相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2015年10月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)62/237,400、2015年9月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)62/222,008以及2014年12月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)62/087,972的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過參照整體并入本申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及通過破壞鋅指(zincfinger)域來活化帕金連接酶(parkinligase)以用于治療益處的方法。

背景技術(shù)：

泛素-蛋白酶體途徑系統(tǒng)(ups)是調(diào)節(jié)關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白并降解錯(cuò)誤折疊或異常蛋白的關(guān)鍵途徑。ups是多個(gè)細(xì)胞過程的核心，如果有缺陷或失衡，則會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)病。泛素對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性的基本細(xì)胞機(jī)制，是生物學(xué)幾乎所有方面的多種功能的基礎(chǔ)。通過e3泛素連接酶的作用實(shí)現(xiàn)了泛素與特定蛋白底物的共價(jià)連接。這些連接酶包含超過500種不同的蛋白質(zhì)，并且被歸類為由其e3功能活性的結(jié)構(gòu)元件定義的多個(gè)類別。特別地，hect和ring連接酶二者將活化的泛素從硫酯轉(zhuǎn)移到底物上的賴氨酸殘基的e-氨基酸基團(tuán)；然而，hect連接酶具有與泛素形成中間體硫酯鍵的活性位點(diǎn)半胱氨酸，而ring連接酶用作支架以允許泛素直接從e2轉(zhuǎn)移至底物。最近的證據(jù)表明，ring連接酶的亞族，ring-中間-ring(rbr)家族除了規(guī)范的ring域之外，還可能含有一種催化性半胱氨酸殘基1,2(riley等人2013.natcommun.4:1982，“riley等人”)，其在此通過參照整體并入。

去泛素化蛋白和泛素特異性蛋白酶(dub和usp)以及e3連接酶在ups中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。這些蛋白由穩(wěn)定泛素(ub)結(jié)合用于特化功功能的柔性鋅指(znf)域支持。

帕金是一種ring-中間-ringe3連接酶，其在泛素與特定底物的共價(jià)連接中起作用，帕金中的突變與帕金森病、癌和分枝桿菌感染相關(guān)。對(duì)于帕金的個(gè)體ring域，關(guān)于配位zn離子的特定殘基以及它們與定義經(jīng)典e2結(jié)合域的規(guī)范ring交叉支架結(jié)構(gòu)的關(guān)系是有爭議的問題。r0是一個(gè)新穎的域結(jié)構(gòu)，但與zn指域相比與e3ring域更為相似(riley等人2013.natcommun.4:1982)。

雖然許多藥物發(fā)現(xiàn)計(jì)劃專注于ups，但由于缺乏選擇性和直接接觸酶蛋白活性位點(diǎn)而少有成功。本發(fā)明針對(duì)的是一種破壞zn指域的新方法，其提供針對(duì)包括腫瘤學(xué)和神經(jīng)病學(xué)紊亂的各種疾病和紊亂的治療益處。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及通過在其znf域中結(jié)合鋅離子和/或半胱氨酸殘基而調(diào)節(jié)ups中連接酶的結(jié)構(gòu)和/或功能，以用于治療益處。該機(jī)制不同于結(jié)合連接酶的活性位點(diǎn)，其接收ub的尾部。本發(fā)明針對(duì)的是通過將小分子配位至帕金znf域中的鋅離子，或通過小分子與帕金znf域中的半胱氨酸殘基的化學(xué)反應(yīng)來活化帕金連接酶的方法。將小分子配位至鋅離子可從znf域移除或不移除鋅離子。小分子與半胱氨酸殘基的化學(xué)反應(yīng)可為可逆的或不可逆的。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括活化帕金連接酶的方法。在一具體實(shí)施方案中，可以通過向受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的化合物來活化帕金連接酶。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可與zn離子配位，和/或與半胱氨酸結(jié)合或反應(yīng)。在一具體實(shí)施方案中，該化合物可與半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。

在另一實(shí)施方案中，活化的帕金連接酶抑制一種或多種腫瘤。在另一具體實(shí)施方案中，活化的帕金連接酶提供多巴胺神經(jīng)元保護(hù)。

可配位至zn離子的化合物包括但不限于單齒、二齒或三齒配體?？膳c半胱氨酸殘基中的巰基反應(yīng)的化合物包括但不限于烷化劑、氧化劑、邁克爾受體、另一不飽和結(jié)構(gòu)或二硫化物。

在某些實(shí)施方案中，該化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力、減少腫瘤轉(zhuǎn)化和/或減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。在某些實(shí)施方案中，該受試者已被診斷患有癌癥。在某些實(shí)施方案中，癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

在一些實(shí)施方案中，該患者已被診斷患有神經(jīng)變性疾病。

在具體實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病是帕金森病、癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)或亨廷頓病。在另外的實(shí)施方案中，癡呆是路易體癡呆(dlb)、多系統(tǒng)萎縮癥(msa)或進(jìn)行性核上性麻痹(psp)。

在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，該化合物基本上破壞帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指選自以下的一種或多種：通過r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465所限定的域。在一具體實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于選自以下的一個(gè)或多個(gè)域或與其對(duì)齊：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另外的實(shí)施方案中，鋅指包含四個(gè)半胱氨酸殘基。在一具體實(shí)施方案中，該化合物可為鋅螯合劑。

在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可與一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可與一個(gè)或多個(gè)選自以下的半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)：人帕金連接酶的c59和c377。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物可基本上破壞帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶中的鋅指可位于選自以下的一個(gè)或多個(gè)域內(nèi)：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另一具體實(shí)施方案中，基本上被破壞的鋅指位于帕金連接酶的ibr氨基酸328-377中。

在另一實(shí)施方案中，該化合物可與磷酸泛素(phosphoubiquitin,pub)在活化帕金連接酶中協(xié)同作用。

在某些實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化(ubiquitination)。

在另一實(shí)施方案中，活化帕金連接酶治療選自以下的一種或多種疾病或疾患(ailment)或降低其發(fā)生率：阿爾茨海默氏癡呆、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、多系統(tǒng)萎縮癥、psp、tau蛋白病、彌散性路易體病、路易體癡呆、任何特征在于α-突觸核蛋白異常蓄積的病癥、老化過程病癥、中風(fēng)、細(xì)菌感染、病毒感染、線粒體相關(guān)性疾病、智力遲鈍、耳聾、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合征(sjogrenssyndrome)、狼瘡、青光眼包括假性剝脫性青光眼、萊伯遺傳性視神經(jīng)病變和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

在一具體實(shí)施方案中，細(xì)菌感染是分枝桿菌感染。在另一具體實(shí)施方案中，病毒感染是丙型肝炎感染。在另一具體實(shí)施方案中，線粒體相關(guān)性疾病選自以下的一種或多種：阿爾珀斯病、巴氏綜合征/lic(致命性小兒心肌病)、β氧化缺陷、肉堿-酰基-肉堿缺乏、肉堿缺乏、肌酸缺陷綜合征、輔酶q10缺乏、復(fù)合體i缺乏、復(fù)合體ii缺乏、復(fù)合體iii缺乏、復(fù)合體iv缺乏/cox缺乏、復(fù)合體v缺乏、cpeo、cpti缺乏、cptii缺乏、kss、乳酸酸中毒、lbsl–腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、lcad、lchad、利氏病或利氏綜合征、勒夫特病、mad/ii型戊二酸尿癥、mcad、melas、merrf、miras、線粒體細(xì)胞病、線粒體dna耗竭、線粒體腦病、線粒體肌病、mngie、narp、皮爾森綜合征、丙酮酸羧化酶缺乏、丙酮酸脫氫酶缺乏、polg突變、呼吸鏈相關(guān)性疾病、scad、schad和vlcad。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的方法。一個(gè)具體實(shí)施方案包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的化合物，其中該化合物可與zn離子配位和/或與半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，活化帕金連接酶抑制一種或多種腫瘤。在另一實(shí)施方案中，該化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力、減少腫瘤轉(zhuǎn)化和減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。在另一實(shí)施方案中，癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括治療帕金森病和/或降低其發(fā)生率的方法。用于治療帕金森病和/或降低其發(fā)生率的一個(gè)具體實(shí)施方案包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的化合物，其中該化合物可與zn離子配位和/或與半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化，如由帕金通過共價(jià)結(jié)合泛素修飾底物蛋白的能力所定義的，底物蛋白為帕金自身，或另一蛋白例如線粒體融合蛋白1或2、fbw7、或者其它公開報(bào)道的帕金連接酶的底物。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括藥物制劑。在一具體實(shí)施方案中，該藥物制劑活化帕金連接酶。在另一具體實(shí)施方案中，該藥物制劑可包含有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的化合物或其鹽，和藥用載體，其中該化合物或其鹽可配位zn離子，和/或與半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可與選自以下的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)：人帕金連接酶的c59和c377。在一具體實(shí)施方案中，藥物組合物是在選自以下的制劑中：固體、粉末、液體和凝膠。

附圖說明

圖1表明n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，即一種螯合劑化合物(識(shí)別為ah001或表2中的化合物76)，其增加了帕金連接酶與基于活性的泛素乙烯砜探針的反應(yīng)。

圖2表明6-芐基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，即一種親電體和螯合劑化合物(識(shí)別為ah007或表2中的化合物77)，其增加了帕金連接酶與基于活性的泛素乙烯砜探針的反應(yīng)。

圖3表明化合物n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，即一種螯合劑化合物(ah001)，其增加了自動(dòng)泛素化(auto-ubiquitination)測(cè)定中的帕金活性。

圖4a和4b表明n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(ah001)與pub協(xié)同增加了自動(dòng)泛素化測(cè)定中的帕金活化且允許較低濃度的pub以活化帕金。

圖5表明6-芐基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，即一種親電體化合物(ah007)，其增加了自動(dòng)泛素化測(cè)定中的帕金活性。

具體實(shí)施方式

所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，包括其中的任何附圖和附錄，以如同每個(gè)個(gè)體出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)、附圖或附錄被明確和單獨(dú)指出通過參照整體并入用于所有目的的相同程度通過參照整體并入用于所有目的。

定義

藥用鹽包括通過使用作堿的活性化合物與無機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)以鹽形成鹽而獲得的那些，例如鹽酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟腦磺酸、草酸、馬來酸、琥珀酸、檸檬酸、甲酸、氫溴酸、苯甲酸、酒石酸、富馬酸、水楊酸、扁桃酸、碳酸等的鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，酸加成鹽可以通過化合物與適當(dāng)?shù)臒o機(jī)或有機(jī)酸經(jīng)由任何多種已知方法的反應(yīng)來制備。

