相關申請案交叉參考

本申請案主張2014年12月15日提出申請的美國臨時申請案第62/092,191號的權益，所述文件的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

政府支持

本發(fā)明是在政府支持下在國家衛(wèi)生研究院(nationalinstituteofhealth)所授予的許可號nihnciu54ca199081-01下作出。

本發(fā)明大體來說涉及環(huán)狀肽與環(huán)狀肽結(jié)合的納米顆粒和使用所述環(huán)狀肽和/或所述與環(huán)狀肽結(jié)合的納米顆粒進行手術中神經(jīng)組織成像的方法。

背景技術：

許多手術程序攜帶意外神經(jīng)損害或橫斷的風險，此可產(chǎn)生大量問題(例如慢性疼痛或癱瘓)。已研究在手術期間使用近紅外(nir)藥劑來突出顯示神經(jīng)組織，由此增強外科醫(yī)生避免切割或損害所突出顯示神經(jīng)組織的能力。舉例來說，已使用諸如二苯乙烯基苯和噁嗪等分子，但其缺乏有效用于人類和其它哺乳動物中的手術中應用所需的結(jié)合特性和/或光譜性質(zhì)。

惠特尼(whitney)等人通過將噬菌體展示方法應用于切下的鼠類周邊神經(jīng)而鑒別出若干神經(jīng)結(jié)合多肽(惠特尼m.a.；克里斯普j.l.(crisp,j.l.)；阮l.t.(nguyen,l.t.)；弗里德曼b.(friedman,b.)；格羅斯l.a.(gross,l.a.)；斯坦巴克p.(steinbach,p.)；錢r.y.(tsien,r.y.)；阮q.t.自然生物技術(nat.biotech.)2011,29,352)。隨后使用熒光團或nir染料標記序列，且在體外和在體內(nèi)評估結(jié)合。較背景提供最高對比的序列為17殘基多肽np41(圖1a)。需要對神經(jīng)組織具有增強的選擇性且對于手術中應用具有改良光譜性質(zhì)的神經(jīng)結(jié)合劑。

技術實現(xiàn)要素：

本文描述環(huán)狀肽、與環(huán)狀肽結(jié)合的納米顆粒和使用所述環(huán)狀肽和/或所述與環(huán)狀肽結(jié)合的納米顆粒進行手術中神經(jīng)組織成像的方法。

在一個方面中，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)結(jié)合肽偶聯(lián)物，其包括：環(huán)狀肽、納米顆粒、熒光劑和連接體部分。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種神經(jīng)結(jié)合肽偶聯(lián)物，其包括：線性多肽、納米顆粒、熒光劑和連接體部分。

在某些實施例(任一方面)中，納米顆粒包括：基于二氧化硅的核心；位于核心內(nèi)的熒光劑；環(huán)繞核心的至少一部分的二氧化硅殼體；附接到納米顆粒的連接體部分；和任選地1到20個附接到經(jīng)聚合物涂覆的納米顆粒的肽配體。

在某些實施例(任一方面)中，納米顆粒為超小顆粒(舉例來說，平均直徑小于100nm、例如小于50nm、例如小于30nm、例如小于20nm、例如小于10nm)(舉例來說，其中超小納米顆粒為c點或c’點)。

在某些實施例(任一方面)中，連接體部分包括一個或多個選自由以下組成的群組的成員：聚乙二醇(peg)、peg2和氨基甲酸對氨基芐基氧基酯(pabc)(舉例來說，其中連接體部分具有2到50個原子)。在某些實施例中，連接體部分包括一個或多個描述于美國專利申請案第14/722,307號(2015年5月27日提出申請，公開為美國專利申請公開案第us2015/0343091號，所述文件的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中)的連接體部分。

在某些實施例中，環(huán)狀肽通過連接體部分結(jié)合到納米顆粒。在某些實施例(任一方面)中，熒光劑包括青色素染料(例如cy5或cy5.5)。在某些實施例(任一方面)中，神經(jīng)結(jié)合肽偶聯(lián)物具有5到20個氨基酸殘基和/或15原子到60原子大環(huán)。在某些實施例(任一方面)中，神經(jīng)結(jié)合肽偶聯(lián)物具有17個氨基酸殘基和/或51原子大環(huán)。

在某些實施例中，環(huán)狀肽包括肽序列ntqtlakapeht。在某些實施例中，大環(huán)是通過頭對尾環(huán)化肽或通過在序列內(nèi)部引入共價鍵來形成。在某些實施例中，環(huán)狀肽包括選自由以下組成的群組的肽序列：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在另一方面中，本發(fā)明涉及包括肽序列ntqtlakapeht的環(huán)狀肽。

在另一方面中，本發(fā)明涉及包括選自由以下組成的群組的肽序列的環(huán)狀肽：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在另一方面中，本發(fā)明涉及一種環(huán)狀肽組合物，其包括：熒光劑；和包括肽序列ntqtlakapeht的環(huán)狀肽。

在另一方面中，本發(fā)明涉及一種環(huán)狀肽組合物，其包括：熒光劑；和包括選自由以下組成的群組的肽序列的環(huán)狀肽：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在某些實施例中，環(huán)狀肽包括大環(huán)。在某些實施例中，大環(huán)是通過頭對尾環(huán)化肽或通過在序列內(nèi)部引入共價鍵來形成。

在另一方面中，本發(fā)明涉及一種包括具有如圖1b或圖4a-4h中所展示的結(jié)構的環(huán)狀肽的環(huán)狀肽組合物。在某些實施例中，環(huán)狀肽附接到納米顆粒。在某些實施例中，環(huán)狀肽通過連接體部分共價或非共價附接到納米顆粒。在某些實施例中，環(huán)狀肽經(jīng)官能化。

在任一上述方面的某些實施例中，組合物另外包括放射標記。

在另一方面中，本發(fā)明涉及一種成像方法，其包括：向個體投與包括任一上述方面的組合物的調(diào)配物且使組合物選擇性結(jié)合到個體的神經(jīng)組織；將個體組織曝露于激發(fā)光；和檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光以產(chǎn)生圖像且顯示圖像。

在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光強于從周圍組織發(fā)射的光(舉例來說，神經(jīng)對肌肉信號比至少為2)，從而神經(jīng)組織可與周圍組織目測區(qū)分。在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光可至少早在向個體(例如其中個體為動物，例如其中個體為人類)投與調(diào)配物后15分鐘檢測到。在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光可至少晚在向個體(例如其中個體為動物，例如其中個體為人類)投與調(diào)配物后1小時(例如至少1小時、至少2小時、至少3小時或至少4小時)檢測到。

在某些實施例中，投與包括在手術暴露之后將調(diào)配物局部施加到毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或在其附近的周邊神經(jīng)干中。在某些實施例中，所述方法包括將調(diào)配物局部施加到周邊神經(jīng)干(例如在手術暴露之后毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或在其附近)，從而使得調(diào)配物的組合物從神經(jīng)干擴散到神經(jīng)組織的較小分支，且檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光以產(chǎn)生神經(jīng)組織的較小分支的圖像。

