本發(fā)明涉及一種表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，egf)和脂質(zhì)體的混合型多層納米結(jié)構(gòu)及其制造方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種新型蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)(protein-lipidhybridmulti-lamellarnanostructures)及其制造方法，所述蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)通過陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡與陰離子表皮生長因子蛋白質(zhì)之間的除疏水相互作用以外的多價(jià)靜電相互作用(multivalentelectrostaticinteractions)制成。
背景技術(shù)：
：由于對美容的興趣增長，具有特定作用機(jī)理和良好功效的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)作為功能性化妝產(chǎn)品的材料而引人注意。然而，由于生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的高的分子量、短的半衰期和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，其不容易滲透皮膚。因此，對這些生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的皮膚遞送的興趣迅速增長。在生理學(xué)活性蛋白質(zhì)當(dāng)中，已知表皮生長因子在皮膚再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此其被用作功能性化妝品組分。目前，表皮生長因子被列入美國化妝品、化妝用具和香料協(xié)會(ctfa)的國際化妝品成分詞典(icid)中，并且其也被韓國食品和藥品安全部(mdfs)批準(zhǔn)用作化妝品原材料，因此在韓國和其他國家中其已被正式用作化妝品原材料(韓國食品藥品管理部門通知號2006-12，2006.4.12)。然而，在生理學(xué)活性蛋白質(zhì)組分(如表皮生長因子)的皮膚遞送中的最大問題在于，這些蛋白質(zhì)組分具有低的皮膚吸收率(滲透率)?？朔@個(gè)問題的典型方法是通過使用脂質(zhì)體作為載體，將生理學(xué)活性蛋白質(zhì)如表皮生長因子遞送到皮膚中。脂質(zhì)體是主要由作為細(xì)胞膜的組分的兩親性磷脂(phospholipid)形成的脂質(zhì)雙層(lipid-bilayer)囊泡(vesicle)。親水性物質(zhì)可以被包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部水性隔室(aqueouscompartment)中，或者疏水性物質(zhì)可以被裝載在脂質(zhì)雙層中。脂質(zhì)體的層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)相似，因此脂質(zhì)體具有低的毒性，并且其可以通過與細(xì)胞融合或通過內(nèi)吞作用遞送物質(zhì)。特別地，由于脂質(zhì)體具有極好的生物相容性，已經(jīng)積極地進(jìn)行了有關(guān)脂質(zhì)體用作載體的研究(bangham,a.d.；torchilin,v.p.,2005,nat.rev.drugdiscov.,4:145)。盡管有這樣的優(yōu)勢，但由于一些問題，脂質(zhì)體難以被廣泛使用。脂質(zhì)體的一個(gè)問題在于，在脂質(zhì)體中包封的效率低。特別地，親水性物質(zhì)僅可以被包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部水性隔室中，并且因?yàn)閮?nèi)部水性隔室的體積小，包封的效率也必然是低的。其通常顯示約10-20％的包封效率，并且顯示嚴(yán)重的技術(shù)限制，因?yàn)橄鄬τ谥|(zhì)體的總重量，包封的蛋白質(zhì)的量非常低(martins,susana等人,2007,int.j.nanomed.,2.4,595)。另一方面，親脂性物質(zhì)以相對高的效率被包封，因?yàn)槠湓谥|(zhì)雙層中被增溶。然而，在一些情況下，親脂性物質(zhì)可以使脂質(zhì)雙層不穩(wěn)定以降低脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。因此，脂質(zhì)體技術(shù)被商業(yè)化應(yīng)用于一些親脂性物質(zhì)，但是其用于親水性物質(zhì)的用途是非常微不足道的。使用脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)遞送載體的另一個(gè)問題在于，生理學(xué)活性蛋白質(zhì)在一般的脂質(zhì)體制備過程中嚴(yán)重變性以失去其特征性的生理學(xué)活性。作為一般的脂質(zhì)體制備方法，bangham法(bangham等人,1965j.mol.biol.13:238-252)或高壓均質(zhì)(high-pressurehomogenization)法被廣泛使用。