本發(fā)明涉及中藥產(chǎn)地加工和炮制領(lǐng)域，首次提出制何首烏的產(chǎn)地加工炮制一體化的新方法。

背景技術(shù)：

制何首烏自唐代記載其應(yīng)用以來(lái)，在我國(guó)有一千多年的藥用歷史。本品為我國(guó)的大宗藥材，廣泛用于烏發(fā)的“七寶美髯丹”等多種中成藥，其原藥來(lái)源于蓼科植物何首烏的干燥塊根。

何首烏生熟異治，經(jīng)炮制后藥性轉(zhuǎn)變，由清瀉轉(zhuǎn)為補(bǔ)益。生何首烏具有解毒、消癰，截瘧，潤(rùn)腸通便的功效，用于治療瘰疬癰瘡，風(fēng)疹瘙癢，久瘧體虛，腸燥便秘等。制何首烏為滋補(bǔ)藥，具有滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)肝益血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的功能，用于治療血虛萎黃，眩暈耳鳴，須發(fā)早白，腰膝酸軟，肢體麻木，崩漏帶下，久瘧體虛；在治療高脂血癥的同時(shí)消除了生何首烏滑腸致瀉的副作用，慢性病人長(zhǎng)期服用而不腹瀉(中國(guó)藥典2015版，176-177；中華本草·第二冊(cè)(第六卷)1816～1817)。

何首烏的炮制品應(yīng)用歷史悠久，唐代就出現(xiàn)了黑豆蒸制、黑豆酒煮、醋煮、水煮熟等炮制方法(唐·《仙授理傷續(xù)斷秘方》)，宋代炮制方法有較大的發(fā)展，除沿用唐代的黑豆制法外，增加了單蒸制、米泔浸后九蒸九暴、麩炒制、酒炒制等炮制方法，并加用生姜、甘草、牛膝等作為炮制輔料。炮制程度多為九蒸九曬、豆熟為度或豆?fàn)€為度。所用的制藥工具提出忌鐵器的要求。明清之后增加了乳拌蒸的方法。其現(xiàn)代炮制方法有黑豆汁蒸、黑豆汁燉、清蒸、黑豆汁高壓蒸和黑豆汁屜上蒸等多種方法。中國(guó)藥典2015版和全國(guó)中藥炮制規(guī)范均收載了黑豆汁蒸或者燉的方法，目前我國(guó)大部分地區(qū)炮制規(guī)范中均采用黑豆汁蒸或者隔水燉的方法。

何首烏傳統(tǒng)炮制方法操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，能源消耗大，因此尋找安全等效的炮制方法一直是研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外何首烏炮制與產(chǎn)地加工的分開，也導(dǎo)致了多方面的不良影響。首先是二次加工過(guò)程中有效成分的流失嚴(yán)重。由于何首烏的產(chǎn)地加工方法為秋冬二季葉枯萎時(shí)采挖，削去兩端，洗凈，個(gè)大的切成塊，干燥；生何首烏片的炮制方法為除去雜質(zhì)，洗凈，稍浸，潤(rùn)透，切厚片或塊，干燥；何首烏在產(chǎn)地加工過(guò)程中有個(gè)藥、切片和切塊等，且片和塊的規(guī)格各地均不一致，致使產(chǎn)地加工后的藥材無(wú)法直接進(jìn)行炮制，需要進(jìn)行再處理，再處理過(guò)程中，往往采用長(zhǎng)時(shí)間泡、潤(rùn)等水處理方法進(jìn)行軟化后切制，而本品質(zhì)地堅(jiān)硬，有效成分水溶性強(qiáng)，經(jīng)過(guò)這些洗、泡、潤(rùn)等水處理過(guò)程之后，大量有效成分流失。其次在于二次污染，由于在洗、泡、潤(rùn)的過(guò)程中，本品富含淀粉，極易造成霉變，且易被微生物再次污染，造成產(chǎn)品變質(zhì)、微生物超標(biāo)等多方面不良影響，導(dǎo)致飲片質(zhì)量的不可控性。第三由于二次加工，造成生產(chǎn)成本的增高。

