本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種藥物組合物及其制備方法，具體涉及該藥物組合物在制備抗感染疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著抗生素的廣泛應(yīng)用及其濫用，越來越多的細菌對抗生素藥物出現(xiàn)了不敏感現(xiàn)象，甚至是產(chǎn)生了嚴重的耐藥性。盡管科學(xué)家不斷研究制造抗菌譜更廣、抗菌作用更強的新抗生素，但卻仍然不能控制耐藥菌的產(chǎn)生和發(fā)展。因此，尋找具有抗菌效果的新型藥物迫在眉睫。ausubel實驗室曾利用e.faecalisstrainsmmh594，og1rf，og1rf△fsrb，v583，vs583等感染野生型n2秀麗隱桿線蟲(caenorhabditiselegans，縮寫c.elegans)及glp-4(bn2ts)；sek-1(km4)突變株系線蟲對6000種合成藥及1136種天然提取藥進行抗感染藥效的篩選，并成功篩選出16種具有高抗感染活性的藥物。楊再昌等在ausubel的實驗基礎(chǔ)上，利用c.elegans作為模型評估了黃連中藥的體內(nèi)抗感染活性，發(fā)現(xiàn)中草藥黃連具有體內(nèi)抗感染作用，而黃連已在感染小鼠實驗中證明具有較好的抗感染效果。因此，秀麗隱桿線蟲感染模型能夠?qū)哂锌垢腥咀饔玫乃幬镞M行有效的篩選。本發(fā)明公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括生黃芪，當歸，肉桂，該藥物組合物具有明顯的體內(nèi)抗感染作用，而且毒副作用低。因此本發(fā)明所提供的藥物組合物適合在制備抗感染疾病的藥物中應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物，按重量份，所述生黃芪為0.125-10份，當歸為0.0625-5份，肉桂為0.0375-3份。優(yōu)選地，所述的生黃芪為0.125g，當歸為0.0625g，肉桂為0.0375g。優(yōu)選地，所述的生黃芪為10g，當歸為5g，肉桂為3g。其中，所述的藥物組合物的制備方法如下：a、按比例稱取藥材生黃芪，當歸，肉桂，加蒸餾水，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加與a等體積蒸餾水，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無菌濾頭過濾除菌即得。其中，所述的藥物組合物的生藥濃度為4.5-36g/l。本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。其中，所述的感染是由糞腸球菌或銅綠假單胞菌引起的。另外，本發(fā)明還提供了一種制備上述所述的藥物組合物的制備方法，所述的藥物組合物的制備方法如下：a、按比例稱取藥材生黃芪，當歸，肉桂，加蒸餾水，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加與a等體積蒸餾水，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無菌濾頭過濾除菌即得。附圖說明圖1為不同濃度藥物組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型的壽命影響的藥效比較。圖2為不同濃度藥物組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命的半數(shù)致死時間影響的藥效比較。圖3為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方單味藥對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型的壽命影響的藥效比較。圖4為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方單味藥對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命的半數(shù)致死時間影響的藥效比較。圖5為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型的壽命影響的藥效比較。圖6為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-e.faecalisog1rf感染模型壽命的半數(shù)致死時間影響的藥效比較。圖7為40倍稀釋的藥物組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-p.aeruginosa感染模型的壽命影響的藥效比較。圖8為40倍稀釋的藥物組合物對秀麗隱桿線蟲ss104-p.aeruginosa感染模型壽命的半數(shù)致死時間影響的藥效比較。圖9為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的配方1對秀麗隱桿線蟲n2壽命影響的藥效比較。圖10為40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的配方1對秀麗隱桿線蟲n2壽命的半數(shù)致死時間影響的藥效比較。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述實施例。實施例一藥物組合物的制備材料：生黃芪、當歸和肉桂購買于蘭州惠仁堂藥業(yè)連鎖有限責任公司。本發(fā)明的藥物組合物包括生黃芪10g，當歸5g，肉桂3g。