術(shù)語“治療”是指減輕、緩解、延遲、減少、逆轉(zhuǎn)、改善或管理受試者中病癥至少一種病癥癥狀中的一種或多種。術(shù)語“治療”還可以指阻滯、延遲病癥的發(fā)作(即病癥臨床表現(xiàn)之前的時(shí)期)或降低其發(fā)展或惡化的風(fēng)險(xiǎn)中的一種或多種。

“有效量”是指根據(jù)本發(fā)明的制劑的用量，其當(dāng)給予患者用于治療狀況、障礙或病癥時(shí)足以進(jìn)行此種治療?！坝行Я俊睂⒏鶕?jù)活性成分、待治療的狀況、障礙或病癥及其嚴(yán)重程度、以及待治療的哺乳動(dòng)物的年齡、體重、身體狀況和響應(yīng)性而變化。

適用于劑量或量的術(shù)語“治療有效的”是指在給予有此需求的患者后足以導(dǎo)致期望的臨床益處的化合物或藥物制劑的量。

本申請(qǐng)?zhí)峒暗乃兄亓堪俜謹(jǐn)?shù)(即，"重量％"和"wt.％"和w/w)，除非另有指示，否則是相對(duì)于藥物組合物的總重量測(cè)量的。

如本申請(qǐng)所用的，“基本上”或“基本”是指動(dòng)作、特征、性質(zhì)、狀態(tài)、結(jié)構(gòu)、項(xiàng)目或結(jié)果的完全或接近完全的程度或度。例如，“基本上”被包圍的對(duì)象將意味著該對(duì)象是完全封閉的或幾乎完全封閉的。偏離絕對(duì)完全性的精確可允許程度在某些情況下可能取決于具體環(huán)境。然而，一般而言，完成的接近程度將以至于具有如同獲得絕對(duì)和完全完成的相同的總體結(jié)果。“基本上”的使用同樣適用于當(dāng)在消極的內(nèi)涵中使用以表示完全或接近完全缺乏行動(dòng)、特征、性質(zhì)、狀態(tài)、結(jié)構(gòu)、項(xiàng)目或結(jié)果時(shí)。例如，“基本上不含”其它活性劑的組合物完全缺乏其它活性劑，或者如此接近完全缺乏其它活性劑以至作用將會(huì)與如同其完全缺乏其它活性劑相同。換而言之，“基本上不含”某成分或要素或另一活性劑的組合物仍可含有此項(xiàng)，只要沒有其可測(cè)的作用。

可以使用可在www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/獲得的比對(duì)程序clustalw2進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)蛋白/氨基酸序列的如本申請(qǐng)所用的“比對(duì)(alignment)”?？梢允褂靡韵氯笔?shù)用于成對(duì)比對(duì)：蛋白權(quán)矩陣(proteinweightmatrix)＝gonnet；缺口開放＝10；缺口延伸＝0.1。

如本申請(qǐng)所用的“泛素蛋白酶體途徑系統(tǒng)(ups)”涉及從酵母到哺乳動(dòng)物保守的泛素蛋白酶體途徑，且為真核細(xì)胞中大多數(shù)短壽命蛋白的靶向降解所需的。靶標(biāo)包括其及時(shí)破壞對(duì)于控制細(xì)胞分裂至關(guān)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，以及不能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)正確折疊的蛋白。泛素修飾是由三類酶進(jìn)行的atp依賴過程。“泛素活化酶”(e1)與泛素(一種高度保守的76氨基酸蛋白)形成硫酯鍵。該反應(yīng)允許隨后將泛素與“泛素綴合酶”(e2)結(jié)合，隨后在泛素的羧基末端和底物蛋白上的賴氨酸殘基之間形成異肽鍵。后一反應(yīng)需要“泛素連接酶”(e3)。e3連接酶可以是單亞基或多亞基酶。在一些情況下，泛素結(jié)合和底物結(jié)合域位于通過銜接蛋白或剔除而在一起的分開的多肽上。許多e3連接酶提供特異性，因?yàn)槊總€(gè)可以僅修飾底物蛋白的子集。另外的特異性通過底物蛋白的翻譯后修飾實(shí)現(xiàn)，其包括但不限于磷酸化。單泛素化的影響包括亞細(xì)胞定位的變化。然而，導(dǎo)致聚泛素鏈的多個(gè)泛素化循環(huán)是將蛋白靶向蛋白酶體用于降解所需的。多亞基26s蛋白酶體識(shí)別、展開多聚泛素化底物并將其降解成小肽。反應(yīng)發(fā)生在蛋白酶體復(fù)合物的圓柱形核心內(nèi)，且肽鍵水解采用核心蘇氨酸殘基作為催化親核體。已經(jīng)表明，多泛素化和降解步驟之間可能存在多泛素鏈?zhǔn)荏w形式的另外一層復(fù)雜性。這些受體與多聚泛素化底物的子集反應(yīng)，有助于26s蛋白酶體的識(shí)別，從而促進(jìn)其降解。該途徑不僅在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中重要，而且在人類疾病中也是重要的。因?yàn)榉核?蛋白酶體依賴性降解通常用于控制細(xì)胞分裂周期和細(xì)胞生長，研究人員已發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑具有發(fā)展成為潛在的癌癥治療劑的一些前景。

通過泛素-蛋白酶體體系的蛋白降解是細(xì)胞內(nèi)蛋白的非溶酶體蛋白水解的主要途徑。它在各種基本細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、分裂、發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞運(yùn)輸以及免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)的核心元素是泛素與靶向蛋白的共價(jià)連接，然后由26s蛋白酶體(一種三磷酸腺苷依賴性多催化蛋白酶)識(shí)別。損害、氧化或錯(cuò)誤折疊的蛋白以及控制許多關(guān)鍵細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)蛋白是該降解過程的靶標(biāo)之一。該系統(tǒng)的異常導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)和多種疾病的發(fā)展(wang等人cellmolimmunol.2006aug；3(4):255-61)。

如本申請(qǐng)所用的“帕金連接酶”或“帕金”涉及在人類中通過park2基因編碼的蛋白(kitadat，asakawas，hattorin，matsumineh，yamamuray，minoshimas，yokochim，mizunoy，shimizun(1998年4月)."mutationsintheparkingenecauseautosomalrecessivejuvenileparkinsonism".nature392(6676):605–608.doi:10.1038/33416.pmid9560156。matsumineh，yamamuray，hattorin，kobayashit，kitadat，yoritakaa，mizunoy(1998年4月)."amicrodeletionofd6s305inafamilyofautosomalrecessivejuvenileparkinsonism(park2)".genomics49(1):143–146.doi:10.1006/geno.1997.5196.pmid9570960。該蛋白是多蛋白e3泛素連接酶復(fù)合體的組成部分，后者又是介導(dǎo)蛋白降解靶向的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的一部分。已知park2基因突變導(dǎo)致稱為常染色體隱性青少年帕金森病(ar-jp)的帕金森病的家族性形式。

如本申請(qǐng)所用的“連接酶”是可以通過采用新化學(xué)鍵將兩種或更多種化合物或生物分子結(jié)合在一起來催化它們的連接的酶。兩者的“連接”通常伴隨著依賴于較大化合物或生物分子之一的小化學(xué)基團(tuán)的水解，或催化兩種化合物連接在一起的酶，例如催化基團(tuán)c-o、c-s、c-n等的連接的酶。泛素-蛋白(e3)連接酶是選擇泛素化蛋白的高度多樣化酶的一個(gè)大家族。

“ub連接酶”涉及腫瘤、炎癥和傳染病的疾病發(fā)病機(jī)制。屬于含有典型的ring域和催化半胱氨酸殘基的e3連接酶的ring-中間-ring(rbr)家族的e3連接酶通常限于hecte3連接酶；稱為“ring/hect”雜交酶。帕金中突變與帕金森病，癌癥和分枝桿菌感染相關(guān)連。帕金被認(rèn)為具有線粒體完整性作用的神經(jīng)保護(hù)蛋白。人類遺傳數(shù)據(jù)暗示了帕金森病(pd)發(fā)病機(jī)制中帕金活性的喪失。

如本申請(qǐng)所用的“鋅指(znf)域”涉及特征在于配位鋅離子以穩(wěn)定功能活性的蛋白結(jié)構(gòu)。znf穩(wěn)定ups中ub、去泛素化酶(dub)和連接酶(e3)的結(jié)合。

如本申請(qǐng)所用的“配體”通過配體中的一個(gè)或多個(gè)原子與金屬結(jié)合，并且通常被稱為螯合配體。通過兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的配體被分類為二齒，且三個(gè)位點(diǎn)為三齒?！耙Ы恰笔侵付X螯合物的兩個(gè)鍵之間的角度。螯合配體通常通過經(jīng)由有機(jī)接頭連接供體組而形成。經(jīng)典的雙齒配體是乙二胺，它是通過兩個(gè)氨基與乙烯(-ch2ch2-)連接體的連接得到的。多齒配體的典型實(shí)例是六齒螯合劑edta，其能夠通過六個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，完全圍繞一些金屬。螯合體系的結(jié)合親和力取決于螯合角或咬角。許多配體能夠通過多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合金屬離子，通常是因?yàn)榕潴w在多于一個(gè)原子上具有孤電子對(duì)。一些配體可以通過相同的原子鍵合到金屬中心，但是與不同數(shù)量的孤電子對(duì)鍵合。金屬配體鍵的鍵合順序可以部分通過金屬配體鍵角(m-x-r)來區(qū)別。這種鍵角通常被稱為線性的或彎曲的，關(guān)于彎曲角的程度具有進(jìn)一步的探討。例如，離子形式的亞胺配體具有三個(gè)孤電子對(duì)。一個(gè)孤電子對(duì)被用作σx供體，另外兩個(gè)孤電子對(duì)可用作l型π供體。如果在π鍵中同時(shí)使用兩個(gè)孤電子對(duì)，則m-n-r是線性的。然而，如果這些孤電子對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)是非鍵合的，則m-n-r鍵是彎曲，并且彎曲的程度說明可能存在多少π鍵合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很少的雜原子，例如氮，氧和硫原子與鋅相互作用，鋅和這些雜原子之間的理想距離被確定。盡管羧酸鹽通過單齒和雙齒相互作用結(jié)合到鋅上，但是主要以二齒形式結(jié)合羥肟酸鹽。這些結(jié)果有助于設(shè)計(jì)具有與靶蛋白中的鋅相互作用的新型抑制劑。幾乎每個(gè)分子和每個(gè)離子可以作為(或“配對(duì)”)金屬的配體。單齒配體包括幾乎所有的陰離子和所有簡單的路易斯堿。因此，鹵化物和類鹵化物是重要的陰離子配體，而氨、一氧化碳和水是特別常見的電荷中性配體。簡單的有機(jī)物種也非常普遍，無論是陰離子(ro^-和rco2^-)還是中性(r2o、r2s、r3-xnhx和r3p)。多齒配體的絡(luò)合物稱為螯合絡(luò)合物。它們傾向于比單齒配體衍生的復(fù)合體更穩(wěn)定。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性，螯合效應(yīng)通常歸因于熵的影響，器有利于許多配體通過一個(gè)多齒配體的取代。當(dāng)螯合配體形成至少部分包圍中心原子并與其結(jié)合的大環(huán)時(shí)，將中心原子留在大環(huán)的中心。其剛性越高，其齒合度越高，大環(huán)復(fù)合物的惰性越多。

