本發(fā)明為一種沉香樹(aquilariamalaccensis)籽萃取物的制備方法，及該萃取物應(yīng)用于抗過敏的用途。

背景技術(shù)：

由于全球環(huán)境隨工業(yè)的發(fā)展使污染隨的增加，且因土地開發(fā)的因素，造成綠地、森林(如：巴西的雨林)大幅減少，使環(huán)境氣候改變，造成罹患過敏性疾病的患者逐年增加，其罹病年齡層也有下降的趨勢(shì)；而過敏性疾病是免疫系統(tǒng)接觸環(huán)境中部分對(duì)一般人影響不大的過敏原因子后，所引發(fā)的一系列超敏反應(yīng)現(xiàn)象；而人體對(duì)于某些因子過度反應(yīng)的現(xiàn)象，包含過敏性鼻炎、食物過敏、蕁麻疹、異位性皮膚炎、哮喘與全身型過敏性反應(yīng)等，癥狀可能有紅眼、引起搔癢的皮疹、流鼻水、呼吸困難與腫脹等。

而過敏反應(yīng)中由免疫球蛋白e(ige)為媒介的過敏，是一種常見的免疫系統(tǒng)失調(diào)的反應(yīng)，其會(huì)與過敏原結(jié)合，并釋放組織胺等引起發(fā)炎的化學(xué)物質(zhì)，過敏的治療包括避開已知的過敏原和使用皮質(zhì)類固醇與抗組織胺藥；當(dāng)嚴(yán)重過敏時(shí)，則會(huì)于靜脈注射腎上腺素，借以抑制細(xì)胞的過敏反應(yīng)，特別的是，在ige媒介的過敏反應(yīng)中，例如過敏性鼻炎、急性氣喘和異位性濕疹，肥大細(xì)胞的去顆粒(β-葡萄糖醛酸酶與組織胺的釋放)扮演著關(guān)鍵的角色；在體外過敏反應(yīng)試驗(yàn)中，活化的肥大細(xì)胞(rbl-2h3細(xì)胞)會(huì)釋出β-葡萄糖醛酸酶與組織胺。雖然目前過敏癥狀可以治療，但可用的藥物在長期使用的情況下會(huì)容易引起不良反應(yīng)，而因天然物不僅容易取得且成份組成較合成藥物安全，因此尋找有活性的天然物作為治療過敏的替代藥物，實(shí)為目前業(yè)界所欲解決的課題。

就以沉香樹(aquilariamalaccensis)而言，其是屬于瑞香科植物，為珍貴的芳香樹脂來源，該樹脂作用為植物的防御機(jī)制，用來抵御病原體的入侵，其可作為強(qiáng)心劑、驅(qū)風(fēng)、平喘、壯陽藥和澀補(bǔ)之用，而且對(duì)治療腹瀉、痢疾、痛風(fēng)、風(fēng)濕、癱瘓以及寄生蟲有效，亦對(duì)治療皮膚病有益；另外，沉香亦被發(fā)現(xiàn)具有抗憂郁、抗神經(jīng)發(fā)炎、鎮(zhèn)痛、抗發(fā)炎、抗氧化、抗菌等活性，而在體內(nèi)試驗(yàn)中亦具有降血糖以及緩瀉效果。

尤其，沉香樹的莖與樹干的酒精萃取物具有強(qiáng)心的作用、對(duì)人類表皮癌細(xì)胞與p-388淋巴白血球細(xì)胞的試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有細(xì)胞毒殺效果；而其水萃物則顯示具有抗錐蟲、抗菌以及體內(nèi)體外抗過敏的功效；過去曾由沉香(a.malaccensis)樹干分離出一個(gè)佛波酯化合物，名為12-o-(2z，4e，6e)-deca-2，4，6-trienoylphorbol-13-acetate，被認(rèn)為具有刺激性、促炎性和促癌性者，但其并未針對(duì)其抗過敏的活性深入研究，故該化合物抗過敏的活性并不可知。

另外，由于利用沉香樹的莖與樹干作萃取，且因沉香樹的生長速度較為緩慢，其并無法大量、有效率提供莖、樹干來萃??；有鑒于此，本發(fā)明人等遂以可較易取得且不影響沉香樹生長的沉香樹(aquilariamalaccensis)籽來試驗(yàn)研究，使其可提供治療過敏替代藥物的天然物，終于構(gòu)思出本案且確已得相關(guān)研究成果，而完成本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題在于，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一種沉香樹籽萃取物、制備方法及其應(yīng)用于抗過敏的用途，其可有效制備可抗過敏藥物的沉香樹籽萃取物及其制備方法；擁有將沉香樹籽萃取物應(yīng)用于抗過敏的用途。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種應(yīng)用于抗過敏藥物的沉香樹籽萃取物的制備方法，包括如下的步驟：