針對(duì)產(chǎn)地加工和炮制分開導(dǎo)致的二次加工過(guò)程中成分流失、存在的二次污染以及生產(chǎn)成本增高，以及傳統(tǒng)炮制方法的繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，本發(fā)明所提出的何首烏產(chǎn)地加工炮制一體化方法中，對(duì)涉及的工藝和評(píng)價(jià)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在最大程度上保證該飲片的質(zhì)量，為推動(dòng)該飲片的產(chǎn)地加工炮制一體化體系框架的建設(shè)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種制何首烏產(chǎn)地加工炮制一體化新方法。

為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明首次提供了一種將何首烏產(chǎn)地加工和炮制結(jié)合在一起的方法，并同時(shí)比較了一體化方法中常壓炮制與加壓炮制的優(yōu)劣，具體步驟為：

(1)常壓炮制一體化方法

取新鮮何首烏，含水量約為37％～54％，快速洗滌后，略晾，切去兩端，削去皮，切成1cm厚度的塊，曬至、晾至或80℃烘至含水量約為20％，置非鐵質(zhì)容器內(nèi)，然后加入黑豆汁，拌勻，待其吸盡黑豆汁，常壓隔水燉32小時(shí)，取出，干燥。

(2)加壓炮制一體化方法

取新鮮何首烏，含水量約為37％～54％，快速洗滌后，略晾，切去兩端，削去皮，切成1cm厚度的塊，曬至、晾至或80℃烘至含水量約為20％，置非鐵質(zhì)容器內(nèi)，然后加入黑豆汁，拌勻，待其吸盡黑豆汁，加壓隔水燉8小時(shí)，取出，干燥。

以上2個(gè)方法中，所用何首烏均為新鮮采集品，來(lái)源于蓼科植物何首烏polygonummultiflorumthurb.的塊根。

新鮮何首烏含水量約為37％～54％，快速洗滌后，略晾，切去兩端，削去皮，切成1cm厚度的塊，曬至，晾至或80℃烘至含水量約為20％。置非鐵質(zhì)容器內(nèi)，加入黑豆汁拌勻后，待黑豆汁吸盡。

黑豆汁的制備方法為：取黑豆1kg加水適量，首次煎煮約4小時(shí)，紗布濾過(guò)，得黑豆汁約1.5kg，豆渣加水再次煎煮約3h，紗布濾過(guò)，得黑豆汁約1kg，合并兩次黑豆汁約2.5kg。

加壓炮制過(guò)程中溫度和壓力為：120℃，0.1mpa，炮制時(shí)間為8小時(shí)，可以一次達(dá)到炮制8小時(shí)或者間斷炮制、時(shí)間累計(jì)達(dá)到8小時(shí)。

制首烏的干燥方法為：曬干、置通風(fēng)處晾干或者80℃鼓風(fēng)干燥。

本發(fā)明的加壓炮制及常壓炮制一體化方法所得到的飲片相對(duì)生何首烏而言，與對(duì)照組比較，各炮制品均未見(jiàn)肝臟毒性，其中加壓炮制一體化方法所得飲片的抗氧化效果略優(yōu)于常壓炮制一體化方法所得的飲片，且節(jié)省了炮制時(shí)間，提高了工作效率，因此，我們最后確定加壓炮制一體化方法為最優(yōu)方法。

附圖說(shuō)明

圖1常壓炮制何首烏指紋圖譜(0-25min)

圖2加壓炮制何首烏指紋圖譜(0-25min)