在某些實施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)(通過i.v.)投與調(diào)配物。在某些實施例中，局部投與調(diào)配物。在某些實施例中，在手術程序期間將個體組織曝露于激發(fā)光。在某些實施例中，圖像為視頻和/或靜止圖像和/或?qū)崟r視頻。在某些實施例中，在實施于個體上的手術程序期間向外科醫(yī)生顯示圖像。

在另一方面中，本發(fā)明涉及一種成像方法，其包括：將個體組織曝露于激發(fā)光，其中已向個體投與包括任一上述方面的組合物的調(diào)配物；和檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光。

在某些實施例中，檢測步驟包括檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光以產(chǎn)生圖像且顯示圖像。在某些實施例中，所述方法進一步包括向個體投與組合物的步驟。

在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光強于從周圍組織發(fā)射的光(舉例來說，神經(jīng)對肌肉信號比至少為2)，從而神經(jīng)組織可與周圍組織目測區(qū)分。在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光可至少早在向個體(例如其中個體為動物，例如其中個體為人類)投與調(diào)配物后15分鐘檢測到。在某些實施例中，從神經(jīng)組織發(fā)射的光可至少晚在向個體(例如其中個體為動物，例如其中個體為人類)投與調(diào)配物后1小時(例如至少1小時、至少2小時、至少3小時或至少4小時)檢測到。在某些實施例中，在手術暴露之后通過局部施加將調(diào)配物投與毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或在其附近的周邊神經(jīng)干。在某些實施例中，通過局部施加將調(diào)配物投與周邊神經(jīng)干(例如在手術暴露之后毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或在其附近)，從而調(diào)配物的組合物從神經(jīng)干擴散到神經(jīng)組織的較小分支，其中所述方法包括檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光以產(chǎn)生神經(jīng)組織的較小分支的圖像。在某些實施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)(通過i.v.)投與調(diào)配物。在某些實施例中，局部投與調(diào)配物。

在某些實施例中，在手術程序期間將個體組織曝露于激發(fā)光。在某些實施例中，檢測步驟包括檢測由組合物的熒光劑發(fā)射的光以產(chǎn)生圖像且顯示圖像，其中圖像為視頻和/或靜止圖像和/或?qū)崟r視頻。在某些實施例中，在實施于個體上的手術程序期間向外科醫(yī)生顯示圖像。

定義

為更容易地理解本發(fā)明，下文首先定義某些術語。下列術語及其它術語的其它定義闡釋于本說明書通篇中。

在本申請案中，除非另有說明，否則使用“或”意指“和/或”。如本申請案中所使用，術語“包括(comprise)”和所述術語的變化形式(例如“包括(comprising和comprises)”)并不打算排除其它添加劑、組份、整數(shù)或步驟。如本申請案中所使用，術語“約”和“大約”可作為等效物使用。本申請案中所使用帶有或不帶有約/大約的任何數(shù)值打算涵蓋所屬領域技術人員所了解的任何正常波動。在某些實施例中，除非另外說明或否則從上下文顯而易見，否則術語“大約”或“約”涉及一系列在所陳述參考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小內(nèi)的值(所述數(shù)字可能超過可能值的100％時除外)。

“投與”：術語“投與”涉及將物質(zhì)或調(diào)配物引入個體中。一般來說，可利用任一投與途徑，包含(例如)非經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi))、經(jīng)口、局部、皮下、腹膜腔、動脈內(nèi)、吸入、陰道、直腸、經(jīng)鼻、引入腦脊髓液中或滴入體腔中。在一些實施例中，投與為經(jīng)口投與。另外或或者，在一些實施例中，投與為非經(jīng)腸投與。在一些實施例中，投與為靜脈內(nèi)投與。在某些實施例中，通過局部注射與靜脈內(nèi)投與來投與物質(zhì)或調(diào)配物。舉例來說，可以足夠高濃度局部注射具有含肽組合物(例如含顆粒和非含顆粒組合物)的物質(zhì)或調(diào)配物以用于成像目的。在某些實施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)投與非顆粒含肽組合物。

“生物相容”：本文所用的術語“生物相容”打算描述不在體內(nèi)誘發(fā)實質(zhì)性有害反應的材料。在某些實施例中，如果材料對細胞無毒，則其為“生物相容”。在某些實施例中，如果將材料在體外添加到細胞中產(chǎn)生小于或等于20％細胞死亡和/或其體內(nèi)投與并不誘導發(fā)炎或其它所述不利效應，則其為“生物相容”。在某些實施例中，材料為生物可降解。

“生物可降解”：如本文中所使用，“生物可降解”材料為在引入細胞中時通過細胞機制(例如酶促降解)或通過水解成細胞可再利用或棄除且對細胞并無顯著毒性效應的組份而分解者。在某些實施例中，通過分解生物可降解材料所生成的組份并不在體內(nèi)誘導發(fā)炎和/或其它不利效應。在一些實施例中，以酶促方式分解生物可降解材料?；蛘呋蛄硗?，在一些實施例中，通過水解來分解生物可降解材料。在一些實施例中，生物可降解聚合材料分解成其組份聚合物。在一些實施例中，生物可降解材料(包含(例如)生物可降解聚合材料)的分解包含酯鍵的水解。在一些實施例中，材料(包含(例如)生物可降解聚合材料)的分解包含氨基甲酸酯鏈接的裂解。

“載劑”：如本文中所使用，術語“載劑”涉及與化合物一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。所述醫(yī)藥載劑可為無菌液體，例如水和油，包含那些石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油和諸如此類。優(yōu)選采用水或水性溶液鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液作為載劑，尤其用于可注射溶液。適宜醫(yī)藥載劑描述于“雷明頓醫(yī)藥科學(remington'spharmaceuticalsciences)”(e.w.馬丁(e.w.martin))中。

“檢測器”：如本文中所使用，“檢測器”涉及電磁輻射的任一檢測器，包含(但不限于)ccd照相機、光倍增管、光二極管和突崩光二極管。

“圖像”：如本文中所使用，術語“圖像”應理解為意指視覺顯示或可經(jīng)詮釋用于視覺顯示的任一數(shù)據(jù)表示。舉例來說，三維圖像可包含在三個空間維度中有所變化的給定量的值的數(shù)據(jù)組。三維圖像(例如三維數(shù)據(jù)表示)可以二維顯示(例如在二維屏幕上或在二維印出上)。舉例來說，術語“圖像”可涉及光學圖像、x射線圖像、通過正電子發(fā)射斷層攝影術(pet)、磁共振(mr)、單光子發(fā)射計算機斷層攝影術(spect)和/或超聲波生成的圖像和這些圖像的任一組合。

“肽”或“多肽”：術語“肽”或“多肽”涉及至少兩個(例如至少三個)由肽鍵連接到一起的氨基酸的串。在一些實施例中，多肽包括非天然氨基酸；或者或另外，在一些實施例中，多肽包括一個或多個非天然氨基酸(即并天然出現(xiàn)但可納入多肽鏈中的化合物；例如參見http://www.cco.caltech.edu/～dadgrp/unnatstruct.gif，其顯示已成功納入功能離子通道中的非天然氨基酸的結(jié)構)和/或可或者采用如業(yè)內(nèi)已知的氨基酸類似物)。在一些實施例中，可(例如)通過添加化學實體(例如碳水化合物基團、磷酸酯基團、法呢基、異法呢基、脂肪酸基團、用于偶聯(lián)、官能化或其它修飾的連接體等)來修飾蛋白質(zhì)中的一個或多個氨基酸。