bangham法包括：在玻璃裝置中將表面活性劑加入并溶解于溶劑中；蒸發(fā)溶液以在玻璃壁上形成表面活性劑(即磷脂)層；引入待包封的材料溶液；并將溶液劇烈攪拌或超聲波均質(zhì)化，從而制備脂質(zhì)體。在高壓均質(zhì)法中，將脂質(zhì)體組分彼此混合，并通過具有亞微米(sub-micro)尺寸的微孔(micro-pore)的卡套式流通池或閥門(也被稱作“相互作用室(interactionchamber)”)。在本文中，微孔的尺寸為約50-300μm。通過在通過期間出現(xiàn)的大剪切應(yīng)力(shearstress)，形成由表面活性劑構(gòu)成的脂質(zhì)雙層，并且藥物被包封在磷脂雙層中。如果使用這些方法捕獲生理學(xué)活性蛋白質(zhì)，由于其暴露在由微孔中的剪切應(yīng)力引起的嚴(yán)酷條件(如高壓、高溫、摩擦熱)中，并且由于有機(jī)溶劑的使用，蛋白質(zhì)可以聚集、變性、氧化或降解，因此很可能失去其特征性的生理學(xué)活性。例如，韓國專利號0752990涉及一種由脂質(zhì)體層構(gòu)成的納米脂質(zhì)體，其包含作為中性脂質(zhì)的酯化卵磷脂(esterifiedlecithin)，并且其公開了一種用于預(yù)防或治療皮膚疾病的組合物，其包含：包封有表皮生長因子的納米脂質(zhì)體；和具有抗炎活性的天然提取物。韓國專利號0962566公開了一種含有人生長激素作為活性成分的納米脂質(zhì)體，其中使用作為中性脂質(zhì)的大豆卵磷脂通過高壓均質(zhì)法制備所述納米脂質(zhì)體。然而，在以上描述的專利文獻(xiàn)中公開的含有生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體具有以下問題：活性成分的包封效率非常低，并且由于脂質(zhì)體是在高溫和高壓下制備的，蛋白質(zhì)的生理活性嚴(yán)重下降。因此，需要開發(fā)方法，其能夠確保高的包封率，同時(shí)在制備載體結(jié)構(gòu)的過程中穩(wěn)定地保持表皮生長因子的生理學(xué)活性。根據(jù)前面研究結(jié)果的分析，有許多使用不同添加劑或開發(fā)新的工藝方法的嘗試，以便提高將生理學(xué)活性蛋白質(zhì)(如表皮生長因子)包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部水性隔室中的效率(pisal,dipaks.等人,2010,j.pharm.sci.,99.6,2557-2575)。然而，所有嘗試的特征都在于，它們關(guān)注于提高將蛋白質(zhì)包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部水性隔室中的效率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題因此，本發(fā)明人已努力開發(fā)一種新方法，其能夠?qū)⒈砥どL因子有效地合并入或捕獲入脂質(zhì)體中，同時(shí)保持表皮生長因子的高生理學(xué)活性。特別地，打破將蛋白質(zhì)包封在脂質(zhì)體的內(nèi)部水性隔室中的方法的陳規(guī)，本發(fā)明人已經(jīng)對通過在脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)之間誘導(dǎo)更多的正相互作用制備新的納米結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行了研究。特別地，本發(fā)明人已注意到研究表明，作為陰離子生物聚合物的核酸與陽離子脂質(zhì)體綴合形成新的納米結(jié)構(gòu)(safinya,c.r.等人,1997,science,275.5301,810-814)，因此本發(fā)明人已對方法進(jìn)行了研究，所述方法不在脂質(zhì)體制備過程中將蛋白質(zhì)包封，而是在脂質(zhì)體的制備后通過脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在合適的條件下，在由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡與作為陰離子蛋白質(zhì)的表皮生長因子之間使用多價(jià)靜電相互作用(multivalentelectrostaticinteractions)與疏水相互作用的組合時(shí)，可以制備新型蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)，其中，表皮生長因子以非常高的效率被捕獲同時(shí)保持其生理學(xué)活性，從而完成了本發(fā)明。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種混合型多層納米結(jié)構(gòu)，其由表皮生長因子與由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡之間的相互作用制成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過混合表皮生長因子和由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡，通過在常溫和常壓下發(fā)生的自發(fā)自組裝(spontaneousself-assembly)過程制造蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種化妝品組合物，其含有混合型多層納米結(jié)構(gòu)。