本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及富含虎杖苷的桑葚提取物在制備預(yù)防和治療大氣污染物pm2.5所致肺部損傷藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

研究表明大氣中的pm2.5污染物會造成人體肺部的功能性損傷^1,2，而附著在pm2.5上的化學(xué)物質(zhì)包括了大量的硫酸鹽，銨鹽，硝酸鹽，芳香烴類物質(zhì)以及鋁，鉛，鐵，鉻等重金屬污染物³.人體可接受的大氣中pm2.5的含量為35μg/m^3,4,然而在京津冀地區(qū)2013年的平均pm2.5含量為106μg/m³.⁵事實上，pm2.5已經(jīng)成為中國大陸居民健康殺手之一⁶.pm2.5主要影響機體的呼吸系統(tǒng)，并引起相關(guān)的炎癥反應(yīng)和降低肺功能，而造成相關(guān)損傷的原理與其氧化勢能有著密切的關(guān)系⁷，因此，尋找能夠顯著降低pm2.5氧化勢能并保護肺部功能的藥物可以大大降低大氣中pm2.5對于機體的損傷。

中國政府在2013年頒布了一項控制大氣污染的國際行動計劃并要求盡快降低大氣中的pm2.5顆粒¹⁰。另一方面，保護個體不受pm2.5的損傷已經(jīng)成為一個緊急的公眾問題。目前的研究首次發(fā)現(xiàn)了富含虎杖苷的桑葚提取物能夠保護人體免受pm2.5的傷害。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種富含虎杖苷的桑葚提取物在制備預(yù)防和治療pm2.5所致肺損傷藥物中的應(yīng)用。

為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面是提供一種富含虎杖苷的桑葚提取物在制備預(yù)防和治療pm2.5所致肺損傷藥物中的應(yīng)用，所述的富含虎杖苷的桑葚提取物，其制備方法包括以下步驟：

(1)將桑葚藥材用提取溶劑甲醇、乙醇或丙酮進行提取，提取液減壓回收溶劑，得浸膏；將浸膏在水中進行分散，并調(diào)整到合適的密度，以石油醚進行脫脂處理，水部分減壓濃縮后得總提取物；

(2)將總提取物經(jīng)水分散后，用大孔吸附樹脂進行分離，流動相為體積濃度為0-95％乙醇梯度溶液，梯度洗脫后，將洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥后得到富含虎杖苷的桑葚提取物。

其中步驟(1)中提取溶劑甲醇、乙醇或丙酮的濃度為30％至95％，其用量為藥材重量的6至12倍；步驟(1)中的提取過程可重復(fù)1、2、3次，每次提取時間為1至3小時；步驟(1)中將浸膏密度調(diào)整為1.15至1.19；步驟(1)中石油醚的用量為1至6倍量，次數(shù)為1至6次；步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂為弱極性或中性大孔樹脂，其型號選自diaionhp-10、diaionhp-20、diaionhp-30、diaionhp-40、diaionhp-50、dm301、nka-9、ab-8、d101、dm130、lsa-10、lsa-20、dm-18和d312；其中步驟(2)中進行梯度洗脫時，每個梯度的洗脫體積為2至4個柱體積；步驟(2)中進行梯度洗脫時，使用體積濃度0-10％乙醇溶劑2-4個柱體積除雜，再用20-90％乙醇溶劑洗脫2-4柱體積，收集洗脫部位減壓回收溶劑并干燥，得富含虎杖苷的桑葚提取物；所述的產(chǎn)品包括藥物、保健品、復(fù)方。

進一步的優(yōu)選的制備方法如下：

步驟一：將桑葚粉碎，使用6-12倍量(體積(ml):質(zhì)量(g))的體積濃度為30-95％的甲醇、乙醇或丙酮加熱回流提取1、2、3次，每次提取時間為1、2、3小時。

步驟二：合并提取液后減壓回收溶劑，使用蒸餾水將所得浸膏密度調(diào)至1.15-1.19，并用體積比為1-6倍量的石油醚萃取，萃取次數(shù)為1-6次，經(jīng)石油醚萃取后的水溶液減壓濃縮并干燥，得桑葚總提取物。