“放射標記”：如本文中所使用，“放射標記”涉及包括至少一種元素的放射性同位素的部分。實例性適宜放射標記包含(但不限于)描述于本文中者。在一些實施例中，放射標記是用于正電子發(fā)射斷層攝影術(pet)中者。在一些實施例中，放射標記是用于單光子發(fā)射計算機斷層攝影術(spect)中者。在一些實施例中，放射性同位素包括^99mtc、¹¹¹in、⁶⁴cu、⁶⁷ga、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁷⁷lu、⁶⁷cu、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹¹c、¹3n、¹⁵o、¹⁸f、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁶⁶ho、¹⁷⁷lu、¹⁴⁹pm、⁹⁰y、²¹³bi、¹⁰³pd、¹⁰⁹pd、¹⁵⁹gd、¹⁴⁰la、¹⁹⁸au、¹⁹⁹au、¹⁶⁹yb、¹⁷⁵yb、¹⁶⁵dy、¹⁶⁶dy、⁶⁷cu、¹⁰⁵rh、¹¹¹ag、⁸⁹zr、²²⁵ac和¹⁹²ir。

“個體”：如本文中所使用，術語“個體”包含人類和哺乳動物(例如小鼠、大鼠、豬、貓、狗和馬)。在許多實施例中，個體為哺乳動物、尤其靈長類動物、尤其人類。在一些實施例中，個體為家畜，例如牛、綿羊、山羊、母牛、豬和諸如此類；家禽，例如雞、鴨、鵝、火雞和諸如此類；和家養(yǎng)動物，尤其為寵物，例如狗和貓。在一些實施例中(例如尤其在研究背景中)，個體哺乳動物為(例如)嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠)、兔、靈長類動物或豬(例如近交豬)和諸如此類。

“基本上”：如本文中所使用，術語“基本上”涉及呈現(xiàn)所關注特性或性質(zhì)的總或幾乎總范圍或程度的定性條件。生物領域技術人員應理解，生物及化學現(xiàn)象極少(如果存在)完成和/或繼續(xù)進行到完全或?qū)崿F(xiàn)或避免絕對結(jié)果。術語“基本上”由此在本文中用于捕獲許多生物及化學現(xiàn)象中固有的完整性的潛在缺乏。

“治療劑”：如本文中所使用，片語“治療劑”涉及在投與個體時具有治療效應和/或誘發(fā)所需生物和/或藥理學效應的任一藥劑。

“治療”：如本文中所使用，術語“治療(treatment)”(還有“治療(treat或treating)”)涉及某一物質(zhì)用于以下用途的任何投與：部分地或完全緩解、改善、再生、抑制、延遲特定疾病、病癥和/或病狀的一種或多種癥狀、特征和/或病因、減小其嚴重程度和/或減小其發(fā)病率。所述治療可為治療并未展現(xiàn)相關疾病、病癥和/或病狀的體征的個體和/或治療僅展現(xiàn)疾病、病癥和/或病狀的早期體征的個體。或者或另外，所述治療可為治療展現(xiàn)相關疾病、病癥和/或病狀的一個或多個確立體征的個體。在一些實施例中，治療可為治療已診斷為患有相關疾病、病癥和/或病狀的個體。在一些實施例中，治療可為治療已知具有一個或多個與具有發(fā)生相關疾病、病癥和/或病狀的增加風險統(tǒng)計學相關的敏感因子的個體。

本文呈現(xiàn)圖式以用于闡釋目的而非加以限制。

附圖說明

通過參照結(jié)合附圖進行的以下詳細描述，本發(fā)明的前述及其它目標、方面、特征和優(yōu)點將變得更顯而易見且更好理解，其中：

圖1a-1d展示神經(jīng)結(jié)合肽-cy5偶聯(lián)物的實例。

圖1a展示具有cy5的線性神經(jīng)結(jié)合肽(ac＝n-末端處的乙?；?。

圖1b展示具有cy5的環(huán)狀神經(jīng)結(jié)合肽。

圖1c展示線性肽的液相色譜-質(zhì)譜(lcms)。

圖1d展示環(huán)狀肽的lcms。對于lcms來說，在waters的4.6×50mmc18管柱(于水中的5-95％乙腈(0.1％tfa)，10min)上運行試樣。證實產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以黑框表示。

圖2展示使用不同證實的多肽(例如隨機、環(huán)狀、線性)處理的坐骨神經(jīng)樣品。將神經(jīng)試樣與50μm多肽在室溫下一起培育30min.，且使用pbs洗滌三次。在體內(nèi)成像系統(tǒng)(ivis)系統(tǒng)上獲得圖像。一式兩份運行實驗。

圖3展示神經(jīng)結(jié)合蛋白(nbp)-聚乙二醇(peg)-cy5.5-c’點的示意圖。染料囊封于二氧化硅殼體內(nèi)且經(jīng)肽表面官能化。

圖4a-4h展示通過固相肽合成器合成的17氨基酸(aa)序列肽、截短序列肽(例如10-aa、14-aa)和亂序肽的線性和環(huán)化構象。還展示使用lc-ms的hplc特征和表征。

圖5展示針對人類尸體神經(jīng)樣品比較肽-nir染料偶聯(lián)物與肽官能化含深紅色/nir染料(cy5、cy5.5)c點的離體結(jié)合/攝取研究。測試肽序列、構象和配體數(shù)量對神經(jīng)結(jié)合的效應。

圖6展示肽-染料偶聯(lián)物或肽官能化c點的人類坐骨神經(jīng)和肌肉攝取。

圖7a和7b展示使用光學成像方法在與神經(jīng)結(jié)合肽或肽官能化c點一起培育后離體人類坐骨神經(jīng)樣品中的時間變化性信號變化。

圖8展示在與肽-cy5染料偶聯(lián)物一起培育后人類坐骨神經(jīng)樣品的歸一化熒光信號強度。

圖9a-9e展示經(jīng)低溫切片、肽-染料偶聯(lián)物預處理的人類坐骨神經(jīng)樣品的熒光顯微術。

圖10a-10e展示在與肽-染料偶聯(lián)物或熒光神經(jīng)結(jié)合肽(nbp)官能化基于顆粒的探針(例如cy5‐nbp‐c點)一起培育后人類坐骨神經(jīng)樣品的橫截面熒光顯微術。

圖11a和11b展示17aa殘基環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物在人類坐骨神經(jīng)樣品中的局部化。

圖12展示在注射400納摩爾環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物后人類坐骨神經(jīng)的時間依賴性體內(nèi)熒光顯微術。