(a)將沉香樹(aquilariamalaccensis)籽經(jīng)陰干、磨粉后以90％乙醇萃取3次，并經(jīng)減壓濃縮抽干后獲得乙醇萃取物(etoh)；

(b)以水(water)及乙酸乙酯(etoac)對(duì)乙醇萃取物(etoh)進(jìn)行3次等比例的液液層析進(jìn)行，以獲得乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)及水層(h2olater)；

(c)以正己烷(n-hex)和90％甲醇水溶液(meoh)對(duì)乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)進(jìn)行液液層析，以獲得正己烷劃分層(n-hexlayer)與甲醇劃分層(meohlayer)；

(d)將甲醇劃分層(meohlayer)以硅膠管柱層析，借由正己烷(n-hex)∶二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)以6∶3∶1、6∶4∶1、6∶6∶1、6∶8∶1、6∶10∶1、6∶10∶2的比例所組成的沖提液進(jìn)行梯度沖提，從而獲得6個(gè)劃分層am1、am2、am3、am4、am5、am6；

(e)將am4劃分層以1∶1比例的二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)的葡聚醣凝膠lh-20(sephadexlh-20)管柱進(jìn)行分離，從而獲得8個(gè)次劃分層am4-1、am4-2、am4-3、am4-4、am4-5、am4-6、am4-7、am4-8；

(f)將am4-3次劃分層經(jīng)由硅膠管柱層析，以1∶10至4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出15個(gè)子劃分層am4-3-1、am4-3-2、am4-3-3、am4-3-4、am4-3-5、am4-3-6、am4-3-7、am4-3-8、am4-3-9、am4-3-10、am4-3-11、am4-3-12、am4-3-13、am4-3-14及am4-3-15；

(g)將am4-4次劃分層經(jīng)由硅膠管柱層析以1∶15～4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出12個(gè)子劃分層am4-4-1、am4-4-2、am4-4-3、am4-4-4、am4-4-5、am4-4-6、am4-4-7、am4-4-8、am4-4-9、am4-4-10、am4-4-11、am4-4-12；

借由上述的步驟，即可由am4-4-9子劃分層獲得一新佛波酯化合物i，其如下式(i)的結(jié)構(gòu)，

而由上述am4-3-6子劃分層及am4-4-3子劃分層獲得一新佛波酯化合物ii，其結(jié)構(gòu)如下式(ii)：

再，由上述am4-3-13子劃分層獲得一新佛波酯化合物iii，其結(jié)構(gòu)如下式(iii)：

另，由上述am4-3-13子劃分層獲得一新佛波酯化合物iv，其結(jié)構(gòu)如下式(iv)：

再，由上述am4-4-7子劃分層及am4-4-8子劃分層可獲得已知佛波酯化合物v及佛波酯化合物vi，該佛波酯化合物v的結(jié)構(gòu)如下式(v)，該佛波酯化合物vi的結(jié)構(gòu)如下式(vi)：

故，借由上述結(jié)構(gòu)的佛波酯化合物，即可用以制備抗過敏藥物，以應(yīng)用于抗過敏用途。

本發(fā)明的有益效果是，其可有效制備可抗過敏藥物的沉香樹籽萃取物及其制備方法；擁有將沉香樹籽萃取物應(yīng)用于抗過敏的用途。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

圖1是本發(fā)明的流程圖。

圖2是本發(fā)明am4-3次劃分層分離以獲得15個(gè)子劃分層的流程圖。

圖3是本發(fā)明am4-4次劃分層分離以獲得12個(gè)子劃分層的流程圖。

圖4是乙醇萃取物(etoh)、甲醇劃分層(meoh)、am4劃分層以及am4-4次劃分層的核磁共振光譜的氫譜比較圖。

圖5是本發(fā)明佛波酯化合物i的核磁共振的氫譜。

圖6是本發(fā)明佛波酯化合物i的核磁共振的碳譜。

圖7是本發(fā)明佛波酯化合物ii的核磁共振的氫譜。

圖8是本發(fā)明佛波酯化合物ii的核磁共振的碳譜。

圖9是本發(fā)明佛波酯化合物iii的核磁共振的氫譜。

圖10是本發(fā)明佛波酯化合物iii的核磁共振的碳譜。

圖11是本發(fā)明佛波酯化合物iv的核磁共振的氫譜。

圖12是本發(fā)明佛波酯化合物iv的核磁共振的碳譜。

圖13是本發(fā)明佛波酯化合物v的核磁共振的氫譜。

圖14是本發(fā)明佛波酯化合物v的核磁共振的碳譜。

圖15是本發(fā)明佛波酯化合物vi的核磁共振的氫譜。

圖16是本發(fā)明的抗過敏活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表。

圖17是本發(fā)明的抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表。

圖18是本發(fā)明的細(xì)胞毒性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表。

圖19是本發(fā)明的去顆粒活性試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

有關(guān)本發(fā)明為達(dá)到目的所運(yùn)用的技術(shù)手段及其方法，茲謹(jǐn)再配合圖1～圖3所示的流程圖、圖4～圖15所示的核磁共振分析圖，及圖16～圖19的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表，詳細(xì)說明如下：

