公開領(lǐng)域本主題發(fā)明涉及蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒素的修飾，編碼這些毒素的多核苷酸序列，以及產(chǎn)生這些毒素的轉(zhuǎn)基因植物。發(fā)明背景昆蟲和其它害蟲在作物損失和控制這些害蟲的費(fèi)用方面每年導(dǎo)致農(nóng)民花費(fèi)數(shù)十億美元。除了田間作物的損失外，昆蟲害蟲也對(duì)蔬菜和水果種植者，觀賞花卉的生產(chǎn)者和家庭園藝師造成負(fù)擔(dān)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中由昆蟲害蟲引起的損失包括作物產(chǎn)率的降低，作物質(zhì)量的降低和收獲成本的增加。昆蟲害蟲主要通過化學(xué)殺蟲劑(pesticides)的密集應(yīng)用來控制，所述化學(xué)殺蟲劑通過抑制昆蟲生長，防止昆蟲進(jìn)食或繁殖或?qū)е滤劳龆l(fā)揮作用。因此，可以達(dá)到良好的昆蟲控制，但是這些化學(xué)品有時(shí)也可以影響其它有益昆蟲。源自廣泛使用化學(xué)殺蟲劑的另一個(gè)問題是昆蟲抗性群體的出現(xiàn)。這已經(jīng)通過各種抗性管理實(shí)踐得到部分緩解，但是對(duì)替代的害蟲控制劑的需求日益增加。生物害蟲控制劑，諸如表達(dá)殺蟲毒素如δ-內(nèi)毒素的蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)(bt)菌株也已經(jīng)應(yīng)用于作物植物產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果，提供了對(duì)化學(xué)殺蟲劑的備選或補(bǔ)充。已經(jīng)分離了編碼這些δ-內(nèi)毒素中某一些的基因，并且已經(jīng)顯示它們?cè)诋愒此拗髦械谋磉_(dá)提供了用于控制經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲害蟲的另一種工具。特別地，在轉(zhuǎn)基因植物中殺蟲毒素(諸如蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素)的表達(dá)已經(jīng)提供了針對(duì)選定的昆蟲害蟲的有效保護(hù)，并且表達(dá)此類毒素的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，為農(nóng)民減少化學(xué)昆蟲控制劑的應(yīng)用創(chuàng)造了條件。鱗翅目是一群重要的農(nóng)業(yè)、園藝、和家庭害蟲，其每年引起大量的損害。此昆蟲目涵蓋以葉和根為食的幼蟲和成蟲。鱗翅類昆蟲害蟲包括但不限于：小蠟螟(achoroiagrisella)、西黑頭長翅卷蛾(aclerisgloverana)、黑頭長翅卷蛾(aclerisvariana)、棉褐帶卷蛾(adoxophyesorana)、小地老虎(agrotisipsilon，blackcutworm“bcw”)、棉葉波紋夜蛾(alabamaargillacea)、波林尺蠖(alsophilapometaria)、臍橙螟(amyeloistransitella)、地中海斑螟(anagastakuehniella)、桃條麥蛾(anarsialineatella)、橙紋犀額蛾(anisotasenatoria)、柞蠶(antheraeapernyi)、大豆夜蛾(anticarsiagemmatalis)(刺毛黧豆毛蟲)、黃卷蛾屬(archipssp.)、帶卷蛾屬(argyrotaeniasp.)、athetismindara、家蠶蛾(bombyxmori)、棉潛蛾(bucculatrixthurberiella)、干果斑螟(cadracautella)、色卷蛾屬(choristoneurasp.)、cochyllshospes、苜蓿黃蝶(coliaseurytheme)、米螟(corcyracephalonica)、cydialatiferreanus、蘋果皮小卷蛾(cydiapomonella)、核桃配片舟蛾(datanaintegerrima)、西伯利亞松毛蟲(dendrolimussibericus)、葡萄小卷葉野螟(desmiafeneralis)、甜瓜絹野螟(diaphaniahyalinata)、黃瓜絹野螟(diaphanianitidalis)、玉米桿草螟(diatraeagrandiosella，南方玉米根蟲(“swcb”))、小蔗桿草螟(diatraeasaccharalis)、榆林黃尺蠖(ennomossubsignaria)、蛀莖螟蛾(eoreumaloftini)、煙草粉螟(esphestiaelutella)、菩提松尺蠖(erannistilaria)、鹽澤燈蛾(estigmeneacrea)、euliasalubricola、eupocoelliaambiguella、環(huán)針單紋卷蛾(eupoeciliaambiguella)、黃毒蛾(euproctischrysorrhoea)、暗緣地老虎(euxoamessoria)、蠟螟(galleriamellonella)、梨小食心蟲(grapholitamolesta)、葡萄葉煙翅斑蛾(harrisinaamericana)、helicoverpasubflexa、谷實(shí)夜蛾/玉米穗蟲(helicoverpazea，cornearworm(“cew”))、煙芽夜蛾(heliothisvirescens)(煙草夜蛾“tbw”)、行列半白大蠶蛾(hemileucaoliviae)、向日葵酮斑螟(homoeosomaelectellum)、美國白蛾(hyphantiacunea)、番茄莖麥蛾(keiferialycopersicella)、鐵杉尺蠖(lambdinafiscellariafiscellaria)、西方鐵杉尺蠖(lambdinafiscellarialugubrosa)、雪毒蛾(leucomasalicis)、葡萄花翅小卷蛾(lobesiabotrana)、網(wǎng)錐額野螟(loxostegesticticalis)、舞毒蛾(lymantriadispar)、macallathyrisalis、天幕毛蟲屬(malacosomasp.)、甘藍(lán)夜蛾(mamestrabrassicae)、蓓帶夜蛾(mamestraconfigurata)、番茄天蛾(manducaquinquemaculata)、煙草天蛾(manducasexta)、豆莢野螟(marucatestulalis)、melanchrapicta、果園秋尺蠖(operophterabrumata)、古毒蛾屬(orgyiasp.)、歐洲玉米螟(ostrinianubilalis，europeancornborer“ecb”)、蘋尺蠖(paleacritavernata)、蛀莖夜蛾(papiapemanebris，常見莖蛀蟲)、巨燕尾蝶(papiliocresphontes)、紅鈴麥蛾(pectinophoragossypiella)、加州櫟石蛾(phryganidiacalifornica)、斑幕潛葉蛾(phyllonorycterblancardella)、暗脈菜粉蝶(pierisnapi)、菜粉蝶(pierisrapae)、苜蓿綠夜蛾(plathypenascabra)、platynotaflouendana、荷蘭石竹小卷蛾(platynotastultana)、洋薊羽蛾(platyptiliacarduidactyla)、印度谷斑螟(plodiainterpunctella)、小菜蛾/菱紋背蛾(plutellaxylostella，diamondbackmoth“dbm”)、美國紋白蝶(pontiaprotodice)、白點(diǎn)粘蟲(pseudaletiaunipuncta)、大豆尺夜蛾(pseudoplasiaincludens)(大豆尺蠖“sbl”)、sabulodesaegrotata、紅山背舟蛾(schizuraconcinna)、麥蛾(sitotrogacerealella)、蘋白小卷蛾(spilontaocellana)、南方灰翅夜蛾(spodopteraeridania)(南方粘蟲“saw”)、草地貪夜蛾/秋粘蟲(spodopterafrugiperda，秋粘蟲“faw”)、甜菜夜蛾/貪夜蛾(spodopteraexigua，甜菜粘蟲“baw”)、thaurnstopoeapityocampa、ensolabisselliella、粉紋夜蛾(trichoplusiani)(卷心菜尺蠖“cl”)、溫室螟蛾(udearubigalis)、xylomygescuriails、和蘋果巢蛾(yponomeutapadella)。上述的任何屬(以及其他)，一般而言，也可以作為靶標(biāo)構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這些屬中的任何其他昆蟲(作為靶標(biāo))也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。蘇云金芽孢桿菌(b.t.)是土壤傳播的、革蘭氏陽性的孢子形成細(xì)菌，其產(chǎn)生稱為delta內(nèi)毒素或cry蛋白的殺蟲結(jié)晶蛋白(在schnepf等，1998的綜述)。具有新的殺蟲特性的新型結(jié)晶(cry)蛋白質(zhì)以不斷增長的速度繼續(xù)被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)報(bào)道了超過440種cry基因。目前，已有超過450種獨(dú)特的cry和細(xì)胞毒素(cytotoxin，cyt)蛋白被歸類到57個(gè)同源性等級(jí)之中。cry蛋白是基于序列同一性的程度命名的，其一級(jí)、二次和三級(jí)邊界分別在約45％，78％和95％的同一性處；近緣的等位基因被賦予新的四級(jí)代號(hào)(crickmore等，1998)。http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/intro.html維護(hù)有一個(gè)delta內(nèi)毒素的大清單，并定期有更新。目前有73個(gè)主要的“cry”毒素類群(cry1-cry73)，以及另外的cyt毒素和植物殺蟲蛋白(vip)毒素等。這些數(shù)字表示的類群中許多都包含大寫字母表示的亞群，而大寫字母表示的亞群具有小寫字母的子亞群。(cry1有a-l，cry1a有a-i)。迄今為止，使用b.t.蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)得到成功地注冊(cè)，去監(jiān)管或者商業(yè)化。這些包括玉米中的cry1ab，cry1ac，cry1f，vip3a，cry34ab1/cry35ab1和cry3bb，棉花中的cry1ac、vip3a和cry2ab，以及馬鈴薯中的cry3a。b.t.毒素占生物殺蟲劑市場的90％以上，而且已被開發(fā)用于提供對(duì)昆蟲攝食的抗性的轉(zhuǎn)基因作物的基因基本上全部來源于b.t.毒素。cry蛋白質(zhì)是口服性毒物，通過作用于易感昆蟲的中腸細(xì)胞發(fā)揮功能。許多cry蛋白的活性形式包含三個(gè)不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。研究最多的b.t.蛋白質(zhì)是三結(jié)構(gòu)域cryδ-內(nèi)毒素的成員。這些蛋白質(zhì)的大小從大約70kda到130kda不等。原始蛋白質(zhì)序列分析揭示了五個(gè)高度保守的序列區(qū)塊，還揭示了保守區(qū)塊三和區(qū)塊五之間有高度序列變異性(schnepf等，1998)。已經(jīng)為cry1aa1、cry2aa1、cry3aa1、cry3bb1、cry4aa、cry4ba和cry8ea1確定了三維晶體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)非常相似，并且由具有以下特征的三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成(參見demaagd等人，2003)。結(jié)構(gòu)域i是七個(gè)α螺旋的束，其中螺旋五被六個(gè)兩親螺旋包圍。已有證據(jù)顯示該結(jié)構(gòu)域中腸膜插入和孔形成。它與其他造孔蛋白(包括溶血素和大腸桿菌素)享有同源性。結(jié)構(gòu)域ii由三個(gè)反平行β片組成，它們一起被包裝在一個(gè)β棱鏡(beta-prism)中。該域與某些碳水化合物結(jié)合蛋白(包括卵黃索(vitelline)和jacaline)享有同源性。該結(jié)構(gòu)域的各環(huán)在結(jié)合昆蟲中腸受體中起重要作用。在cry1a蛋白中，結(jié)構(gòu)域iiβ片的頂點(diǎn)處的表面暴露的環(huán)參與和鱗翅目鈣粘蛋白受體的結(jié)合。結(jié)構(gòu)域iii是與另一受體相互作用的β夾心結(jié)構(gòu)，此類受體的實(shí)例，就cry1a蛋白質(zhì)而言，有氨基肽酶和堿性磷酸酶(piggotandellar，2007)。在結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)域與葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白質(zhì)的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域有親緣關(guān)系。該結(jié)構(gòu)域結(jié)合某些類型的受體蛋白，并可能參與寡聚毒素前體的插入。保守的b.t.序列塊2和3分別定位在結(jié)構(gòu)域2的n末端和c末端附近。因此，這些保守序列塊2和3是三個(gè)功能域之間的近似邊界區(qū)域。這些具有dna和蛋白質(zhì)同源性的保守區(qū)域已被開發(fā)用于工程化重組b.t.毒素(美國專利號(hào)6,090,931，wo91/01087，wo95/06730，wo1998022595)。提出的cry蛋白作用模式模型之一是基于敏感昆蟲中腸膜中的孔形成(knowlesandellar，1987)。在該模型的當(dāng)前版本(bravo等人，2007)中，與鱗翅目中腸膜上的鈣粘蛋白和氨基肽酶受體的結(jié)合對(duì)于cry蛋白毒性都是必需的。根據(jù)孔隙形成模型，cry蛋白中毒涉及幾個(gè)步驟：1)可溶性cry原毒素蛋白水解加工成活化的核心毒素；2)cry蛋白與昆蟲中腸上的鈣粘蛋白受體結(jié)合；3)在核心毒素n末端進(jìn)一步蛋白水解切割以除去α-螺旋區(qū)；4)cry蛋白寡聚形成前孔；5)前孔結(jié)合第二位點(diǎn)膜受體(氨基肽酶和堿性磷酸酶)；6)前孔插入膜；和7)滲透性細(xì)胞溶解導(dǎo)致中腸破裂和昆蟲死亡。由于抗蟲轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有人擔(dān)憂害蟲種群將會(huì)對(duì)這些植物產(chǎn)生的殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性。人們已經(jīng)提出了幾種策略來保護(hù)基于bt的昆蟲抗性性狀的效用，包括與避難所組合部署高劑量的蛋白質(zhì)，以及用不同毒素輪換或共同部署(mcgaughey等(1998)，“btresistancemanagement”，naturebiotechnol.16：144-146)。昆蟲對(duì)b.t.蛋白的抗性可以通過幾種機(jī)制發(fā)生(heckel等，2007，piggotandellar，2007)。在昆蟲中已經(jīng)鑒定了多個(gè)cry蛋白受體蛋白類別，而且每個(gè)受體類別有多個(gè)實(shí)例。對(duì)特定cry蛋白的抗性可以通過例如受體蛋白質(zhì)的鈣粘著蛋白結(jié)構(gòu)域的毒素結(jié)合部分內(nèi)的突變而發(fā)生。另一種抗性方式可以通過原毒素加工蛋白酶介導(dǎo)。因此，鱗翅目物種中對(duì)cry1a毒素的抗性具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，至少有四個(gè)不同的主要抗性基因。