圖13a-13e展示在注射17aa環(huán)狀神經(jīng)結(jié)合肽后坐骨神經(jīng)和肌肉熒光信號對時間的體內(nèi)成像。

圖14a和14b展示在注射17aa線性神經(jīng)結(jié)合肽后坐骨神經(jīng)和肌肉熒光信號對時間的體內(nèi)成像。

圖15展示在thy1-yfp轉(zhuǎn)基因小鼠中注射150納摩爾環(huán)狀肽與線性肽-染料偶聯(lián)物后人類坐骨神經(jīng)的時間依賴性體內(nèi)熒光顯微術。

圖16a-16e展示在注射150納摩爾17aa環(huán)狀神經(jīng)結(jié)合肽后坐骨神經(jīng)和肌肉熒光信號對時間的體內(nèi)成像。

具體實施方式

在整個說明書中，其中將組成物描述為具有、包含或包括特定組份，或其中將方法描述為具有、包含或包括特定步驟，另外預計存在基本上由所敘述組份組成或由其組成的本發(fā)明組成物，且存在基本上由所敘述處理步驟組成或由其組成的本發(fā)明方法。

應理解，只要本發(fā)明保持可操作，各步驟的次序或用于執(zhí)行某些動作的次序并不重要。此外，可同時實施兩個或多于兩個步驟或動作。

本文中對(舉例來說)背景技術章節(jié)中的任何公開案的提及并非承認所述公開案充當關于本文中所呈現(xiàn)的技術方案中的任一者的先前技術。背景技術章節(jié)是出于清晰的目的而呈現(xiàn)且并非意在作為對關于任何技術方案的先前技術的描述。

在本文所描述的實驗中，線性多肽經(jīng)環(huán)化，從而產(chǎn)生更具剛性的結(jié)構且增強結(jié)合親和力和選擇性。對于所呈現(xiàn)研究來說，使用二甲基甲酰胺(dmf)作為溶劑且使用六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻(pybop)作為偶合劑來實現(xiàn)最佳化條件和高產(chǎn)物產(chǎn)率。

首先，合成線性多肽np41且使用nir染料cy5進行標記以用于測試。通過lcms來證實圖1a中所展示的結(jié)構，如圖1c中所展示。還合成圖1a的np41結(jié)構的環(huán)狀類似物。還通過lcms來證實圖1b中所展示的環(huán)狀肽的結(jié)構，如圖1d中所展示。作為對照，使用cy5標記隨機多肽(ac-shsstardlwphgkegc)并加以評價。如圖2中所展示，與亂序多肽和線性多肽相比，環(huán)狀化合物針對坐骨神經(jīng)樣品展現(xiàn)顯著增強的熒光強度(2到3倍)。與線性多肽和亂序多肽相比，環(huán)狀化合物還展現(xiàn)增強的神經(jīng)組織選擇性(對肌肉組織)。

圖4a-4h展示用于本文所描述的神經(jīng)結(jié)合實驗的不同肽-染料偶聯(lián)物證實(例如線性、環(huán)化、亂序)的合成和表征。舉例來說，通過固相肽合成器合成17氨基酸(aa)序列肽、截短序列肽(10-aa、14-aa)和亂序肽的線性和環(huán)化構象。在液相中使用cy5-馬來酰亞胺在半胱氨酸殘基處標記肽。使用制備型hplc純化最終產(chǎn)物且產(chǎn)率大于95％。通過分析型hplc和lc-ms來表征和證實最終產(chǎn)物的純度和質(zhì)量，如每一表中所展示。隨后使最終神經(jīng)結(jié)合肽產(chǎn)物附接到c’點以產(chǎn)生用于體內(nèi)和離體研究的多價平臺。

為改良量子增強和熒光相關光譜(fcs)光亮度，可將環(huán)狀化合物結(jié)合(或另外納入)于/到納米顆粒(舉例來說，如由菲利普斯(phillips)(菲利普斯e、佩尼亞特-麥地那o(penate-medinao)、贊佐尼科pb(zanzonicopb)、卡瓦哈爾rd(carvajalrd)、莫漢p(mohanp)、葉y(yey)、胡姆j(hummj)、格嫰m(m)、卡利吉安h(kaliagianh)、舍德爾h(h)、斯特勞斯w(straussw)、拉爾森sm(larsonsm)、威斯納u(wiesneru)、布萊伯利ms(bradburyms.)超小光學雜合納米顆粒探針的臨床轉(zhuǎn)譯(clinicaltranslationofanultrasmallopticalhybridnanoparticleprobe)?？茖W轉(zhuǎn)譯醫(yī)學(sciencetranslationalmedicine)。2014；6(260))所描述的c點和/或c’點(納入cy5.5的較新一代pet放射標記(¹²⁴i)fda-ind批準的crgdy官能化c’點))中。通過使反應性染料物質(zhì)與有機硅酸鹽來源偶合來產(chǎn)生熒光二氧化硅前體。然后水解雜合前體且與純二氧化硅縮合以得到雜合有機/無機核心。這些核心用作用于生長純二氧化硅殼體的均質(zhì)核，從而進一步保護所囊封染料。(伯恩斯a.(burns,a.)、ow,h.、威斯納u.熒光核心-殼體二氧化硅納米顆粒：針對用于納米生物技術的“顆粒實驗室”架構(fluorescentcore-shellsilicananoparticles:towards“l(fā)abonaparticle”architecturesfornanobiotechnology)?；瘜W學會評論(chemsocrev.)2006；35(11):1028-42)(圖3)。具有熒光核心的核心-殼體納米顆粒還描述于美國專利第8,298,677號和第8,409,876號中，所述專利的全部內(nèi)容以引用方式併入本文中。

在某些實施例中，可使用描述于布萊伯利等人，整合生物學(integr.biol.)(2013)5:74-86(其以引用方式併入本文中)中的特征。在某些實施例中，可使用描述于赫茲(herz)等人，材料化學期刊(j.mater.chem.)(2009)19,6341-6347(其以引用方式併入本文中)中的特征(例如探針物質(zhì))。

在某些實施例中，可使用描述于布萊伯利等人的國際pct專利申請案第pct/us2010/040994號和第pct/us2014/030401號(公開為2011年1月6日的wo2011/003109和2014年9月18日的wo2014/145606，其全部內(nèi)容均以引用方式併入本文中)中的特征(例如納米顆粒)。

在某些實施例中，可使用描述于威斯納等人的美國專利第8298677號(公開于2012年10月30日，其全部內(nèi)容以引用方式併入本文中)中的特征(例如納米顆粒)。

圖3展示根據(jù)本發(fā)明的一闡釋性實施例的nbp-peg-cy5.5-c’點的示意圖。nbp是進一步詳細描述于下文中的特定環(huán)狀神經(jīng)結(jié)合肽。cy5.5染料展示為附加到環(huán)狀nbp結(jié)構，且cy5.5還展示為摻雜于二氧化硅核心中。在某些實施例中，使染料附接到環(huán)狀肽且并不附接到納米顆粒、含于其內(nèi)、結(jié)合到納米顆?；蛄硗馀c其直接締合。在某些實施例中，染料并不附接到環(huán)狀肽，但附接到納米顆粒、含于其內(nèi)、結(jié)合到納米顆粒和/或另外與其直接締合。