步驟三：將桑葚總提取物經(jīng)水分散后進行弱極性或中性大孔樹脂大孔樹脂分離，型號為diaionhp-10、diaionhp-20、diaionhp-30、diaionhp-40、diaionhp-50、dm301、nka-9、ab-8、d101、dm130、lsa-10、lsa-20、dm-18和d312。以體積濃度為0-95％乙醇梯度系統(tǒng)溶劑進行洗脫，每個梯度的洗脫體積為2-4個柱體積，洗脫部位減壓回收溶劑并干燥，即得富含虎杖苷的桑葚提取物。洗脫溶劑優(yōu)選20％-90％乙醇溶劑，進一步的優(yōu)選30-90％乙醇溶劑、50-90％乙醇溶劑。

有益技術(shù)效果：

1、本發(fā)明的富含虎杖苷的桑葚提取物具有明顯的預(yù)防和治療大氣污染物pm2.5所致肺部損傷的作用，其一，能夠顯著改善pm2.5所致后呼吸功能損傷；其二，能夠顯著改善pm2.5所致肺組織病理學(xué)改變。

2、通過大孔吸附樹脂對桑葚提取物進行富集，除去了大量的糖類成分以及其它一些雜質(zhì)成分，大大降低了使用的劑量，制備所得的活性部位僅為藥材量的0.5％-1％，有利于進一步開發(fā)制備成各種劑型的中成藥。

3、本發(fā)明所提供的桑葚提取物具有制備工藝簡單、易操作、生產(chǎn)成本低、安全可靠等優(yōu)點，整個過程符合綠色環(huán)保的要求。

附圖說明

圖1.桑葚提取物液相色譜圖1

圖2.桑葚提取物液相色譜圖2

具體實施方式

下面的實施例及藥理活性實驗用于進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。

實施例1：富含虎杖苷的桑葚提取物的制備方法1

采用干燥的桑葚作為原生藥，粉碎后以95％乙醇回流提取2次，每次用量為原生藥重量的7倍，提取時間為每次3小時，將提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得浸膏，調(diào)節(jié)浸膏密度為1.18，以體積比為1:1.5的石油醚進行萃取脫脂，共萃取3次。脫脂后的水部分減壓濃縮后進行hp-40大孔吸附樹脂分離，采用純水，5％乙醇，50％乙醇，95％乙醇四個梯度進行洗脫，將50％乙醇的洗脫液減壓濃縮，經(jīng)冷凍干燥后得到富含虎杖苷的桑葚提取物，見圖1。

實施例2：富含虎杖苷的桑葚提取物的制備方法2

采用干燥的桑葚作為原生藥，粉碎后以70％甲醇回流提取2次，每次用量為原生藥重量的8倍，提取時間為每次2小時，將提取液合并后過濾，濾液減壓濃縮回收甲醇，得浸膏，調(diào)節(jié)浸膏密度為1.17，以體積比為1:1的石油醚進行萃取脫脂，共萃取4次。脫脂后的水部分減壓濃縮后進行d101大孔吸附樹脂分離，采用純水，5％乙醇，50％乙醇，95％乙醇四個梯度進行洗脫，50％乙醇的洗脫液減壓濃縮，經(jīng)冷凍干燥后得到富含虎杖苷的桑葚提取物，見圖2。

藥理實驗

實驗例1、sd大鼠染毒后呼吸功能改善實驗

1.1方法：采用hope-med8052粉塵類口鼻動式染毒設(shè)備模擬大氣污染環(huán)境，構(gòu)建細顆粒物慢性染毒大鼠模型。具體制備過程如下：spf級sd大鼠(180～200g)，口鼻部暴露于染毒艙內(nèi)，染毒倉設(shè)有一個進氣系統(tǒng)和排氣系統(tǒng)。將適量細顆粒物放入設(shè)備藥粉盒中，通過進氣系統(tǒng)霧化至整個染毒艙，通過采樣系統(tǒng)計算細顆粒物濃度及染毒劑量，并測定染毒狀態(tài)下可吸入顆粒物的粒徑分布。染毒同時進行藥物干預(yù)，每天給藥1次，桑葚提取物(實施例1)給藥劑量為100mg/kg，給予連續(xù)染毒與給藥至4周、8周。染毒期結(jié)束前一日禁食，戊巴比妥鈉(40mg/kg,i.p.)麻醉，放血處死動物，收集大鼠血液、肺泡灌洗液和肺組織。檢測指標包括臨床一般癥狀觀察、清醒大鼠肺功能的測定(采用emka動物肺功能監(jiān)測系統(tǒng))、血液生化指標測定、呼吸道刺激性觀察、呼吸系統(tǒng)臟器系數(shù)測定、組織病理學(xué)觀察、灌洗液中白細胞分類和計數(shù)測定，以及血清、肺組織樣本和灌洗液中的氧化損傷指標和炎性因子進行檢測，考察大鼠口鼻部吸入暴露模型中細顆粒物對大鼠呼吸系統(tǒng)的急慢性損傷。