如圖1～圖3所示的流程圖，其是用以制備沉香樹(aquilariamalaccensis)籽萃取物的制備方法，詳細(xì)說明如下：

(a)將沉香樹(aquilariamalaccensis)籽經(jīng)陰干、磨粉后以90％乙醇萃取3次，并經(jīng)減壓濃縮抽干后獲得乙醇萃取物(etoh)；取陰干、磨粉后的沉香樹籽462公克，在室溫下以5公升的90％乙醇萃取3次，并經(jīng)由減壓濃縮抽干后獲得27.7公克的乙醇萃取物(etoh)。

(b)以水及乙酸乙酯(etoac)對(duì)乙醇萃取物(etoh)進(jìn)行3次等比例的液液層析進(jìn)行，以獲得乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)及水層(h2olater)；以1公升的水和乙酸乙酯(etoac)對(duì)乙醇萃取物(etoh)進(jìn)行3次等比例的液液層析，并獲得25.6公克的乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)及水層(h２olater)。

(c)以正己烷(n-hex)和90％甲醇水溶液(meoh)對(duì)乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)進(jìn)行液液層析，以獲得正己烷劃分層(n-hexlayer)與甲醇劃分層(meohlayer)；以正己烷(n-hex)和90％甲醇水溶液(meoh)對(duì)25.6公克的乙酸乙酯劃分層(etoaclayer)進(jìn)行液液層析，以劃分獲得7.1公克的正己烷劃分層(n-hexlayer)和16.2公克的甲醇劃分層(meohlayer)；又，該水層(h２olater)可分離純化出正丁醇劃分層(n-butanollayer)及水劃分層(waterlayer)。

(d)將甲醇劃分層(meohlayer)以硅膠管柱層析，借由正己烷(n-hex)∶二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)以6∶3∶1、6∶4∶1、6∶6∶1、6∶8∶1、6∶10∶1、6∶10∶2的比例所組成的沖提液進(jìn)行梯度沖提，從而獲得6個(gè)劃分層am1、am2、am3、am4、am5、am6；將甲醇劃分層(meohlayer)經(jīng)由硅膠管柱層析(23cm×4cm，silicagel60，0.063-0.200mm，merck)，借由正己烷(n-hex)∶二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)以6∶3∶1、6∶4∶1、6∶6∶1、6∶8∶1、6∶10∶1、6∶10∶2的比例所組成的沖提液進(jìn)行梯度沖提，從而獲得2917毫克的am1劃分層、1320毫克的am2劃分層、6834毫克的am3劃分層、3212.2毫克的am4劃分層、1703毫克的am5劃分層及97.9毫克的am6劃分層。

(e)將am4劃分層以1∶1比例的二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)的葡聚醣凝膠lh-20(sephadexlh-20)管柱進(jìn)行分離，從而獲得8個(gè)次劃分層am4-1、am4-2、am4-3、am4-4、am4-5、am4-6、am4-7、am4-8；將上述步驟中am4劃分層以1∶1比例的二氯甲烷(dcm)∶甲醇(meoh)的葡聚醣凝膠lh-20(sephadexlh-20)管柱進(jìn)行分離，從而獲得688毫克的am4-1次劃分層、688毫克的am4-2次劃分層、762毫克的am4-3次劃分層、173.7毫克的am4-4次劃分層、609毫克的am4-5次劃分層、253.5毫克的am4-6次劃分層、80毫克的am4-7次劃分層及80毫克的am4-8次劃分層；其中該am4-3及am4-4次劃分層含有豐富的佛波酯。

(f)將am4-3次劃分層經(jīng)由硅膠管柱層析，以1∶10至4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出15個(gè)子劃分層am4-3-1、am4-3-2、am4-3-3、am4-3-4、am4-3-5、am4-3-6、am4-3-7、am4-3-8、am4-3-9、am4-3-10、am4-3-11、am4-3-12、am4-3-13、am4-3-14及am4-3-15；將上述步驟(e)中762毫克的am4-3次劃分層硅膠管柱層析(17cm×4cm，geduransi60，0.040-0.063mm，merck)，以1∶10至4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出3.4毫克的am4-3-1子劃分層、25.3毫克的am4-3-2子劃分層、345.6毫克的am4-3-3子劃分層、49.2毫克的am4-3-4子劃分層、16.4毫克的am4-3-5子劃分層、39.5毫克的am4-3-6子劃分層、8.4毫克的am4-3-7子劃分層、3.8毫克的am4-3-8子劃分層、42.7毫克的am4-3-9子劃分層、23毫克的am4-3-10子劃分層、42.5毫克的am4-3-11子劃分層、43.5毫克的am4-3-12子劃分層、23.5毫克的am4-3-13子劃分層、7.9毫克的am4-3-14子劃分層及38.3毫克的am4-3-15子劃分層(如圖2所示)，且該4-3-13子劃分層中含有豐富的佛波酯。