為證實相對于背景的信號增強，使線性多肽np41通過peg偶聯(lián)結(jié)合到c’點，且測量量子增強和fcs光亮度的所得改良(表1)。類似地，可使環(huán)狀肽結(jié)合到納米顆粒以較未結(jié)合環(huán)狀肽獲得改良的量子增強和fcs光亮度。

表1展示線性nbp-c’點的表征數(shù)據(jù)。從熒光相關光譜(fcs)測定測量值。

表1

可使用噬菌體展示方式來鑒別對人類尸體神經(jīng)組織樣品具有特異性的新穎人類神經(jīng)結(jié)合肽序列(例如神經(jīng)選擇性標記物)。噬菌體展示是成功應用于切下的鼠類神經(jīng)組織的有力基因工具，其可與人類面神經(jīng)和喉神經(jīng)樣品一起使用以鑒別對這些神經(jīng)組織具有選擇性的新穎nbp序列。對神經(jīng)組織展現(xiàn)有益整體結(jié)合親和力和選擇性的肽序列可在附接到c點之后用于多工應用。

在某些實施例中，噬菌體展示利用隨機12殘基肽的組合文庫以及109個獨立克隆或序列(新英格蘭生物實驗室(newenglandbiolabs))的復雜度。m13噬菌體載體提供融合到piii衣殼蛋白的隨機肽的五價展示。噬菌體經(jīng)受多輪正性選擇和負性選擇。通過分離、測序和擴增來正性選擇結(jié)合所制得面(或喉)神經(jīng)組織的噬菌體。噬菌體然后經(jīng)受負性選擇步驟；將其與坐骨組織一起培育且選擇未結(jié)合噬菌體?？衫^續(xù)此選擇循環(huán)直到重復觀察到不同序列為止。

如本文所描述，使用線性多肽np41(其包含序列ntqtlakapeht或更具體來說ac-shsntqtlakapehtgc)以及環(huán)狀形式的多肽實施實驗(展示于圖1b中)。使用熒光染料將每一多肽官能化。在某些實施例中，可使用其它可檢測標記物，且可使用其它肽序列。np41的核心序列為ntqtlakapeht。盡管實驗中所使用的np41多肽包含附接到n-末端的乙酰基-shs基團和附接到c-末端的-gc基團，但其它實施例可使用其它端基(或無端基)。在所展示實例中，包含來自噬菌體衣殼蛋白的-shs-基團，且包含用于染料的-gc。不期望受限于任一特定理論，似乎以化學方式約束線性形式的多肽可增強結(jié)合。具有神經(jīng)組織選擇性的其它多肽還可以以下方式使用：原樣、結(jié)合到納米顆粒、環(huán)化和/或環(huán)化且結(jié)合到納米顆粒(舉例來說，后者是通過使用適宜連接體化學(例如peg))。舉例來說，可環(huán)化和/或結(jié)合到納米顆粒使用的其它多肽包含于惠特尼等人的文獻中的線性多肽，例如包括序列tytdwlnfwawp、ntqtlakapeht、kslsrhdhihhh和/或dftktsplgih的多肽。

在某些實施例中，使用其它多肽。舉例來說，可增加、修飾本文所揭示的任一序列，或減小其長度。盡管本文所描述的實驗使用酰胺化學形成頭對尾環(huán)狀肽，但可在內(nèi)部引入共價約束(例如與頭對尾相反)，和/或其它化學也適用(例如點擊、二硫化物、置換等)。在某些實施例中，多肽具有5到20個氨基酸殘基和/或15原子到60原子大環(huán)(例如形成環(huán)的原子數(shù)，例如15-到60元環(huán))。

一般來說，用于實踐本文所描述實施例的納米顆粒為基于二氧化硅的納米顆粒(例如c點或c’點)，其加入、涂覆有或另外結(jié)合或締合可檢測試劑(例如有機染料、放射標記)和肽靶向配體。在某些實施例中，在使用肽官能化之前，基于二氧化硅的納米顆粒(例如c點或c’點)可具有小于或等于10nm的平均大小(例如直徑)。在某些實施例中，在使用肽官能化之前，基于二氧化硅的納米顆粒(例如c點或c’點)可具有大于10nm的平均大小。在某些實施例中，平均顆粒大小、顆粒大小分布和/或光亮度適用于特定應用。在某些實施例中，使用基于聚合物的納米顆粒。在某些實施例中，多肽可檢測試劑-納米顆粒材料(附接有或另外締合有線性或環(huán)狀肽和可檢測試劑的納米顆粒)無毒且通過腎有效清除。在某些實施例中，使染料結(jié)合到肽(而非直接結(jié)合到納米顆粒)。在某些實施例中，染料結(jié)合到納米顆粒(而非肽)，納入其內(nèi)或另外進行締合。在某些實施例中，使染料與納米顆粒締合，且使染料結(jié)合到肽。

在某些實施例中，可使用多種不同多肽將基于二氧化硅的納米顆粒表面官能化。在某些實施例中，多種多肽可加入、涂覆有或另外結(jié)合或締合多種可使用不同讀出檢測到的檢測劑。在某些實施例中，可同時或在不同時間使用基于二氧化硅的納米顆粒以執(zhí)行用于手術中應用的靶向配體的多工光學檢測。舉例來說，在某些實施例中，可使用兩種或多于兩種基于二氧化硅的光譜差異性納米顆粒(各自含有獨特表面官能化靶向配體)以產(chǎn)生用于手術中應用的多價結(jié)構。在某些實施例中，基于二氧化硅的光譜差異性納米顆粒(各自含有獨特表面官能化靶向配體)可發(fā)射可通過不同檢測方式測量的信號，從而產(chǎn)生多模式讀出功能性。

本文所描述的系統(tǒng)和方法可與美國專利申請案第13/381,209號(在2013年2月14日公開為us2013/0039848，其涉及采用基于二氧化硅的熒光納米顆粒的體內(nèi)成像系統(tǒng)和方法且以引用方式并入本文中)中所描述的系統(tǒng)和方法一起使用。在一些實施例中，至少一種探針物質(zhì)包括納米顆粒。在一些實施例中，納米顆粒具有二氧化硅架構和富染料核心。在一些實施例中，富染料核心包括熒光報導子。在一些實施例中，熒光報導子為近紅外或遠紅染料。在一些實施例中，熒光報導子是選自由以下組成的群組：熒光團、熒光色素、染料、顏料、熒光過渡金屬和熒光蛋白。在一些實施例中，熒光報導子是選自由以下組成的群組：cy5、cy5.5、cy2、fitc、tritc、cy7、fam、cy3、cy3.5、德克薩斯紅(texasred)、rox、hex、ja133、阿來魯爾(alexafluor)488、阿來魯爾546、阿來魯爾633、阿來魯爾555、阿來魯爾647、dapi、tmr、r6g、gfp、增強的gfp、cfp、ecfp、yfp、檸檬素、維納斯(venus)、ypet、cypet、amca、光譜綠(spectrumgreen)、光譜橙(spectrumorange)、光譜淺綠(spectrumaqua)、麗絲胺(lissamine)和銪。