制備方法：所述的藥物組合物的制備方法如下：a、稱取藥材生黃芪10g，當歸5g，肉桂3g，加蒸餾水150ml，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加蒸餾水150ml，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容至50ml；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無菌濾頭過濾除菌即得。實施例二藥物組合物的體外抑菌作用1、生物材料(1)埃希氏菌屬大腸桿菌op50(e.coliop50)，購自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)。(2)金黃色葡萄球菌staphylococcusaureusatcc29213(s.aureusatcc29213)，購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號29213。(3)銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853(p.aeruginosaatcc27853)購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號27853。(4)糞腸球菌enterococcusfaecalisatcc29212(e.faecalisatcc29212)購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號29212。(5)白色念珠菌canidiaalbicansatcc10231(c.albicansatcc10231)購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號10231。2、試劑(1)藥物：實施例一制備得到的藥物組合物水煎液。(2)固體bhi(brainheartinfusion)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)(bhi培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司)：成分含量bhi38.50g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體bhi培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(3)固體lb(lysogenybroth)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量蛋白胨10.00g酵母粉5.00gnacl10.00g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體lb培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(4)固體mh(mueller-hinton)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量牛肉浸膏6.00g可溶性淀粉1.50g酸水解酪蛋白17.50g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體mh培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(5)固體改良馬丁培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：固體改良馬丁培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(6)固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量蛋白胨10.00g牛肉浸膏3.00gnacl5.00g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。3、儀器高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)漩渦攪拌器(上海精科儀器有限公司)離心機(ct15e，日立)4、實施步驟(1)菌液培養(yǎng)：取20μls.aureus的菌液在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μlp.aeruginosa的菌液在lb固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μle.coli的菌液在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μle.faecalisatcc29212的菌液在bhi固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃培養(yǎng)48h。挑單克隆于150mlbhi液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。取20μlc.albicans的菌液在改良的馬丁固體培養(yǎng)基上劃單克隆，37℃下培養(yǎng)48h。挑單克隆于150ml馬丁液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基混濁。4℃冷藏，備用。(2)牛津杯法體外抑菌實驗設(shè)置陰性對照組(無菌蒸餾水)，陽性對照組(0.125g/l左氧氟沙星或100μg/ml制霉素)，藥物組合物水煎液實驗組。采用麥氏比濁法用相應(yīng)菌的液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至0.5(即細菌數(shù)在1.5×108/ml，見表1)。在mh固體培養(yǎng)基板上，涂布200μl菌液，其中菌液包括：s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalisatcc29212(每個菌株設(shè)置2～3個平行)。