如本申請(qǐng)所用的“螯合劑”涉及通過形成螯合物(其中金屬原子或離子在配體上的兩個(gè)或更多個(gè)點(diǎn)上與配體結(jié)合的配位化合物，因此例如形成含有金屬原子的雜環(huán))抑制化學(xué)活性的結(jié)合劑。

如本申請(qǐng)所用的“螯合”涉及離子和分子結(jié)合金屬離子的特殊方式。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(iupac)，螯合包括在多齒(多重鍵合)配體和單個(gè)中心原子之間形成或存在兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的配位鍵。通常這些配體是有機(jī)化合物，且稱為螯合劑、螯合試劑或掩蔽劑。

如本申請(qǐng)所用的“親電體”涉及吸引至電子富集中心的物種。在化學(xué)中，親電體是被電子吸引的試劑。它通過接受電子對(duì)來參與化學(xué)反應(yīng)，以便與親核體結(jié)合。因?yàn)橛H電體接受電子，所以它們是路易斯酸。大多數(shù)親電體帶正電，具有帶有部分正電荷的原子，或具有不具有電子八位位組的原子。

以下描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。并不承認(rèn)本文提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與當(dāng)前要求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，或者特定或隱含引用的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)。

泛素-蛋白(e3)連接酶是選擇各種蛋白用于泛素化的酶的一個(gè)大家族。已知這些泛素連接酶(稱作“ub連接酶”)在各種疾病和病癥中具有作用，該疾病和病癥包括但不限于，癌癥、炎癥和傳染性疾病。

一種特定的ub連接酶是帕金連接酶。帕金連接酶是多蛋白“e3”泛素連接酶復(fù)合物的組分，其又是介導(dǎo)蛋白降解的靶向的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的一部分。雖然帕金連接酶的具體功能尚不清楚，但帕金連接酶的突變與諸如帕金森病、癌癥和分枝桿菌感染的各種疾病有關(guān)。因此，帕金連接酶是用于治療干預(yù)的有吸引力的靶標(biāo)。

另外，存在用于調(diào)節(jié)本領(lǐng)域已知的連接酶的各種已知方法。已知許多連接酶，特別是涉及泛素-蛋白酶體途徑系統(tǒng)(ups)的連接酶，具有穩(wěn)定該連接酶中的關(guān)鍵蛋白結(jié)合區(qū)的鋅指(znf)域。

znf域配位鋅離子且該配位穩(wěn)定了蛋白的功能活性。蛋白與znf域提供的功能活性可以包括調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞信號(hào)通路，例如識(shí)別泛素、調(diào)節(jié)dna，例如轉(zhuǎn)錄和修復(fù)，并用作細(xì)胞氧化還原傳感器。鋅與znf域的結(jié)合，或簡單調(diào)節(jié)鋅如何與znf域相互作用，對(duì)于ups中涉及的連接酶是必要的。

已知帕金連接酶具有一個(gè)或多個(gè)znf域。本發(fā)明聚焦于調(diào)節(jié)帕金連接酶中znf域的兩種不同策略。本發(fā)明的一種策略包括使用結(jié)合znf域并因此不允許鋅的結(jié)合，或者引起諸如zn或zn²⁺的鋅從znf域解離的螯合化合物。

本發(fā)明的另一種策略包括使用與znf域中的半胱氨酸氨基酸殘基結(jié)合或反應(yīng)的化合物。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基(且有時(shí)在組氨酸殘基的幫助下)在znf域中對(duì)于結(jié)合和/或配位至鋅離子是必需的。鋅離子(通常zn²⁺)可以與多個(gè)半胱氨酸或組氨酸殘基配位。該域中具有的半胱氨酸殘基越多，znf域越柔性。連接酶如帕金連接酶被認(rèn)為在其znf域中具有與鋅配位的多個(gè)半胱氨酸殘基。帕金連接酶znf域的柔性被認(rèn)為是允許域是可逆的，且因此是調(diào)節(jié)帕金連接酶的一種可能的機(jī)制。

本發(fā)明因此涉及具有親電、螯合或親電和螯合性質(zhì)的一種或多種藥物或一種或多種化合物的使用，其可以與帕金連接酶中的鋅離子和/或半胱氨酸殘基(一個(gè)或多個(gè))相互作用并因此調(diào)節(jié)帕金連接酶的活性。具體地，認(rèn)為不允許鋅離子在帕金連接酶的znf域中的至少一個(gè)中配位以誘導(dǎo)其活性。因此，本發(fā)明涉及一種通過zn的螯合，然后從znf域?qū)⑵涑セ蛲ㄟ^在保持zn在適當(dāng)位置的半胱氨酸氨基酸(一個(gè)或多個(gè))處的親電攻擊來活化帕金連接酶的方法。

因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，活化帕金連接酶的方法包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的一種或多種化合物。在另一實(shí)施方案中，活化帕金連接酶的方法包括向受試者給予破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的兩種或更多種化合物。

在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可為親電體或螯合劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可能能夠同時(shí)用作親電體和螯合劑。例如，本發(fā)明化合物可以包括多個(gè)官能團(tuán)，其中一官能團(tuán)具有螯合性質(zhì)且一官能團(tuán)具有親電性質(zhì)。

在另一具體實(shí)施方案中，化合物選自以下的一種或多種：表1和表2中的化合物或其鹽或酯。雖然不受限于特定理論，但認(rèn)為表1或表2中的至少一些化合物可以是螯合劑，親電體或兩者。例如，認(rèn)為來自表2的化合物76和97用作螯合劑，但表2的化合物113用作硫醇反應(yīng)性親電體。在另一實(shí)例中，來自表1或表2的化合物可以同時(shí)用作親電體和親核試劑。認(rèn)為，例如，表2的化合物91和107都是螯合劑，但也可能作為硫醇反應(yīng)性親電體。因此，在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是選自由表1和表2中的化合物或其鹽或酯構(gòu)成的組的一種或多種的親電體、螯合劑或親電體和螯合劑。

在另一實(shí)施方案中，表1和表2中的化合物或其鹽或酯結(jié)合并活化帕金連接酶。例如，化合物n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(ah001)，一種螯合劑化合物和6-芐基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇(ah007)，一種親電體和螯合劑化合物，二者均可獨(dú)立增加與基于活性的泛素乙烯砜探針的帕金連接酶反應(yīng)。參見實(shí)施例2-3。因此，螯合劑和/或親電體二者均可結(jié)合并活化帕金連接酶。

在另一實(shí)施方案中，化合物可為2-(4-芐基哌嗪-1-基)-n-[(2-羥基-3-丙-2-烯基-苯基)亞甲基氨基]乙酰胺(還稱作pac-1)或其鹽或酯。雖然不受限于特定理論，但認(rèn)為以下表2中提供為化合物114的pac-1的結(jié)構(gòu)是螯合劑，并且還可具有增加帕金連接酶反應(yīng)的能力。在另一實(shí)施方案中，pac-1或其鹽還可以是親電體和/或既為螯合劑又為親電體。

在另一實(shí)施方案中，化合物可為pac-1的衍生物或類似物。在一具體實(shí)施方案中，化合物可為pct申請(qǐng)公開wo2010/091382、wo2013/131089、wo2013/124407、wo2014/022858、美國申請(qǐng)公開us2015/0210659、us2015/0231132、us2014/0073609、us20150017264、us2015/0099759、美國專利8,916,705、美國專利9,102,661、美國專利8,592,584和美國專利8,778,945中所述的化合物，其公開內(nèi)容通過參照整體并入本申請(qǐng)。

在一特定實(shí)例中，基于活性的探針測(cè)定和質(zhì)譜分析表明表1和/或表2中的一些候選化合物可以與人帕金連接酶中的多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)。例如，質(zhì)譜分析表明ah007與帕金連接酶的至少半胱氨酸殘基59(c59)和半胱氨酸殘基377(c377)結(jié)合。

因此，在一具體實(shí)施方案中，活化帕金連接酶的方法包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的一種或多種化合物。在一具體實(shí)施方案中，該一種或多種化合物選自表1和/或表2，或其鹽或酯。在另一實(shí)施方案中，化合物可為螯合劑、親電體或螯合劑和親電體。

在另一實(shí)施方案中，一種或多種化合物可與zn離子配位，和/或與一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)。在一具體實(shí)施方案中，zn離子可以是zn⁺或zn²⁺離子。在另一實(shí)施方案中，可以配位至zn離子的化合物是單齒，二齒或三齒配體。

在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與超過一個(gè)半胱氨酸殘基中的巰基結(jié)合和/或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與兩個(gè)半胱氨酸殘基中的巰基結(jié)合和/或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與三個(gè)半胱氨酸殘基中的巰基結(jié)合和/或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與四個(gè)半胱氨酸殘基中的巰基結(jié)合和/或反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可以與選自以下的一個(gè)或多個(gè)域中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)：人帕金連接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449。參見http://www.uniprot.org/uniprot/o60260。

在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可以與選自以下的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)：人帕金連接酶的c182、c258和c377。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物可以與選自以下的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)：人帕金連接酶的c59和c377。在一具體實(shí)施方案中，該化合物可以與人帕金連接酶的反應(yīng)c377。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物是ah007。

在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與選自對(duì)應(yīng)于或?qū)R于人帕金連接酶的c182、c258和/或c377的帕金連接酶、帕金連接酶衍生物或帕金連接酶同源物的一個(gè)或多個(gè)殘基的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與選自對(duì)應(yīng)于或?qū)R于人帕金連接酶的c59和/或c377的帕金連接酶、帕金連接酶衍生物或帕金連接酶同源物的一個(gè)或多個(gè)殘基的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，該化合物是ah007。