在某些實施例中，熒光劑具有在紅色和近紅外光譜范圍內(nèi)的激發(fā)波長和發(fā)射波長。在某些實施例中，熒光劑具有介于400nm到1300nm或440nm到1100nm或550nm到800nm或600nm到900nm的激發(fā)波長和發(fā)射波長。使用此部分電磁光譜可最大化組織滲透且最小化生理學豐富的吸收劑(例如血紅素(<650nm)和水(>1200nm))的吸收。在某些實施例中，還可采用激發(fā)波長和發(fā)射波長在其它光譜(例如可見光和紫外光光譜)中的探針物質(zhì)。特定來說，可使用熒光團(例如某些羰花青或聚次甲基熒光熒光色素或染料)作為熒光劑，例如頒予卡普托(caputo)等人的美國專利第6,747,159號(2004)；頒予卡普托等人的美國專利第6,448,008號(2002)；頒予德拉席亞拉(dellaciana)等人的美國專利第6,136,612號(2000)；頒予索思威克(southwick)等人的美國專利第4,981,977(1991)號；頒予瓦戈納(waggoner)等人的5,268,486(1993)；頒予瓦戈納等人的美國專利第5,569,587號(1996)；頒予瓦戈納等人的5,569,766(1996)；頒予瓦戈納等人的美國專利第5,486,616號(1996)；頒予瓦戈納等人的美國專利第5,627,027號(1997)；頒予布魯斯(brush)等人的美國專利第5,808,044號(1998)；頒予雷丁頓(reddington)等人的美國專利第5,877,310號(1999)；頒予施恩(shen)等人的美國專利第6,002,003號(1999)；頒予梁(leung)等人的美國專利第6,004,536號(1999)；頒予瓦戈納等人的美國專利第6,008,373號(1999)；頒予明登(minden)等人的美國專利第6,043,025號(2000)；頒予明登等人的美國專利第6,127,134號(2000)；頒予瓦戈納等人的美國專利第6,130,094號(2000)；頒予瓦戈納等人的美國專利第6,133,445號(2000)；頒予理查(licha)等人的美國專利第7,445,767號(2008)；頒予理查等人的美國專利第6,534,041號(2003)；頒予米瓦(miwa)等人的美國專利第7,547,721號(2009)；頒予米瓦等人的美國專利第7,488,468號(2009)；頒予川上(kawakami)等人的美國專利第7,473,415號(2003)；還有wo96/17628、ep0796111b1、ep1181940b1、ep0988060b1、wo98/47538、wo00/16810、ep1113822b1、wo01/43781、ep1237583a1、wo03/074091、ep1480683b1、wo06/072580、ep1833513a1、ep1679082a1、wo97/40104、wo99/51702、wo01/21624和ep1065250a1；和四面體快報(tetrahedronletters)41,9185-88(2000)。

實例性熒光劑包含(例如)下列物質(zhì)：cy5.5、cy5、cy7.5和cy7(醫(yī)療(healthcare))；阿來克魯爾(alexafluor)660、阿來克魯爾680、阿來克魯爾790和阿來克魯爾750(英杰(invitrogen))；vivotag^tm680、vivotag^tm-s680、vivotag^tm-s750(韋恩醫(yī)學(visenmedical))；dy677、dy682、dy752和dy780547和/或647(皮爾斯(pierce))；hilytefluor^tm647、hilytefluor^tm680和hilytefluor^tm750800cw、800rs和700dxads780ws、ads830ws和ads832ws(美國染料資源(americandyesource))；xenolightcf^tm680、xenolightcf^tm750、xenolightcf^tm770和xenolightdir(生命科學(lifesciences))；和x-650、x-sight691、x-sight751(健康(health))。在某些實施例中，連接體部分是在末端具有兩個或多于兩個(雙官能、三官能等)官能團的經(jīng)布置以連結(jié)基于二氧化硅的納米顆粒與肽和/或可檢測標記物的化學部分。在本文所描述的實驗性實例中，使用peg作為使多肽(例如線性或環(huán)狀肽)結(jié)合到納米顆粒的連接體部分?？墒褂闷渌B接體部分?？?例如)使用不同大小的peg(或其它連接體)鏈來改變c’點(或其它納米顆粒)與多肽之間的間隔。在某些實施例中，連接體部分包括一個或多個描述于美國專利申請案第14/722,307號(2015年5月27日提出申請，公開為美國專利申請公開案第us2015/0343091號，所述文件的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中)的連接體部分。

在某些實施例中，神經(jīng)結(jié)合肽官能化c點或肽-染料偶聯(lián)物具有不同構象(例如環(huán)狀、線性)和長度(例如截短、狹長)，且在手術暴露之后局部投與毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或在其附近的周邊神經(jīng)干(包含(但不限于)面神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、腹下神經(jīng)、喉神經(jīng))以顯著增強對比且在sln定位程序期間描繪在不存在這些藥劑下不能充分觀察到的較小遠端神經(jīng)分支和/或分布以減小損害風險。

在某些實施例中，這些肽官能化顆粒探針或肽-染料偶聯(lián)物可局部投與于原發(fā)性腫瘤位點或患病結(jié)點(例如腮腺)附近以促進其由毗鄰正常神經(jīng)(例如面神經(jīng))的攝取)。

在某些實施例中，通過局部注射與靜脈內(nèi)投與來投與物質(zhì)或調(diào)配物。舉例來說，可以足夠高濃度局部注射具有含肽組合物(例如含顆粒和非含顆粒組合物)的物質(zhì)或調(diào)配物以用于成像目的。在某些實施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)投與非顆粒含肽組合物。在某些實施例中，在含顆粒組合物在足夠用于成像目的的高濃度下過粘時，局部注射優(yōu)于靜脈內(nèi)注射。

與當前所描述化合物相比，新環(huán)狀肽或基于顆粒的產(chǎn)物可提供改良的光物理和神經(jīng)結(jié)合性質(zhì)比較。

在某些實施例中，與可通過注射僅簡單熒光染料所實現(xiàn)者相比，通過這些途徑中的一者或多者投與的神經(jīng)結(jié)合肽官能化c點允許神經(jīng)結(jié)構以高神經(jīng)對肌肉對比最大程度地可視化，這是因為其具有優(yōu)良多價增強、改良的靶位點結(jié)合/滯留和光物理特征。這些產(chǎn)物可與針對癌癥靶(例如具有癌癥的結(jié)節(jié))的與肽結(jié)合的顆粒探針一起適用于多工應用。

在某些實施例中，可局部或通過靜脈內(nèi)途徑投與可見染料(例如可見光譜中的染料，例如綠色染料，例如fitc)且可用于通過熒光信號觀看神經(jīng)。在某些實施例中，結(jié)合肽的可見染料優(yōu)先附接到神經(jīng)組織且來自染料的光可由外科醫(yī)生以肉眼視力看到。舉例來說，可將調(diào)配物局部施加到神經(jīng)本身中或局部施加到神經(jīng)附近，舉例來說，可將調(diào)配物局部施加到周邊神經(jīng)干(例如在手術暴露之后毗鄰轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)或原發(fā)性腫瘤或其附近)，從而使得調(diào)配物的組合物自神經(jīng)干擴散到神經(jīng)組織的較小分支。光是由組合物的熒光劑發(fā)射，且可檢測并顯示(例如實時)，或可足夠亮以用于由外科醫(yī)生在手術程序期間以肉眼視力直接觀察到。局部施加到神經(jīng)組織(且隨后擴算穿過神經(jīng)組織)可提供較大對比，這是因為來自血蛋白(例如血紅素)的背景信號將與調(diào)配物的靜脈內(nèi)投與相比有所減小。