有益效果根據(jù)本發(fā)明所述的新的混合型多層納米結(jié)構(gòu)不僅表現(xiàn)出高的包封效率，還表現(xiàn)出簡單的制造過程，從而允許將表皮生長因子以高的生理學(xué)活性遞送到身體或細(xì)胞中。附圖說明圖1為顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案形成egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的過程的示意圖。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸和表面電荷的測量結(jié)果。圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的透射率的測量結(jié)果。圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的包封率的測量結(jié)果。圖5顯示通過cryo-tem觀察到的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的實(shí)際結(jié)構(gòu)。圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的分析結(jié)果。圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的皮膚滲透性質(zhì)的測量結(jié)果(圖7a：皮膚表面；和圖7b：皮膚切片)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種由表皮生長因子與由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡之間的相互作用形成的混合型多層納米結(jié)構(gòu)；一種通過表皮生長因子與由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡之間的自組裝制造蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)的方法；和一種含有混合型多層納米結(jié)構(gòu)的化妝品組合物。在下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種表皮生長因子-脂質(zhì)體混合型多層納米結(jié)構(gòu)，其包含：(a)由陽離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的空單層脂質(zhì)體；(b)圍繞空單層脂質(zhì)體且由陽離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的一個(gè)或多個(gè)單層脂質(zhì)體；和(c)表皮生長因子，其中，所述表皮生長因子通過靜電相互作用與單層脂質(zhì)體結(jié)合，并且位于單層脂質(zhì)體之間。所述陽離子脂質(zhì)可以為選自1,2-二油?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edopc)、1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，epopc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edmpc)、1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，spc)、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edppc)、1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，dotap)、n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(n-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride，dotma)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇(3β-[n-(n',n'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol，dc-膽固醇)、二油?；劝滨０?dioleoylglutamide)、二硬脂?；劝滨０?distearoylglutamide)、二棕櫚?；劝滨０?dipalmitoylglutamide)、二油酰基天冬酰胺(dioleoylaspartamide)和二甲基二-十八烷基溴化銨(dimethyldioctadecylammoniumbromide，ddab)中的一種或多種，但不限于此。所述空單層脂質(zhì)體可以具有+1至100mv，優(yōu)選+30mv或更高的zeta電位(zetapotential)(或表面電荷)。所述混合型多層納米結(jié)構(gòu)可以具有50-900nm，優(yōu)選50-500nm，更優(yōu)選100-200nm的顆粒尺寸。如果納米結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸大于900nm，則由于其大的尺寸，納米結(jié)構(gòu)將難以滲透皮膚，因此其將不適合于將表皮生長因子遞送到皮膚中。