還認(rèn)為ibr域可能在調(diào)節(jié)帕金活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。認(rèn)為ro域包括至少一個(gè)如上所述的znf域，其可以涉及用于調(diào)節(jié)帕金連接酶的一種可能的機(jī)制。因此，在一具體實(shí)施方案中，通過向有有此需求的受試者給予化合物可以基本上破壞位于ibr域(氨基酸328-377)中的至少一個(gè)znf域的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，選自表1和/或表2的一種或多種化合物或其鹽或酯可基本上破壞位于ibr域(氨基酸328-377)中的至少一個(gè)znf域的結(jié)構(gòu)。

在另一實(shí)施方案中，該化合物可以與半胱氨酸殘基(包括znf域內(nèi)或附近的任何組氨酸殘基(一個(gè)或多個(gè)))結(jié)合和/或反應(yīng)。

在另一實(shí)施方案中，該化合物可基本上破壞帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指(或znf域)的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可破壞帕金連接酶中的一個(gè)或多個(gè)znf域。

riley等人描述了一種465個(gè)氨基酸的人帕金連接酶，其包括具有zn配位殘基的多個(gè)功能區(qū)(表3中提供的氨基酸序列(seqidno:1)，并在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_004562.2中識(shí)別)。riley等人探討了指定為r0、r1、ibr和r2的4個(gè)域。r0、r1和r2，其先前指定為ring域。然而，riley等人質(zhì)疑r0、ibr和r2域是實(shí)際的還是傳統(tǒng)的ring域：“r0是一個(gè)新穎的域結(jié)構(gòu)，但其更相似于zn指域，而不是e3ring域”。riley等人還指出ibr或r2域都不類似規(guī)范的ring域基序，因?yàn)樗鼈儧]有通常與ring域相關(guān)聯(lián)的交叉支架結(jié)構(gòu)。此外，r0、ibr和r2域的分析表明其鋅中心可能存在缺陷。因此，r0、ibr和r2域看起來是調(diào)節(jié)帕金連接酶活性的理想域候選。r0、ibr和r2域分別是指人帕金連接酶的氨基酸141-216、氨基酸328-377和氨基酸415-465。

因此，在一具體實(shí)施方案中，可被基本上破壞的至少一個(gè)鋅指對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)域：人帕金連接酶的氨基酸141-216、氨基酸328-377和氨基酸415-465。在另一具體實(shí)施方案中，來自至少一個(gè)鋅指的氨基酸可以在與來自人帕金連接酶的r0、ibr和r2域中的一個(gè)或多個(gè)比對(duì)中重疊。

在另一具體實(shí)施方案中，可被基本上破壞的至少一個(gè)鋅指對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)域：人帕金連接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449。參見http://www.uniprot.org/uniprot/o60260。

在一具體實(shí)施方案中，在帕金連接酶中的至少一個(gè)鋅指包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)半胱氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的破壞誘導(dǎo)帕金連接酶的活性。在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶中的至少一個(gè)鋅指包含來自人帕金連接酶的氨基酸141-225、氨基酸238-293、氨基酸313-377和氨基酸418-449的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)半胱氨酸殘基。例如，在一具體實(shí)施方案中，化合物可以通過與選自由人帕金連接酶的c182、c258和c377構(gòu)成的組的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合或反應(yīng)而起反應(yīng)并因此破壞一個(gè)或多個(gè)鋅指。

本發(fā)明的方法還包括通過向有此需求的受試者給予治療有效量的一種或多種化合物來活化帕金連接酶的自動(dòng)泛素化。在一具體實(shí)施方案中，一種或多種化合物破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指。在另一實(shí)例中，表1和/或表2中的化合物可用于活化帕金連接酶的自動(dòng)泛素化。在另一實(shí)施方案中，表1和/或表2中的化合物可以與其他化合物一起使用以活化帕金連接酶的自動(dòng)泛素化。例如，可以將帕金的內(nèi)源性細(xì)胞調(diào)節(jié)劑磷酸泛素(pub)加入到可以活化帕金連接酶及其自身泛素化的帕金連接酶中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可向有此需求的受試者給予用作與磷酸泛素(pub)協(xié)同活化帕金連接酶的表1和/或表2中的一種或多種化合物或其鹽和酯。參見例如實(shí)施例5。在另一實(shí)施方案中，可與pub一起給予一種或多種化合物以協(xié)同增加帕金連接酶和/或其自身泛素化的活化。在另一實(shí)施方案中，化合物可以是螯合劑和/或親電體。在一具體實(shí)施方案中，一種或多種化合物選自表1和/或表2，或其鹽或酯。

在另一具體實(shí)施方案中，帕金連接酶的活化治療選自以下的一種或多種疾病或疾患或降低其發(fā)生率：阿爾茨海默氏癡呆、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、多系統(tǒng)萎縮癥、psp、tau蛋白病、彌散性路易體病、路易體癡呆、任何特征在于α-突觸核蛋白異常蓄積的病癥、老化過程病癥、中風(fēng)、細(xì)菌感染、病毒感染、線粒體相關(guān)性疾病、智力遲鈍、耳聾、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合征、狼瘡、青光眼包括假性剝脫性青光眼、萊伯遺傳性視神經(jīng)病變、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

在一具體實(shí)施方案中，細(xì)菌感染是分枝桿菌感染。在另一具體實(shí)施方案中，病毒感染是hiv、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的方法，其特別包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的一種或多種化合物。在一具體實(shí)施方案中，活化的帕金連接酶抑制一種或多種腫瘤的生長和/或預(yù)防一種或多種腫瘤的轉(zhuǎn)移。

在另一實(shí)施方案中，癌癥可選自以下的一種或多種：急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、aids相關(guān)性癌癥、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細(xì)胞瘤、兒童非典型畸胎瘤/橫紋肌樣瘤、基底細(xì)胞癌、皮膚癌(非黑色素瘤)、兒童膽管癌、肝外膀胱癌、骨癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和惡性纖維組織細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、胚胎腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、支氣管腫瘤、伯基特淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、類癌瘤、未知原發(fā)性胃腸癌、心臟(心)腫瘤、淋巴瘤、原發(fā)性、宮頸癌、兒童癌癥、脊索瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性腫瘤結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚t細(xì)胞淋巴瘤、導(dǎo)管原位癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、成感覺神經(jīng)細(xì)胞瘤、尤因肉瘤、顱內(nèi)生殖細(xì)胞腫瘤、外源性生殖細(xì)胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、眼內(nèi)黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨、惡性和骨肉瘤纖維組織細(xì)胞瘤、膽囊癌、胃部(胃)癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸道間質(zhì)腫瘤、外源性癌癥、卵巢癌、睪丸癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、膠質(zhì)瘤、腦干癌、毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細(xì)胞(肝)癌、組織細(xì)胞增多癥、朗格漢斯細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞腫瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卡波西肉瘤、腎癌、腎細(xì)胞癌、威爾姆氏瘤和其他兒童腎腫瘤、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、喉癌、白血病、慢性淋巴細(xì)胞癌、慢性骨髓瘤、毛細(xì)胞癌、唇部和口腔癌、肝癌(原發(fā)性)、原位小葉癌(lcis)、肺癌、非小細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、淋巴瘤、皮膚t細(xì)胞(蕈樣真菌病和塞扎里綜合征)、霍奇金癌、非霍奇金癌、巨球蛋白血癥、瓦爾登斯特倫病、男性乳腺癌、骨和骨肉瘤的惡性纖維性組織細(xì)胞瘤、黑色素瘤、眼內(nèi)(眼)癌、梅克爾細(xì)胞癌、間皮瘤、惡性腫瘤、具有隱匿性原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌、中線細(xì)胞癌涉及nut基因的中線道癌、口腔癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征、多發(fā)性骨髓瘤/血漿細(xì)胞腫瘤、蕈樣真菌病、異型骨髓增生異常綜合征、骨髓增生異常/骨髓增生性腫瘤、骨髓性白血病、慢性髓樣白血病、急性骨髓瘤多發(fā)性、慢性骨髓增生性腫瘤、鼻腔和鼻旁竇癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、口腔癌、口腔癌、嘴唇和口咽癌、骨的骨肉瘤和惡性纖維性組織細(xì)胞瘤、上皮癌、低惡性潛在腫瘤、胰腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(胰島細(xì)胞腫瘤)、乳頭狀瘤病、副神經(jīng)節(jié)瘤、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、血漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺炎、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、直腸癌、腎細(xì)胞(腎)癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤因癌、卡波西癌、骨肉瘤(骨癌)、軟組織癌、子宮癌、塞扎里綜合征、皮膚癌、兒童黑色素瘤、梅克爾細(xì)胞癌、非黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌(非黑色素瘤)、具有隱匿性原發(fā)性的兒童鱗狀頸癌、轉(zhuǎn)移性癌癥、胃部(胃)癌、t細(xì)胞淋巴瘤、皮膚癌、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、腎臟骨盆和輸尿管的過渡細(xì)胞癌、未知原發(fā)性、兒童癌、兒童不尋常的癌癥、尿道癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、威爾姆氏瘤和女性癌癥。

在一具體實(shí)施方案中，癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和/或前列腺癌。在另一實(shí)施方案中，給予帕金連接酶抑制受試者中的一種或多種腫瘤

在另一具體實(shí)施方案中，化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力、減少腫瘤轉(zhuǎn)化和減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括治療帕金森病和/或降低其發(fā)生率的方法，其特別是通過向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的一種或多種化合物，其中該化合物可與zn離子配位和/或與半胱氨酸(一個(gè)或多個(gè))中的巰基反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該一種或多種化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力和/或減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白?！皊omaticmutationsoftheparkinson’sdisease‐associatedgenepark2inglioblastomaandotherhumanmalignancies”(naturegeneticsjan201042(1)77-82)。

在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化。具體而言，泛素化的改變是由帕金通過共價(jià)連接泛素，一種為帕金自身的底物蛋白或另一種蛋白如線粒體融合蛋白1或2、fbw7或其他公開報(bào)道的帕金連接酶的底物來修飾底物蛋白的能力引起的。