而在馬丁固體培養(yǎng)基上涂布200μlc.albicans菌液，同樣設(shè)置2～3個平行。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，在各個培養(yǎng)基上各放置三個牛津杯，s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalisatcc29212組的菌板分別加入200μl無菌蒸餾水、200μl0.125g/l左氧氟沙星、200μl藥物組合物水煎液。c.albicans組的菌板分別加入200μl無菌蒸餾水、200μl100μg/ml制霉素、200μl藥物組合物水煎液。放入37℃恒溫箱培養(yǎng)，12h后進行觀察。若12h后出現(xiàn)明顯的抑菌圈，取出s.aureus、p.aeruginosa、e.coli、e.faecalis、c.albicans的各培養(yǎng)基，測量抑菌圈直徑(mm)。當抑菌圈直徑d≥20mm時定為極敏，記作“+++”；當抑菌圈直徑15≤d＜20mm時定為高敏，記作“++”；當抑菌圈直徑10≤d＜15mm時定為中敏，記作“+”；當抑菌圈直徑d＜10mm時定為低敏或無效，記作“－”。結(jié)果見表2。表1麥氏比濁法濁度bacl2(1.175％，g/l)h2so4(1％，v/v)細菌數(shù)×108/ml0.50.5ml99.5ml1.511.0ml99.0ml3.0表2藥物組合物水煎液的體外抑菌結(jié)果表2中陰性對照組為無菌蒸餾水，陽性對照組為0.125g/l左氧氟沙星(可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌生長)或100μg/ml制霉素(可抑制白色念珠菌生長)，實驗組為藥物組合物水煎液。表2中所展示的是陰性對照組、陽性對照組及藥物組合物水煎液抑菌圈直徑的測量數(shù)值。從結(jié)果中可以看出，本發(fā)明所公開的藥物組合物水煎液在該濃度下對五種供試菌均無直接抑制生長作用，說明本發(fā)明所公開的藥物組合物水煎液在該濃度下無體外抑菌效果。實施例三藥物組合物水煎液及其拆方的體內(nèi)抗感染作用與毒副作用1、生物材料(1)c.elegansss104購自caenorhabditisgeneticscenter；基因型為glp-4(bn2)i，在溫度為20℃的恒溫箱里能正常生長，并繁殖后代，在溫度為25℃的恒溫箱里生長可誘導(dǎo)不育。(2)c.elegansn2購自caenorhabditisgeneticscenter；為野生型，在溫度為20℃的恒溫箱里能正常生長，并繁殖后代。(3)埃希氏菌屬大腸桿菌op50(e.coliop50)，購自caenorhabditisgeneticscenter，作為秀麗隱桿線蟲的食物。(4)糞腸球菌enterococcusfaecalisog1rf(e.faecalisog1rf)購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號47077。(5)銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853(p.aeruginosaatcc27853)購自美國菌種保藏中心(atcc)，編號27853。2、試劑(1)藥物：實施例一制備得到的藥物組合物水煎液；拆方生黃芪；拆方當歸；拆方肉桂；拆方組合物生黃芪和當歸；拆方組合物生黃芪和肉桂；拆方組合物當歸和肉桂。生黃芪：稱取生黃芪10g；當歸：稱取當歸5g；肉桂：稱取肉桂3g；配方1：生黃芪和當歸，稱取生黃芪10g，當歸5g；配方2：生黃芪和肉桂，稱取生黃芪10g，肉桂3g；配方3：當歸和肉桂，稱取當歸5g，肉桂3g；制備方法如下：a、按配方比例稱取藥材，加蒸餾水150ml，浸泡20min，煮沸30min；b、停止加熱，冷卻后，濾出即得第一次煎煮液；c、將b所得藥渣加蒸餾水150ml，煮沸30min；d、停止加熱，冷卻后，濾出即得第二次煎煮液；e、合并b、d所得煎煮液，定容至50ml；f、將e所得煎煮液在12000rpm，10min條件下離心2次，沉淀藥渣，留取上清液；g、將f所得上清液用0.22μm的無菌濾頭過濾除菌即得。(2)固體ngm(nematodegrowthmedium)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨2.50g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體ngm培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，在無菌操作臺下加入5g/l膽固醇1ml，1mmgso41ml，1mcacl21ml，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(3)固體bhi(brainheartinfusion)培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)(bhi培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司)：成分含量bhi38.50g瓊脂粉17.00g補充h2o至1000ml固體bhi培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(4)改良ngm培養(yǎng)基成分與制作(以1升為例)：改良ngm培養(yǎng)基配制好后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，在無菌操作臺下加入5g/l膽固醇1ml，1mmgso41ml，1mcacl21ml，搖勻，趁熱倒入已滅菌培養(yǎng)皿。靜置等待培養(yǎng)基凝固，備用。