對(duì)小菜蛾(plutellaxylostella)(tabashnik，1994)，鱗翅目昆蟲中的粉紋夜蛾(trichoplusiani)(janmaat和myers2003,2005)，谷實(shí)夜蛾(helicoverpazea)(tabashnik等，2008)和草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)(storer等人，2010)等已經(jīng)在田間出現(xiàn)了對(duì)cry蛋白的抗性。開發(fā)新的高效力的cry蛋白質(zhì)將為管理鱗翅目昆蟲提供更多的工具。本發(fā)明提供了b.t.殺蟲蛋白，其可有效控制對(duì)cry1ac和cry1f有抗性的昆蟲。這些蛋白質(zhì)毒素可以有利地用于保護(hù)農(nóng)藝作物免受昆蟲攝食損害。以一定方式表達(dá)這些昆蟲毒素，使得感興趣的作物中存在足夠量的功能活性蛋白質(zhì)的能力也是本發(fā)明的主題。發(fā)明概述包含seqidno:2的殘基2至68的修飾的cry1ca毒素，其中氨基酸殘基54選自gly和ala，氨基酸殘基57選自leu和met，且氨基酸殘基68選自val、phe和ile。包含seqidno:210的殘基2至628的修飾的cry1ca毒素，其中氨基酸殘基54選自gly和ala，氨基酸殘基57選自leu和met，氨基酸殘基68選自val、phe和ile，氨基酸殘基73選自trp、ala和met，氨基酸殘基596選自phe、met和ala，且氨基酸酸殘基620選自leu和phe。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:36的氨基酸殘基629至1164組成的羧基末端延伸。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:36的氨基酸殘基629至1164組成的羧基末端延伸。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:40的氨基酸殘基1至74組成的氨基末端延伸。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:40的氨基酸殘基1至74組成的氨基末端延伸。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:40的氨基酸殘基1至74組成的氨基末端延伸。上述修飾的cry1ca毒素還包含由seqidno:40的氨基酸殘基1至74組成的氨基末端延伸。本發(fā)明中包括編碼修飾的cry1ca毒素的dna，產(chǎn)生修飾的cry1ca毒素的轉(zhuǎn)基因植物和使用經(jīng)修飾的cry1ca毒素控制害蟲的方法。本發(fā)明涉及用于控制對(duì)植物和農(nóng)業(yè)有害的節(jié)肢動(dòng)物害蟲的新材料和方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制鱗翅目害蟲的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明有用的具體的b.t.cry蛋白質(zhì)(內(nèi)毒素，毒素)包括可從命名為mr-1206的b.t.分離株獲得的毒素。本發(fā)明還包括示例的b.t.分離株和毒素的突變體的應(yīng)用，這些突變體具有改善的鱗翅目活性性質(zhì)，可抵抗蛋白酶加工，或者當(dāng)基因被轉(zhuǎn)化到異源表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)以高水平表達(dá)。制備突變體的程序在微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
是眾所周知的。紫外光和化學(xué)誘變劑如亞硝基胍廣泛用于此目的?？梢浴笆┯谩被蛱峁┲黝}蛋白質(zhì)毒素以通過各種方式與目標(biāo)昆蟲接觸。例如，可以使用轉(zhuǎn)基因植物(其中所述蛋白質(zhì)由植物產(chǎn)生并存在于植物中)，轉(zhuǎn)基因植物是本領(lǐng)域公知的。也可以在植物的特定組織例如根，葉等中選擇性地表達(dá)毒素基因。這可以通過使用例如組織特異性啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。噴灑施用應(yīng)用(spray-onapplication)是另一個(gè)實(shí)例，并且在本領(lǐng)域中也是已知的。主題蛋白質(zhì)可以適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜谄谕淖罱K用途，然后在發(fā)現(xiàn)侵染之前，在發(fā)現(xiàn)侵染之后，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)昆蟲之后，在之前和之后，等等，噴灑(或以其它方式施用)到待保護(hù)植物之上和/或植物周圍和/或植物附近。主題蛋白質(zhì)也可以適當(dāng)?shù)嘏渲撇⒁园璺N劑(seedtreatment)的形式施用于種子，這使得蛋白質(zhì)可以與植物的根部區(qū)域接觸以保護(hù)其免受嚙根性昆蟲之害。例如，誘餌顆粒也可以使用并且是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明蛋白質(zhì)可用于保護(hù)幾乎任何類型的植物免受鱗翅目昆蟲的損害。這些植物的實(shí)例包括玉米，向日葵，大豆，棉花，卡諾拉，稻，高粱，小麥，大麥，蔬菜，觀賞植物，辣椒類(包括辣椒)，甜菜，水果和草坪草，僅舉數(shù)例。特別優(yōu)選的植物是玉米、大豆和棉花。一種最優(yōu)選的植物是玉米。另一種最優(yōu)選的植物是大豆。另一種最優(yōu)選的植物是棉花。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸序列編碼約68-71kda的毒素。這些毒素用于控制鱗翅目害蟲，特別是秋粘蟲、小菜蛾、西南玉米螟，南方粘蟲，玉米穗蛾、和歐洲玉米螟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本主題發(fā)明涉及這樣的植物細(xì)胞，其被用本主題發(fā)明的至少一個(gè)多核苷酸序列轉(zhuǎn)化，使得經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在被目標(biāo)害蟲消耗的組織中產(chǎn)生并含有本發(fā)明的殺蟲毒素?；蛘撸景l(fā)明的b.t.分離株、或表達(dá)編碼本文所述的殺蟲毒素蛋白質(zhì)的基因的重組微生物，可用于防治昆蟲害蟲。在這方面，本發(fā)明包括處理基本上完整的b.t.細(xì)胞，和/或含有本發(fā)明毒素的重組細(xì)胞，這些細(xì)胞經(jīng)過處理，使得當(dāng)這些基本上完整的細(xì)胞被施用于目標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)，殺蟲活性延長。經(jīng)處理的細(xì)胞充當(dāng)殺蟲毒素的保護(hù)性包層。一旦被目標(biāo)昆蟲攝入后，毒素就變成活性。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含編碼殺蟲蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列的分離的核酸分子，以及足以用作雜交探針來鑒定編碼所要求保護(hù)的毒素的核酸的核酸分子。如本文所用的，術(shù)語“核酸分子”旨在包括dna分子(例如cdna或基因組dna)和rna分子(例如mrna)，以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的dna或rna的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈dna。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39，及其互補(bǔ)物。“互補(bǔ)物”是指這樣的核苷酸序列，其具有與給定核苷酸序列的充分的互補(bǔ)性，使得其可以與給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體(雙鏈)分子。由這些核苷酸序列編碼的殺蟲活性的修飾的cry1ca毒素的相應(yīng)氨基酸序列列于seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。作為所要求保護(hù)的編碼毒素的核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本發(fā)明中?！捌巍笔侵妇幋a所要求修飾的cry1ca毒素片段的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼所請(qǐng)求保護(hù)的毒素蛋白質(zhì)的生物活性部分，或者可以是可以使用下文所公開的方法用作雜交探針或pcr引物的片段。序列表簡要說明seqidno:1編碼dig-468的dna序列seqidno:2是dig-468蛋白質(zhì)序列seqidno:3編碼dig-483的dna序列seqidno:4是dig-483蛋白質(zhì)序列seqidno:5編碼dig-485的dna序列seqidno:6是dig-485蛋白質(zhì)序列seqidno:7編碼dig-487的dna序列seqidno:8是dig-487蛋白質(zhì)序列seqidno:9編碼dig-462的dna序列seqidno:10是dig-462蛋白序列seqidno:11編碼dig-463的dna序列seqidno:12是dig-463蛋白序列seqidno:13編碼dig-464的dna序列seqidno:14是dig-464蛋白質(zhì)序列seqidno:15編碼dig-465的dna序列seqidno:16是dig-465蛋白質(zhì)序列seqidno:17編碼dig-466的dna序列seqidno:18是dig-466蛋白質(zhì)序列seqidno:19編碼dig-467的dna序列seqidno:20是dig-467蛋白質(zhì)序列seqidno:21編碼dig-469的dna序列seqidno:22是dig-469蛋白質(zhì)序列seqidno:23編碼dig-473的dna序列seqidno:24是dig-473蛋白質(zhì)序列seqidno:25編碼dig-474的dna序列seqidno:26是dig-474蛋白質(zhì)序列seqidno:27編碼dig-482的dna序列seqidno:28是dig-482蛋白質(zhì)序列seqidno:29經(jīng)玉米密碼子優(yōu)化的編碼修飾的cry1ca的dna序列(irdig544.11)seqidno:30是修飾的cry1ca蛋白質(zhì)蛋白毒素序列(irdig544.11)seqidno:31編碼經(jīng)過高gc密碼子優(yōu)化的修飾的cry1ca，irdig544.12的dna序列seqidno:32irdig544.12的蛋白毒素序列seqidno:33是針對(duì)雙子葉植物優(yōu)化的編碼修飾的cry1ca：irdig544.9的dna序列seqidno:34修飾的cry1ca：irdig544.9的蛋白質(zhì)序列seqidno:35雙子葉植物優(yōu)化的編碼修飾的cry1ca：irdig544.8的dna序列seqidno:36針對(duì)雙子葉植物密碼子優(yōu)化的irdig544.8蛋白質(zhì)seqidno:37編碼cry1ab原毒素區(qū)段與修飾的cry1ca毒素的融合物的dna序列seqidno:38是從seqidno:37的dna產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素序列seqidno:39高gc密碼子優(yōu)化的dna序列，編碼修飾的cry1cairdig544.12與trap12的融合物seqidno:40是修飾的cry1ca毒素irdig544.12與trap12的融合物。附圖說明圖1顯示了在通過葉沖孔取樣的t1玉米葉中構(gòu)建體115752表達(dá)dig-465的水平，和構(gòu)建體115753表達(dá)dig-473的水平。圖2是玉米中由faw或cry1fa抗性faw引起的葉損傷的量對(duì)dig-465的表達(dá)水平的作圖。圖3是玉米中由faw或cry1fa抗性faw引起的葉損傷的量對(duì)dig-473的表達(dá)水平的作圖。發(fā)明詳細(xì)說明本文中的術(shù)語“遺傳物質(zhì)”意圖包括所有基因、核酸、dna和rna。這些序列已經(jīng)以一定方式被改變，以在當(dāng)該基因被轉(zhuǎn)化到植物，特別是玉米和雙子葉植物中時(shí)，提高表達(dá)的蛋白質(zhì)毒素的穩(wěn)定性。本文討論的蛋白質(zhì)毒素通常被稱為“殺蟲劑”或“殺蟲的”。殺蟲劑”和“殺蟲的”在本文中意指蛋白質(zhì)毒素具有本文進(jìn)一步定義的“功能活性”，并被用作昆蟲控制劑。“功能活性”在本文中是指蛋白質(zhì)毒素可發(fā)揮昆蟲控制劑功能，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)具有口服活性，或具有毒性作用，或能夠破壞或阻止進(jìn)食，這可能或可能不引起昆蟲死亡。當(dāng)昆蟲與通過轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、經(jīng)配制的蛋白質(zhì)組合物、可噴霧蛋白質(zhì)組合物、誘餌基質(zhì)或其它遞送系統(tǒng)遞送的有效量的毒素接觸時(shí)，結(jié)果通常是昆蟲死亡，或這些昆蟲不以給昆蟲提供毒素的來源為食。術(shù)語“寡核苷酸”，是指由rna或dna的核苷酸的短鏈組成的大分子。這樣的長度可以是至少一個(gè)核苷酸，但通常在約10至約12個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。寡核苷酸的長度的確定在技術(shù)人員的技藝范圍內(nèi)，在本文中不應(yīng)該構(gòu)成限制。因此，寡核苷酸可以小于10個(gè)或大于12個(gè)。本主題發(fā)明不僅涉及編碼這些類型的毒素的多核苷酸序列，而且涉及這些多核苷酸序列用于產(chǎn)生表達(dá)毒素的重組宿主的用途。如本文所用的，術(shù)語“毒性”是指由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素具有如本文所定義的“功能活性”。術(shù)語“修飾的cry1ca毒素”意在包括序列表的所有蛋白質(zhì)序列和本文所述的它們的所有變體。本文中使用的術(shù)語“遺傳物質(zhì)”意圖包括所有基因、核酸、dna和rna。對(duì)于多核苷酸、dna、rna、寡核苷酸和引物的核苷酸殘基的命名以及蛋白質(zhì)氨基酸殘基的命名，在本文中使用標(biāo)準(zhǔn)iupac縮寫。核酸序列以標(biāo)準(zhǔn)5'至3'方向呈現(xiàn)，蛋白質(zhì)序列以標(biāo)準(zhǔn)的氨基(n)末端到羧基(c)末端方向呈現(xiàn)。本發(fā)明的毒素和基因可以通過其氨基酸和核苷酸序列、以及全長dna氨基序列中包含的獨(dú)特片段的序列進(jìn)一步限定。每個(gè)新類別之內(nèi)的分子的序列可以用其與特定的示例序列的同源性、以及用其與某些示例的探針和引物雜交、或被某些示例的探針和引物擴(kuò)增的能力來限定。本文提供的毒素類別也可以基于其與某些抗體的免疫反應(yīng)性來鑒定。毒素結(jié)構(gòu).本主題發(fā)明的毒素也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域組成來表征。由于蛋白質(zhì)序列變異性與生物活性譜中的差異之間相關(guān)性，早先有假說認(rèn)為，區(qū)塊三和區(qū)塊五之間的“高變區(qū)”區(qū)域是各種b.t.δ-內(nèi)毒素之間昆蟲特異性的差異的基礎(chǔ)。當(dāng)編碼天然全長cry1ca蛋白的基因被插入玉米細(xì)胞并在玉米細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，觀察到至少5種可檢測的蛋白水解降解產(chǎn)物。