在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的方法，其特別包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的化合物，其中該化合物可與zn離子配位和/或與半胱氨酸結(jié)合或反應(yīng)。在一具體實(shí)施方案中，該化合物是來自表1或表2或其鹽或酯。在一具體實(shí)施方案中，帕金連接酶抑制一種或多種腫瘤的生長和/或預(yù)防一種或多種腫瘤的轉(zhuǎn)移。在另一實(shí)施方案中，該化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力、減少腫瘤轉(zhuǎn)化和減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。在另一實(shí)施方案中，癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

在另一實(shí)施方案中，用于治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的化合物可作為單齒、二齒或三齒配體配位至zn離子。在另一實(shí)施方案中，用于治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的化合物可配位至zn離子，其基本上破壞了帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸域：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另一實(shí)施方案中，該化合物基本上破壞位于ibr域(氨基酸328-377)中的至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，鋅指包含四個(gè)半胱氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化。在另一實(shí)施方案中，該化合物與半胱氨酸中的巰基結(jié)合或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸選自由以下構(gòu)成組中的一個(gè)或多個(gè)：人帕金連接酶的c59和c377。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸是人帕金連接酶的c377。在另一實(shí)施方案中，化合物為ah001和/或ah007。

在另一實(shí)施方案中，用于治療癌癥和/或降低其發(fā)生率的化合物是烷化劑、氧化劑、邁克爾受體、另一不飽和結(jié)構(gòu)，和/或具有二硫化物。在一具體實(shí)施方案中，該化合物也基本上破壞了帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸域：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另一實(shí)施方案中，鋅指包含四個(gè)半胱氨酸殘基。

在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括治療帕金森病和/或降低其發(fā)生率的方法，其包括向有此需求的受試者給予治療有效量的破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指并誘導(dǎo)帕金連接酶活性的化合物，其中該化合物可與zn離子配位和/或與半胱氨酸結(jié)合或反應(yīng)。在一具體實(shí)施方案中，該化合物是來自表1或表2或其鹽或酯。在一具體實(shí)施方案中，該化合物消除受損的線粒體、增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力和/或減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。在另一實(shí)施方案中，可配位至鋅離子的化合物是單齒、二齒或三齒配體。在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸域：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另一實(shí)施方案中，該化合物基本上破壞位于ibr域(氨基酸328-377)中的至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，鋅指包含四個(gè)半胱氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化。在另一實(shí)施方案中，該化合物與半胱氨酸中的巰基結(jié)合或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸選自由以下構(gòu)成組中的一個(gè)或多個(gè)：人帕金連接酶的c59和c377。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸是人帕金連接酶的c377。在另一實(shí)施方案中，化合物為ah001和/或ah007。

在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化，其中泛素化的改變是由帕金通過共價(jià)連接泛素，一種為帕金自身的底物蛋白或另一種蛋白如線粒體融合蛋白1或2、fbw7或其他公開報(bào)道的帕金連接酶的底物來修飾底物蛋白的能力引起的。在一具體實(shí)施方案中，化合物誘導(dǎo)帕金連接酶活化。在另一實(shí)施方案中，該化合物是來自表1或表2或其鹽或酯。在另一實(shí)施方案中，該化合物是烷化劑、氧化劑、邁克爾受體、另一不飽和結(jié)構(gòu)，或具有二硫化物。在另一實(shí)施方案中，該化合物基本上破壞了帕金連接酶中至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)鋅指的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于或?qū)R于選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸域：人帕金連接酶的r0氨基酸141-216、ibr氨基酸328-377和r2氨基酸415-465。在另一實(shí)施方案中，該化合物基本上破壞位于ibr域(氨基酸328-377)中的至少一個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，鋅指包含四個(gè)半胱氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，帕金連接酶活化改變泛素化。在另一實(shí)施方案中，該化合物與半胱氨酸中的巰基結(jié)合或反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸選自由以下構(gòu)成組中的一個(gè)或多個(gè)：人帕金連接酶的c59和c377。在另一實(shí)施方案中，半胱氨酸是人帕金連接酶的c377。在另一實(shí)施方案中，化合物為ah001和/或ah007。

雖然蛋白被建立以滿足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)要求，但它們也在不僅僅用作破壞和空間管理目的的高度調(diào)節(jié)的過程被分解。蛋白具有不同的半衰期，由其它們n-末端存在的氨基酸的性質(zhì)所決定。有些將會(huì)長期存在，而其他將會(huì)被快速分解。蛋白水解不僅能夠使細(xì)胞處理錯(cuò)誤折疊或損壞的蛋白，而且可以微調(diào)細(xì)胞內(nèi)必需蛋白(例如參與細(xì)胞周期的蛋白)的濃度。這種快速/高度特異性的降解可以通過向靶蛋白加入一到數(shù)個(gè)泛素分子來實(shí)現(xiàn)。該過程稱為泛素化。

泛素化對(duì)于多種生理過程至關(guān)重要，包括細(xì)胞存活和分化以及先天和適應(yīng)性免疫。近年來，了解泛素在信號(hào)通路中的分子作用以及泛素系統(tǒng)的改變?nèi)绾螌?dǎo)致不同人類疾病的發(fā)展已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。已經(jīng)表明泛素化在癌癥、代謝綜合征、神經(jīng)變性疾病、自身免疫、炎癥性疾病、感染和肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮作用(popovic等人naturemedicine20，1242–1253(2014))。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及治療、預(yù)防或改善一種或多種與(但不限于)實(shí)體瘤以及腫瘤中瓦布格效應(yīng)(恢復(fù)帕金活性以預(yù)防瓦布格效應(yīng))相關(guān)的疾病或紊亂的癥狀的方法，所述實(shí)體瘤例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤(少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、混合神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌。人類遺傳和病理學(xué)數(shù)據(jù)支持帕金蛋白作為高價(jià)值靶標(biāo)。如果沒有足夠的活化的帕金，則發(fā)生多巴胺神經(jīng)元的細(xì)胞死亡和喪失(“familialparkinsondiseasegeneproduct,parkin,isaubiquitin‐proteinligase”naturegenetics25,302-305,2000年7月1日)。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及治療、預(yù)防或改善與神經(jīng)疾病或紊亂相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，所述神經(jīng)疾病或紊亂包括但不限于阿爾茨海默氏癡呆、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、多系統(tǒng)萎縮癥、psp、tau蛋白病、彌散性路易體病、路易體癡呆、任何特征在于α-突觸核蛋白異常蓄積的病癥、老化過程病癥和中風(fēng)。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及治療、預(yù)防或改善與以下(但不限于)相關(guān)的一種或多種癥狀的方法：智力遲鈍、耳聾、失明、糖尿病、肥胖、心血管疾病、和自身免疫疾病例如多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合征、狼瘡、青光眼包括假性剝脫性青光眼、萊伯遺傳性視神經(jīng)病變、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及治療、預(yù)防或改善與如下線粒體相關(guān)性疾病或膠囊(但不限于)相關(guān)的一種或多種癥狀的方法：

·阿爾珀斯病

·巴氏綜合征/lic(致命性小兒心肌病)

·β氧化缺陷

·肉堿-酰基-肉堿缺乏

·肉堿缺乏

·肌酸缺陷綜合征

·輔酶q10缺乏

·復(fù)合體i缺乏

·復(fù)合體ii缺乏

·復(fù)合體iii缺乏

·復(fù)合體iv缺乏/cox缺乏

·復(fù)合體v缺乏

·cpeo

·cpti缺乏

·cptii缺乏

·kss

·乳酸酸中毒

·lbsl-腦白質(zhì)營養(yǎng)不良

·lcad

·lchad

·利氏病或利氏綜合征

·勒夫特病

·mad/ii型戊二酸尿癥

·mcad

·melas

·merrf

·miras

·線粒體細(xì)胞病

·線粒體dna耗竭

·線粒體腦病

·線粒體肌病

·mngie

·narp

·皮爾森綜合征

·丙酮酸羧化酶缺乏

·丙酮酸脫氫酶缺乏

·polg突變

·呼吸鏈

·scad

·schad

·vlcad.

增加的帕金活性消除受損的線粒體(紅)并增加細(xì)胞應(yīng)激期間的細(xì)胞活力、減少腫瘤轉(zhuǎn)化和減輕細(xì)胞中α-突觸核蛋白。鑒定出多種的從帕金去除鋅的帕金活化化合物。znf展開后的活化與其他已知的znf蛋白相似。

本發(fā)明還包括用于活化受試者的帕金連接酶的藥物組合物。在一具體實(shí)施方案中，該藥物組合物包含破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的一種或多種化合物或其鹽。在一具體實(shí)施方案中，該一種或多種化合物或其鹽可與鋅離子配位，和/或與半胱氨酸中的至少一個(gè)巰基反應(yīng)。在一具體實(shí)施方案中，該藥物組合物可包含選自由表1和表2中化合物所構(gòu)成的組的一種或多種化合物。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明中的化合物、方法和藥物組合物可來自以下藥物類別中的一種或多種：8-羥基喹啉；α-羥基酮；氨基甲基苯并咪唑；氨基甲基吲哚；巴比妥類；苯并異噻唑酮、羧化物、二硫代雙苯甲酰胺、二硫代氨基甲酸酯、甲酰胺、酰肼、氧羥肟酸、羥基吡啶酮/羥基吡喃酮、羥基磺酰胺、咪唑、酮水合物、n-酰基鄰苯二胺、n-羥基脲、o-取代的氨基膦酸酯(phosphamates)、氨基膦酸酯、膦、氨基磺酸酯、磺酰胺、磺基二亞胺、磺胺類、噻二嗪、噻二唑并硫酮和硫醇。例如，表1中的以下所列是代表性的，但不是可在本發(fā)明中使用的潛在化合物的詳盡列表。

表1.潛在化合物的實(shí)例

表2.潛在化合物的實(shí)例

表3.人帕金連接酶的氨基酸序列(seqidno:1)

本發(fā)明還涉及用于活化受試者的帕金連接酶的藥物制劑，其包含破壞至少一個(gè)帕金連接酶鋅指的藥物的有效劑量，其中該藥物或化合物可以配位鋅離子，或該藥物或化合物可以與半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及進(jìn)一步包含藥用賦形劑或輔料的藥物制劑。

本發(fā)明的方法包括將該組合物給予受試者的任何臨床上可接受的給藥途徑。在各個(gè)方面，給藥途徑是全身性的，例如口服或通過注射。藥物或化合物或其藥用鹽或衍生物經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)皮、經(jīng)肺、經(jīng)吸入、經(jīng)口腔、經(jīng)舌下、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)皮下、經(jīng)肌肉內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)胸膜內(nèi)、經(jīng)鞘內(nèi)、經(jīng)門靜脈內(nèi)和經(jīng)腸胃外給藥?；蛘呋蛄硗獾兀o藥途徑是局部的，例如局部、腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍。在一些實(shí)施方案中，口服給藥化合物。