(5)m液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml補充h2o至1000ml配制好m液之后，121℃下高壓恒溫滅菌20min，待其冷卻，置于室溫下，備用。(6)秀麗隱桿線蟲裂解液的配制取0.32ml的naclo液體溶于4.68ml的m液，再加入5ml1m的naoh溶液，即為秀麗隱桿線蟲裂解液。(7)配制不含藥物的bhi培養(yǎng)基吸取3ml無菌蒸餾水，溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基中，再把培養(yǎng)基均分至10個35mm的培養(yǎng)皿中。(8)配制含有不同濃度藥物組合物水煎液的bhi培養(yǎng)基吸取3ml的藥物組合物水煎液溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為10倍稀釋的含藥培養(yǎng)基；吸取4ml的藥物組合物水煎液溶于4ml的無菌蒸餾水，記為液體1，吸取3ml液體1溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為20倍稀釋的含藥培養(yǎng)基；吸取4ml的液體1溶于4ml的無菌蒸餾水，記為液體2，吸取3ml液體2溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為40倍稀釋的含藥培養(yǎng)基；吸取4ml的液體2溶于4ml的無菌蒸餾水，記為液體3，吸取3ml液體3溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為80倍稀釋的含藥培養(yǎng)基。以此方法得到生藥濃度為36g/l、18g/l、9g/l、4.5g/l的10倍稀釋的藥物組合物、20倍稀釋的藥物組合物、40倍稀釋的藥物組合物、80倍稀釋的藥物組合物。將含不同濃度藥物組合物的培養(yǎng)基均分至10個35mm的培養(yǎng)皿中。(9)配制含有不同藥物組別水煎液的bhi培養(yǎng)基分別吸取1ml的不同藥物組別水煎液溶于1ml的無菌蒸餾水，記為液體1，分別吸取2ml的液體1溶于2ml的無菌蒸餾水，記為液體2，分別吸取3ml液體2溶于27ml滅菌之后的bhi培養(yǎng)基，即為40倍稀釋的不同藥物組別水煎液。將含40倍稀釋的不同藥物組別水煎液的培養(yǎng)基均分至10個35mm的培養(yǎng)皿中。(10)配制不含藥物水煎液的改良ngm培養(yǎng)基吸取3ml無菌蒸餾水，溶于27ml滅菌之后的改良ngm培養(yǎng)基中，把培養(yǎng)基均分至10個35mm的培養(yǎng)皿中。(11)配制含有終濃度為中濃度的藥物組合物水煎液的改良ngm培養(yǎng)基吸取1ml的藥物組合物水煎液溶于1ml的無菌蒸餾水，記為液體1，吸取2ml的液體1溶于2ml的無菌蒸餾水，記為液體2，吸取3ml液體2溶于27ml滅菌之后的改良ngm培養(yǎng)基，即為40倍稀釋的藥物組合物。將含有40倍稀釋的藥物組合物的培養(yǎng)基均分至10個35mm的培養(yǎng)皿中。3、儀器高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)spx智能型生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)漩渦攪拌器(上海精科儀器有限公司)離心機(ct15e，日立)4、實施步驟(1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)：將秀麗隱桿線蟲接在涂布有200μle.coliop50的固體ngm培養(yǎng)基上，然后置于20℃的恒溫箱中培養(yǎng)，秀麗隱桿線蟲長到成蟲階段開始產(chǎn)卵，當固體ngm培養(yǎng)基表面的卵數(shù)與幼蟲數(shù)比例大約1:1時，進行同步化處理。(2)秀麗隱桿線蟲同步化：挑選含有大量成蟲并且有部分蟲卵已經(jīng)孵出的ngm培養(yǎng)基，用m液將秀麗隱桿線蟲從培養(yǎng)基上沖下，轉(zhuǎn)移到離心管中，靜置使秀麗隱桿線蟲自由沉降至管底，棄上清。根據(jù)秀麗隱桿線蟲的數(shù)量向離心管中加入秀麗隱桿線蟲裂解液，在漩禍攪拌器上振蕩5-7min待秀麗隱桿線蟲全部斷裂時停止渦旋，并分裝于1.5ml離心管中，用m液洗蟲卵三次，然后把秀麗隱桿線蟲的卵直接加到涂有op50的含有藥物的ngm培養(yǎng)基上。(一)不同濃度的藥物組合物水煎液的體內(nèi)抗糞腸球菌感染作用同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長到l4期時，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有e.faecalisog1rf固體bhi培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被糞腸球菌感染的c.elegansss104挑至涂布有e.faecalisog1rf不含藥物的直徑35mm的bhi培養(yǎng)基(空白對照組)及各涂布有e.faecalisog1rf含有不同濃度藥物組合物的bhi培養(yǎng)基(實驗組)上，每個處理設(shè)置3個平行，每個平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進行統(tǒng)計各對照組及實驗組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖1、2中10倍稀釋藥物組合物、20倍稀釋藥物組合物、40倍稀釋藥物組合物、80倍稀釋藥物組合物分別代表生藥量為36g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為18g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為9g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為4.5g/l的藥物組合物水煎液。