如果納米結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸小于50nm，則可以出現(xiàn)安全性方面的問題，因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)對人體的安全性尚未得到證實(shí)?；旌闲投鄬蛹{米結(jié)構(gòu)的表皮生長因子：陽離子脂質(zhì)重量比(w/w)可以為0.001至2.5:1，優(yōu)選0.001至2.3:1，更優(yōu)選0.001至2.0:1。如果表皮生長因子：陽離子脂質(zhì)重量比(w/w)小于0.001:1，則不能形成多層納米結(jié)構(gòu)。如果表皮生長因子：陽離子脂質(zhì)重量比(w/w)大于2.5:1，則由于其大的尺寸，納米結(jié)構(gòu)將難以滲透皮膚，因此其將不適合于將表皮生長因子遞送到皮膚中?；旌闲投鄬蛹{米結(jié)構(gòu)中表皮生長因子的包封率可以為至少60％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％。本發(fā)明中使用的表皮生長因子可以是韓國賽特瑞恩股份有限公司制備的重組蛋白質(zhì)，或者可以是市售可得的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明所述的“混合型多層納米結(jié)構(gòu)(hybridmulti-lamellarnanostructures)”是通過由陽離子脂質(zhì)形成的空囊泡與陰離子表皮生長因子之間的多價(jià)靜電和疏水相互作用形成的新的納米結(jié)構(gòu)。更具體地，如圖1所示，可以通過空囊泡與表皮生長因子之間的自發(fā)自組裝(spontaneousself-assembly)形成新型混合型多層納米結(jié)構(gòu)。如本文所使用，術(shù)語“空囊泡”是指具有空的內(nèi)部空間的囊泡。更具體地，該術(shù)語是指由脂質(zhì)雙層構(gòu)成的一般脂質(zhì)體。甚至更具體地，術(shù)語“空囊泡”是指本發(fā)明中的空單層脂質(zhì)體。根據(jù)本發(fā)明所述的“一個(gè)或多個(gè)單層脂質(zhì)體”可以是在脂質(zhì)體顆粒中具有多個(gè)非同心的(non-concentric)內(nèi)部水性隔室的多囊泡脂質(zhì)體(multivesicularliposome；mvl)，或者是具有由散布有水性層的脂質(zhì)雙層(lipidbilayer)形成的一系列大體上為球形的殼(shell)的多囊泡脂質(zhì)體(mvl)，但不限于此。本發(fā)明還涉及一種用于制備混合型多層納米結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟：(1)制備含有由陽離子脂質(zhì)構(gòu)成的具有均勻顆粒尺寸的空單層脂質(zhì)體的溶液；(2)制備含有表皮生長因子的水性溶液；和(3)將在步驟(1)中獲得的含有空單層脂質(zhì)體的溶液與在步驟(2)中獲得的含有表皮生長因子的水性溶液混合。步驟(1)中的陽離子脂質(zhì)可以為選自1,2-二油?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edopc)、1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，epopc)、1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edmpc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，spc)、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-乙基磷酰膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，edppc)、1,2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，dotap)、n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(n-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride，dotma)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇(3β-[n-(n',n'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol，dc-膽固醇)、二油?；劝滨０?dioleoylglutamide)、二硬脂?；劝滨０?distearoylglutamide)、二棕櫚?；劝滨０?dipalmitoylglutamide)、二油酰基天冬酰胺(dioleoylaspartamide)和二甲基二-十八烷基溴化銨(dimethyldioctadecylammoniumbromide，ddab)中的一種或多種，但不限于此?？