在其它實(shí)施方案中，本文公開的藥物通過靜脈內(nèi)途徑給藥。在另外的實(shí)施方案中，腸胃外給藥可以以推注或通過輸注提供。

組合物的給藥方式部分取決于原因和/或位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到某些給藥途徑的優(yōu)點(diǎn)。

該方法包括給予有效量的藥物或化合物(或包含該藥物或化合物的組合物)以實(shí)現(xiàn)所需的生物反應(yīng)，例如，有效緩解、改善或預(yù)防待治療病癥例如腫瘤學(xué)和神經(jīng)病學(xué)病癥的全部或部分癥狀的量。

在各個(gè)方面中，表1和/或表2中所示任一結(jié)構(gòu)式的化合物或其鹽或酯的量為約0.001mg/kg至約100mg/kg體重(例如，約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.1mg/kg至約5mg/kg)。

所公開的化合物在藥用混合物中的濃度將根據(jù)若干因素而變化，包括所給藥化合物的劑量、所用化合物(一種或多種)的藥代動(dòng)力學(xué)特征和給藥途徑。藥物可以以單一劑量或重復(fù)劑量給藥。使用本發(fā)明化合物的劑量方案根據(jù)包括以下的各種因素來選擇：患者的類型、物種、年齡、體重、性別和身體狀況；待治療病癥的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的腎功能和肝功能；以及所使用的特定化合物或其鹽。治療可以每天或更頻繁地給予，這取決于多種因素，包括患者的總體健康狀況、以及所選化合物(一種或多種)的制劑和給藥途徑。普通技術(shù)的醫(yī)生或獸醫(yī)可以容易地確定和處方所需的藥物有效量以預(yù)防、對(duì)抗或阻止病癥進(jìn)展。

本發(fā)明的化合物或組合物可以以單一或多個(gè)單位劑量形式制造和/或給予。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及包含表1和/或表2中所示任一結(jié)構(gòu)式的化合物和藥用載體的組合物，藥用載體例如為藥用賦形劑、載體、粘合劑和/或稀釋劑。

用于制劑和給予本發(fā)明所公開化合物的技術(shù)可在remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，mackpublishingco.，easton，pa(1995)中找到。

在其它實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的化合物及其藥用鹽、溶劑合物、水合物和前藥與藥用載體或稀釋劑組合使用在藥物制劑中。適當(dāng)?shù)乃幱幂d體包括惰性固體填充劑或稀釋劑和無菌水性或有機(jī)溶液。任選地，組合物包含一種或多種另外的治療劑?；衔飳⒁宰阋栽诒旧暾?qǐng)所述的范圍內(nèi)提供所需劑量的量在此類藥物組合物中存在。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以以其已有確定的使用水平另外包含常規(guī)見于藥物組合物中的其他輔助成分。因此，例如，組合物可含有附加的、相容的藥物活性物質(zhì)，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有用于物理配制本發(fā)明組合物的各種劑型的附加物質(zhì)，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，此類物質(zhì)在添加時(shí)不應(yīng)不適當(dāng)?shù)馗蓴_本發(fā)明組合物的組分的生物活性。制劑可經(jīng)滅菌，如果需要的話，與助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳族物質(zhì)等混合，其不會(huì)與制劑的寡核苷酸有害地相互作用。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種賦形劑。在某些此類實(shí)施方案中，賦形劑選自水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、淀粉酶、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘石蠟、羥基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物使用已知技術(shù)來制備，其包括但不限于混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或壓片過程。

另外的實(shí)施方案涉及藥物制劑，該制劑選自：固體、粉末、液體和凝膠。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是是液體(例如，懸浮液、酏劑和/或溶液)。在某些此類實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的成分制備液體藥物組合物，其包括但不限于水、二醇類、油、醇、調(diào)味劑、防腐劑和著色劑。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是是固體(例如，粉末、片劑和/或膠囊)。在某些此類實(shí)施方案中，固體藥物組合物包含本領(lǐng)域已知的一種或多種成分，其包括但不限于淀粉、糖、稀釋劑、制粒劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物被配制為貯庫制劑。某些此類貯庫制劑通常比非貯庫制劑更為長效。在某些實(shí)施方案中，此類制劑通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過肌內(nèi)注射來給藥。在某些實(shí)施方案中，使用適當(dāng)?shù)木酆匣蚴杷镔|(zhì)(例如在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂或作為微溶性衍生物，例如作為微溶性鹽來制備貯庫制劑。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含遞送系統(tǒng)。遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于脂質(zhì)體和乳劑。某些遞送系統(tǒng)可用于制備某些包括包含疏水化合物的那些的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，使用某些有機(jī)溶劑，例如二甲基亞砜。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含共溶劑系統(tǒng)。某些此類共溶劑系統(tǒng)包含例如芐醇、非極性表面活性劑、水混溶性有機(jī)聚合物和水相。在某些實(shí)施方案中，此類共溶劑系統(tǒng)用于疏水化合物。此共溶劑系統(tǒng)的非限制性實(shí)例是vpd共溶劑系統(tǒng)，其是包含3％w/v芐醇、8％w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300的無水乙醇溶液。此類共溶劑系統(tǒng)的比例可以相當(dāng)?shù)刈兓伙@著改變其溶解性和毒性特征。此外，共溶劑組分的特性可以變化：例如，可以使用其它表面活性劑代替聚山梨醇酯80；聚乙二醇的分?jǐn)?shù)大小可以變化；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；且其他糖或多糖可代替葡萄糖。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含持續(xù)釋放系統(tǒng)。此持續(xù)釋放系統(tǒng)的非限制性實(shí)例是固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，持續(xù)釋放系統(tǒng)根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)可能會(huì)經(jīng)數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月釋放藥物。

在某些實(shí)施方案中，制備本發(fā)明的藥物組合物用于口服給藥。在某些此類實(shí)施方案中，藥物組合物通過組合一種或多種藥物和藥用載體來配制。某些此類載體使得藥物組合物能被配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于受試者的口服攝取。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括但不限于填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。在某些實(shí)施方案中，任選地研磨此混合物并任選地加入助劑。在某些實(shí)施方案中，形成藥物組合物以獲得片劑或糖衣丸芯。在某些實(shí)施方案中，加入崩解劑(例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸鹽或其鹽，例如藻酸鈉)。

在某些實(shí)施方案中，糖衣丸芯伴隨包衣提供。在某些此類實(shí)施方案中，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可以添加到片劑或糖衣丸包衣中。

在某些實(shí)施方案中，用于口服給藥的藥物組合物是由明膠制成的推入-配合膠囊。某些此類推入-配合膠囊包含一種或多種本發(fā)明的藥物，其與一種或多種填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉和/或潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂以及任選的穩(wěn)定劑混合。在某些實(shí)施方案中，用于口服給藥的藥物組合物是由明膠和增塑劑例如甘油或山梨糖醇制成的軟的密封膠囊。在某些軟膠囊中，本發(fā)明的一種或多種藥物可溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)囊后w中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于口腔給藥。某些此類藥物組合物是以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于通過注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)等)給藥。在某些此類實(shí)施方案中，藥物組合物包含載體并且配制在水溶液中，例如水或生理相容的緩沖液，例如漢克溶液，林格溶液或生理鹽水緩沖液。在某些實(shí)施方案中，包括其他成分(例如，有助于溶解或用作防腐劑的成分)。在某些實(shí)施方案中，使用適當(dāng)?shù)囊后w載體、懸浮劑等制備可注射懸浮液。用于注射的某些藥物組合物以單位劑量形式存在在例如安瓿或多劑量容器中。某些用于注射的藥物組合物是在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制劑，例如助懸劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。適用于用于注射的藥物組合物中的某些溶劑包括但不限于親脂性溶劑和脂肪油，例如芝麻油、合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，以及脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。任選地，此類懸浮液還可以含有增加藥物的溶解度以允許制備高度濃縮的溶液的適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑或試劑。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于經(jīng)粘膜給藥。在某些此類實(shí)施方案中，在制劑中使用適合于滲透屏障的滲透劑。此類滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于通過吸入給藥。某些此類用于吸入的藥物組合物以氣霧劑噴霧的形式在加壓包裝或霧化器中制備。某些此類藥物組合物包括推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)?shù)臍怏w。在使用加壓氣溶膠的某些實(shí)施方案中，劑量單位可以用遞送計(jì)量量的閥來確定。在某些實(shí)施方案中，可以配制用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒。某些此類制劑包含本發(fā)明的藥物和諸如乳糖或淀粉的適當(dāng)?shù)姆勰┗|(zhì)的粉末混合物。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于直腸給藥，例如栓劑或保留灌腸。某些此類藥物組合物包含已知的成分，例如可可脂和/或其它甘油酯。

在某些實(shí)施方案中，制備藥物組合物用于局部給藥。某些此類藥物組合物包含溫和的保濕基質(zhì)，例如軟膏或霜?jiǎng)?。示例性的適當(dāng)?shù)能浉嗷|(zhì)包括但不限于凡士林、凡士林加揮發(fā)性硅酮、以及羊毛脂和油包水乳液。示例性的適當(dāng)?shù)娜楦嗷|(zhì)包括但不限于冷霜和親水性軟膏。

在某些實(shí)施方案中，治療有效量足以預(yù)防、緩解或改善疾病癥狀或延長被治療受試者的生存。治療有效量的確定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的一種或多種化合物配制為前藥。在某些實(shí)施方案中，體內(nèi)給藥時(shí)，前藥在化學(xué)上被轉(zhuǎn)化為生物學(xué)上、藥學(xué)上或治療上更有活性的形式。在某些實(shí)施方案中，前藥是有用的，因?yàn)樗鼈儽认鄳?yīng)的活性形式更容易施用。例如，在某些情況下，前藥可以比相應(yīng)的活性形式更具生物利用度(例如通過口服給藥)。在某些情況下，與相應(yīng)的活性形式相比，前藥可具有改善的溶解性。在某些實(shí)施方案中，前藥比相應(yīng)的活性形式水溶性更低。在某些情況下，此類前藥具有優(yōu)異的跨細(xì)胞膜傳輸，其中水溶性對(duì)移動(dòng)性有害。在某些實(shí)施方案中，前藥是酯。在某些此類實(shí)施方案中，酯在給藥時(shí)被代謝水解成羧酸。在某些情況下，含羧酸化合物是相應(yīng)的活性形式。在某些實(shí)施方案中，前藥包括與酸基結(jié)合的短肽(聚氨基酸)。在某些此類實(shí)施方案中，肽在給藥時(shí)被切割以形成相應(yīng)的活性形式。