(g)將am4-4次劃分層經(jīng)由硅膠管柱層析以1∶15～4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出12個(gè)子劃分層am4-4-1、am4-4-2、am4-4-3、am4-4-4、am4-4-5、am4-4-6、am4-4-7、am4-4-8、am4-4-9、am4-4-10、am4-4-11、am4-4-12；將上述步驟(e)中173.7毫克的am4-4次劃分層經(jīng)由硅膠管柱層析(30cm×1.5cm，geduransi60，0.040-0.063mm，merck)以1∶15～4∶1比例的乙酸乙酯∶正己烷進(jìn)行梯度沖堤，從而分離出2.2毫克的am4-4-1子劃分層、16.3毫克的am4-4-2子劃分層、3.5毫克的am4-4-3子劃分層、5.7毫克的am4-4-4子劃分層、7.7毫克的am4-4-5子劃分層、11.5毫克的am4-4-6子劃分層、37.6毫克的am4-4-7子劃分層、6.8毫克的am4-4-8子劃分層、43.9毫克的am4-4-9子劃分層、3.3毫克的am4-4-10子劃分層、3.5毫克的am4-4-11子劃分層及23.5毫克的am4-4-12子劃分層(如圖3所示)，且該4-4-7及4-4-9子劃分層中含有豐富的佛波酯。

(h)取得am4-4-9子劃分層中的萃取物，獲得佛波酯化合物i(12-o-(2z，4e，6e)-tetradeca-2，4，6-trienoylphorbol-13-acetate)；取得上述am4-4-9子劃分層中的萃取物，而其含有43.9毫克的新佛波酯化合物i

(12-o-(2z，4e，6e)-tetradeca-2，4，6-trienoylphorbol-13-acetate)，其分子式為c36h50o8，其結(jié)構(gòu)如下式(i)：

(i)取得am4-3-6子劃分層及am4-4-3子劃分層中的萃取物，從而獲得新佛波酯化合物ii；將am4-4-3子劃分層中的萃取物，而其共含有8.8毫克新佛波酯化合物ii

(12-deoxy-13-o-acetoylphorbol-20-octadec-9-enoate)，其分子式為c40h62o7，其結(jié)構(gòu)如下式(ii)：

(j)取得am4-3-13子劃分層中的萃取物，其含有新佛波酯化合物iii及新佛波酯化合物iv；取得23.5毫克am4-3-13子劃分層中的萃取物，而其含有0.7毫克新佛波酯化合物iii(12-o-(2e，4e)-6-oxohexa-2，4-dienoylphorbol-13-acetate)及0.9毫克的新佛波酯化合物iv

(12-o-(2e，4e)-6，7-dihydroxytetradeca-2，4-dienoylphorbol-13-acetate)，該新佛波酯化合物iii分子式為c28h34o9，其結(jié)構(gòu)如下式(iii)；而該新佛波酯化合物iv分子式為c36h52o10，其結(jié)構(gòu)如下式(iv)：

(k)取得am4-4-7子劃分層及am4-4-8子劃分層中的萃取物，從而獲得已知的佛波酯化合物v(12-deoxyphorbol13-decanoate)與佛波酯化合物vi(12-deoxyphorbol13-octanoate)；取得am4-4-7子劃分層與am4-4-8子劃分層中的萃取物，而其內(nèi)共含有8.5毫克已知的佛波酯化合物v與1.4毫克已知的佛波酯化合物vi，該佛波酯化合物v分子式為c30h46o6，其結(jié)構(gòu)如下式(v)，而該佛波酯化合物vi分子式為c28h42o6，其結(jié)構(gòu)如下式(vi)：

又，請(qǐng)參閱圖4所示的核磁共振光譜的氫譜比較圖，其可看出乙醇萃取物(etoh)、甲醇劃分層(meoh)、am4劃分層以及am4-4次劃分層確實(shí)均含有佛波酯化合物，且發(fā)現(xiàn)抗過敏的活性與佛波酯化合物訊號(hào)的增加成正比例關(guān)系。