梢酝ㄟ^一般的脂質(zhì)體制備方法制備步驟(1)中的空單層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體制備方法可以選自bangham法、干燥脂質(zhì)水合(drylipidhydration)法、冷凍解凍(freezeandthawing)法(其中，重復(fù)用液氮冷凍然后在室溫解凍的過程)、擠出法(extrusionmethod)、聲波降解(sonication)法和微流化器(microfluidizer)法，但不限于此。在步驟(1)中獲得的空單層脂質(zhì)體可以具有100-300nm，優(yōu)選100-250nm，更優(yōu)選100-200nm的顆粒尺寸。在步驟(3)中，表皮生長因子和空單層脂質(zhì)體通過它們之間的多價(jià)靜電和疏水相互作用彼此結(jié)合，以形成新的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)混合型多層納米結(jié)構(gòu)。更具體地，如圖1所示，空單層脂質(zhì)體和表皮生長因子通過它們之間的多價(jià)靜電和疏水相互作用自發(fā)自組裝(spontaneouslyself-assembly)，從而形成如圖5所示的混合型多層納米結(jié)構(gòu)?；旌闲投鄬蛹{米結(jié)構(gòu)包含：(a)由陽離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的空單層脂質(zhì)體；(b)圍繞空單層脂質(zhì)體且由陽離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的一個(gè)或多個(gè)單層脂質(zhì)體；和(c)表皮生長因子，其中所述表皮生長因子位于單層脂質(zhì)體之間。所述混合型多層納米結(jié)構(gòu)可以具有50-900nm，優(yōu)選50-500nm，更優(yōu)選100-200nm的顆粒尺寸。所述混合型多層納米結(jié)構(gòu)的表皮生長因子：陽離子脂質(zhì)重量比(w/w)可以為0.001至2.5:1，優(yōu)選0.001至2.3:1，更優(yōu)選0.001至2.0:1。所述混合型多層納米結(jié)構(gòu)中表皮生長因子的包封率可以為至少60％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％。不同于用于制備脂質(zhì)體的一般方法，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法包括制備具有期望尺寸的空的脂質(zhì)囊泡(空單層脂質(zhì)體)，并將制備的脂質(zhì)體與生理學(xué)活性成分混合。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法的優(yōu)勢在于，省略了將表皮生長因子(即生理學(xué)活性成分)在脂質(zhì)體制備期間暴露于高壓、高溫或強(qiáng)酸性溶液中的過程，因此可以保持表皮生長因子的生理學(xué)活性。本發(fā)明還涉及一種含有混合型多層納米結(jié)構(gòu)的化妝品組合物。所述混合型多層納米結(jié)構(gòu)可以滲透到皮膚的真皮，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明所述的化妝品組合物的類型沒有特別限制，并且根據(jù)所制備的制劑，本發(fā)明的化妝品組合物可以含有在本發(fā)明的領(lǐng)域中通常使用的化妝品組合物組分。本發(fā)明的化妝品組合物可以被制備成制劑，包括皮膚柔膚水、乳劑、滋養(yǎng)霜、護(hù)膚霜、美容液、精油等，并且根據(jù)所制備的制劑，本發(fā)明的化妝品組合物可以進(jìn)一步含有選自油、水、表面活性劑、潤濕劑、低級醇、增稠劑、螯合劑、顏料、防腐劑、芳香劑等的一種或多種。發(fā)明的模式在下文中，將參考實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和制劑實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和制劑實(shí)施例僅用于說明目的，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的制備1.1：含有dotap的陽離子空單層脂質(zhì)體的制備將陽離子脂質(zhì)dotap(20.96mg，avantipolarlipid,inc.)溶解于1ml氯仿中，然后在圓形玻璃燒瓶中混合。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotaryevaporator)中，用氮?dú)庖缘退贈_洗脂質(zhì)溶液以去除氯仿，并將脂質(zhì)干燥，從而形成薄的脂質(zhì)層。將形成的脂質(zhì)層進(jìn)一步在真空中干燥12小時(shí)，以完全去除剩余的氯仿。將1ml純化水加入到制備的脂質(zhì)層中，然后在37℃攪拌2小時(shí)，從而制備空的脂質(zhì)囊泡。將獲得的空脂質(zhì)囊泡擠出通過孔徑為100nm的聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)(avantipolarlipid,inc.)數(shù)次，從而制備包含dotap且具有均勻的顆粒尺寸的陽離子空單層脂質(zhì)體。1.2：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的制備將含有在實(shí)施例1.1中制備的包含dotap的陽離子空單層脂質(zhì)體的溶液(500μl)和egf溶液(500μl，celltrion,inc.)