實驗性實例

線性和環(huán)狀神經(jīng)結(jié)合多肽-cy5偶聯(lián)物的合成

在氯三苯甲基樹脂上使用標準基于fmoc的固相肽合成(spss)方案來合成線性np41(圖1a)和其環(huán)狀類似物(圖1b)。通過使用tfa:tis:edt:水(85:5:5:5)的混合劑裂解/去保護肽-樹脂、隨后進行反相hplc純化來獲得線性多肽。為制備環(huán)狀類似物，去除n-末端fmoc基團，且然后在溫和條件下使用六氟異丙醇從樹脂裂解經(jīng)完全保護的線性多肽。通過分子內(nèi)偶合反應(其中n-末端和c-末端殘基在溶液中發(fā)生接合，從而提供所需環(huán)狀前體)來獲得頭對尾環(huán)狀類似物。然后將粗制材料全面去保護且通過反相hplc純化。使用此合成方式，易于獲得所需51元大環(huán)肽產(chǎn)物。應注意，此大小的環(huán)狀肽在合成上具有一定挑戰(zhàn)性。然而，本文所使用方式提供具有優(yōu)異純度(例如大于95％)和良好產(chǎn)率(約40％)的環(huán)狀產(chǎn)物。通過使用馬來酰亞胺基-cy5修飾半胱氨酸殘基的游離硫醇來對線性肽和環(huán)狀肽進行熒光標記。通過lcms來表征和證實最終產(chǎn)物，如圖1a到1d中所展示。

線性多肽-納米顆粒偶聯(lián)物(線性nbp-c’點)的合成

使用peg連接體部分將線性神經(jīng)結(jié)合多肽(nbp)np41納入c’點中。如表1中所展示，對于nbp-c’點來說，cy5染料的所測量光亮度至少大于游離多肽130％。

結(jié)合到離體人類坐骨神經(jīng)組織

使用cy5標記線性肽和環(huán)狀肽以及隨機對照多肽(ac-shsstardlwphgkegc)且評價到離體人類神經(jīng)組織試樣的結(jié)合。所用組織試樣是新切下且由國家疾病研究交流會(nationaldiseaseresearchinterchange，ndri)獲得的尸體坐骨神經(jīng)。在24孔板上制備組織試樣，使用pbs洗滌，然后與50um線性、環(huán)狀或亂序多肽在室溫下一起培育。在15min之后，使用pbs對試樣實施數(shù)輪洗滌。使用ivis光譜成像系統(tǒng)使板成像。如圖2中所展示，總而言之，環(huán)狀化合物與亂序和線性多肽相比對于坐骨神經(jīng)樣品展現(xiàn)顯著增強的熒光強度(2-3倍)；且較肌肉組織展現(xiàn)選擇性。

圖5展示，將人類尸體坐骨神經(jīng)切片成1‐cm長度片段且在室溫下于肽或結(jié)合肽的c點的15μm溶液中培育80分鐘，隨后進行多次磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。在培育后80分鐘通過ivis光譜成像獲得的所關注非侵襲區(qū)分析顯示增加的光學信號(從最高到最低)：17-氨基酸(aa)殘基肽官能化環(huán)狀c點(上左)；17aa殘基環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物(上右)；17aa殘基線性肽-染料偶聯(lián)物(中右)；17aa亂序環(huán)狀肽官能化c點(下左)。后兩種探針用作對照。

圖6展示在肽-染料偶聯(lián)物或肽官能化c點溶液中培育的神經(jīng)和肌肉(對照)樣品的離體熒光信號測量。將神經(jīng)和肌肉組織樣品在室溫及輕微振蕩下于15μm肽-染料偶聯(lián)物或肽官能化c點溶液中培育80分鐘，隨后進行pbs洗滌。在ivis光譜上成像后，執(zhí)行roi分析。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，使用5個獨立視場進行量化。與肌肉、組織樣品相比，在神經(jīng)中觀察到較高熒光信號。針對17aa殘基環(huán)狀肽官能化c’點測得最大熒光信號，隨后依次為17aa殘基環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物、17aa殘基線性肽‐染料偶聯(lián)物和亂序環(huán)狀肽官能化c點。與同類似探針培育的肌肉組織樣品相比，在神經(jīng)中觀察到至少4到接近5倍大的信號。不期望受限于任一理論，數(shù)據(jù)表明，肽-染料偶聯(lián)物和肽官能化c點都達成選擇性攝取和滯留。

圖7a和7b展示使用光學成像方法在與神經(jīng)結(jié)合肽或肽官能化c點一起培育后攝取的時間依賴性信號變化。使用光學成像來評價與神經(jīng)結(jié)合肽(例如環(huán)狀、線性、亂序)或相應肽官能化c點一起培育的離體人類坐骨神經(jīng)樣品的時間變化性攝取。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，使用5個獨立視場進行量化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)培育神經(jīng)樣品中的相對歸一化熒光信號相對于對照顆粒探針(例如結(jié)合肽的亂序c點)在20min時約為80％且在80％時接近100％。另外在與自然線性肽比較時，針對17aa環(huán)狀肽官能化c點在20min時發(fā)現(xiàn)60％以上的信號(例如在80min時接近100％)。

圖8展示肽序列長度和構象對神經(jīng)結(jié)合/攝取性質(zhì)的效應。將人類坐骨神經(jīng)樣品在具有環(huán)狀構象的17aa、截短14-aa和截短10-aa殘基肽序列的15μm溶液中培育以評估結(jié)合/攝取對序列特異性和構象的依賴性。使用線性17aa肽-染料偶聯(lián)物測定構象的影響。利用環(huán)狀形式的亂序肽作為對照。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，使用5個獨立視場進行量化。自橫截面圖像獲取感興趣區(qū)域。使用17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物治療觀察到最大熒光信號，隨后依次為14-aa環(huán)狀肽-染料和10aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物。與17aa線性肽-染料偶聯(lián)物治療相比，使用17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物治療觀察到變化大于2倍的光學信號。

圖9a-9e展示肽序列長度和構象對神經(jīng)結(jié)合/攝取的效應。在使人類坐骨神經(jīng)切片與15μm肽-染料偶聯(lián)物溶液一起培育后，評價選擇性神經(jīng)結(jié)合/攝取。將預培育神經(jīng)組織包埋于oct中且在橫截面中低溫切片(20μm)。相對于線性和亂序肽構筑體，使用具有5×物鏡和cy5濾光器設置的熒光顯微術針對17aa殘基環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物觀察到最大熒光信號。所有cy5熒光圖像都是在相同曝露和歸一化設置下所獲取。比例尺＝200μm。