具體實(shí)施方法

通過(guò)考察以下兩種工藝確定了本發(fā)明專利的方法。

一個(gè)是采用產(chǎn)地加工與常壓炮制一體化方法制備制何首烏；另一個(gè)是產(chǎn)地加工與加壓炮制一體化方法。

為了比較不同炮制時(shí)間對(duì)這兩個(gè)工藝的影響，我們分別在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，以化學(xué)指標(biāo)和毒理藥理指標(biāo)為參考依據(jù)，其中化學(xué)指標(biāo)有主成分含量測(cè)定和指紋圖譜分析；毒理指標(biāo)有肝毒性試驗(yàn)；藥理指標(biāo)觀察大鼠腦組織勻漿中mda含量和sod活力。化學(xué)指標(biāo)的取樣時(shí)間點(diǎn)：傳統(tǒng)炮制工藝選擇常壓隔水燉的方法，選擇1小時(shí)至36小時(shí)，間隔1小時(shí)取樣，共得到36份常壓炮制樣品；加壓炮制工藝選擇120℃，壓力0.1mpa的加壓炮制方法，選擇0.5小時(shí)至10.5小時(shí)，間隔0.5小時(shí)取樣，共得到21份加壓炮制樣品。毒理藥理指標(biāo)觀測(cè)樣本為：何首烏生品、常壓炮制4h、12h、24h、32h和加壓炮制8h，每個(gè)樣本均包括高劑量和低劑量，共12個(gè)受試樣品。

一、主要有效成分含量的變化

1多糖類成分

有報(bào)道何首烏多糖類成分可顯著提高模型小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，清除氧自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，為何首烏抗衰老的有效成分。(徐愛(ài)霞，張振明，葛斌，等.何首烏多糖對(duì)氧自由基及抗氧化酶活性的作用研究.中國(guó)藥師，2005，8(11)：900-902)何首烏多糖可以顯著增強(qiáng)環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致的小鼠免疫功能低下。(葛朝亮，劉穎.何首烏多糖對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫保護(hù)作用.中國(guó)新藥雜志，2007，16(24))。何首烏多糖不僅可提高衰老小鼠的免疫功能，也可促進(jìn)衰老小鼠神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育，因此何首烏多糖是其補(bǔ)益、強(qiáng)壯、抗衰老的活性成分之一。(苗明三.何首烏多糖對(duì)衰老模型小鼠組織的影響.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2001，8(增刊)：40)

1.1儀器與試藥：

t6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、cx-250超聲清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

d-葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：110833-200904)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定。

0.5％硫酸蒽酮試液：準(zhǔn)確稱取蒽酮0.5g，加入蒸餾水25ml，緩慢加入98％濃硫酸75ml，邊加邊攪拌，直至蒽酮溶解，冷卻至室溫后使用(臨用新配)。

1.2方法

(1)對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的d-葡萄糖對(duì)照品57.72mg，用少量蒸餾水溶解，定容至100ml容量瓶中，配制成濃度為0.58mg·ml^-1的對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備a液：取何首烏樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.1g，精密稱定，精密加入80％乙醇50ml，準(zhǔn)確稱重，回流1h，待其冷卻至室溫，再次稱重，用80％乙醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，精密量取濾液4.0ml，揮干乙醇，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?0ml量瓶中，搖勻，即得。

b液：取何首烏粉末(過(guò)4號(hào)篩)0.1g，精密稱定，精密加入水50ml，準(zhǔn)確稱重，回流1h，待其冷卻至室溫，稱重，水補(bǔ)足減少的重量，離心(4600r/min)，精密量取上清液2.0ml，置10ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

(3)最大吸收波長(zhǎng)的確定精密量取d-葡萄糖對(duì)照品溶液0.5ml，置10ml具塞刻度試管中，精密加水0.5ml；精密量取a、b液各1.0ml，分別置于10ml刻度試管中，加入0.5％硫酸蒽酮溶液4.0ml，搖勻，冰浴冷卻5分鐘后，取出，90℃恒溫水浴加熱15min，冷卻10min，于400nm～800nm波長(zhǎng)之間進(jìn)行掃描。各樣品均在627±1nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇627nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取d-葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分別置于10ml具塞刻度試管中，各加蒸餾水至1.0ml，準(zhǔn)確加入硫酸蒽酮溶液4.0ml，搖勻，冰浴冷卻5分鐘后，取出，90℃恒溫水浴加熱15min，冷卻10min，于627nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度(a)為縱坐標(biāo)，以濃度(c)為橫坐標(biāo)計(jì)算回歸方程為y＝0.0355x+0.0561，r＝0.9991。表明葡萄糖濃度在11.5-69.3μg·ml^-1的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