空白對照組是無菌蒸餾水。圖1的縱坐標表示感染狀態(tài)下不同濃度藥物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個時間點，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長糞腸球菌感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強，由圖1可以看出，在每個時間點，40倍稀釋藥物組合物處理的c.elegansss104存活數(shù)都最大，且從圖2(圖中a、b、c、d表示各組之間的差異顯著性，相同標記之間沒有顯著性差異)中的半數(shù)致死時間可以看出，10、20、40倍稀釋藥物組合物與其它組別均具有顯著的差異，其中40倍具有極顯著差異，說明其在延長糞腸球菌感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命均有明顯作用，即均具有較好的體內(nèi)抗感染效果。其中40倍稀釋的藥物組合物效果最佳。(二)40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方單味藥對糞腸球菌的體內(nèi)抗感染作用同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長到l4期時，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有e.faecalisog1rf固體bhi培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被e.faecalisog1rf感染的c.elegansss104挑至涂布有e.faecalisog1rf不含藥物的直徑35mm的bhi培養(yǎng)基(空白對照組)及各涂布有e.faecalisog1rf含有40倍稀釋的不同藥物的bhi培養(yǎng)基(實驗組)上，每個處理設(shè)置3個平行，每個平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進行統(tǒng)計各對照組及實驗組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖3、4中40倍稀釋藥物組合物、40倍稀釋生黃芪、40倍稀釋當歸、40倍稀釋肉桂分別代表生藥量為9g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為5g/l的拆方生黃芪水煎液，生藥量為2.5g/l的拆方當歸水煎液，生藥量為1.5g/l的拆方肉桂水煎液?？瞻讓φ战M代表無菌蒸餾水。圖3的縱坐標表示感染狀態(tài)下40倍稀釋的不同藥物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個時間點，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長e.faecalis感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強，由圖3可以看出，在每個時間點，40倍稀釋藥物組合物處理的c.elegansss104存活數(shù)都最大，且從圖4(圖中a、b表示各組之間的差異顯著性，相同標記之間沒有顯著性差異)中的半數(shù)致死時間可以看出，40倍稀釋藥物組合物與其它組別均具有極顯著的差異，說明其在延長e.faecalis感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命有明顯作用，即說明40倍稀釋藥物組合物相比各拆方單味藥具有更優(yōu)的體內(nèi)抗感染效果。(三)40倍稀釋的藥物組合物及其同倍稀釋的拆方組合物對糞腸球菌的體內(nèi)抗感染作用同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長到l4期時，用m液沖洗下c.elegansss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有e.faecalisog1rf固體bhi培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被e.faecalisog1rf感染的c.elegansss104挑至涂布有e.faecalisog1rf不含藥物的直徑35mm的bhi培養(yǎng)基(空白對照組)及各涂布有e.faecalisog1rf含有中濃度的不同藥物組合物的bhi培養(yǎng)基(實驗組)上，每個處理設(shè)置3個平行，每個平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進行統(tǒng)計各對照組及實驗組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖5、6中40倍稀釋藥物組合物、配方1、配方2、配方3分別代表生藥量為9g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為7.5g/l的拆方生黃芪與當歸藥物組合物水煎液，生藥量為6.5g/l的拆方生黃芪與肉桂藥物組合物水煎液，生藥量為4g/l的拆方當歸與肉桂藥物組合物水煎液?？瞻讓φ战M代表無菌蒸餾水。