圖10a-10e展示與15μm神經(jīng)結(jié)合肽官能化c點或肽一起培育80分鐘的神經(jīng)樣品的熒光信號。洗滌經(jīng)處理神經(jīng)組織，在載玻片上低溫切片(15μm)，且通過熒光顯微鏡(5×物鏡)進行觀察(圖10a-10d)。在使用不同探針處理后，將感興趣區(qū)域(roi)置于神經(jīng)樣品上。在依次與17aa環(huán)狀肽官能化c點、17aa環(huán)狀或線性肽-染料偶聯(lián)物或亂序環(huán)狀肽-染料官能化c點培育的樣品中觀察到熒光信號(最高到最低順序，參見圖10e)。

圖11a和11b展示，使用倒置顯微鏡(×20)觀察在17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物溶液(15μm)中預培育80min的經(jīng)低溫切片的坐骨神經(jīng)樣品(20μm)。使用弗洛美林(fluoromyelin)綠(髓磷脂標記物)來共感染神經(jīng)切片，隨后進行pbs洗滌，且通過倒置顯微鏡(×20)進行掃描。成像結(jié)果展示肽與此髓磷脂標記物并不共局部化；據(jù)觀察，17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物主要涉及神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜，而在神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)觀察到相對較小程度的cy5信號。

與體內(nèi)人類坐骨神經(jīng)組織的結(jié)合

圖12展示在注射400納摩爾環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物后人類坐骨神經(jīng)的時間依賴性體內(nèi)熒光顯微術。

圖13a-13e展示使用光學成像在靜脈內(nèi)注射17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物后來自坐骨神經(jīng)和肌肉的體內(nèi)時間依賴性攝取。將17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物(cy5標記)經(jīng)靜脈內(nèi)注射(400納摩爾)到裸小鼠的尾部靜脈中，然后進行手術暴露且使用具有熒光成像能力的哲思魯馬立體顯微鏡(zeisslumarstereomicroscope)(0.8×物鏡)使坐骨神經(jīng)和毗鄰肌肉成像。獲取注射前圖像且在從注射后(p.i.)15min到240min的8個時間點獲取連續(xù)注射后圖像(明場，熒光)。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，使用5個獨立視場進行量化。在神經(jīng)和肌肉區(qū)域中執(zhí)行感興趣區(qū)域(roi)分析以評價時間依賴性信號變化。圖13a-13e分別展示神經(jīng)(圖13a和13b)和毗鄰肌肉(圖13b和13d)的絕對和相對熒光信號(例如在注射后15min時獲取的初始熒光信號的百分比)。圖13e展示時間變化性神經(jīng)對肌肉或?qū)Ρ缺嚷?，其?jīng)4小時時段從約1.2增加到接近2.0，從而表明神經(jīng)樣品隨時間變化具有選擇性攝取和滯留。

圖13a-13e展示，與來自(周圍)肌肉的信號相比，環(huán)化肽提供來自神經(jīng)的良好熒光信號。舉例來說，來自神經(jīng)組織的信號對來自肌肉組織的信號的比率越高，則神經(jīng)組織與周圍(背景)組織越易于目測區(qū)分(例如實時，手術中)。線性肽不同等高的比率。圖13a-13e還展示，環(huán)化肽的信號持續(xù)時間長于線性肽，且來自神經(jīng)組織與肌肉組織的信號比實際上隨時間而增加。較長持續(xù)信號是有益的，這是因為外科醫(yī)生在手術程序中更加自如。舉例來說，藥劑的投與未必發(fā)生于即將進行程序之前；而是，在可檢測信號期間具有較長時間窗口?？稍诩s15分鐘之后檢測信號，但神經(jīng)/肌肉信號比實際上隨時間變化而改良。可在投與之后長達至少數(shù)小時時檢測信號。在人類中預計與在動物研究中使用類似時間段。

圖14a-14b展示使用光學成像在靜脈內(nèi)注射17aa線性肽-染料偶聯(lián)物后來自坐骨神經(jīng)和肌肉的體內(nèi)時間依賴性攝取。將17aa線性肽-染料偶聯(lián)物(cy5標記)經(jīng)靜脈內(nèi)注射(150納摩爾)到裸小鼠的尾部靜脈中，然后進行手術暴露且使用具有熒光成像能力的哲思魯馬立體顯微鏡(0.8×物鏡)使坐骨神經(jīng)和毗鄰肌肉成像。獲取注射前圖像且在注射后(p.i.)的6個時間點(15min-150min)獲取連續(xù)注射后圖像(明場，熒光)。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，量化，每一重復是來自一個生物實驗，量化，(15min，6個時間，且肌肉區(qū)域以評價時間依賴性信號變化。圖14a展示絕對神經(jīng)熒光肌肉?？煽吹?，熒光信號在30min時顯著降到注射后水平的約15％；然后幾乎不能看到信號，從而妨礙評估(數(shù)據(jù)未展示)。此外，圖14a展示，來自線性肽的信號在投與之后30分鐘減小到初始信號的10％。圖14b展示相應時間變化性神經(jīng)對肌肉或?qū)Ρ缺嚷剩霰嚷试谧⑸渚€性肽-染料偶聯(lián)物后前30min內(nèi)大致相等，從而表明坐骨神經(jīng)樣品相對于肌肉隨時間變化具有選擇性攝取和滯留。

圖15展示在thy1-yfp轉(zhuǎn)基因小鼠中注射150納摩爾環(huán)狀肽與線性肽-染料偶聯(lián)物后人類坐骨神經(jīng)的時間依賴性體內(nèi)熒光顯微術。

圖16a-16e展示使用光學成像在靜脈內(nèi)注射17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物后來自坐骨神經(jīng)和肌肉的體內(nèi)時間依賴性攝取。將17aa環(huán)狀肽-染料偶聯(lián)物(cy5標記)經(jīng)靜脈內(nèi)注射(150納摩爾)到裸小鼠的尾部靜脈中，然后進行手術暴露且使用具有熒光成像能力的哲思魯馬立體顯微鏡(0.8×物鏡)使坐骨神經(jīng)和毗鄰肌肉成像。獲取注射前圖像且在注射后(p.i.)的6個時間點(15min-150min)獲取連續(xù)注射后圖像(明場，熒光)。條指示平均值+/-標準偏差。n＝5個/組。每一重復是來自一個生物實驗，使用5個獨立視場進行量化。在神經(jīng)和肌肉區(qū)域中執(zhí)行感興趣區(qū)域(roi)分析以評價時間依賴性信號變化。圖16a-16d分別展示神經(jīng)(圖16a和16c)和毗鄰肌肉(圖16b和16d)的絕對和相對熒光信號(在注射后15min時獲取的初始熒光信號的百分比)。圖16e展示時間變化性神經(jīng)對肌肉或?qū)Ρ缺嚷?，其?jīng)1.5小時時段從約1.3增加到接近2.6。不期望受限于任一理論，這些數(shù)據(jù)表明神經(jīng)樣品隨時間變化具有選擇性攝取和滯留。