在某些實(shí)施方案中，通過改變藥學(xué)活性化合物來產(chǎn)生前藥，使得活性化合物在體內(nèi)給藥時(shí)將被再生。前藥可以被設(shè)計(jì)成改變藥物的代謝穩(wěn)定性或運(yùn)輸特性，以掩蓋副作用或毒性、以改善藥物的風(fēng)味或改變藥物的其它特征或性質(zhì)。由于知曉藥效學(xué)過程和藥物體內(nèi)代謝，一旦藥學(xué)活性化合物是已知的，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)該化合物的前藥(參見例如，nogrady(1985)medicinalchemistryabiochemicalapproach，oxforduniversitypress，newyork，388-392頁)。

現(xiàn)已總體上描述了本發(fā)明，通過參考以下以實(shí)例說明提供的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，且其而無意于限制本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1:帕金活化劑的鑒定

測(cè)定原理：

測(cè)定基于活性基探針(abp)與酶中活性位點(diǎn)半胱氨酸的不可逆反應(yīng)。abp由在n末端具有表位標(biāo)記(例如hatag)的泛素部分和c末端的反應(yīng)性基團(tuán)組成。帕金-rbr(不包括r0抑制域)的活性顯著高于帕金-r0rbr的活性或全長帕金的活性。abp對(duì)帕金的共價(jià)結(jié)合可以通過時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(tr-fret)來監(jiān)測(cè)

-帕金-r0rbr、全長帕金→低tr-fret信號(hào)(陰性對(duì)照)

-帕金rbr→高tr-fret信號(hào)(陽性對(duì)照)

增加帕金-r0rbr活性或增加全長-帕金活性的化合物可以通過tr-fret信號(hào)的增加來識(shí)別。

策略：使用帕金-r0rbr、全長帕金和帕金-rbr的n末端his-sumo標(biāo)記的構(gòu)建體(來自evotecslides；基于riley等人2013.natcommun.4:1982和由e3xbio提供的信息；授予申請(qǐng))

構(gòu)建體：

–如通過riley等人所述在大腸桿菌中表達(dá)具有n末端his6-sumo-標(biāo)記(可在使用senp1蛋白酶純化期間潛在地除去)的全長帕金(1-465)、r0rbr(141-465)和rbr(238-465)。

-n末端his6-標(biāo)記使得能夠進(jìn)行tr-fret測(cè)定→使用仍具有n末端his6-sumo-標(biāo)記的純化蛋白。

-對(duì)所有構(gòu)建體進(jìn)行小規(guī)模測(cè)試以評(píng)估全長帕金或r0rbr中的哪種構(gòu)建體得到更好的產(chǎn)出以促進(jìn)hts測(cè)定。

階段1：蛋白產(chǎn)生

–通過第三方初始基因合成具有n末端his6-sumo、his6-sumo-r0rbr和his6-sumo-rbr的全長帕金，密碼子優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)以及亞克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中

-通過免疫印跡(westernblotting)評(píng)估小規(guī)模測(cè)試表達(dá)以估計(jì)可溶性蛋白的產(chǎn)量

-如riley等人的概述，以6-24l的規(guī)模(取決于小規(guī)模測(cè)試表達(dá)的結(jié)果)將rbr構(gòu)建體以及全長帕金結(jié)構(gòu)體或r0rbr構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到bl21(de3)中并表達(dá)

-如riley等人*所述純化～10mgrbr構(gòu)建體以及全長帕金構(gòu)建體或或r0rbr構(gòu)建體，即imac、monoq和尺寸排阻。

階段2：測(cè)定開發(fā)

-目標(biāo)：在1,536孔測(cè)定板格式中設(shè)置穩(wěn)健的初步篩選測(cè)定

-以384孔格式建立具有合理動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)定(例如使用帕金+/-r0抑制域)

-優(yōu)化測(cè)定(例如，關(guān)于測(cè)定組分的濃度、緩沖液、添加劑、試劑的加入順序和培養(yǎng)溫度)

-運(yùn)行時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)以定義最佳培養(yǎng)時(shí)間

-論證測(cè)定穩(wěn)健性(目標(biāo)：z’>0.5)

-論證讀數(shù)穩(wěn)定性

-測(cè)試dmso耐受

-通過ub滴定(與abp競爭)論證使用帕金rbr域(不包括r0抑制域)獲得的測(cè)定信號(hào)的特異性

-將測(cè)定從384孔轉(zhuǎn)移至最終的1,536孔篩選板格式；使測(cè)定適應(yīng)evoscreen^tmmarkiiihts平臺(tái)

-如果需要，微調(diào)測(cè)定條件以優(yōu)化此高密度板格式(目標(biāo)：z’>0.5)的測(cè)定穩(wěn)健性，并論證測(cè)定適用于高通量篩選(hts)

-在篩選條件下確認(rèn)測(cè)定試劑的經(jīng)時(shí)穩(wěn)定性

-論證板對(duì)板和日對(duì)日測(cè)定穩(wěn)健性

-估計(jì)和獲得篩選和命中分析(hitprofiling)所需的所有測(cè)定試劑的量。

階段3：篩選

標(biāo)記庫篩選(mls)：

-以一式三份的兩種濃度預(yù)篩針對(duì)初篩測(cè)定的約2.5k種代表性的先導(dǎo)(lead-like)化合物的不同標(biāo)記庫

-使用3-σ方法(基于板的、基于無化合物dmso孔的散射)的mls和命中定義的統(tǒng)計(jì)分析

-選擇初篩的最佳化合物濃度

初篩(ps):

-在一個(gè)均勻化合物濃度(n＝1)篩選針對(duì)初篩測(cè)定的約75,000種先導(dǎo)化合物；重新篩選不符合約定的重新篩選標(biāo)準(zhǔn)(例如z’>0.5)的化合物板

-使用3-σ方法(基于板的、基于無化合物dmso孔的散射)的初篩的命中定義

-統(tǒng)計(jì)分析初篩→初級(jí)命中化合物(帕金活化劑)

命中確認(rèn)(hc)：

-選擇一組最多約750個(gè)初級(jí)命中用于命中確認(rèn)

-隨意選取選定的化合物并重新格式化用于測(cè)試

-在化合物篩選濃度對(duì)針對(duì)初篩所選的cpds進(jìn)行重新測(cè)試(n＝3)

-命中確認(rèn)活動(dòng)的統(tǒng)計(jì)分析→識(shí)別確認(rèn)的小分子帕金活化劑。

階段4：命中分析(hp):

-選擇一組最多約250個(gè)確認(rèn)的命中化合物用于命中分析

-隨意選取選定的化合物并重新格式化用于濃度響應(yīng)測(cè)試

-濃度響應(yīng)測(cè)試為針對(duì)初篩測(cè)試的11點(diǎn)化合物連續(xù)稀釋(n＝2)

-濃度響應(yīng)曲線的自動(dòng)數(shù)據(jù)擬合和所得ic50值的計(jì)算

-lc/ms檢查命中化合物以確認(rèn)化合物同一性和純度

-活性命中化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析(sar)

-經(jīng)確認(rèn)和剖析的小分子帕金活化劑

實(shí)施例2:使用泛素乙烯砜探針的基于活性的探針測(cè)定

可以使用不可逆地結(jié)合帕金連接酶的活性位點(diǎn)半胱氨酸的泛素乙烯砜探針。通過tr-fret可以監(jiān)測(cè)探針與帕金的共價(jià)結(jié)合。候選活化劑化合物可以通過歸因于tr-fret信號(hào)增加的帕金連接酶活性的增加來識(shí)別?；罨衔锏暮Y選可以與對(duì)照區(qū)別如下：

100％活化信號(hào)＝熱活化的帕金+dmso中的100nm對(duì)照活化劑。0％活化信號(hào)＝熱活化的帕金+僅dmso?？梢酝ㄟ^0％活化信號(hào)tr-fret信號(hào)的增加來識(shí)別帕金活化劑。

測(cè)定條件：

材料：

測(cè)定板:白色384孔板(corning3572)

酶:帕金-his標(biāo)記的203μm(10.5mg/ml)

探針:泛素乙烯砜(ha-ub-vsbostonbiochemu-212)

dmso:dmso(sigma批號(hào)#d4540-100ml)

反應(yīng)緩沖液:50mmhepes(ph8.5)、150mmnacl、0.01％吐溫20、0.1％bsa

檢測(cè)緩沖液:50mmhepes(ph8.5)、150mmnacl、0.01％吐溫20、0.1％bsa、800mmkf

檢測(cè)試劑a:檢測(cè)緩沖液中的2.6nm抗6his-eu穴狀化合物和40nm抗ha-xl665

eu穴狀化合物:抗6his-eu穴狀化合物(cisbio61hiskla)

xl665:抗ha-xl665(cisbio610haxla)

酶反應(yīng)(僅采用活化劑預(yù)培養(yǎng)帕金15分鐘)

帕金:40nm

ha-ub-vs探針:70nm

活化劑/dmso:2x活化劑候選物/2％dmso

反應(yīng)時(shí)間:60分鐘

溫度:22℃

總體積:10μl反應(yīng)混合物

檢測(cè)反應(yīng)

取10μl上述酶反應(yīng)混合物并加入10μl檢測(cè)試劑a，條件如下：

反應(yīng)時(shí)間:60分鐘

溫度:22℃

總體積:20μl

測(cè)定操作：

1)在酶反應(yīng)緩沖液中熱活化帕金(500μl/1.5ml管:eppendorfthermomixer5分鐘，在58℃400rpm并放在冰上直至需要)。

2)通過使用bravo，采用反應(yīng)緩沖液中的4.8μl84.5nm帕金裝載測(cè)定板孔。

3)通過使用hpd-300化合物分配器在dmso中遞送0.2μl200x活化劑候選。最高200x濃度＝20μm，然后兩倍稀釋。

4)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

5)室溫孵育板15分鐘

6)通過使用bravo加入反應(yīng)緩沖液中的5μl140nmha-ub-vs探針。

7)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

8)室溫孵育板60分鐘

9)加入檢測(cè)緩沖液中的10μl2.6nm抗6his-eu穴狀化合物和40nm抗ha-xl665。

10)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

11)室溫孵育板60分鐘

12)在perkinelmerenvision儀器上讀板。

數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)可在csv文件中讀取。這些csv文件中有兩個(gè)表，分別是655nm(通道1)和615nm(通道2)波長的值。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為htrf比率＝(通道1/通道2)*10,000