確定這5種多肽具有以下氨基酸長度：1-1164、1-628、29-628、74-628和74-596。在檢測到的五種cry1ca降解產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)片段對(duì)要因性(keydriver)昆蟲害蟲無活性。在大多數(shù)情況下，這兩個(gè)無活性片段代表了在玉米細(xì)胞中檢測到的cry1ca相關(guān)蛋白的主要部分。在玉米中表達(dá)cry1ca的天然全長基因?qū)е轮参飳?duì)關(guān)鍵害蟲如草地貪夜蛾的功能活性不足。當(dāng)表達(dá)截短的天然cry1ca蛋白(aa1-628)的基因被插入玉米細(xì)胞中并在玉米細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，發(fā)生蛋白水解加工較少。大多數(shù)保持未被加工且具有功能活性。因此，在玉米細(xì)胞中表達(dá)截短的cry1ca基因后，由于玉米細(xì)胞中蛋白水解減少，導(dǎo)致植物對(duì)主要昆蟲害蟲具有足夠的功能活性。改變cry1ca的原始氨基酸序列為實(shí)現(xiàn)針對(duì)針對(duì)關(guān)鍵害蟲的連續(xù)生物活性提供了可能性，并且導(dǎo)致蛋白質(zhì)的蛋白水解加工減少，如在體外使用胰凝乳蛋白酶作為蛋白酶測量的。由于改變的cry1ca蛋白質(zhì)的蛋白水解加工較少，導(dǎo)致植物中積累的功能活性蛋白質(zhì)的量更高，并導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)昆蟲害蟲的活性更大。蛋白酶敏感變體.昆蟲腸道蛋白酶通常發(fā)揮作用幫助昆蟲從餌食蛋白質(zhì)獲得所需的氨基酸。了解最充分的昆蟲消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其似乎是最常見的類型(englemann和geraerts，1980)，特別是在鱗翅目物種中。鞘翅目昆蟲的腸道比鱗翅目的腸道更偏中性到酸性。大多數(shù)鞘翅目幼蟲和成蟲，例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲，具有微酸性的中腸，且由半胱氨酸蛋白酶提供主要的蛋白水解活性(wolfson和murdock，1990)。更準(zhǔn)確地說，thie和houseman(1990)在科羅拉多馬鈴薯甲蟲中鑒定和表征了半胱氨酸蛋白酶——組織蛋白酶b樣蛋白酶和組織蛋白酶h樣蛋白酶，以及天冬氨酰蛋白酶——組織蛋白酶d樣蛋白酶。gillikin等人(1992)表征了西方玉米根蟲幼蟲的腸道中的蛋白水解活性，發(fā)現(xiàn)主要是半胱氨酸蛋白酶。美國專利第7230167號(hào)公開了絲氨酸蛋白酶組織蛋白酶g存在于西方玉米根蟲中。昆蟲腸道蛋白酶的多樣性和不同的活性水平可能影響昆蟲對(duì)特定b.t.毒素的昆蟲敏感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，毒素在其氨基酸序列中具有特定的改變，從而顯著降低玉米植物中天然存在的蛋白酶對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白酶加工水平。這些氨基酸的變化導(dǎo)致該蛋白質(zhì)當(dāng)在玉米中表達(dá)時(shí)的功能活性水平更高?？梢酝ㄟ^化學(xué)基因合成或剪接重疊pcr在期望的位置引入蛋白酶切割位點(diǎn)(horton等，1989)。例如，可以在cry蛋白結(jié)構(gòu)中的特定位點(diǎn)任選地插入絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列以影響某些昆蟲害蟲中腸內(nèi)的期望的缺失位點(diǎn)處的蛋白質(zhì)加工。通過在期望的加工位點(diǎn)工程構(gòu)建蛋白酶識(shí)別序列，可以利用鱗翅目中腸絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等(christler等，1992)來激活cry蛋白。同樣，可以類似地通過在期望的加工位點(diǎn)工程構(gòu)建識(shí)別序列來利用鞘翅目絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶g樣蛋白酶。此外，通過在期望的加工位點(diǎn)工程構(gòu)建識(shí)別序列，可以利用鞘翅目半胱氨酸蛋白酶，如組織蛋白酶(b樣、l樣、o樣和k樣蛋白酶)(koiwa等，2000和bown等，2004)，金屬蛋白酶如adam10(ochoa-campuzano等人，2007)，天冬氨酸蛋白酶如組織蛋白酶d樣和e樣蛋白酶，胃蛋白酶，plasmepsin和凝乳酶。本發(fā)明的范圍包括變體cry1ca殺蟲蛋白，這些變體cry1ca殺蟲蛋白是通過操縱本發(fā)明的殺蟲蛋白的編碼序列，在適當(dāng)位置引入或消除蛋白酶加工位點(diǎn)，以允許或消除昆蟲、植物或微生物蛋白酶對(duì)較大變體蛋白質(zhì)的蛋白水解切割而產(chǎn)生的。這種操作的最終結(jié)果是產(chǎn)生具有與完整(全長)天然毒素蛋白相同或更好的活性的毒素分子。與ii型限制性內(nèi)切核酸酶的dna底物識(shí)別和切割中的高度序列特異性不同，蛋白水解酶對(duì)包含切割識(shí)別位點(diǎn)的氨基序列的非特異性更高。與組織蛋白酶b，k，l和s(bown等人，2004)相比，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)關(guān)于包含一些蛋白酶切割位點(diǎn)，特別是組織蛋白酶g的氨基酸結(jié)構(gòu)的一些共性。在下文舉例說明中的蛋白酶切割位點(diǎn)的命名法中，切割位點(diǎn)的上游(即朝向n末端)的氨基酸殘基編號(hào)為p1，p2，p3，p4，p5等，殘基p1緊鄰于切割位點(diǎn)，而殘基p5在n末端方向上相距切割位點(diǎn)第五遠(yuǎn)。切割位點(diǎn)的下游(即朝向c末端)的氨基酸殘基編號(hào)為p1'，p2'，p3'，p4'，p5'等，殘基p1'緊鄰切割位點(diǎn)，殘基p5'在c末端方向上相距切割位點(diǎn)第五遠(yuǎn)。已知組織蛋白酶g表現(xiàn)出在p1殘基谷氨酰胺、賴氨酸、色氨酸或苯丙氨酸之后優(yōu)先切割，其中殘基p2、p3、p4、p5等，以及p1'、p2'、p3'、p4'、p5'等，可以是通常在天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸的任何一種。組織蛋白酶b、k、l和s表現(xiàn)出少許增強(qiáng)的切割位點(diǎn)序列特異性，其中p2氨基酸的側(cè)鏈適配到組織蛋白酶的底物結(jié)合位點(diǎn)s2中。這些組織蛋白酶的s2位點(diǎn)優(yōu)先與具有大疏水側(cè)鏈(例如在纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸中發(fā)現(xiàn)的)的p2氨基酸相互作用，且不利于與具有帶電側(cè)鏈的p2殘基相互作用(例外的是組織蛋白酶b和l接受p2位置上的精氨酸的大親水帶電側(cè)鏈)。p3位置的氨基酸的身份可見到一些特異性。例如，當(dāng)苯丙氨酸或精氨酸占據(jù)p2位置時(shí)，組織蛋白酶l優(yōu)先在p1位置的精氨酸之后切割。p3氨基酸可以是芳香型(例如苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸或酪氨酸)或疏水型(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)。位置p4、p5等和p1'、p2'、p3'、p4'、p5'等可以是通常在天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸的任何一種。蛋白水解切割還依賴于主題切割序列對(duì)各個(gè)蛋白酶而言的可用性；潛在切割位點(diǎn)被隔離在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)可能使蛋白質(zhì)對(duì)特定蛋白酶的切割具有抗性。有人認(rèn)為，昆蟲腸道蛋白酶的多樣性和不同的活性水平可能影響昆蟲對(duì)特定b.t.毒素的敏感性。生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以檢測易感昆蟲的腸道蛋白酶對(duì)較大蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶切割/激活而產(chǎn)生的殺蟲蛋白片段的生物化學(xué)特征(包括但不限于確定構(gòu)成該多肽的n末端和c末端的氨基酸的序列)的蛋白酶。也可以表征非敏感昆蟲的腸道或宿主植物的蛋白酶體系，并且在b.t.殺蟲蛋白的編碼序列內(nèi)的適當(dāng)位置構(gòu)造容易被非敏感昆蟲的腸道中、或預(yù)期要在其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生該b.t.殺蟲蛋白的宿主植物中的蛋白酶切割的序列。對(duì)主題b.t.殺蟲蛋白的此類分析和操作應(yīng)理解為落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，毒素在其氨基酸序列中具有特定的變化，這些變化顯著提高該毒素在多種不同表達(dá)系統(tǒng)(包括植物和細(xì)菌)中表達(dá)時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)表達(dá)增加的結(jié)果是在該表達(dá)系統(tǒng)中的功能活性增加。其有利之處是向昆蟲提供高劑量的毒素，可以防止由于接受亞致死劑量的蛋白質(zhì)毒素的小昆蟲群體的存活而導(dǎo)致昆蟲對(duì)毒素產(chǎn)生抗性?；蚝投舅?本文實(shí)施方案的蛋白質(zhì)分子包含與已知?dú)⑾x蛋白、特別是b.t.cry蛋白，更特別是cry1ca蛋白(genbank登錄號(hào)：aaa22343)同源的氨基酸序列。由這些實(shí)施方案的核苷酸序列編碼的預(yù)測的氨基酸序列公開為seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。本主題發(fā)明的毒素序列以seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40提供。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的毒素具有以下特征中的至少一種：(a)所述毒素由在嚴(yán)格條件下與選自seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列所編碼。(b)所述毒素與針對(duì)來自蘇云金芽孢桿菌分離株的約68-71kda殺蟲性毒素或其片段產(chǎn)生的抗體具有免疫反應(yīng)性。(c)所述毒素由這樣的核苷酸序列編碼，其中該核苷酸序列的一部分可以使用引物對(duì)pcr擴(kuò)增而產(chǎn)生約25-40bp的片段，(d)所述毒素包含seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所示的氨基酸序列的殺蟲性部分。(e)所述毒素包含與選自seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列的殺蟲性部分具有至少約(90％)同源性的氨基酸序列，(f)所述毒素由在嚴(yán)格條件下與選自編碼seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的dna的核苷酸序列的殺蟲性部分雜交的核苷酸序列編碼，(g)所述毒素與針對(duì)來自蘇云金芽孢桿菌分離株mr-1206的約68kda或130kda殺蟲性毒素或其片段的抗體具有免疫反應(yīng)性。(h)所述毒素包含與選自seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列、以及seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的殺蟲性部分具有至少約(90％)同源性的氨基酸序列。本文例示的具體基因、這些基因的變體、和這些基因的片段也可以通過例如由幾個(gè)商業(yè)供應(yīng)商中的任何一個(gè)當(dāng)前實(shí)施的方法進(jìn)行合成構(gòu)建來獲得(參見例如美國專利號(hào)7482119)。這些基因或其部分或變體也可以合成地構(gòu)建，例如通過使用基因合成儀和例如美國專利號(hào)5,380,831的方法?；蛘?，可以使用制造點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)容易地構(gòu)建合成或天然存在的基因的變體。這些基因的片段也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程使用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶制備。例如，可以使用bal31之類的酶或通過定點(diǎn)誘變，系統(tǒng)地從這些基因的末端切斷核苷酸。此外，可以使用多種限制酶獲得編碼活性毒素片段的基因片段。作為所要求保護(hù)的編碼毒素的核苷酸序列的片段的核酸分子，取決于預(yù)備的用途，包含至少約15,20,30,40,50,60,75,100,200,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,3000,3500個(gè)核苷酸，或者最多達(dá)本文公開且請(qǐng)求保護(hù)的編碼殺蟲毒素的核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，對(duì)seqidno:1而言為1,878個(gè)核苷酸；對(duì)seqidno:37而言為3,495個(gè)核苷酸)。編碼本發(fā)明要求保護(hù)的蛋白質(zhì)的生物活性部分的核苷酸序列的片段將編碼至少約15,25,30,40,50,75,100,125,150,175,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,800,900,1000,1100或1200個(gè)連續(xù)氨基酸，或最多達(dá)本發(fā)明的全長殺蟲蛋白中存在的氨基酸總數(shù)(例如對(duì)seqidno:2而言為625個(gè)氨基酸，或?qū)eqidno:38而言為1164個(gè)氨基酸)。重組宿主.可以將本發(fā)明的毒素編碼基因?qū)霕O其多種微生物或植物宿主。毒素基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致殺蟲蛋白的胞內(nèi)生成和維持。憑借合適的微生物宿主，例如假單胞菌屬(pseudomonas)，可以將微生物應(yīng)用于害蟲的環(huán)境，在那里它們會(huì)繁殖并可能被攝取。結(jié)果是控制害蟲?；蛘?，可以在延長毒素活性和穩(wěn)定細(xì)胞的條件下處理包含毒素基因的微生物。然后可以將經(jīng)過處理的保留毒素活性的細(xì)胞應(yīng)用于靶害蟲的環(huán)境。在經(jīng)合適的載體將毒素基因?qū)胛⑸锼拗髦?，并將所述宿主以活的狀態(tài)應(yīng)用于環(huán)境的情形中，必須使用某些宿主微生物。選擇已知占據(jù)一種或多種感興趣作物的“植物圈”(葉軸、葉圈、根圈、和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物從而能夠在特定環(huán)境(作物和其它昆蟲棲息地)中成功地與野生型本土微生物競爭，提供表達(dá)多肽殺蟲劑的基因的穩(wěn)定維持和表達(dá)，及期望地提供針對(duì)環(huán)境降解和滅活對(duì)殺蟲劑改善的保護(hù)。b.t.孢子或重組宿主細(xì)胞也可以在施用或者制劑化用于施用給植物之前加以處理。例如，可以對(duì)分離的b.t.孢子合伙毒素晶體進(jìn)行化學(xué)處理以延長殺蟲活性，從而包括經(jīng)處理的本發(fā)明的多肽(美國專利號(hào)4,695,462和gaertneretal.,1993)。