(5)樣品測(cè)定方法

取各樣品，照(2)項(xiàng)下的方法分別制備a液和b液，分別精密吸取1.0ml，置于10ml具塞刻度試管中，加蒸餾水至1.0ml，準(zhǔn)確加入硫酸蒽酮溶液4.0ml，搖勻，冰浴冷卻5分鐘后，取出，90℃恒溫水浴加熱15min，冷卻10min，于627nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。計(jì)算水溶性總糖、單糖-低聚糖含量及多糖含量，多糖含量＝水溶性總糖含量-(單糖-低聚糖)含量(mg·g^-1)。

1.3測(cè)定結(jié)果

各部位中無(wú)論是總糖、多糖或者單糖低聚糖，含量從高到低均為：塊(片)＞皮＞兩端。

常壓炮制一體化過(guò)程中，總糖和多糖含量在24小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)，并在24小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，之后維持該水平，而當(dāng)炮制時(shí)間超過(guò)32小時(shí)，總糖、單糖、低聚糖、多糖均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，因此，我們選擇了32小時(shí)為常壓炮制的最優(yōu)時(shí)間。

加壓炮制一體化過(guò)程中，單糖、低聚糖含量先升高后下降，而總糖和多糖的含量隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，在8小時(shí)的時(shí)候達(dá)到最大值，之后總糖和多糖含量較為穩(wěn)定，因此加壓8小時(shí)為加壓炮制最佳時(shí)間。

對(duì)比常壓炮制和加壓炮制結(jié)果，發(fā)現(xiàn)加壓炮制8小時(shí)多糖含量約為常壓炮制24小時(shí)的兩倍，總糖含量也顯著高于常壓24小時(shí)。由于多糖類成分是何首烏滋補(bǔ)作用的有效成分，因此，加壓炮制顯著優(yōu)于常壓炮制。

2蒽醌類成分含量的變化

2.1儀器與試藥

lc-20a型液相色譜儀(島津國(guó)際貿(mào)易有限公司，dgu-20a5，lc-20at，sil-20a，spd-m20a，cto-20a)。cx-250超聲清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110756-200110)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用。大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：04-2011)，購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，供含量測(cè)定用。

甲醇、乙腈均為色譜純(fisher公司)，水為純凈水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

(1)色譜條件

色譜柱為kromasilc18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇-0.1％磷酸溶液(80∶20)；流速0.8ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

(2)對(duì)照品溶液的制備

取大黃素對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1ml含大黃素80μg，大黃素甲醚40μg的溶液，即得。

(3)供試品溶液的制備：

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5ml作為供試品溶液a(測(cè)游離蒽醌用)。另精密量取續(xù)濾液25ml，置具塞錐形瓶中，揮去溶劑，精密加8％的鹽酸溶液20ml，超聲處理(功率100w，頻率40khz)5分鐘，加三氯甲烷20ml，加熱回流1小時(shí)，取出，冷卻，置分液漏斗中，用少量的三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，取酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次15ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状?0ml，稱定重量，回流30分鐘，放置，待其冷卻至室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液b(測(cè)總蒽醌用)。

(4)樣品測(cè)定：

分別精密吸取對(duì)照品溶液與上述兩種供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

結(jié)合蒽醌含量＝總蒽醌含量-游離蒽醌含量。

2.3測(cè)定結(jié)果

生何首烏的兩端與塊片中游離蒽醌、總蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量接近，無(wú)顯著性差別，而而皮中三種成分含量均較低。

常壓炮制一體化過(guò)程中(1小時(shí)～36小時(shí))，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，總蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量略有下降。至24小時(shí)總蒽醌、游離蒽醌和結(jié)合蒽醌含量的含量均降至最低值0.195％，0.145％，0.05％。24小時(shí)之后，三者含量略有上升，至32小時(shí)降至0.194％，0.143％，0.051％。因此我們選擇32小時(shí)為常壓炮制一體化的最佳時(shí)間。

加壓炮制一體化條件下，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，總蒽醌、游離蒽醌的含量大致呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在8小時(shí)均降至最低點(diǎn)，二者的含量依次為0.191％，0.179％；而結(jié)合蒽醌含量呈現(xiàn)比較明顯的下降趨勢(shì)，且下降幅度大于常壓，在8小時(shí)時(shí)含量最低，為0.012％。在8小時(shí)后，含量均略有升高。因此我們選擇8小時(shí)為加壓炮制一體化的最佳時(shí)間。