1.2動物：spf級sd大鼠(180～200g，訂購時)，48只，購自北京維通利華生物。

1.3具體數(shù)據(jù)；

1.3.1桑葚提取物對pm2.5所致大鼠整體毒性的保護作用

連續(xù)8周測定大鼠體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8周觀察期結(jié)束時，各組大鼠體重分別增長了82.4％(對照組，control)、61.7％(染毒組，pm2.5)和71.9％(給藥組，pm2.5+桑葚提取物)。說明pm2.5暴露明顯抑制體重增長(表1)，且從暴露第一周起至結(jié)束均有統(tǒng)計學(xué)差異。而給藥組大鼠體重高于染毒組，說明桑葚提取物對pm2.5引起的大鼠體重變化有一定程度的改善作用。

籠旁觀察發(fā)現(xiàn)模型染毒組隨著染毒時間的延長，從染毒第二周開始出現(xiàn)乍毛，易怒，活動增加，呼吸急促等癥狀，而桑葚提取物組癥狀明顯輕于模型組。

表1桑葚提取物對pm2.5所致大鼠體重改變的改善作用

注：*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比。

1.3.2桑葚提取物對大鼠呼吸功能的改善作用

功能指標可判斷空氣細顆粒物所引起肺功能受損的氣道通暢性、呼吸肌肉力量、肺組織彈性、通氣功能和儲存能力的狀態(tài)。本研究對大鼠通氣功能進行了測定。

由表2可知，4周起pm2.5導(dǎo)致肺功能流量指標最大吸氣流量(peakinspiratoryflow)、最大呼氣流量(peakexpiratoryflow)、呼氣中流量(50％tidalvolumeexpiratoryflow)的降低，并持續(xù)至8周，反映通氣功能和/或氣道阻力升高。桑葚提取物可明顯改善pm2.5所致的作用，使上述指標接近正常水平。

從表3可知，sd大鼠連續(xù)吸入空氣細顆粒物2周起，pm2.5導(dǎo)致潮氣量(tidalvolume)和呼氣量(expiratoryvolume)呈現(xiàn)時間依賴性降低，呼吸的容積量明顯下降。吸入細顆粒物4周開始，每分通氣量(minuteventilationvolume)降低并持續(xù)至8周，表明肺通氣功能儲備量亦降低。桑葚提取物作用可明顯改善上述指標，接近正常水平。結(jié)果說明肺功能的儲氣功能受到損傷，桑葚提取物可顯著提升連續(xù)吸入細顆粒物造成的大鼠肺功能中與容量相關(guān)指標的減低。

由表4可知，8周時可觀察到模型組呼氣時間(expiratorytime)和放松時間(relaxationtime)也明顯升高，而pd給藥后與對照組更為接近。說明當(dāng)模型組大鼠與流量和容量相關(guān)的肺功能指標受到了顯著抑制后，動物必須通過延長呼氣時間與放松時間才能維持相對需要的肺功能，而連續(xù)服用桑葚提取物4周和8周，在顯著提升改善連續(xù)吸入細顆粒物造成的大鼠肺功能中與容量和容量相關(guān)指標的減低的同時，也可以適當(dāng)降低模型組增加的時間指標，具有一定的改善作用。

本研究的結(jié)果說明，吸入pm2.5導(dǎo)致大鼠呼吸流量、容量和時間相關(guān)的指標呈時間依賴性改變，肺功能的正常通氣功能受到了損傷。連續(xù)服用桑葚提取物2周至8周具有顯著的改善作用，說明桑葚提取物對空氣細顆粒物造成的大鼠肺功能損害具有顯著的保護作用。