已知多種微生物棲息于極其多種重要作物的葉軸(植物葉的表面)和/或根圈(植物根周圍的土壤)。這些微生物包括細(xì)菌、藻類、和真菌。特別感興趣的是微生物，諸如細(xì)菌，例如假單胞菌屬(pseudomonas)、歐文氏菌屬(erwinia)、沙雷氏菌屬(serratia)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、黃單胞菌屬(xanthomonas)、鏈霉菌屬(streptomyces)、根瘤菌屬(rhizobium)、中華根瘤菌(sinorhizobium)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(methylophilius)、土壤桿菌屬(agrobacterium)、醋桿菌屬(acetobacter)、乳桿菌屬(lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、固氮菌屬(azotobacter)、明串珠菌屬(leuconostoc)、和產(chǎn)堿菌屬(alcaligenes)；以及真菌，特別是酵母，例如糖酵母屬(saccharomyces)、隱球酵母屬(cryptococcus)、克魯維氏酵母屬(kluyveromyces)、擲孢酵母屬(sporobolomyces)、紅酵母屬(rhodotorula)、和短柄霉屬(aureobasidium)。特別感興趣的是植物圈細(xì)菌物種，諸如丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescens)、木醋桿菌(acetobacterxylinum)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)、類球紅假單胞菌(rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)、苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)(以前的苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti))、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(alcaligeneseutrophus)、和維涅蘭德固氮菌(azotobactervinelandii)；和植物圈酵母物種，諸如深紅酵母(rhodotorularubra)、膠粘紅酵母(r.glutinis)、海濱紅酵母(r.marina)、橙黃紅酵母(r.aurantiaca)、淺白色隱球酵母(cryptococcusalbidus)、流散隱球酵母(c.diffluens)、羅侖氏隱球酵母(c.laurentii)、羅茜糖酵母(saccharomycesrosei)、善地糖酵母(s.pretoriensis)、啤酒糖酵母/釀酒酵母(s.cerevisiae)、紅色擲孢酵母(sporobolomycesroseus)、香氣擲孢酵母(s.odorus)、佛地克魯維氏酵母(kluyveromycesveronae)、和出芽短柄霉(aureobasidiumpollulans)。特別感興趣的是有色微生物。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是用編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白或其變體的基因轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化植物由于在轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞中存在控制量的主題殺蟲蛋白或其變體而可抵抗昆蟲靶害蟲的攻擊。通過在被特定昆蟲害蟲所食的植物的基因組中摻入編碼b.t.殺蟲毒素的殺蟲性質(zhì)的遺傳物質(zhì)，成蟲或幼蟲在食用該食物植物后會(huì)死亡。單子葉和雙子葉分類中的許多成員已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物以及水果和蔬菜均具有商業(yè)意義。這些作物包括但不限于玉米，稻，大豆，卡諾拉，向日葵，苜蓿，高粱，小麥，棉花，花生，番茄，馬鈴薯等。有幾種技術(shù)可將外來遺傳物質(zhì)引入單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞中，以及獲得穩(wěn)定維持和表達(dá)引入的基因的可育植物。這些技術(shù)包括將包裹在微粒上的遺傳物質(zhì)直接加速打入細(xì)胞中(美國專利4945050和5141131)。植物可以用土壤桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化，見美國專利5177010，美國專利5104310，歐洲專利申請(qǐng)0131624b1，歐洲專利申請(qǐng)120516，歐洲專利申請(qǐng)159418b，歐洲專利申請(qǐng)176112，美國專利5149645，美國專利5469976，美國專利5464763，美國專利4940838，美國專利4693976，歐洲專利申請(qǐng)116718，歐洲專利申請(qǐng)290799，歐洲專利申請(qǐng)320500，歐洲專利申請(qǐng)604662，歐洲專利申請(qǐng)627752，歐洲專利申請(qǐng)0267159，歐洲專利申請(qǐng)0292435，美國專利5231019，美國專利5463174，美國專利4762785，美國專利5004863，和美國專利5159135。其他轉(zhuǎn)化技術(shù)包括whiskerstm技術(shù)，見美國專利5302523和美國專利5464765。電穿孔技術(shù)也已被用于轉(zhuǎn)化植物，見wo87/06614，美國專利5472869，美國專利5384253，wo9209696，和wo9321335。將所有這些轉(zhuǎn)化的專利和公布通過提述并入本文。除了許多用于轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)之外，與外來基因接觸的組織的類型也可以變化。這樣的組織將包括但不限于胚胎發(fā)生組織，i型和ii型愈傷組織，下胚軸，分生組織等。幾乎所有的植物組織可以在脫分化期間使用本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。可以使用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)將編碼修飾的cry1ca殺蟲毒素和變體的基因插入植物細(xì)胞中。例如，多種含有允許選擇轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的標(biāo)記物和在大腸桿菌中有功能的復(fù)制體系的克隆載體可用于制備和修飾用于插入高等植物的外源基因。這樣的操作可以包括例如根據(jù)期望的用途插入突變、截短、添加、缺失或取代。載體包括例如pbr322、puc系列、m13mp系列、pacyc184等。因此，編碼cry蛋白或變體的序列可以插入載體中的合適的限制性位點(diǎn)中。所得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將其細(xì)胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收獲并裂解，從而回收可用量的質(zhì)粒。通常進(jìn)行序列分析、限制性片段分析、電泳和其他生化分子生物學(xué)方法作為分析方法。每次操作后，可以將所用的dna序列切割并連接到下一個(gè)dna序列。每個(gè)操縱的dna序列可以克隆在相同或其他質(zhì)粒中。根據(jù)植物轉(zhuǎn)化方法，輔助dna序列可能是必需的。如果，例如，使用ti或ri質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，則至少t-dna右邊界重復(fù)序列，但是通常ti或ri質(zhì)粒的右邊界重復(fù)序列和左邊界重復(fù)序列將會(huì)被接合作為期望插入植物細(xì)胞的基因的側(cè)翼區(qū)域。含t-dna的載體用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的用途已經(jīng)得到深入研究，并在ep120516中充分描述；lee和gelvin(2008)，fraley等，(1986)和an等，(1985)，在該領(lǐng)域中已經(jīng)確立。一旦插入的dna已被整合到植物基因組中，其在所有后續(xù)世代中是相對(duì)穩(wěn)定的。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體通常含有選擇標(biāo)記基因，其編碼賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞對(duì)除草劑或抗生素(如雙丙氨膦、卡那霉素、g418、博來霉素或潮霉素)的耐受性等等的蛋白質(zhì)。因此，單獨(dú)使用的選擇標(biāo)記基因應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地允許選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，同時(shí)不含有插入的dna的細(xì)胞的生長被選擇化合物抑制。有多種技術(shù)可用于將dna插入宿主植物細(xì)胞中。這些技術(shù)包括用根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌遞送的t-dna轉(zhuǎn)化。此外，可以使用植物原生質(zhì)體與含有要遞送的dna的脂質(zhì)體的融合、dna的直接注射、生物射彈轉(zhuǎn)化(微粒轟擊)或電穿孔，以及其它可能的方法。植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了，有多種方法學(xué)可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物，并且它們可以修改和專用化，以適應(yīng)各種宿主植物物種之間的生物學(xué)差異。如果使用土壤桿菌菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，則將要插入的dna克隆到特殊的質(zhì)粒中，即要么進(jìn)入中間體(穿梭)載體，要么進(jìn)入二元載體。中間載體可以借助ti或ri質(zhì)粒與中間質(zhì)粒之間同源的序列，通過同源重組整合入ti或ri質(zhì)?；蚱溲苌?。ti或ri質(zhì)粒還包含vir區(qū)，該區(qū)含有轉(zhuǎn)移t-dna所需的vir基因。中間載體不能在土壤桿菌中復(fù)制?？梢越柚o助質(zhì)粒(通過細(xì)菌接合)、通過電穿孔、通過直接dna，通過化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、或通過其他方法將中間載體轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌中。二元載體在大腸桿菌和土壤桿菌細(xì)胞二者中都能自主復(fù)制。它們包括由右和左t-dna邊界重復(fù)區(qū)框定的序列，這些序列可以包括用于選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因、克隆接頭、克隆多接頭或其它可充當(dāng)用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因的引入位點(diǎn)的序列。它們可以通過電穿孔直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌細(xì)胞中(holsters等人，(1978))，或通過直接dna、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、或通過細(xì)菌接合或其他方法學(xué)引入。用作宿主細(xì)胞的土壤桿菌將會(huì)包含攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。該vir區(qū)域是將t-dna轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中所必需的。除了編碼b.t.殺蟲毒素蛋白或其變體的t-dna區(qū)之外，土壤桿菌宿主細(xì)胞中可以存在另外的t-dna區(qū)域。將如此轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?？梢杂欣貙⒅参锿庵搀w(例如，葉的碎片、莖的節(jié)段、根、以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)與根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌一起培養(yǎng)，以將dna轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。然后在植入合適的生長條件和培養(yǎng)基中后，可以從經(jīng)感染的植物材料再生出整個(gè)植物，其中培養(yǎng)基可以含有用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的抗生素或除草劑。然后可以測試如此獲得的植物中是否存在插入dna。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以常規(guī)方式在植物內(nèi)部生長。它們可以形成生殖細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化的性狀傳遞給后代植物?？梢砸哉７绞皆耘噙@樣的植物，并將其與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子或其他遺傳因子的植物雜交。所得的雜交個(gè)體具有相應(yīng)的表型性質(zhì)，例如控制植物害蟲攝食的能力。在用于注射和電穿孔的那些情況下，質(zhì)粒的構(gòu)建沒有特別的要求。可以使用普通質(zhì)粒，例如包含所有期望轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的基因的適當(dāng)修飾的puc衍生物。插入到植物細(xì)胞中的重組多核苷酸的活性可以取決于與插入物相鄰的內(nèi)源植物dna的影響。因此，另一個(gè)選擇是利用已知是植物基因組中優(yōu)良的插入位置的事件。參見例如wo2005/103266a1，涉及cry1f和crylac棉花事件；主題b.t.殺蟲毒素基因可以在那些基因組基因座中代替cry1f或crylac插入物。根據(jù)本發(fā)明可以使用例如靶向同源重組。這種類型的技術(shù)是例如wo03/080809和相應(yīng)公開的美國申請(qǐng)(uspa20030232410)的主題，涉及使用鋅指進(jìn)行靶向重組。使用重組酶(例如cre-lox和flp-frt)也是本領(lǐng)域已知的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將用這樣的基因轉(zhuǎn)化植物，該基因中蛋白質(zhì)編碼區(qū)的密碼子用法已針對(duì)植物被優(yōu)化。參見例如美國專利號(hào)5,380,831，其通過引用并入本文。此外，有利地，將使用編碼截短的毒素的植物。截短的毒素通常將編碼全長毒素的約55％至約80％。創(chuàng)建用于植物的合成b.t.基因的方法是本領(lǐng)域已知的(stewart2007)。另一個(gè)變量是選擇標(biāo)記的選擇。對(duì)于具體標(biāo)記的偏好屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員自由裁量，但是下述任何選擇標(biāo)記，連同本文未列出的任何其它可能用作選擇標(biāo)記的基因，均可以使用。