在常溫在純化水中彼此混合，從而制備egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)。將制備的納米結(jié)構(gòu)儲存在4℃直至使用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的形成的評價(jià)1.1：陽離子空單層脂質(zhì)體的形成的確認(rèn)使用動態(tài)光散射(dynamiclightscattering)(dls，elsz-1000，otsukaelectronics)測量在實(shí)施例1.1中制備的陽離子空單層脂質(zhì)體的顆粒尺寸和zeta電位，測量結(jié)果示于下表1中。測量結(jié)果表明，制備的陽離子空單層脂質(zhì)體具有200nm的顆粒尺寸和正的表面電荷。[表1]空單層脂質(zhì)體空單層脂質(zhì)體顆粒尺寸(nm)zeta電位(mv)dotap197.7±4.956.5±2.51.2：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的形成的確認(rèn)使用dls測量在實(shí)施例1.2中制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸和zeta電位，并使用分光光度計(jì)(spectrophotometer，jasco-815，jasco.inc.)在500nm處測量其透射率。測量結(jié)果示于圖2和圖3。如圖2所示，當(dāng)egf/dotap重量比為2或更小時(shí)，egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸為約200nm，這與dotap空單層脂質(zhì)體的顆粒尺寸相似，而egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的表面電荷與空單層脂質(zhì)體相比有所降低。這被認(rèn)為是因?yàn)殛庪x子的egf通過靜電相互作用與陽離子空單層脂質(zhì)體相結(jié)合，從而形成新型結(jié)構(gòu)。如圖3所示，當(dāng)egf/dotap重量比為2或更小時(shí)，透射率保持在恒定水平，但是當(dāng)重量比大于2時(shí)，透射率降低。這可能是因?yàn)闆]有與陽離子空單層脂質(zhì)體相結(jié)合而聚集的egf的量隨著egf濃度的增加而增加。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2：在egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)中egf的包封效率的評價(jià)為了測量包封在egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)中的egf的量，使用超速離心機(jī)(200,000xg，2小時(shí)，4℃，beckman)將在實(shí)施例1.2中制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)(1ml)離心，以分離未包封的游離egf。使用微量bca測試(microbcaassay)和elisa測試(elisaassay)測量分離的游離egf的量。測量結(jié)果示于圖4。從圖4中可以看出，在大部分egf/dotap重量比下出現(xiàn)60％或更高的高包封率，其根據(jù)用于定量egf的方法而略有變化。因此，可以看出，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中的包封效率顯著高于常規(guī)脂質(zhì)體中的包封效率(僅10-20％)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的多層結(jié)構(gòu)的形成的確認(rèn)為了確認(rèn)egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的多層結(jié)構(gòu)的形成，使用投入-浸漬法(plunge-dippingmethod)用cryo-tem進(jìn)行觀察，所述投入-浸漬法使得能夠精確觀察水溶液中的顆粒材料。將4μl在實(shí)施例1.2中制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)放置在花邊網(wǎng)格(laceygrid)上，從而形成薄層。將薄水性層保持在合適的溫度和97-99％的濕度以使溶劑不蒸發(fā)，然后將其迅速投入液態(tài)乙烷(約-170℃)中以獲得單層冷凍樣品。使用透射電子顯微鏡(jem-3011，jeolltd.)在加速電壓(300kv)下觀察如上所描述制成的冷凍樣品，并使用gatandigitalmicrograph程序分析數(shù)據(jù)。如圖5所示，顯示egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的多層結(jié)構(gòu)是通過egf與dotap之間的靜電吸引形成的。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的考察為了通過egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)中egf的結(jié)構(gòu)變化考察egf蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，通過使用jasco-815cd分光偏振計(jì)(spectropolarimeter，jasco-815，jascoinc.)