現(xiàn)代研究認(rèn)為結(jié)合蒽醌是何首烏瀉下作用的主要藥效成分，加壓炮制能更有效地降低結(jié)合蒽醌含量，故加壓條件優(yōu)于常壓。

二、指紋圖譜的變化

1儀器與試藥

lc-20a型液相色譜儀(島津國(guó)際貿(mào)易有限公司，dgu-20a5，lc-20at，sil-20a，spd-m20a，cto-20a)。cx-250超聲清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：110844-200908)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定研究院，供含量測(cè)定用。

甲醇、乙腈均為色譜純(fisher公司)，水為純凈水。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件避光操作。色譜柱為kromasilc18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為兩相梯度洗脫，a相為乙腈；b相為0.4％的磷酸水溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋?.01-4.00min，3％a；4.00-15.00min，3％a-20％a；15.00-20.01min，20％a-7％a；20.01-30min，7％a-20％a；30-45min，20％a-60％a；45-60min，60％a-80％a；60-80min，80％a-93％a；80.00-80.01，93％a-3％a；80.01-100.00min，3％a。流速1.2ml·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫：35℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品和大黃酸對(duì)照品各適量，分別精密稱定，分別加稀乙醇或甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4樣品測(cè)定取各樣品按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004a版)處理數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度。

3測(cè)定結(jié)果

指紋圖譜差別主要在極性較強(qiáng)的區(qū)域(0-25min)，該區(qū)域圖譜顯示炮制過(guò)程有新物質(zhì)生成，并且隨炮制時(shí)間峰面積逐步增加，加壓炮制和常壓炮制具有相同的變化趨勢(shì)。

三、肝毒性和抗氧化作用的變化

sd大鼠，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組，何首烏生品16.5、4.125g生藥/kg劑量組、炮制品16.5、4.125g生藥/kg劑量組，連續(xù)灌胃給藥29天后，檢測(cè)血清中alt、ast、alp、ggt、ldh含量的變化，鏡下觀察各給藥組動(dòng)物肝臟的病理改變。結(jié)果顯示各給藥組的上述生化指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，病理鏡下觀察結(jié)果顯示何首烏生品高劑量組與對(duì)照組比較顯示出一定的肝臟毒性，炮制品各劑量組均未發(fā)現(xiàn)明顯的肝毒性。另以sod、mda等指標(biāo)進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明加壓炮制8小時(shí)顯示出一定的抗衰老作用，高、低劑量組均能明顯降低腦組織中mda含量，而其余各給藥組與對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差異。與同等劑量的生品組、常壓炮制4h組比較，加壓炮制8h組其降低腦組織中mda含量的作用明顯增強(qiáng)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1肝毒性試驗(yàn)

1.1受試物

何首烏生品及不同炮制品共6種樣品，每種樣品均采用水煎煮的方法提取，用時(shí)均配制成1.1、0.275g生藥/ml兩個(gè)濃度。受試物包括生高(生品高劑量)，生低(生品低劑量)，炮1高(常壓4h炮制品高劑量)，炮1低(常壓4h炮制品低劑量)，炮2高(常壓12h炮制品高劑量)，炮2低(常壓12h炮制品低劑量)，炮3高(常壓24h炮制品高劑量)，炮3低(常壓24h炮制品低劑量)，炮4高(常壓32h炮制品高劑量)，炮4低(常壓32h炮制品低劑量)，炮5高(加壓8h炮制品高劑量)，炮5低(加壓8h炮制品低劑量)。

1.2動(dòng)物與試劑

sd大鼠(spf級(jí))，雌雄各半，共130只。9周齡大鼠，雄性動(dòng)物體重280-320g，雌性動(dòng)物體重180-220g。均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為scxk(京)2006-0009，發(fā)證單位：北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的材料表明動(dòng)物符合spf/vaf要求。

質(zhì)控血清：randox，北京萬(wàn)泰德瑞診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)552un。試劑盒廠家：北京萬(wàn)泰德瑞診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑盒信息見(jiàn)表1：