這些選擇標(biāo)記包括但不限于：轉(zhuǎn)座子tn5(aphii)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其編碼對(duì)抗生素卡那霉素、新霉素和g418的抗性；以及編碼對(duì)草甘膦耐受性的那些基因；潮霉素；甲氨蝶呤；膦絲菌素(雙丙氨膦)；咪唑啉酮，磺酰脲類和三唑并嘧啶除草劑，如氯磺隆、溴苯腈、達(dá)拉邦等。這些基因的實(shí)例在merlo(2002)中提供，其通過引用并入本文。除了選擇標(biāo)記之外，可以使用報(bào)告基因。在某些情況下，可以使用報(bào)告基因而沒有選擇標(biāo)記。報(bào)告基因是通常不向受體生物或組織提供生長優(yōu)勢的基因。報(bào)告基因通常編碼可提供某些表型改變或酶性質(zhì)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的報(bào)告基因是葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因。報(bào)告基因的其他例子在merlo(2002)中提供。不管使用何種轉(zhuǎn)化技術(shù)，優(yōu)選將該基因摻入基因轉(zhuǎn)移載體，通過在基因轉(zhuǎn)移載體中納入植物啟動(dòng)子而使其適于在植物細(xì)胞中表達(dá)b.t殺蟲毒素基因和變體。除了植物啟動(dòng)子之外，來自多種來源的啟動(dòng)子可以用于在植物細(xì)胞中高效地表達(dá)外源基因。例如，可以使用細(xì)菌來源的啟動(dòng)子，如章魚堿合酶啟動(dòng)子，胭脂堿合酶啟動(dòng)子，甘露堿合酶啟動(dòng)子；病毒來源的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒的35s和19s啟動(dòng)子等。植物啟動(dòng)子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(rubp)羧化酶小亞基(ssu)，β-伴大豆球蛋白啟動(dòng)子，菜豆蛋白啟動(dòng)子，adh(醇脫氫酶)啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，adf(肌動(dòng)蛋白解聚因子)啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以含有可提高轉(zhuǎn)錄效率的某些增強(qiáng)子序列元件。典型的增強(qiáng)子包括但不限于adh1-內(nèi)含子1和adh1-內(nèi)含子6?？梢允褂媒M成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在幾乎所有細(xì)胞類型和幾乎所有時(shí)間中指導(dǎo)連續(xù)基因表達(dá)(例如肌動(dòng)蛋白，泛素，camv35s)。組織特異性啟動(dòng)子負(fù)責(zé)特定細(xì)胞或組織類型(例如葉或種子(例如玉米醇溶蛋白，油質(zhì)蛋白，napin，acp(?；d體蛋白))中的基因表達(dá)，也可以使用這些啟動(dòng)子。還可以使用在植物發(fā)育的某一階段中有活性的啟動(dòng)子，以及在特定植物組織和器官中有活性的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于根特異性、花粉特異性、胚胎特異性、玉米絲特異性、棉花纖維特異性、種子胚乳特異性、韌皮部特異性啟動(dòng)子等。在某些情況下，可能需要使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子負(fù)責(zé)響應(yīng)于特定信號(hào)的基因的表達(dá)，例如：物理刺激(例如熱休克基因)；光(例如rubp羧化酶)；激素(如糖皮質(zhì)激素)；抗生素(如四環(huán)素)；代謝產(chǎn)物；和脅迫(例如干旱)。可以使用其它期望的在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，例如5'非翻譯前導(dǎo)序列，rna轉(zhuǎn)錄終止序列和多聚腺苷酸添加信號(hào)序列。許多植物特異性基因轉(zhuǎn)移載體是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明包括不全能(非全能)的植物細(xì)胞，不是繁殖材料(例如，在一些實(shí)施方案中，葉細(xì)胞，某些實(shí)施方案中排除種子細(xì)胞)、并且不能分化為全植物的植物細(xì)胞。本發(fā)明包括除了再生成整個(gè)植物以外的用途的植物細(xì)胞。例如，所述植物細(xì)胞可用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明的dig-465蛋白質(zhì))。因此，本發(fā)明的植物細(xì)胞包括具有全能性以外的用途(即，某些本發(fā)明的細(xì)胞不可再生成整個(gè)植物)的植物細(xì)胞。然而，一些實(shí)施方案確實(shí)包括可以再生成整個(gè)植物的種子細(xì)胞和植物細(xì)胞。另一種用于鑒定本主題發(fā)明的毒素和基因的方法是通過使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列?？梢越柚m當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記使得這些序列可檢測，或者可以如美國專利號(hào)6268132所述地那樣使得這些序列固有地發(fā)生熒光。如本領(lǐng)域眾所周知的，如果探針分子和核酸樣品通過兩個(gè)分子之間形成強(qiáng)堿基配對(duì)鍵而雜交，則可以合理地推定探針和樣品具有相當(dāng)大的序列同源性。優(yōu)選地，雜交通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，例如在keller和manak(1993)中所述。探針的檢測提供了以已知方式確定雜交是否發(fā)生的手段。這種探針分析提供了用于鑒定本主題發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可以使用dna合成儀和標(biāo)準(zhǔn)程序合成。這些核苷酸序列也可以用作pcr引物來擴(kuò)增本主題發(fā)明的基因。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”旨在表示這樣的條件，在該條件下探針其靶序列雜交(退火)的程度可檢測地大于與其他序列的雜交的程度(例如至少是背景的2倍以上)。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，在不同的情況下會(huì)有所不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測)。或者，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中有一些錯(cuò)配，從而檢測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長度小于500個(gè)核苷酸。典型地，嚴(yán)格條件會(huì)是那些其中鹽濃度不到約1.5mna離子，通常約0.01至1.0mna離子濃度(或其它鹽)，處于ph7.0至ph8.3，且溫度為用于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)的至少約30℃和用于長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)的至少約60℃。也可以添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。例示性低嚴(yán)格條件包括用30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液于37℃雜交并在1x至2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m檸檬酸三鈉)中于50℃至55℃清洗。例示性中等嚴(yán)格條件包括在40％至45％甲酰胺、1.0mnacl、1％sds中于37℃雜交并在0.5x至1xssc中于55℃至60℃清洗。例示性高嚴(yán)格條件包括在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中于37℃雜交并在0.1xssc中于60℃至65℃清洗。任選地，清洗緩沖液可包含約0.1％至約1％sds。雜交持續(xù)時(shí)間一般小于約24小時(shí)，通常約4至約12小時(shí)。特異性通常根據(jù)雜交后清洗而變化，關(guān)鍵因素是最終清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于dna/dna雜交體，熱熔點(diǎn)(tm)為50％的互補(bǔ)靶序列雜交至完全匹配的探針的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和ph下)。每有1％的錯(cuò)配，tm降低約1℃；因此，可以調(diào)整tm、雜交條件、和/或清洗條件以便于具有期望的同一性的序列退火。例如，如果尋找同一性>90％的序列的話，可以將tm降低10℃。一般地，選擇比特定序列和其互補(bǔ)物在限定離子強(qiáng)度和ph的tm低約5℃的嚴(yán)格條件。然而，高嚴(yán)格條件可利用比tm低1℃、2℃、3℃、或4℃的雜交和/或清洗；中等嚴(yán)格條件可利用比tm低6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃的雜交和/或清洗；而低嚴(yán)格條件可利用比tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、或20℃的雜交和/或清洗。tm(以℃為單位)可以通過實(shí)驗(yàn)來測定，或者可以通過計(jì)算來估算。對(duì)于dna-dna雜交體，可以自meinkoth和wahl(1984)的方程來估算tm：tm(℃)＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％甲酰胺)-500/l；其中m是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％gc是dna中鳥苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且l是雜交體以堿基對(duì)計(jì)的長度?；蛘?，tm由下式(beltz等，1983)記載。tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[na+])+0.41(％gc)-0.61(％甲酰胺)-600/l其中[na+]是鈉離子的摩爾濃度，％gc是dna中鳥苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且l是雜交體以堿基對(duì)計(jì)的長度。使用該等方程、雜交和清洗組合物、及期望tm，普通技術(shù)人員會(huì)理解，內(nèi)在描述了雜交和/或清洗溶液的嚴(yán)格性的變化。如果期望錯(cuò)配程度導(dǎo)致tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的話，優(yōu)選提高ssc濃度，使得可使用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)可見于tijssen(1993)及ausubel等(1995)。還可參見sambrook等(1989)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法來實(shí)施southern印跡上固定化dna與放射性標(biāo)記的基因特異性探針的雜交(sambrook等，見上文)。用于標(biāo)記多核苷酸探針的放射性同位素可以包括32p、33p、14c、或3h?？梢酝ㄟ^分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的數(shù)種方法任一來進(jìn)行將放射性同位素?fù)饺攵嗪塑账崽结樂肿?參見例如sambrook等，見上文)。一般地，可以在容許檢測與要求保護(hù)的毒素編碼基因具有同源性的靶序列的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交和后續(xù)清洗。對(duì)于雙鏈dna基因探針，雜交可以于比dna組合物的tm低20-25℃，在6xsspe、5xdenhardt氏溶液、0.1％sds、0.1mg/ml變性dna中進(jìn)行過夜[20xsspe為3mnacl、0.2mnahpo4、和0.02medta(乙二胺四乙酸鈉鹽)，100xdenhardt氏溶液為20gm/l聚乙烯吡咯烷酮、20gm/lficoll400型和20gm/l牛血清清蛋白(級(jí)分v)]。通?？扇缦逻M(jìn)行清洗：(1)于室溫在1xsspe、0.1％sds中進(jìn)行15分鐘兩次(低嚴(yán)格清洗)。(2)于tm-20℃在0.2xsspe、0.1％sds中進(jìn)行15分鐘一次(中等嚴(yán)格清洗)。對(duì)于寡核苷酸探針，雜交可以于比雜交體的tm低10-20℃，在6xsspe、5xdenhardt氏溶液、0.1％sds、0.1mg/ml變性dna中過夜?？梢酝ㄟ^下式確定用于寡核苷酸探針的tm(suggs等，1981)。tm(℃)＝2(t/a堿基對(duì)的數(shù)目)+4(g/c堿基對(duì)的數(shù)目)通?？扇缦逻M(jìn)行清洗：(1)于室溫在1xsspe、0.1％sds中進(jìn)行15分鐘兩次(低嚴(yán)格清洗)。(2)于雜交溫度在1xsspe、0.1％sds中進(jìn)行15分鐘一次(中等嚴(yán)格清洗)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以用過除放射性標(biāo)記之外的手段使得用于雜交的探針分子以及探針和靶分子之間形成的雜交分子能夠被檢測到。變體毒素.根據(jù)本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括所公開的截短序列，而且還包括保留本文具體示例的毒素的特征殺蟲活性的全長序列、這些序列的片段、變體、突變體和融合蛋白。如本文所用的，術(shù)語基因的“變體”或“變化”是指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的等效毒素的核苷酸序列。此外，如本文所使用的，術(shù)語“等效毒素”是指具有與所要求保護(hù)的毒素相同或基本上相同的針對(duì)目標(biāo)害蟲的生物活性的毒素。因此，要求保護(hù)的毒素的變體或變化形式將具有所要求保護(hù)的毒素的活性的至少約30％，優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約70％，甚至更優(yōu)選至少約80％。用于測量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在本文中舉例說明。本文的“變體”旨在包括這樣的蛋白質(zhì)或多肽，其具有與seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列至少約60％，65％，優(yōu)選約70％，75％，更優(yōu)選約80％，85％，最優(yōu)選約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列。變體還包括由核酸分子編碼的多肽，其在嚴(yán)格條件下與seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39的核酸分子雜交。這樣的變體通常將保留所要求的活性。變體包括由于誘變而在氨基酸序列上不同的多肽。本發(fā)明涵蓋的變體蛋白質(zhì)具有殺蟲活性。還可以設(shè)計(jì)變體蛋白質(zhì)，其在一級(jí)氨基酸序列水平上不同，并且保留相同或相似的總體必需的三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等。