圖5的縱坐標表示感染狀態(tài)下40倍稀釋的不同藥物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個時間點，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長e.faecalis感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強，由圖5可以看出，在每個時間點，40倍稀釋藥物組合物及配方1處理的c.elegansss104存活數(shù)無顯著差異，效果均很好，且從圖6(圖中a、b、c表示各組之間的差異顯著性，相同標記之間沒有顯著性差異)中的半數(shù)致死時間可以看出，40倍稀釋藥物組合物及配方1與其它組別均具有極顯著的差異，說明其在延長e.faecalis感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命有明顯作用，即說明40倍稀釋藥物組合物與配方1均具有較好的抗感染效果。(四)40倍稀釋的藥物組合物對銅綠假單胞菌的體內(nèi)抗感染作用為了觀察藥物組合物除了能體內(nèi)抗革蘭氏陽性菌糞腸球菌外，是否還能抗革蘭氏陰性菌，因此選擇銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)進行了探究。同步化后的c.elegansss10425℃恒溫箱內(nèi)生長到l4期時，用m液沖洗下秀麗隱桿線蟲ss104，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansss104接到涂布有p.aeruginosa固體改良ngm培養(yǎng)基上，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將被銅綠假單胞菌感染的c.elegansss104挑至涂布有p.aeruginosa不含藥物的直徑35mm的改良ngm培養(yǎng)基(空白對照組)及涂布有p.aeruginosa含有40倍稀釋藥物組合物的改良ngm培養(yǎng)基(實驗組)上，處理設(shè)置3個平行，每個平行35條c.elegansss104，于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進行統(tǒng)計各對照組及實驗組c.elegansss104的死活數(shù)，直到全部c.elegansss104死亡。圖7、8中40倍稀釋藥物組合物代表生藥量為9g/l的藥物組合物水煎液。空白對照組表示無菌蒸餾水。圖7的縱坐標表示感染狀態(tài)下40倍稀釋藥物組合物處理的c.elegansss104的生存比例，在同一個時間點，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansss104數(shù)量越多，即藥物延長p.aeruginosa感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命的作用越強，在每個時間點，40倍稀釋藥物組合物處理的c.elegansss104存活數(shù)都比對照組的大，且從圖8(圖中a、b表示各組之間的差異顯著性，相同標記之間沒有顯著性差異)的半數(shù)致死時間可以清晰地看出，40倍稀釋藥物組合物與對照組具有極顯著的差異，說明其在延長p.aeruginosa感染狀態(tài)下c.elegansss104的壽命有明顯作用，即說明40倍稀釋藥物組合物具有較好的體內(nèi)抗感染效果。(五)40倍稀釋的藥物組合物及同濃度的配方1藥物組合物的毒副作用因為40倍稀釋藥物組合物與配方1均具有很好的體內(nèi)抗感染效果，考慮到藥物可能存在毒副作用，影響正常機體。因此進行了毒性評價試驗，以此來評價二者的毒副作用。同步化后的c.elegansn220℃恒溫箱內(nèi)生長到l4期時，用m液沖洗下c.elegansn2，收集在1.5ml離心管中，渦旋5s，1500rpm2min離心，重復(fù)操作兩次。將沖洗干凈的c.elegansn2接到涂布有e.coliop50固體ngm培養(yǎng)基上，于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h之后，將c.elegansn2挑至涂布有e.coliop50不含藥物的直徑35mm的ngm培養(yǎng)基(空白對照組)及各涂布有e.coliop50含有中濃度的不同藥物組合物的ngm培養(yǎng)基(實驗組)上，每個處理設(shè)置3個平行，每個平行35條c.elegansn2，于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h進行統(tǒng)計各對照組及實驗組c.elegansn2的死活數(shù)，直到全部c.elegansn2死亡。圖9、10中40倍稀釋藥物組合物、配方1分別代表生藥量為9g/l的藥物組合物水煎液，生藥量為7.5g/l的拆方生黃芪與當歸藥物組合物水煎液?？瞻讓φ战M代表無菌蒸餾水。圖9的縱坐標表示40倍稀釋的不同藥物組合物處理的c.elegansn2的生存比例，在同一個時間點，此值越大，表明該處理組中存活的c.elegansn2數(shù)量越多，即藥物的毒副作用越低。圖9壽命結(jié)果及圖10(圖中a、b表示各組之間的差異顯著性，相同標記之間沒有顯著性差異)半數(shù)致死時間的結(jié)果表明，40倍稀釋藥物組合能顯著改善c.elegansn2的生活狀態(tài)，延長線蟲的壽命；而配方1藥物組合物與空白對照組之間無顯著性差異，說明配方1藥物組合物對線蟲的生長無毒副作用。綜合實驗結(jié)果表明，40倍稀釋藥物組合物與配方1均具有很好的抗感染效果，且毒副作用低，但考慮到40倍稀釋藥物組合物不僅毒副作用低，同時還能顯著改善正常線蟲生活狀態(tài)，因此認為40倍稀釋藥物組合物較其拆方配方1具有更好的利用價值。本發(fā)明提供的藥物組合物在體外無抑菌效果的濃度下，不僅對革蘭氏陽性菌感染疾病有治療作用，同時對革蘭氏陰性菌感染疾病同樣有治療作用，說明本發(fā)明所提供的藥物組合物具有很好的體內(nèi)抗感染效果。同時，本發(fā)明提供的藥物組合物毒副作用低，且較其拆方具有更好的利用價值。綜上所述，本發(fā)明提供的藥物組合物可在制備治療感染疾病的藥物中應(yīng)用。當前第1頁12