表1試劑盒信息

1.3實(shí)驗(yàn)方法

sd大鼠，130只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組，生高，生低，炮1高，炮1低，炮2高，炮2低，炮3高，炮3低，炮4高，炮4低，炮5高，炮5低，共13組。每組均灌胃給藥，給藥體積15ml/kg體重，生品及炮制品的高低劑量分別為16.5，4.125g生藥/kg，連續(xù)給藥29天，1次/日，空白對(duì)照組灌胃給予同體積蒸餾水。末次投予受試物后，禁食16～20h，自由飲水。各組動(dòng)物自腹主動(dòng)脈取血，在室溫下靜置30min，3000轉(zhuǎn)離心15min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、堿性磷酸酶(alp)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(ggt)、乳酸脫氫酶(ldh)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

取肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，4％甲醛(10％福爾馬林)固定，石蠟包埋切片，he(haematoxylin&eosin)染色，作病理檢查，病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

結(jié)果采用spss11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生化指標(biāo)采用單因素方差分析(anova)，病理指標(biāo)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異顯著的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

表2肝臟病變性質(zhì)及程度的診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.1血液生化學(xué)檢查

給藥29天后，各給藥組alt、ast、alp、ggt、ldh各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較均未見(jiàn)明顯升高(表略)。

1.4.2病理學(xué)檢查

給藥29天后，何首烏生藥大劑量(16.5g生藥/kg)組大部分動(dòng)物肝臟出現(xiàn)不同程度的腫脹、變性，個(gè)別動(dòng)物匯管區(qū)小膽管擴(kuò)張、增生，間質(zhì)可見(jiàn)灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較對(duì)照組有明顯差異(p＜0.05)，提示該劑量對(duì)大鼠肝臟具有一定的毒性。何首烏生藥低劑量(4.125g生藥/kg)組和5種炮制品高(16.5g生藥/kg)、低(4.125g生藥/kg)劑量組部分動(dòng)物局部肝組織呈不同程度腫脹、變性，個(gè)別肝臟間質(zhì)可見(jiàn)小灶狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)小膽管輕度增生，其余肝組織結(jié)構(gòu)正常，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未顯示出明顯的肝臟毒性。結(jié)果見(jiàn)表3-4。

表3各組肝臟分類病變積分表

表4各組肝臟病變總積分統(tǒng)計(jì)

注：與對(duì)照組比較：*p＜0.05。

2抗氧化作用

2.1受試物

同1.1項(xiàng)下。

2.2動(dòng)物與試劑

動(dòng)物見(jiàn)1.2項(xiàng)下。蛋白、sod、mda試劑盒廠家：南京建成生物科技有限公司(批號(hào)：20110210)。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

sd大鼠，130只，雌雄各半，分為13組。分組及給藥方法見(jiàn)1.3項(xiàng)下。各組動(dòng)物自腹主動(dòng)脈取血后處死后，取腦組織進(jìn)行蛋白含量、丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活力的測(cè)定，計(jì)算每毫克蛋白中mda含量、sod活力。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(anova)，以p＜0.05為差異顯著的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

sd正常大鼠連續(xù)口服給藥29天后，何首烏5號(hào)炮制品，即加壓炮制8h，16.5g生藥/kg組、4.125g生藥/kg劑量組腦組織中mda含量與對(duì)照組比較明顯降低(p＜0.05，p＜0.01)，而生品及其它炮制品未見(jiàn)此差異。與同等劑量的生品組、炮制4h組比較，加壓炮制8h組其降低腦組織中mda含量的作用明顯增強(qiáng)，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。說(shuō)明何首烏經(jīng)新工藝炮制后能降低正常成年大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，從而起到一定的防止衰老的作用。各給藥組sod活力均未見(jiàn)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5何首烏生品及不同炮制品給藥29天后對(duì)大鼠腦組織勻漿中mda含量、sod活力的影響(n＝10，)

注：與對(duì)照組比較：^*p＜0.05，^**p＜0.01

與同等劑量的生品組比較：^#p＜0.05

與同等劑量的炮1組比較：^δp＜0.05。