有關(guān)上述佛波酯化合物i(12-o-(2z，4e，6e)-tetradeca-2，4，6-trienoylphorbol-13-acetate)，經(jīng)分析后，其分子量為hresimsm/z633.33980[m+na]⁺(calcdforc36h50o8na，633.33979)；旋光度為[α]^d25：-3.75±1.97(c0.0667，chcl3)；其紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：303(2.78)，233(2.75)nm；其紅外光譜ir(neat)νmax：3413，2965，2922，1710，1615，1377，1258，1092，802cm-1；其核磁共振氫譜如圖5所示，其核磁共振碳譜則如圖6所示。

有關(guān)上述佛波酯化合物ii(12-deoxy-13-o-acetoylphorbol-20-octadec-9-enoate)，經(jīng)分析后，其分子量為hresimsm/z677.43884[m+na]⁺(calcdforc40h62o7na，677.43878)；旋光度為[α]^d25：+2.91±0.49(c0.3333，chcl3)；紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：285(2.78)，250(2.83)nm；紅外光譜為ir(neat)νmax：3409，2922，2855，1717，1375，1332，1152，1021cm^-1；其核磁共振氫譜如圖7所示，其核磁共振碳譜則如圖8所示。

有關(guān)上述佛波酯化合物iii(12-o-(2e，4e)-6-oxohexa-2，4-dienoylphorbol-13-acetate)，經(jīng)分析后，其分子量為hresimsm/z537.20959[m+na]⁺(calcdforc28h34o9na，537.20950)；旋光度為[α]^d25：+4.20±0.82(c0.1667，chcl3)；紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：295(2.80)，249(2.84)nm；紅外光譜為ir(neat)νmax：3413，2925，2855，2360，2339，1625，1597，1261，1184，755cm^-1；其核磁共振氫譜如圖9所示，其核磁共振碳譜則如圖10所示。

有關(guān)上述佛波酯化合物iv

(12-o-(2e，4e)-6，7-dihydroxytetradeca-2，4-dienoylphorbol-13-acetate)，經(jīng)分析后，其分子量為hresimsm/z667.34515[m+na]⁺(calcdforc36h52o10na，667.34527)；旋光度為[α]^d２5：+10.44±1.45(c0.1667，chcl3)；紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：289(2.79)，249(2.83)nm；紅外光譜為ir(neat)νmax：3392，2925，2851，1710，1632，1455，1375，1261，1024，802，755cm^-1；其核磁共振氫譜如圖11所示，其核磁共振碳譜則如圖12所示。

有關(guān)上述佛波酯化合物v(12-deoxyphorbol13-decanoate)，經(jīng)分析后，其分子量為hresimsm/z525.31921[m+na]⁺(calcdforc30h46o6na，525.31921)；旋光度為[α]^d25：+8.55±0.63(c0.200，chcl3)；紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：325(0.14)，249(1.31)nm；紅外光譜為ir(neat)νmax：3392，2925，2356，1710，1629，1335，1155cm^-1；其核磁共振氫譜如圖13所示，其核磁共振碳譜則如圖14所示。

有關(guān)上述佛波酯化合物vi(12-deoxyphorbol13-octanoate)，經(jīng)分析后，其分子量為475[m+h]⁺(calcdforc28h43o6)；旋光度為[α]^d25：+4.75±1.27(c0.200，chcl3)；紫外光譜為uv(meoh)λmax(logε)：311(0.01)，250(2.85)nm；紅外光譜ir(neat)νmax：3377，2922，2858，1710，1625，1332，1018cm^-1；其核磁共振氫譜如圖15所示。

另，在本說明書和申請(qǐng)專利范圍中，提供的化學(xué)式名稱應(yīng)涵蓋其所有光學(xué)異構(gòu)物和立體異構(gòu)物，因此，所有此等異構(gòu)物均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

而為研究試驗(yàn)本發(fā)明沉香樹籽萃取物抗過敏的效率及活性分析，本發(fā)明進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：

細(xì)胞培養(yǎng)：本發(fā)明取得由黏膜肥大細(xì)胞分離出來的大鼠嗜堿性細(xì)胞株(rbl-2h3)。細(xì)胞生長于添加了10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dulbecco改良式eagle(dmem)培養(yǎng)基的10公分細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中設(shè)37℃、空氣含5％二氧化碳的條件下培養(yǎng)。

樣品準(zhǔn)備：將經(jīng)上述沉香樹籽萃取物制備方法所制備出的沉香樹籽萃取物，如：乙醇萃取物(etoh)、正丁醇劃分層(buoh)、水劃分層(water)、乙酸乙酯劃分層(etoac)、正己烷劃分層(hexane)、甲醇劃分層(meoh)及經(jīng)分離的am4劃分層、am4-4次劃分層、am4-4-7子劃分層、am4-4-8子劃分層及am4-4-9子劃分層等物質(zhì)作為樣品；而其中該am4-4-9子劃分層的物質(zhì)即屬新佛波酯化合物i。