所有0um對(duì)照(僅dmso)的均值＝bkgd(背景–0％活化)。從每個(gè)htrf比值減去bkgd＝htrf-bkgd。dmso對(duì)照中所有100um100nm對(duì)照活化劑的均值＝max(100％活化)。然后使用以下方程式以計(jì)算如下的每個(gè)孔/候選物的活化％：活化％＝(htrf-bkgd/max)*100。

然后可以使用化合物滴定的活化％來發(fā)現(xiàn)活化ec50或最高活化％，如果對(duì)于候選化合物看到小于75％活化的話。

實(shí)施例3:采用候選親電體和螯合劑化合物的基于活性的探針測(cè)定

如以上實(shí)施例2中所述采用表1和/或表2中的各種化合物進(jìn)行基于活性的探針測(cè)定。至少兩種化合物表明增加的帕金與基于活性的探針泛素-乙烯砜的活性。如圖1中證實(shí)的，化合物n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，一種螯合劑化合物(ah001)，其增加了帕金連接酶與基于活性的泛素乙烯砜探針的反應(yīng)。

類似地，如圖2中所示，6-芐基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，一種親電體和螯合劑化合物(ah007)，其增加了帕金連接酶與基于活性的泛素乙烯砜探針的反應(yīng)。該實(shí)施例表明螯合劑和親電體二者都可以調(diào)節(jié)和/或增加帕金連接酶活性。

實(shí)施例4:帕金pub自動(dòng)泛素化測(cè)定

使用帕金pub自動(dòng)泛素化測(cè)定以評(píng)估候選化合物活化帕金自動(dòng)泛素化自身的能力的潛力。

該測(cè)定的原理是e3連接酶帕金催化泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白，但也具有自動(dòng)泛素化自身的能力。添加到該測(cè)定中的磷酸泛素(pub)將帕金改變?yōu)樾》肿踊罨瘎┛梢酝ㄟ^e1-e2級(jí)聯(lián)反應(yīng)使得帕金能夠自動(dòng)泛素化的狀態(tài)。使用結(jié)合his標(biāo)記的帕金的eu穴狀化合物泛素和抗6his-d2將在當(dāng)eu穴狀化合物泛素自動(dòng)泛素化至帕金上時(shí)產(chǎn)生信號(hào)，其可通過tr-fret監(jiān)測(cè)。

類似于實(shí)施例2和3中基于活性的探針測(cè)定，活化化合物的篩選可以與對(duì)照區(qū)別如下：

100％活化信＝pub活化的帕金+dmso中的40nm對(duì)照活化劑。

0％活化信號(hào)＝pub活化的帕金+僅dmso。

可以通過0％活化信號(hào)tr-fret信號(hào)的增加來識(shí)別帕金活化劑。

材料:

測(cè)定板:白色384孔板(corning3572)

酶1:5μme1(泛素-活化酶/ube1bostonbiocheme-305)

酶2:25μme2(ubch7/ube2l3bostonbiocheme2-640)

酶3:帕金-his標(biāo)記的203μm(10.5mg/ml)，由an2h供應(yīng)

pub:230μm(2mg/ml)磷酸泛素(s65)(bostonbiochemu-102)，由an2h供應(yīng)。

eu穴狀化合物試劑:1.77μm泛素eu(cisbio61ubikla)，采用250μl蒸餾水重構(gòu)。

dmso:dmso(sigma批號(hào)#d4540-100ml)

pf-127:pluronicf-127(fisherscientific50-310-494)

反應(yīng)緩沖液:50mmhepes、50mmnacl、1mmmgcl2、0.005％吐溫20、0.1％pf-127，ph8.5

檢測(cè)緩沖液:50mmhepes、50mmnacl、800mmkf、5mmedta、0.005％吐溫20、0.1％pf-127，ph8.5

檢測(cè)試劑z:檢測(cè)緩沖液中的13.4nm抗6his-d2

d2試劑:2.67μm抗6his-d2(cisbio61hisdla)，采用250μl蒸餾水重構(gòu)。

測(cè)定條件：

10μl酶反應(yīng)(僅預(yù)孵育帕金、pub和活化劑15分鐘)

帕金:196nm

pub:392nm

活化劑/dmso:1x活化劑/1％dmso

e1:5nm

e2:50nm

泛素eu:8.8nm

反應(yīng)時(shí)間:120分鐘

溫度:22℃

總體積:10μl反應(yīng)混合物

檢測(cè)反應(yīng)

取10μl上述酶反應(yīng)混合物并加入10μl檢測(cè)試劑z，在以下條件下：

反應(yīng)時(shí)間:60分鐘

溫度:22℃

總體積:20μl

測(cè)定操作：

1)通過使用bravo，采用反應(yīng)緩沖液中的4.9μl400.0nm帕金裝載測(cè)定板孔。

2)通過使用hpd-300化合物分配器在dmso中遞送0.1μl100x活化劑候選。最高100x濃度＝100μm，然后兩倍稀釋。在一式兩份的孔中加入各化合物和對(duì)照。

3)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

4)室溫孵育板15分鐘

5)通過使用bravo加入反應(yīng)緩沖液中的5μl10nme1、100nme2、17.6nm泛素eu和2mmatp。

6)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

7)室溫孵育板120分鐘

8)通過使用bravo加入檢測(cè)緩沖液中的10μl13.4nm抗hisd2。

9)室溫旋轉(zhuǎn)1000rpm，2分鐘

10)室溫孵育板60分鐘

11)在perkinelmerenvision儀器上讀板。

數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)可在csv文件中讀取。這些csv文件中有兩個(gè)表，分別是655nm(通道1)和615nm(通道2)波長的值。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為htrf比率＝(通道1/通道2)*10,000

所有0um對(duì)照(僅dmso)的均值＝bkgd(背景–0％活化)。從每個(gè)htrf比值減去bkgd＝htrf-bkgd。dmso對(duì)照中所有100um對(duì)照活化劑的均值＝max(100％活化)。然后使用以下方程式以計(jì)算如下的每個(gè)孔/候選物的活化％：活化％＝(htrf-bkgd/max)*100。

然后可以使用化合物滴定的活化％來發(fā)現(xiàn)活化ec50或最高活化％，如果對(duì)于候選化合物看到小于75％活化的話。

實(shí)施例5:采用候選親電體和螯合劑化合物的帕金pub自動(dòng)泛素化測(cè)定

如以上實(shí)施例4中所述采用表1和/或表2中的各種化合物進(jìn)行帕金pub自動(dòng)泛素化測(cè)定。至少兩種化合物表明增加的帕金與基于活性的探針泛素-乙烯砜的活性。如圖3中證實(shí)的，化合物n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺，一種螯合劑化合物(ah001)，其增加了自動(dòng)泛素化測(cè)定中的帕金活性。此外，如圖4a中所示，n,n'-(1-苯基-1h-1,2,4-三唑-3,5-二基)二苯甲酰胺(ah001)在自動(dòng)泛素化測(cè)定中與pub協(xié)同增加帕金活化。

類似地，如圖5中所示，6-芐基-2,5-二甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-硫醇，一種親電體化合物(ah007)，其增加了自動(dòng)泛素化測(cè)定中的帕金活性。該實(shí)施例表明螯合劑和親電體二者都可以調(diào)節(jié)和/或增加自動(dòng)泛素化測(cè)定中的帕金連接酶活性。

實(shí)施例6:殘基c59和c377對(duì)于調(diào)節(jié)劑結(jié)合至帕金是關(guān)鍵的

用ah007化合物培養(yǎng)帕金連接酶，然后在蛋白水解消化以產(chǎn)生帕金連接酶片段后將混合物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。目的是識(shí)別含有結(jié)合ah007化合物的帕金的特異性片段，其揭示了帕金對(duì)該化合物的特異性結(jié)合殘基。當(dāng)通過質(zhì)譜分析時(shí)，化合物an2h07也是片段化的。因此，也可以識(shí)別連接在帕金的特定殘基上的化合物ah007的特征片。

這些片段的特征在于指示ah007預(yù)測(cè)分子量的結(jié)合小分子的片段大小的變化。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在帕金連接酶的兩個(gè)特定殘基上識(shí)別了ah007的三個(gè)特異性片段。該數(shù)據(jù)識(shí)別了連接于帕金連接酶的半胱氨酸殘基377(c377)的ah007化合物的253.08-256.09片段和連接于c377的ah007化合物的343.14-346.14的片段。數(shù)據(jù)還識(shí)別了連接于帕金連接酶的半胱氨酸殘基59(c59)的ah007化合物的253.08-256.09片段。因此，采用ah007化合物培養(yǎng)的帕金連接酶的質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明該化合物結(jié)合和/或連接至帕金連接酶中的兩個(gè)特異性位點(diǎn)：c59和c377。殘基c59和c377是觀察到的唯一兩個(gè)一致的位點(diǎn)，即使在與帕金連接酶的混合物中ah007化合物的濃度急劇增加時(shí)，這提示這些位點(diǎn)在多個(gè)其它潛在連接位點(diǎn)之上的特異性。還認(rèn)為，至少c377包含在人帕金連接酶的znf域中，且因此符合柔性帕金連接酶znf域中的半胱氨酸殘基易于被小分子候選物連接和/或中斷的理論。包含c59和/或c377的帕金的肽片段將有用于設(shè)計(jì)進(jìn)一步的結(jié)合測(cè)定和另外的調(diào)節(jié)劑的選擇。

本申請(qǐng)所討論的出版物僅僅是針對(duì)其在本申請(qǐng)申請(qǐng)日之前的公開內(nèi)容而提供。本申請(qǐng)不得被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無法憑借在先發(fā)明而先于該出版物。

雖然已結(jié)合本發(fā)明提出的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，能夠進(jìn)行進(jìn)一步的修改，并且本申請(qǐng)旨在涵蓋本發(fā)明的任何變化、使用或改編，一般而言，其遵循本發(fā)明的原理并且包括如本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知或習(xí)慣的實(shí)踐范圍內(nèi)的以及如可以應(yīng)用于上文所闡述的基本特征的以及如所附權(quán)利要求的范圍中遵循的本公開內(nèi)容的偏離。

序列表

<110>an2h探索有限公司

johnston,jennifer

<120>帕金連接酶活化方法和組合物

<130>andi-001/03us323223-2006

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