％的無菌生理鹽水離心洗滌三次，再用0.9％的無菌生理鹽水重懸，最后通過紫外分光光度計測定OD₆₀₀值，用生理鹽水將菌液的濃度分別調至10⁶，10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰，10¹¹cfu/mL。

試驗方法：

取體重相當且健康的草魚35尾，隨機分成7組，每組5尾，分別標記為10⁶組，10⁷組，10⁸組，10⁹組，10¹⁰組，10¹¹組和對照組，每一組三個平行，分別飼養(yǎng)于10L的圓桶中(使用前經高錳酸鉀處理)，10⁶組，10⁷組，10⁸組，10⁹組，10¹⁰組，10¹¹組分別通過腹腔注射200μL菌液，濃度分別為10⁶cfu/mL，10⁷cfu/mL，10⁸cfu/mL，10⁹cfu/mL，10¹⁰cfu/mL和10¹¹cfu/mL菌液，對照組注射等量0.9％的無菌生理鹽水，連續(xù)喂養(yǎng)7天，每天全換水和投喂顆粒飼料。每天記錄和統(tǒng)計實驗組和對照組中魚的總存活數(shù)，連續(xù)記錄七天，最后統(tǒng)計魚的死亡數(shù)，結果如表1。

表1假單胞菌IAS03菌株的毒性實驗

由表1，通過SPSS軟件的數(shù)據(jù)分析，假單胞菌IAS03菌株對草魚的半致死濃度為(LC₅₀)為7.34×10⁹cfu/mL，因此可認為該菌株對草魚是安全的。

實施例4拮抗菌株對水霉菌絲的抑制效果

試驗材料：水霉菌(Saprolegnia sp.)來自本實驗室的保種。所述的水霉菌(Saprolegnia sp.)在文獻“水霉拮抗菌的篩選及其拮抗活性物質穩(wěn)定性初步研究[J].微生物學通報,2015,42(6):1067-1074.”中公開。

培養(yǎng)基的配制：

土豆葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)：去皮土豆200.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂15.0～20.0g、水1000mL，pH自然。沸水煮沸20min，然后用四層紗布過濾，除去殘渣，過濾液加入葡萄糖和瓊脂粉，121℃高溫滅菌處理20min。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配制同實施例1。

試驗方法：

(1)無菌細胞破碎上清的制備。取該菌株的種子液按照2％的比例接種于裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL的三角燒瓶，28℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48h后，將發(fā)酵液于4℃，7500rpm離心15min，收集菌體，用無菌水反復洗滌兩次，離心，再用PBS懸浮，進行超聲波破碎(超3s，停5s)，所得的胞漿液于4℃，12000rpm離心30min，收集上清液，并用0.45μm孔徑的無菌濾膜過濾即得無菌細胞破碎上清(CFDS)。

(2)無菌細胞破碎上清對水霉菌絲的抑制作用。將濃度為50mg/mL的無菌菌體破碎上清稀釋成1.5625～50mg/mL的濃度梯度，然后采用瓊脂孔擴散法，測定其抗水霉菌絲生長活性，即利用無菌打孔器在PDA平板中央打孔(直徑8mm)，在孔的四周約3cm處分別接種四塊水霉塊(直徑8mm)，25℃恒溫培養(yǎng)24h后，在孔中分別加入200μL不同濃度的無菌細胞破碎上清，然后25℃繼續(xù)培養(yǎng)48h。對照組中加入無菌PBS緩沖液，待對照組水霉長滿平板，測量實驗組中的抑菌圈的直徑大小。每一組三個平行。結果表明濃度≥6.25mg/mL的無菌細胞破碎上清就可以抑制水霉菌絲的生長。

實施例5拮抗菌株對水霉孢子萌發(fā)的抑制效果

試驗材料：

水霉孢子懸液的制備：取新鮮的水霉板用無菌打孔器打孔，然后用鑷子夾取10～12塊水霉塊加入裝有150mL無菌水的三角燒瓶中，25℃恒溫培養(yǎng)2d后，用8層無菌紗布過濾，除去菌絲，最后通過稀釋涂布法對水霉孢子進行計數(shù)，用無菌水調至5×10³cfu/mL，4℃冰箱保存。

培養(yǎng)基的配制：

PDA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配制方法同實施例4。

試驗方法：

(1)無菌細胞破碎上清的制備同實施例4。

(2)無菌細胞破碎上清對水霉孢子萌發(fā)的抑制作用。將濃度為50mg/mL無菌細胞破碎上清稀釋為1.5625～50mg/mL的濃度梯度。將200μL濃度分別為1.5625～50mg/mL的無菌細胞破碎上清加入到EP管中，每一個濃度的EP管分別加入10μL的孢子懸浮液(約50個孢子)，25℃恒溫培養(yǎng)16h后，采用平板稀釋涂布法，統(tǒng)計孢子的萌發(fā)數(shù)量，并計算出孢子萌發(fā)率。每一組六個平行。結果表明濃度≥3.125mg/mL的無菌細胞破碎上清就可以抑制水霉孢子的萌發(fā)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它任何在未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。