細(xì)胞存活率試驗(yàn)：細(xì)胞存活率試驗(yàn)是以顯色劑噻唑藍(lán)(mtt，四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)來測(cè)量樣品對(duì)rbl-2h3肥大細(xì)胞造成的潛在毒性作用，簡而言之，在96孔微量盤中接種rbl-2h3肥大細(xì)胞(2×10⁴細(xì)胞/孔)靜置過夜后，添加不同濃度的樣品(10-100μg/ml)并靜置24小時(shí)。在每孔加入80μl噻唑藍(lán)溶液(0.5mg/ml)一小時(shí)后，以80μl二甲基亞砜沖洗掉甲瓚(formazan)結(jié)晶，將微量盤分析儀(multiskanascent，thermoscientific)設(shè)定在595nm波長，測(cè)量吸光度。各樣品的細(xì)胞存活率是實(shí)驗(yàn)組(添加樣品細(xì)胞)除以對(duì)照值(無添加樣品細(xì)胞)的百分比來計(jì)算。對(duì)二甲基亞砜最大的耐受劑量為0.5％，且所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)二次以上；借此，即可得如圖16所示的抗過敏活性結(jié)果表。

以卡西霉素a23187或抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶去顆粒試驗(yàn)：以卡西霉素a23187和抗原誘導(dǎo)rbl-2h3肥大細(xì)胞去顆粒的程度，是由β-葡萄糖醛酸酶釋放試驗(yàn)，經(jīng)由下列方式改良的方法來測(cè)定：接種rbl-2h3肥大細(xì)胞(2×104cells/well)在96孔微量盤和rbl-2h3肥大細(xì)胞(3×104cells/well)在48孔微量盤中，分別供給卡西霉素a23187誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和抗原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所用，在細(xì)胞中加入各種濃度的樣品，靜置20小時(shí)；使用迪皮質(zhì)醇(10nm)作為正對(duì)照組。在抗原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞首先以抗-二硝基苯酚ige單克隆抗體(anti-dinitrophenolige，anti-dnpige)(5μg/ml)被動(dòng)高敏至少2小時(shí)，將細(xì)胞以預(yù)熱的臺(tái)羅德氏緩沖液(135mm氯化鈉，5mm氯化鉀，1.8mm氯化鈣，1.0mm氯化鎂，5.6mm葡萄糖，20mm4-羥乙基呱嗪乙磺酸，ph7.4)徹底沖洗后，各別以臺(tái)羅德氏緩沖液配制的鈣離子載體a23187(卡西霉素，1μm)或抗原二硝基苯-胎牛血清共軛物(100ng/ml)刺激一小時(shí)。為測(cè)量β-葡萄糖醛酸酶釋放的總量，將未受刺激的細(xì)胞以0.5％的tritonx-100溶液裂解，或者不進(jìn)行處理使細(xì)胞自發(fā)性的釋放β-葡萄糖醛酸酶；分裝上清液(50μl)與等量的1μm聚氮-乙酰葡萄糖胺(抗原)配制于0.1m檸檬酸鹽緩沖液(ph4.5)中，用作釋放β-葡萄糖醛酸酶的基底。在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)后，加入100μl的終止緩沖液(0.1mna2/nahco3，ph10.0)猝滅反應(yīng)。將微量盤分析儀(multiskanascent，thermoscientific)設(shè)定在405nm波長，測(cè)量吸光度；β-葡萄糖醛酸酶釋放的抑制百分比是實(shí)驗(yàn)組除以對(duì)照值(未處理細(xì)胞)的百分比來計(jì)算；對(duì)二甲基亞砜最大的耐受劑量為0.5％，且所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；借此，即可得如圖16所示的抗過敏活性結(jié)果表。

β-葡萄糖醛酸酶的酵素活性影響：為測(cè)試樣品是否可能直接影響酵素活性，因此進(jìn)行以下試驗(yàn)，將含有細(xì)胞懸浮液(2×106cells)的臺(tái)羅德氏緩沖液(2ml)以超音波震蕩5分鐘后進(jìn)行離心，將上清液以8ml臺(tái)羅德氏緩沖液稀釋成酵素溶液；取該酵素溶液(45μl)和樣品溶液(5μl)于96孔微量盤中，依照前述方式(materialsandmethods3.6)測(cè)量酵素活性，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上；借此，即可得如圖16所示的抗過敏活性結(jié)果表。