在180-260nm的范圍內(nèi)測量圓二色性(circulardichroism，cd)。將在實(shí)施例1.2中制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)放置在0.5mm光程流通池(pathlengthcell)中并分析。使用未被捕獲在納米結(jié)構(gòu)中的游離egf作為對照。在不同溫度考查egf的結(jié)構(gòu)變化持續(xù)100天。cd數(shù)據(jù)示于圖6。由圖6可以看出，相比于對照(egf)，在4℃儲存的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)(egf-dotap，4℃)和在常溫儲存的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)(egf-dotap，常溫)沒有經(jīng)歷很大的物理變化。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5：egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的皮膚滲透性的考查為了考查egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的皮膚滲透性，使用裸鼠(skh-1hairless，5周齡，orientbio，korea)。將pdms模具(直徑：0.8cm；高度：0.5cm)固定到每只小鼠的背部，并將50ml樣品裝載在pdms模具中，并允許其與小鼠皮膚反應(yīng)1小時(shí)，所述樣品通過使熒光劑(fitc)與egf、dotap或在實(shí)施例1.2中制備的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)反應(yīng)獲得。用恒冷箱切片機(jī)(leicacm1850，leicamicrosystems)將從小鼠上分離的皮膚切片，然后用熒光顯微鏡(leicadmi3000b，leicamicrosystems)觀察。如圖7a所示，觀察到單獨(dú)的egf或dotap沉積在皮膚表面上而沒有滲透過表皮，但是egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)沒有保留在皮膚表面上。此外，如圖7b所示，使用切片機(jī)(microtome)獲得的皮膚切片的觀察表明，egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)從皮膚的表皮滲透至真皮?；谏厦娴膶?shí)驗(yàn)實(shí)施例的結(jié)果，現(xiàn)在將描述含有本發(fā)明的egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)的化妝品組合物的制劑實(shí)施例。然而，本發(fā)明的組分不限于這些制劑實(shí)施例。制劑實(shí)施例1：皮膚洗劑根據(jù)常規(guī)方法制備具有下表2所示組分的皮膚洗劑。[表2]皮膚洗劑的組合物組分含量(重量份)egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)0.51,3-丁二醇6.0甘油4.0油醇0.1聚山梨酯200.5乙醇15.0二苯甲酮-90.05芳香劑和防腐劑適量純化水至100制劑實(shí)施例2：乳液洗劑根據(jù)常規(guī)方法制備具有下表3所示組分的乳液洗劑。[表3]乳液洗劑的組合物組分含量(重量份)egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)1.0丙二醇6.0甘油4.0三乙醇胺1.2醋酸生育酚3.0液體石蠟5.0角鯊?fù)?.0澳洲堅(jiān)果油2.0聚山梨酯601.5脫水山梨糖醇倍半油酸酯1.0羧基乙烯基聚合物1.0丁基羥基甲苯0.01edta-2na0.01芳香劑和防腐劑適量純化水至100制劑實(shí)施例3：精油(essence)根據(jù)常規(guī)方法制備具有下表4所示組分的精油。[表4]精油的組合物制劑實(shí)施例4：滋養(yǎng)霜根據(jù)常規(guī)方法制備具有下表5所示組分的滋養(yǎng)霜。[表5]滋養(yǎng)霜的組合物組分含量(重量份)egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)2.0十八十六醇2.0硬脂酸甘油酯1.5三辛酸甘油酯5.0聚山梨酯601.2脫水山梨糖醇硬脂酸酯0.5角鯊?fù)?.0液體石蠟3.0環(huán)甲硅油3.0丁基羥基甲苯0.05δ-生育酚0.2濃縮甘油4.01,3-丁二醇2.0黃原膠0.1edta-2na0.05芳香劑和防腐劑適量純化水至100制劑實(shí)施例5：護(hù)膚霜根據(jù)常規(guī)方法制備具有下表6所示組分的護(hù)膚霜。[表6]護(hù)膚霜的組合物組分含量(重量份)egf-dotap混合型多層納米結(jié)構(gòu)1.0丙二醇2.0甘油4.0羧基乙烯基聚合物0.3乙醇7.0peg-40氫化蓖麻油0.8三乙醇胺0.3丁基羥基甲苯0.01edta-2na0.01芳香劑和防腐劑適量純化水至100當(dāng)前第1頁12