表2桑葚提取物對pm2.5導(dǎo)致肺功能流量指標改變的改善作用

*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^#p<0.05，^##p<0.01,與pm2.5組相比。

表3桑葚提取物對pm2.5導(dǎo)致肺功能容量指標改變的改善作用

*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^#p<0.05，^##p<0.01,與pm2.5組相比。

表4桑葚提取物對pm2.5導(dǎo)致肺功能時間指標改變的改善作用

*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^#p<0.05,與pm2.5組相比。。

1.3.3桑葚提取物減輕pm2.5導(dǎo)致的氧化應(yīng)激

為了確定桑葚提取物對pm2.5對肺氧化應(yīng)激損傷的保護作用，我們在大鼠連續(xù)4周、8周吸入空氣細顆粒物染毒的試驗中，對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(mda)水平、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)和超氧化物歧化酶(sod)活力進行測定。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸入pm2.5大鼠肺泡灌洗液(balf)mda水平呈時間依賴性增高，8周時肺內(nèi)gsh-px活力顯著降低，表明隨著染毒時間延長，氧化應(yīng)激損傷加重；給藥能明顯降低mda水平(p<0.01)，升高gsh-px活力。另一方面，血清中pm2.5作用后mda水平4周明顯升高，且桑葚提取物作用明顯，8周機體產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)；桑葚提取物可顯著提高機體抗氧化酶gsh-px和sod活力(表5、6、7)。

上述結(jié)果均說明連續(xù)服用桑葚提取物4周和8周，可以有效提高機體抗氧化損傷能力，降低空氣細顆粒物造成的模型大鼠肺氧化應(yīng)激。

表5balf與血清中mda水平

結(jié)果以相對于對照組平均值的倍數(shù)表示，*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^##p<0.01,與pm2.5組相比。

表6肺與血清中g(shù)sh-px活力水平

結(jié)果以相對于對照組平均值的倍數(shù)表示，^#p<0.05，與pm2.5組相比。

表7血清中sod活力水平

結(jié)果以相對于對照組平均值的倍數(shù)表示，*p<0.05，與對照組相比；^#p<0.05，與pm2.5組相比。

1.3.4桑葚提取物減輕pm2.5所致肺部炎癥

pm2.5連續(xù)暴露8周會引起大鼠肺白細胞(wbc)、淋巴細胞(lym)、單核細胞(mon)、中性粒細胞(neut)、嗜酸性粒細胞(eos)和嗜堿性粒細胞(bas)數(shù)明顯增高(表8)。與染毒組相比，給藥使wbc、mon、bas顯著降低，lym、neut和eos雖然無統(tǒng)計學(xué)差異，但數(shù)值上亦低于pm2.5暴露大鼠。結(jié)果說明桑葚提取物能明顯降低pm2.5引起的肺部炎細胞數(shù)，減輕炎癥反應(yīng)。

表8給藥8周balf中細胞計數(shù)及分類(10⁹/l，)

*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^#p<0.05，^##p<0.01,與pm2.5組相比。

1.3.5桑葚提取物調(diào)節(jié)pm2.5所致的炎癥相關(guān)基因表達改變

在本研究中，我們通過測定肺組織炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵mrna以更清楚地描述pm2.5所致機體炎癥反應(yīng)應(yīng)答。pm2.5導(dǎo)致肺炎癥因子tnf-αmrna表達明顯升高，而桑葚提取物作用能顯著降低其表達(表6)，該作用4周強于8周。pm2.5吸入染毒4周誘導(dǎo)肺內(nèi)前炎性細胞因子il-1βmrna表達，桑葚提取物組從數(shù)值上低于染毒大鼠，8周各組雖無顯著差異，但數(shù)值上依然低于染毒大鼠。此外，pm2.5暴露4周引起的炎癥抑制因子il-10mrna表達水平降低，而桑葚提取物能明顯升高il-10。

上述結(jié)果說明，染毒初期桑葚提取物能顯著降低pm2.5引起的肺部炎癥反應(yīng)，但隨著染毒時間持續(xù)、毒性作用增強，桑葚提取物作用不明顯。

表9桑葚提取物和pm2.5對肺部炎癥因子表達的影響

*p<0.05，**p<0.01,與對照組相比；^#p<0.05與pm2.5組相比。