樣品誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶直接去顆粒試驗(yàn)：在rbl-2h3肥大細(xì)胞中，由樣品引發(fā)的β-葡萄糖醛酸酶的釋放量是以改良過的β-葡萄糖醛酸酶釋放實(shí)驗(yàn)來決定；簡單地說，將rbl-2h3肥大細(xì)胞(4×104cells/well)接種于48孔微量盤中，加入樣品后靜置10小時(shí)。將臺(tái)羅德氏緩沖液加入5.6mm葡萄糖、2mg/ml牛血清白蛋白(bsa)和2mm谷氨酸以制備樣品和細(xì)胞所用。50μl的上清液轉(zhuǎn)移至96孔微量盤，依照前述方式(materialsandmethods3.6)測(cè)量β-葡萄糖醛酸酶的釋放量，卡西霉素a23187(1μm)做為正對(duì)照組，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)三次以上；借此，即可得如圖16所示的抗過敏活性結(jié)果表。

人類嗜中性粒細(xì)胞的備制：從健康成年志愿者(20～30歲)的靜脈血液，以ficoll-hypaque聚蔗糖泛影葡胺分層液密度梯度離心法、低滲裂解紅血球以及葡聚醣沉淀等標(biāo)準(zhǔn)方法，分離出人類嗜中性粒細(xì)胞；純化的嗜中性粒細(xì)胞，經(jīng)過臺(tái)盼蘭排除法測(cè)定后，仍有超過98％嗜中性粒細(xì)胞存活可用，將細(xì)胞懸浮于ph7.4的無鈣離子hank’s緩沖鹽溶液(hbss)中，保持在4℃的情況下備用。

抑制超氧陰離子生成試驗(yàn)與彈性蛋白酶釋放的抑制試驗(yàn)：嗜中性粒細(xì)胞超氧陰離子的生成，是以超氧化物歧化酶(sod)抑制細(xì)胞色素還原法來測(cè)定，而嗜苯胺藍(lán)顆粒的去顆粒反應(yīng)則是經(jīng)由彈性蛋白酶釋放測(cè)定方法來測(cè)定；借此，即可得如圖17所示的抑制率結(jié)果表。

細(xì)胞毒殺試驗(yàn)：細(xì)胞毒殺試驗(yàn)是依據(jù)過去文獻(xiàn)的方法來進(jìn)行的，將人類肝癌細(xì)胞株hepg2(1×104cells)、人類肺癌細(xì)胞株a549(5×103cells)以及人類乳腺癌細(xì)胞株mda-mb231(1×104cells)等三種癌細(xì)胞株接種于96孔微量盤中，各別加入濃度20μg/ml的沉香樹籽樣品；靜置72小時(shí)后，將培養(yǎng)盤去除培養(yǎng)基并在每個(gè)孔中加入100μl噻唑藍(lán)顯色劑溶液(0.5mg/ml)，并在37℃下培養(yǎng)一小時(shí)；以二甲基亞砜(100μl)沖洗掉甲瓚(formazan)結(jié)晶，將微量盤分析儀(multiskanascent，thermoscientific)設(shè)定在595nm波長，測(cè)量吸光度；阿霉素作為正對(duì)造組；借此，即可得如圖18所示的細(xì)胞毒性篩選結(jié)果。

借由上述實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，可得如圖16所示的卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放實(shí)驗(yàn)(抗過敏活性)試驗(yàn)結(jié)果，及圖17所示抗過敏活性試驗(yàn)(在人類嗜中性粒細(xì)胞fmlp/cb誘導(dǎo)超氧陰離子的產(chǎn)生與彈性蛋白酶的釋放的抑制作用)結(jié)果；另外，在佛波酯豐集的am4劃分層和佛波酯化合物i對(duì)無添加刺激劑的肥大細(xì)胞rbl-2h3的去顆?；钚栽囼?yàn)中，在肥大細(xì)胞rbl-2h3中，施予am4(10μg/ml)和佛波酯化合物i(10μg/ml)后靜置10小時(shí)，以添加葡萄糖、牛血清白蛋白(bsa)和谷氨酸的臺(tái)羅德氏緩沖液作為培養(yǎng)基，卡西霉素a23187(1μm)作為陽性控制組，則可得如圖19所示的去顆?；钚栽囼?yàn)結(jié)果。

接著，由圖16所示的沉香樹籽萃取物、劃分層以及佛波酯化合物i的抗過敏活性結(jié)果可知，其沉香樹籽的乙醇萃取物(etoh)于以卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放實(shí)驗(yàn)(抗過敏作用分析)中，結(jié)果分別為ic50值：0.92和3.9μg/ml；而為闡明實(shí)驗(yàn)樣品的抗過敏活性是來自于抑制β-葡萄糖醛酸酶的釋放，而不是來自于直接抑制β-葡萄糖醛酸酶活性所造成的假陽性結(jié)果，其分離出β-葡萄糖醛酸酶并與活性樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示沒有樣品會(huì)抑制β-葡萄糖醛酸酶的酵素活性；而因該甲醇劃分層(meoh)具有最佳的抗過敏活性(以卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果分別為ic50值：0.0089和0.069μg/ml)，因此，進(jìn)一步將該劃分層以硅膠管柱層析進(jìn)行分離，得到六個(gè)劃分層am1～am6；其中，am4劃分層在肥大細(xì)胞中以卡西霉素a23187誘導(dǎo)β-葡萄糖醛酸酶的抑制結(jié)果為ic50值：0.0034μg/ml，而以抗原誘導(dǎo)的誘導(dǎo)β-葡萄糖醛酸酶的抑制結(jié)果為ic50值：0.0065μg/ml，因此該am4劃分層具有最顯著的抗過敏活性。