參見例如美國專利號(hào)7,058,515；larson等，(2002)；crameri等，(1997)；stemmer，w.p.c.(1994a)；stemmer，w.p.c.(1994b)”stemmer，w.p.c.(1995)；crameri等人(1996a)；和crameri等人(1996b)。本發(fā)明的某些毒素已在本文中具體示例。由于這些毒素僅僅是本發(fā)明的毒素的示例，因此應(yīng)當(dāng)顯見，本發(fā)明包括與所列舉的毒素具有相同或相似的殺蟲活性的變體或等效的毒素(和編碼等效毒素的核苷酸序列)。等效毒素將與例示的毒素具有氨基酸同源性。氨基酸同一性通常大于60％，優(yōu)選大于75％，更優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，并且可大于95％。氨基酸同源性在毒素的關(guān)鍵區(qū)域中是最高的，所述關(guān)鍵區(qū)域負(fù)責(zé)生物活性，或者參與決定三維構(gòu)型，而三維構(gòu)型最終負(fù)責(zé)生物學(xué)活性。在這方面，如果某些氨基酸取代發(fā)生在對(duì)活性不關(guān)鍵的區(qū)域中，或者為不影響分子的三維構(gòu)型的保守氨基酸取代，則這些氨基酸取代是可接受的，并且可以預(yù)期。例如，氨基酸可以歸入以下類別：非極性、不帶電極性、堿性、和酸性。屬于某一類別的氨基酸被屬于相同類別的氨基酸替換的保守取代落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該取代不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變化合物的生物活性即可。表1提供了屬于每一類別的氨基酸的實(shí)例列表表1氨基酸的類別和實(shí)例氨基酸類別氨基酸實(shí)例非極性側(cè)鏈ala,val,leu,ile,pro,met,phe,trp非帶電極性側(cè)鏈gly,ser,thr,cys,tyr,asn,gln酸性側(cè)鏈asp,glu堿性側(cè)鏈lys,arg,hisβ-分支側(cè)鏈thr,val,ile芳香側(cè)鏈tyr,phe,trp,his在一些情況下，也可以進(jìn)行非保守取代。關(guān)鍵因素是這些取代不能顯著降低毒素的生物活性。本發(fā)明的優(yōu)選的殺蟲毒素蛋白質(zhì)由與seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39充分相同的核苷酸序列編碼?！俺浞窒嗤笔侵赴被峄蚝塑账嵝蛄邢啾扔诶脴?biāo)準(zhǔn)參數(shù)由本文所述的比對(duì)程序之一分析過的參考序列具有至少約60％或65％的序列同一性，優(yōu)選約70％或75％序列同一性，更優(yōu)選約80％或85％序列同一性，最優(yōu)選約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值，來確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是這些序列享有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，百分比同一性＝相同位置的數(shù)量/位置總數(shù)(例如重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列具有相同的長度。兩個(gè)序列之間的百分比同一性可以使用類似于以下描述的技術(shù)來確定，有或沒有允許間隙。在計(jì)算百分比同一性，通常會(huì)計(jì)算精確匹配的數(shù)目。可以使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)兩種序列之間百分比同一性的確定。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性實(shí)例是karlin和altschul(1990)的算法，并根據(jù)karlin和altschul(1993)改良。這種算法被整合在altschuletal.(1990)的blastn和blastx程序中。可以方便地使用blast搜索來鑒定核酸或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中與檢索序列同源(相似)的序列?？梢允褂胋lastn程序?qū)嵤゜last核苷酸檢索(得分＝100，字長＝12)來鑒定與本發(fā)明要求保護(hù)的核酸分子具有同源性的核苷酸序列?？梢允褂胋lastx程序?qū)嵤゜last蛋白質(zhì)檢索(得分＝50，字長＝3)來鑒定與本發(fā)明要求保護(hù)的殺蟲蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。為了獲得帶空位的比對(duì)用于比較目的，可以如altschuletal.,(1997)中所述利用帶空位的blast?；蛘?，可以使用psi-blast來實(shí)施檢測分子間遠(yuǎn)緣關(guān)系的迭代搜索(altschul等，1997)。在利用blast、帶空位的blast、和psi-blast程序時(shí)，可使用各程序(例如blastx和blastn)的缺省參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。比對(duì)還可以通過檢視而人工進(jìn)行。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性實(shí)例是clustalw算法(thompson等，1994)。clustalw比較序列且比對(duì)整個(gè)氨基酸或dna序列，如此能提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。clustalw算法用于數(shù)種商品化dna/氨基酸分析軟件包，諸如vectornti程序套件(invitrogen，inc.，carlsbad，ca)的alignx模塊。在用alignx比對(duì)氨基酸序列時(shí)，可以方便地使用缺省設(shè)置，空位生成罰分10、空位延伸罰分0.1、和blosum63mt2比較矩陣。在用alignx比對(duì)兩條蛋白質(zhì)序列之后，可以評(píng)估兩條序列之間的百分比氨基酸相似性(一致性)或同一性。在用alignx比對(duì)兩條dna序列時(shí)，可以方便地使用缺省設(shè)置，空位生成罰分15、空位延伸罰分6.6和swgapdnamt比較矩陣。在用alignx比對(duì)兩條dna序列之后，可以評(píng)估兩條序列之間的百分比同一性。另一個(gè)可用于分析clustalw比對(duì)的軟件程序的非限制性實(shí)例是genedoctm(由karlnicholas開發(fā)，http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/ibmpc/genedoc-readme.html)。genedoctm可以評(píng)估多種蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或dna)相似性和同一性。數(shù)學(xué)算法用于比較序列的另一個(gè)非限制性實(shí)例是myers和miller(1988)的算法。此類算法整合在wstretcher程序中，該程序是wemboss序列比對(duì)軟件包(可在http://emboss.sourceforge.net/處訪問)的一部分。stretcher使用利用線性空間的經(jīng)典動(dòng)力學(xué)編程算法的一種改良來計(jì)算兩種序列的最佳全局比對(duì)。輸入為標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)文件。可以規(guī)定用于計(jì)算比對(duì)的替代矩陣、空位插入罰分和空位延伸罰分。在利用stretcher程序來比較核苷酸序列時(shí)，可以使用空位打開罰分16和空位延伸罰分4。用于比較dna序列的評(píng)分矩陣文件為ednafull。在用于比較氨基酸序列時(shí)，可以使用空位打開罰分12和空位延伸罰分2。用于比較蛋白質(zhì)序列的評(píng)分矩陣文件為eblosum62。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的又一個(gè)非限制性實(shí)例是needleman和wunsch(1970)的算法，該算法整合在序列比對(duì)軟件包gap10版和wneedle(http://emboss.sourceforge.net/)中。可以使用下述參數(shù)使用gap10版來確定序列同一性或相似性：對(duì)于核苷酸序列，使用空位權(quán)重50和長度權(quán)重3，及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣來求出％同一性和％相似性。對(duì)于氨基酸序列比較，使用gap權(quán)重8和長度權(quán)重2，及blosum62評(píng)分程序來確定％同一性或％相似性。wneedle讀取兩個(gè)輸入序列，沿著它們的整個(gè)長度找到最佳比對(duì)(包括空位)，并將它們的最佳全局序列比對(duì)寫入文件。該算法使用動(dòng)態(tài)編程方法，通過探索所有可能的比對(duì)并選擇最佳者來保證比對(duì)是最佳的。讀取評(píng)分矩陣，其含有用于每個(gè)可能的殘基或核苷酸匹配的值。wneedle找到具有最大可能得分的比對(duì)，其中比對(duì)的得分等于取自評(píng)分矩陣的匹配之和減去在比對(duì)序列中打開和延伸空位引起的罰分。替代矩陣及空位打開和延伸罰分由使用者規(guī)定。在比較氨基酸序列時(shí)，使用缺省空位打開罰分10、空位延伸罰分0.5、和eblosum62比較矩陣。在使用wneedle比較dna序列時(shí)，使用空位打開罰分10、空位延伸罰分0.5、和ednafull比較矩陣。也可以使用等同的程序?！暗韧某绦颉币庵笇?duì)于討論的任何兩種序列，與由alignx、wneedle、或wstretcher生成的相應(yīng)比對(duì)相比，生成具有相同核苷酸殘基匹配和相同百分比序列同一性的比對(duì)的任何序列比較程序。％同一性為在報(bào)告的比對(duì)區(qū)(包括長度中的任何空位)上兩種序列之間相同匹配的百分比，而％相似性為在報(bào)告的比對(duì)區(qū)(包括長度中的任何空位)上兩種序列之間匹配的百分比。毒素片段和等同物.保留示例毒素的殺蟲活性的片段和等同物將落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，由于遺傳密碼的冗余，本文公開的氨基酸序列可以被各種不同的dna序列編碼。創(chuàng)建編碼相同或基本相同的毒素的替代dna序列完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。這些變體dna序列落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用的，“基本上相同”的序列是指具有不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響殺蟲活性的氨基酸取代，缺失，添加或插入的序列。保留殺蟲活性的片段也包括在此定義中?？梢栽诒景l(fā)明的殺蟲蛋白和變體的氨基或羧基末端進(jìn)行改變，導(dǎo)致保留生物活性的多肽。片段或生物活性部分包括這樣的多肽片段，它們包含與seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中所示的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列。δ內(nèi)毒素蛋白的生物活性部分可以例如是這樣的多肽，其長度為10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸。這樣的生物活性部分可以通過本領(lǐng)域熟知的重組蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備并評(píng)價(jià)殺蟲活性。測定殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。如本文所用，片段包含seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明涵蓋其它片段，例如蛋白質(zhì)中的任何大于約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100,1150或1200個(gè)氨基酸的片段，直到seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的殺蟲蛋白或變體蛋白的全長為止。在本發(fā)明中還提供了具有改善的生物學(xué)活性或害蟲譜、或能夠控制抗性昆蟲種群的片段。可以對(duì)cry蛋白進(jìn)行修飾以產(chǎn)生能更好地形成孔、因此具有更好的殺蟲活性的片段。在三結(jié)構(gòu)域cry蛋白的情況下，結(jié)構(gòu)域1由涉及在易感昆蟲的中腸中形成孔的七個(gè)α-螺旋構(gòu)成。具有改善活性的修飾的dig蛋白可以設(shè)計(jì)為具有n-末端缺失，所述缺失發(fā)生在與結(jié)構(gòu)域1的α螺旋1和α-螺旋2具有推測的同源性的區(qū)域中。可利用蛋白酶直接獲得這些毒素的活性片段。所要求的殺蟲毒素的片段將包含至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100或1200個(gè)連續(xù)氨基酸，或至多達(dá)到本發(fā)明全長殺蟲毒素中存在的氨基酸的總數(shù)(例如對(duì)seqidno:2而言為625個(gè)氨基酸，或?qū)eqidno:4而言為625個(gè)氨基酸)。核心毒素和原毒素嵌合體.大部分蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素晶體蛋白分子由兩個(gè)功能片段組成。蛋白酶抗性核心毒素是第一個(gè)區(qū)段，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的大體上前半部分。該分子的大約c末端一半是第二個(gè)區(qū)段。為了本申請(qǐng)的目的，該第二個(gè)區(qū)段在本文中將被稱為“原毒素區(qū)段”。原毒素區(qū)段被認(rèn)為參與毒素晶體形成(arvidson等，(1989))。完整的130kda毒素分子被昆蟲腸道中的蛋白酶快速加工成抗性核心區(qū)段。因此，通過減少毒素分子的蛋白酶加工(haider等人，(1986))或通過降低毒素溶解度(aronsonetal.，(1991))，限制核心對(duì)昆蟲的可及性，原毒素區(qū)段可以對(duì)毒素傳遞部分昆蟲特異性。已經(jīng)報(bào)道了有利地連接在cry1fa和cry1ab的毒素結(jié)構(gòu)域內(nèi)的嵌合蛋白(美國專利號(hào)5,527,883)。文獻(xiàn)報(bào)道了該領(lǐng)域中的其他成功案例。例如，在以下相關(guān)技術(shù)中報(bào)告了雜合δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建。國際專利申請(qǐng)公布wo95/30753公開了在用于熒光假單胞菌中生產(chǎn)的雜合蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建，其中cry1f的無毒性原毒素片段已經(jīng)被美國專利5,128,130中所公開的cry1ac/cry1ab的無毒性原毒素片段替代。該專利還公開了用于在熒光假單胞菌中生產(chǎn)的雜合蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建，其中crylac無毒性原毒素區(qū)段的一部分被相應(yīng)的cry1ab的無毒性原毒素片段替代。