而由圖17所示的抗發(fā)炎試驗(yàn)結(jié)果可知，沉香樹籽的乙醇萃取物(etoh)對(duì)于超氧陰離子的產(chǎn)生與彈性蛋白酶的釋放分別有90.1％和85.3％的抑制效果；而除了沉香樹籽萃取物的水劃分層以外，其余的劃分層均具有顯著的抗過敏和抗發(fā)炎活性。

而由圖18可知，在對(duì)人類肝癌細(xì)胞株hepg2、人類肺癌細(xì)胞株a549以及人類乳腺癌細(xì)胞株mda-mb231等進(jìn)行細(xì)胞毒殺試驗(yàn)中，僅有一些沉香樹籽萃取的劃分層，在濃度為20μg/ml時(shí)具有細(xì)胞毒殺活性，正丁醇劃分層(buoh)對(duì)人類肺癌細(xì)胞株a549具有57.1％的毒殺效果，前述的am4劃分層對(duì)人類肺癌細(xì)胞株a549和人類乳腺癌細(xì)胞株mda-mb231各別具有56.5％和79.3％的致死率，而另一個(gè)am6劃分層對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞株mda-mb231具有56.0％的毒殺效果；同時(shí)，由于沉香樹籽對(duì)于rbl-2h3肥大細(xì)胞的弱毒性，使得具抗過敏活性的am4劃分層的治療指數(shù)達(dá)到28000(如圖16所示)。為了進(jìn)一步排除am4劃分層直接造成肥大細(xì)胞活化的可能性，針對(duì)am4劃分層本身引發(fā)肥大細(xì)胞去顆粒(β-葡萄糖醛酸酶釋放)的能力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，與控制組相比的下，am4劃分層的施予不會(huì)引起顯著的去顆粒作用，即am4劃分層的施予不會(huì)導(dǎo)致β-葡萄糖醛酸酶釋放(如圖16所示)。

特別的是，由圖16可知，該am4-4次劃分層(其對(duì)以卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放的抑制結(jié)果，ic50值分別為4.8×10^-5μg/ml和6.8×10^-4μg/ml，而治療指數(shù)分別為1477328和103776)分離出活性最佳的am4-4-8子劃分層(其對(duì)以卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放的抑制結(jié)果，ic50值分別為7.6×10^-6μg/ml和8.0×10^-5μg/ml，而治療指數(shù)分別為9645374和9645374)以及一個(gè)新的佛波酯化合物i，其對(duì)以卡西霉素a23187與抗原誘導(dǎo)的β-葡萄糖醛酸酶釋放的抑制結(jié)果，ic50值分別為0.0017μm和0.011μm，而治療指數(shù)分別為71538和10550。

因此，由上述試驗(yàn)可知，本發(fā)明的新佛波酯化合物i確具有可有效抑制過敏的活性，實(shí)可應(yīng)用于制備抗過敏藥物的用途；同理，該含有佛波酯化合物i的am4-4-9子劃分層則同樣具有抑制過敏的活性，亦可應(yīng)用于制備抗過敏藥物的用途，因此，同樣含有豐富佛波酯的am4-3-13、am4-4-3及am4-4-7子劃分層則亦同樣具有抑制過敏的活性；綜上而言，本發(fā)明沉香樹籽的萃取物及劃分層可制備抗過敏用途的藥物，且具有顯著的抑制效果，實(shí)可應(yīng)用于抗過敏的用途；尤其，本發(fā)明是利用沉香樹籽來制備佛波酯化合物，其不僅有別于現(xiàn)有以沉香樹莖干的來制備抗發(fā)炎藥物的技術(shù)手段，且取得方便、簡單，亦不致影響沉香樹的生長，實(shí)可為具高度新穎性與進(jìn)步性的發(fā)明；另本發(fā)明經(jīng)由對(duì)沉香樹籽萃取后并獲得四種新佛波酯化合物，實(shí)為難能可貴的發(fā)明。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

綜上所述，本發(fā)明在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、使用實(shí)用性及成本效益上，完全符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展所需，且所揭示的結(jié)構(gòu)亦是具有前所未有的創(chuàng)新構(gòu)造，具有新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性，符合有關(guān)發(fā)明專利要件的規(guī)定，故依法提起申請(qǐng)。