美國專利號(hào)5,055,294公開了用于在熒光假單胞菌中生產(chǎn)的cry1ac(氨基酸殘基1-466)和cry1ab(氨基酸殘基466-1155)之間的特異性雜合δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建。雖然上述專利公開了活性毒素片段內(nèi)的雜合毒素的構(gòu)建，但是沒有關(guān)于雜合毒素的殺蟲活性的具體細(xì)節(jié)。國際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo95/30752公開了用于在熒光假單胞菌中生產(chǎn)的雜合蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建，其中cry1c的無毒性原毒素區(qū)段被來自crylab的無毒性原毒素區(qū)段代替。上述應(yīng)用進(jìn)一步公開了雜合δ-內(nèi)毒素的針對(duì)草地貪夜蛾的活性比親本活性毒素cry1c的活性提高。國際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo95/06730公開了一種雜合型蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建，其組成為：cry1e的結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2偶聯(lián)于cry1c的非毒性原毒素區(qū)段的結(jié)構(gòu)域3。對(duì)煙草天蛾(對(duì)cry1c和cryle敏感)，草地貪夜蛾(對(duì)cry1c敏感)和甘藍(lán)夜蛾(對(duì)cry1c敏感)進(jìn)行的昆蟲生物測定顯示，該雜合cry1e/cry1c雜合毒素對(duì)煙草天蛾、草地貪夜蛾和甘藍(lán)夜蛾有活性。生物測定結(jié)果表示為ec50值(提供50％生長減少的毒素濃度)而不是lc50值(提供50％死亡率的毒素濃度)。雖然用于生物測定的δ-內(nèi)毒素是在蘇云金芽孢桿菌中產(chǎn)生，但是僅使用了人工產(chǎn)生的δ-內(nèi)毒素的活性區(qū)段，而不是蘇云金芽孢桿菌市售制劑中存在的通常由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)生的晶體。生物測定結(jié)果表明，雜合cryle/cry1c晶體對(duì)草地貪夜蛾的lc50值比天然cry1c低1.5至1.7倍(即比后者活性更高)。該技術(shù)還公開了在cry1ab(結(jié)構(gòu)域1和2)與cry1c(結(jié)構(gòu)域3和無毒性原毒素區(qū)段)之間的雜合蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建，盡管沒有給出關(guān)于該雜合毒素的活性或有用性的數(shù)據(jù)。lee等人(1995)報(bào)道了活性毒素區(qū)段內(nèi)cry1ac和cry1aa之間的雜合蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建。使用人工產(chǎn)生的雜合毒素的活性區(qū)段來檢測敏感昆蟲的刷狀膜囊泡(bbmv)中的蛋白質(zhì)相互作用。這些雜合毒素的生物活性未有報(bào)道。honee等(1991)報(bào)道了crylc(結(jié)構(gòu)域1)和crylab(結(jié)構(gòu)域2和3)之間的雜合δ-內(nèi)毒素的構(gòu)建以及反向的cry1ab(結(jié)構(gòu)域1)和cry1c(結(jié)構(gòu)域2和3)之間的雜合體。這些雜合體沒有顯示對(duì)敏感昆蟲的活性的顯著增加。此外，發(fā)現(xiàn)cry1c(結(jié)構(gòu)域1)/cry1ab(結(jié)構(gòu)域2和3)雜合毒素對(duì)蛋白酶降解高度敏感。schnepf等人(1990)的報(bào)道公開了crylac雜合毒素的構(gòu)建，其中結(jié)構(gòu)域2的一小部分被相應(yīng)的cry1aa區(qū)域代替，盡管沒有觀察到對(duì)敏感昆蟲幼蟲的活性的顯著增加。本主題發(fā)明的嵌合毒素包含b.t.毒素的全核心n-末端毒素部分，并且在毒素部分末端之外的某一點(diǎn)，該蛋白質(zhì)過渡為異源原毒素序列。向異源原毒素區(qū)段的過渡可以大概在天然的毒素/原毒素接點(diǎn)處發(fā)生，或者可以保留天然原毒素的一部分(延伸超過毒素部分)，而向異源原毒素的過渡發(fā)生在其下游。例如，本主題發(fā)明的嵌合毒素可以具有修飾的cry1ca毒素的完整毒素部分，例如dig-473或dig-465的氨基酸1-628，以及異源原毒素區(qū)段(c末端的氨基酸629)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源原毒素區(qū)段部分取自cry1ab。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，各種b.t.毒素，甚至在某一類別內(nèi)的毒素，也將在長度上，以及從核心毒素部分向原毒素部分過渡的精確位置上有一定程度的差異。從核心毒素部分到原毒素部分的過渡通常發(fā)生在全長毒素的約50％至約60％處。本主題發(fā)明的嵌合毒素包括該核心n-末端毒素部分的全部范圍，如irdig544.12殺蟲毒素蛋白質(zhì)的全長628個(gè)氨基酸。seqidno:15公開了編碼dig-465的dna的1887個(gè)核苷酸的序列，其中5'末端的1887個(gè)核苷酸構(gòu)成具有突變l57a(亮氨酸在氨基酸位置57代替丙氨酸)的cry1ca核心毒素區(qū)段的編碼區(qū)，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。seqidno:16公開了全長dig-465多肽的628個(gè)氨基酸的序列，其中具有上述氨基酸取代的cry1ca的n末端核心部分。seqidno:23公開了編碼dig-473的dna的1887個(gè)核苷酸的序列，其包含具有突變f596m(氨基酸位置596位上苯丙氨酸代替甲硫氨酸)的cry1ca的核心毒素區(qū)段的編碼區(qū)，本發(fā)明的另一個(gè)主題。seqidno:24公開了全長dig-473多肽的628個(gè)氨基酸的序列，其包含具有上述氨基酸取代的cry1ca的部分。對(duì)于原毒素部分，天然cry1ab原毒素部分的全部范圍自cry1ab全長蛋白質(zhì)的毒素部分的末端起延伸至該分子的c末端止。注意該原毒素的最后約100至150個(gè)氨基酸，這是要包括在本發(fā)明的嵌合毒素中的最關(guān)鍵者。因?yàn)閏ry蛋白具有選擇性殺蟲活性，大多數(shù)cry蛋白僅對(duì)有限范圍的目標(biāo)害蟲有活性。因此，需要進(jìn)一步改善cry蛋白的生物活性屬性。具有獨(dú)特結(jié)合特征和作用模式的cry蛋白質(zhì)在用于擴(kuò)大控制的昆蟲害蟲的范圍或?qū)Ω禸.t.抗性的發(fā)生的策略中是有用的。結(jié)構(gòu)域iii修飾.如本文所述，本發(fā)明的殺蟲毒素是3結(jié)構(gòu)域型毒素，包括結(jié)構(gòu)域i、結(jié)構(gòu)域ii、和結(jié)構(gòu)域iii。結(jié)構(gòu)域iii結(jié)合某些類型的受體蛋白質(zhì)，并且可能參與寡聚體毒素預(yù)孔的插入。已顯示某些包含結(jié)構(gòu)域iii取代的雜合毒素對(duì)斜紋夜蛾(spodopteraexigua)具有優(yōu)異的毒性(demaagd等，1996)，并且存在關(guān)于cry毒素域互換的設(shè)計(jì)的指導(dǎo)(knightetal.，2004)。結(jié)構(gòu)域i修飾.許多使用生物化學(xué)和分子方法的研究提供了關(guān)于cry蛋白結(jié)合和插入昆蟲中腸膜的決定因素的信息(綜述見piggot和ellar，2007)。已經(jīng)研究了來自cry1a和cry3a蛋白的結(jié)構(gòu)域i在膜中插入和形成孔的能力。結(jié)構(gòu)域i的α螺旋4和5在膜插入和孔形成中起關(guān)鍵作用(walters等，1993，gazit等人，1998；nunez-valdez等，2001)，有人提出其他螺旋像傘的肋條一樣接觸膜表面(gazit等人，1998)。α-螺旋3在某些情況下似乎是寡聚體預(yù)孔形成和毒性所必需的。一些α螺旋3突變體能夠結(jié)合受體，但不形成寡聚體，對(duì)煙草天蛾無毒(參見jimenez-juarez等，2008)。然而，cry3aa1的蛋白水解活化形式缺乏α螺旋1、2和3(carroll等，1997)。α螺旋1在受體結(jié)合后被除去。gomez等人(2002)發(fā)現(xiàn)，bbmv受體結(jié)合時(shí)形成的cry1ab寡聚體缺乏結(jié)構(gòu)域i的α螺旋1部分。另外，soberon等(2007)已經(jīng)顯示，cry1ab和cry1ac的n末端缺失突變體——它們?cè)谌Scry結(jié)構(gòu)上缺少包含α-螺旋1的約60個(gè)氨基酸，能夠在沒有鈣粘蛋白結(jié)合的情況下將分子量約60kda的單體組裝到預(yù)孔中。據(jù)報(bào)道，這些n末端缺失突變體對(duì)抗性昆蟲幼蟲具有活性。此外，diaz-mendoza等(2007)描述了保留對(duì)地中海玉米螟(sesamianonagrioides)的活性的43kda和46kda的cry1ab片段。證實(shí)這些片段包括116至423的氨基酸殘基；然而，確切的氨基酸序列未被闡明，并且這些蛋白水解片段的活性機(jī)制是未知的。gomez等人(2002)，soberon等人，2007和diaz-mendoza等(2007)的結(jié)果與hofte等(1986)的結(jié)果相反，后者報(bào)道了從cry1ab的n末端缺失36個(gè)氨基酸導(dǎo)致殺蟲活性的喪失。抗毒素抗體.使用本文提供的教導(dǎo)，可以從蘇云金芽孢桿菌分離株和/或dna文庫衍生等效毒素和/或編碼這些等效毒素的基因。獲得本發(fā)明的殺蟲毒素的方法有許多。例如，對(duì)本文公開和要求保護(hù)的殺蟲毒素有免疫反應(yīng)性的抗體可用于從蛋白質(zhì)混合物中鑒定和分離其它毒素。具體地說，可以針對(duì)毒素的最恒定部分和最不同于其它b.t毒素的部分生成抗體。然后可以使用這些抗體通過例如免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)或免疫印跡(western印跡)來特異性鑒定具有特征活性的等效毒素。針對(duì)本文公開的毒素或等效毒素或這些毒素的片段的抗體可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序容易地制備。然后可以從產(chǎn)生毒素的微生物獲得編碼這些毒素的基因。一旦已經(jīng)分離了b.t.殺蟲毒素，可以通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法產(chǎn)生對(duì)毒素特異性的抗體。在幾周或幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)重復(fù)注射選定的宿主可引起免疫應(yīng)答并導(dǎo)致顯著的抗bt毒素血清滴度。優(yōu)選的宿主是哺乳動(dòng)物物種，更優(yōu)選的物種是兔、山羊、綿羊和小鼠。從這樣經(jīng)免疫的動(dòng)物抽取的血液可以通過慣常的方法進(jìn)行處理以獲得與b.t.殺蟲毒素具有反應(yīng)性的抗血清(多克隆抗體)。然后可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，通過吸附至毒素對(duì)抗血清進(jìn)行親和純化。經(jīng)過親和純化的抗血清可以通過使用本領(lǐng)域已知的方法分離抗血清中的免疫球蛋白級(jí)分來進(jìn)一步純化。結(jié)果得到的材料將是與b.t.殺蟲毒素有反應(yīng)性的免疫球蛋白的異質(zhì)群體?？?b.t.毒素抗體也可以通過制備半合成免疫原來產(chǎn)生，半合成免疫原由b.t.殺蟲毒素的合成肽片段以及與之綴合的免疫原性載體構(gòu)成。許多用于制備肽片段的方案和儀器是本領(lǐng)域公知的。許多合適的免疫原性載體如牛血清白蛋白(bsa)或匙孔血藍(lán)蛋白也是本領(lǐng)域熟知的，偶聯(lián)免疫原和載體蛋白的技術(shù)同樣是本領(lǐng)域熟知的。一旦構(gòu)建了半合成免疫原，制備針對(duì)b.t.殺蟲毒素片段的特異性抗體的程序與用于制備與天然b.t.毒素反應(yīng)的抗體相同。使用純化的b.t.殺蟲毒素容易制備抗-b.t.毒素單克隆抗體(mab)。生產(chǎn)mab的方法已經(jīng)實(shí)踐了15年以上，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。用佐劑中的純化b.t.殺蟲毒素反復(fù)腹膜內(nèi)或皮下注射在大多數(shù)動(dòng)物中將會(huì)引起免疫應(yīng)答。從動(dòng)物中取出超免疫b淋巴細(xì)胞，并與能夠無限培養(yǎng)的合適的融合伴侶細(xì)胞系融合。優(yōu)選的其b淋巴細(xì)胞可能被超免疫并用于生產(chǎn)mab的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選的動(dòng)物是大鼠和小鼠，最優(yōu)選的是balb/c小鼠株系。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是用于產(chǎn)生雜交瘤的合適的融合伴侶。許多這樣的細(xì)胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc，manassas，va)和商業(yè)供應(yīng)商獲得。優(yōu)選的融合伙伴細(xì)胞系衍生自小鼠骨髓瘤，最優(yōu)選friendly骨髓瘤-653細(xì)胞系(ventrex，portland，me)。一旦融合，將所得的雜交瘤在選擇性生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)1至2周。有兩種眾所周知的選擇體系可用于從混合的雜交瘤培養(yǎng)物中淘汰未融合的骨髓瘤細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞間的融合物。選擇體系的選擇取決于被免疫的小鼠株系和使用的骨髓瘤融合伴侶。可以使用taggart和samloff(1983)描述的aat選擇體系；然而，由littlefield(1964)描述的hat(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇體系是優(yōu)選的，因?yàn)槠渑c上述優(yōu)選的小鼠株系和融合伴侶的相容性。然后對(duì)用過的培養(yǎng)基篩選免疫特異性mab的分泌。酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)程序最適合此目的；但調(diào)適用于大量篩選的放射免疫測定也是可以接受的?？梢詫?shí)施多次篩選，這些篩選被設(shè)計(jì)為連續(xù)地減少可考慮的無關(guān)或不太理想的培養(yǎng)物的數(shù)目。對(duì)于分泌與bt殺蟲毒素反應(yīng)的mab的培養(yǎng)物，可以篩選與已知的b.t.殺蟲毒素的交叉反應(yīng)性。對(duì)于優(yōu)先結(jié)合優(yōu)選的b.t.殺蟲毒素的mab，可以使用市售的測定法確定其同種型。優(yōu)選的mab是igg類，更優(yōu)選的mab是igg1和igg2a亞型。分泌優(yōu)選的mab的雜交瘤培養(yǎng)物可以進(jìn)行多次亞克隆以建立單克隆性和穩(wěn)定性。用于亞克隆真核非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物的眾所周知的方法包括有限稀釋、軟瓊脂糖和熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)。在每次亞克隆之后，優(yōu)選對(duì)所得培養(yǎng)物重新測定抗體分泌和同種型，以確保已建立了穩(wěn)定的優(yōu)選的分泌mab的培養(yǎng)物?？?bt毒素抗體可用于各種檢測本發(fā)明所要求保護(hù)的b.t.殺蟲毒素及其變體或片段的方法。眾所周知，用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的抗體可用于鑒定多種環(huán)境中抗原的存在。數(shù)十年來，用放射性同位素標(biāo)記的抗體已經(jīng)在放射免疫測定中被用于以極高的精度和靈敏度鑒定各種生物液體中抗原的存在。更近時(shí)候，酶標(biāo)記的抗體已經(jīng)在elisa測定中用來替代放射性標(biāo)記的抗體。此外，可以將針對(duì)本發(fā)明的b.t.殺蟲毒素的免疫反應(yīng)性抗體結(jié)合到固定物質(zhì)諸如聚苯乙烯孔或顆粒，并用于免疫測定中以確定b.t.毒素是否存在于測試樣品中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，殺蟲蛋白或變體通過包含表達(dá)本發(fā)明的毒素的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物口服遞送。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將本發(fā)明的核酸分子引入植物中，其中毒素可以在轉(zhuǎn)基因植物中以有效量表達(dá)以控制昆蟲。在非限制性實(shí)例中，一種基本克隆策略可以是將全長或修飾的cry編碼序列(cds)亞克隆到植物表達(dá)質(zhì)粒中ncoi和saci限制性位點(diǎn)處。使用例如技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)限制酶片段克隆程序?qū)⑺玫暮刑幱谥参锉磉_(dá)元件(如植物可表達(dá)啟動(dòng)子、3'末端轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷酸添加決定簇等)控制下的適當(dāng)cry編碼區(qū)的植物表達(dá)盒亞克隆到二元載體質(zhì)粒中。如果使用技術(shù)，則可以用lrclonasetm(invitrogen)將全長和修飾的基因植物表達(dá)盒重組到二元植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中。當(dāng)質(zhì)粒存在于大腸桿菌和土壤桿菌細(xì)胞中時(shí)，使用具有賦予抗生素壯觀霉素抗性的細(xì)菌基因的二元植物轉(zhuǎn)化載體是方便的。使用含有在期望的宿主植物中有功能的植物可表達(dá)的選擇標(biāo)記基因的二元載體質(zhì)粒也是方便的。植物可表達(dá)的選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括但不限于編碼對(duì)抗生素卡那霉素、新霉素和g418的抗性的轉(zhuǎn)座子tn5(aphii)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，以及編碼對(duì)草甘膦、潮霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素(雙丙氨膦)、咪唑啉酮、磺酰脲類和三唑并嘧啶除草劑如氯磺隆，溴苯腈，達(dá)拉邦等的耐受性的那些基因。或者，通過土壤桿菌操作領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法從候選土壤桿菌分離株制備質(zhì)粒dna，對(duì)其進(jìn)行限制性消化指紋圖譜作圖，分析含有dig-465，dig-473，dig-468，dig-483，dig-462，dig-463，dig-464，dig-466，dig-467，dig-469，dig-474，dig-482，dig-485，dig-487，irdig544.8，irdig544.9，irdig544.11或irdig544.12基因插入物的二元植物轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)化植物的領(lǐng)域中的技術(shù)人員將理解，可以使用除z707s之外的其他土壤桿菌菌株，并且菌株的選擇可以取決于待轉(zhuǎn)化的宿主植物物種的身份。以下是舉例說明實(shí)施本發(fā)明的規(guī)程的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制性。除非另有說明，所有百分?jǐn)?shù)均以重量計(jì)，所有溶劑混合物的比例均以體積計(jì)。本文提及或援引的所有專利，專利申請(qǐng)，臨時(shí)申請(qǐng)和出版物通過提述整體并入本文，以其與本說明書的明確教導(dǎo)無矛盾為限。除非另有明確說明或暗示，本文所用術(shù)語“一”和“該”表示“至少一”。實(shí)施例1b.t.殺蟲蛋白編碼序列的植物優(yōu)化版本的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)并合成了具有植物密碼子偏倚的dna序列，用以在轉(zhuǎn)基因單子葉植物和雙子葉植物中產(chǎn)生殺蟲蛋白。根據(jù)從genbank存儲(chǔ)的序列中獲得的706個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列(cds)計(jì)算得到了玉米(zeamaysl.)的密碼子使用表。從網(wǎng)站http://www.kazusa.or.jp/codon/的數(shù)據(jù)下載煙草(nicotianatabacum，1268cds)、卡諾拉(brassicanapus，530cds)，棉花(gossypiumhirsutum，197cds)，和大豆(glycinemax；約1000cds)的密碼子使用表。，計(jì)算一個(gè)偏倚的密碼子組，該組包含玉米數(shù)據(jù)組和雙子葉植物數(shù)據(jù)組二者共有的被頻繁使用的密碼子，這些密碼子具有合適的加權(quán)平均相對(duì)量，該密碼子組是在省略掉任何使用率小于該氨基酸在任一植物類型中的總密碼子使用率的約10％的冗余密碼子之后計(jì)算的。為了得到編碼殺蟲蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化序列，對(duì)殺蟲蛋白dna序列進(jìn)行密碼子取代，使得得到的dna序列的總體密碼子組成符合植物優(yōu)化的密碼子偏倚表。對(duì)序列進(jìn)行進(jìn)一步精修以消除不期望的限制酶識(shí)別位點(diǎn)、潛在的植物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、長段的a/t或c/g殘基，以及其它可能干擾編碼區(qū)在植物細(xì)胞中的rna穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或翻譯的基序。進(jìn)行其他改變以引入所需的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，并消除長的內(nèi)部開放閱讀框(+1以外的框)。這些變化都是在保留植物偏倚的密碼子組成這一約束之下進(jìn)行的。為了完成設(shè)計(jì)，在編碼區(qū)的3'末端添加一個(gè)以全部6種開放閱讀框編碼翻譯終止密碼子的序列，并在序列的5'和3'末端添加適當(dāng)?shù)南拗菩宰R(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)出的序列由商業(yè)供應(yīng)商(dna2.0，menlopark，ca)合成。有關(guān)合成基因生產(chǎn)的其他指導(dǎo)可以在例如wo97/13402和美國專利5,380,831中找到。編碼本發(fā)明的dig蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化的dna序列(seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)作為seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39公開。包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中公開的序列的dna分子由商業(yè)實(shí)體(dna2.0)合成性組裝。實(shí)施例2編碼殺蟲毒素的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)菌宿主中的表達(dá)使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建熒光假單胞菌(pf)表達(dá)質(zhì)粒，所述質(zhì)粒被工程改造以產(chǎn)生由植物優(yōu)化編碼區(qū)編碼的dig-465(seqidno:16)、dig-473(seqidno:24)、dig-468(seqidno:2)、dig-483(seqidno:4)、dig-462(seqidno:10)、dig-463(seqidno:12)、dig-464(seqidno:14)、dig-466(seqidno:18)、dig-467(seqidno:20)、dig-469(seqidno:22)、dig-474(seqidno:26)、dig-482(seqidno:28)、dig-485(seqidno:6)和dig-487(seqidno:8)蛋白。限制性內(nèi)切核酸酶得自newenglandbiolabs(neb；ipswich，ma)，t4dna連接酶(invitrogencorporation，carlsbad，ca)用于dna連接。基本克隆策略包括將dig-465，dig-473，dig-468，dig-483，dig-462，dig-463，dig-464，dig-466，dig-467，dig-469，dig-474，dig-482，dig-485或dig-487毒素編碼序列(cds)亞克隆到pdow1169的限制性位點(diǎn)如spei和xhoi處，由此將其置于來自質(zhì)粒pkk223-3(plpharmacia，milwaukee，wi)的ptac啟動(dòng)子和rrnbt1t2終止子的表達(dá)控制下。pdow1169是一種低拷貝質(zhì)粒，具有rsf1010復(fù)制起點(diǎn)、pyrf基因、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，之后是限制酶識(shí)別位點(diǎn)，其中可以引入含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)的dna片段(美國專利申請(qǐng)us20080193974)。將該表達(dá)質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化入dc454(一種具有突變?chǔ)膒yrf和lsc::laciqi的近野生型熒光假單胞菌菌株)或其衍生物，在soc-大豆水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中回收，并且在選擇性培養(yǎng)基(缺乏尿嘧啶的m9葡萄糖瓊脂，sambrook等人，同上)上鋪板。微生物操作的細(xì)節(jié)可以在squires，c.h.等人，(2004)，美國專利申請(qǐng)20060008877，美國專利申請(qǐng)20080193974，和美國專利申請(qǐng)20080058262中公開，其通過引用并入本文。通過限制性消化小提質(zhì)粒dna來驗(yàn)證菌株。搖瓶中的生長和表達(dá)分析.通過搖瓶培養(yǎng)的攜帶表達(dá)構(gòu)建體的熒光假單胞菌來生產(chǎn)dig-465，dig-473，dig-468，dig-483，dig-462，dig-463，dig-464，dig-466，dig-467，dig-469，dig-474，dig-482，dig-485或dig-487毒素，用于表征和昆蟲生物測定。種子培養(yǎng)物在補(bǔ)充有1％葡萄糖和微量元素的m9培養(yǎng)基中生長，用種子培養(yǎng)物接種50ml含5％甘油的限定基本培養(yǎng)基(teknovacat.#3d7426，hollister，ca)。30℃振蕩初始溫育24小時(shí)后，通過加入異丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，誘導(dǎo)ptac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的殺蟲蛋白毒素基因表達(dá)。在誘導(dǎo)時(shí)和誘導(dǎo)后的不同時(shí)間對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行取樣。通過600nm處的光密度(od600)度量細(xì)胞密度。其它適用于熒光假單胞菌生長的培養(yǎng)基也可以使用，例如huang等人，2007和美國專利申請(qǐng)20060008877中所述。搖瓶樣品的細(xì)胞分級(jí)和sds-page分析.在每個(gè)采樣時(shí)間，將0.5ml等分試樣以14000xg離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀物在-80℃冷凍。使用bugbustermastermix(darmstadt,germany)從冷凍搖瓶細(xì)胞沉淀樣品產(chǎn)生可溶性和不溶性級(jí)分。將每個(gè)細(xì)胞沉淀重新懸浮于0.5mlbugbustermastermixtm溶液中，并在室溫下震蕩溫育30分鐘。使用具有0.1mm玻璃珠的珠磨(beadbeater)將樣品裂解3分鐘。將裂解物以14,000rpm離心5分鐘，并回收上清液作為可溶性級(jí)分。然后將沉淀(不溶性級(jí)分)重懸浮于等體積的提取緩沖液(8m尿素，0.5mnacl，25mmnapo4，ph10.4)中。將樣品與含有二硫蘇糖醇(dtt)的2xnupagetris甘氨酸sds樣品緩沖液(invitrogen，carlsbad，ca)1:1混合并煮沸5分鐘，然后加載到novex4-20％tris甘氨酸sds聚丙烯酰胺凝膠(invitrogen，carlsbad，ca)上。在推薦的tris-甘氨酸緩沖液中進(jìn)行電泳。根據(jù)制造商(bio-radinc.，hercules，ca)的方案，用bio-safe考馬斯染色劑染色凝膠，并使用getyphooon系列成像系統(tǒng)(pittsburgh，pa)成像。包涵體制備.從產(chǎn)生不溶性b.t.殺蟲蛋白[如sds-page和maldi-ms(基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜)所證實(shí)]的熒光假單胞菌發(fā)酵物獲得細(xì)胞，用這些細(xì)胞制備cry蛋白包涵體(ib)。熒光假單胞菌發(fā)酵物離心沉淀在37℃水浴中解凍。將細(xì)胞在裂解緩沖液[50mmtrisph7.5，200mmnacl，20mmedta二鈉鹽(二乙胺四乙酸)、1％tritonx-100和5mm二硫蘇糖醇(dtt)，在使用前加入5ml/l的細(xì)菌蛋白酶抑制劑混合物(p8465sigma-aldrich，st.louis，mo)]中再懸浮至25％w/v。使用手持式均化器在最低設(shè)置值(tissuetearor，biospecproducts，incbartlesville，ok)將細(xì)胞懸浮。通過用金屬藥匙攪拌將溶菌酶(sigma-aldrichl765125mg，來自雞卵白)加入到細(xì)胞懸浮液中，并將懸浮液在室溫下溫育1小時(shí)。將懸浮液在冰上冷卻15分鐘，然后使用bransonsonifier250(兩次1分鐘，50％占空比，30％輸出)進(jìn)行超聲處理。通過顯微鏡檢查細(xì)胞裂解。如果需要，另加25mg溶菌酶，重復(fù)溫育和超聲處理。當(dāng)通過顯微鏡確認(rèn)了細(xì)胞裂解時(shí)，將裂解物以11,500×g離心25分鐘(4℃)以形成ib沉淀，棄去上清液。將ib沉淀物用100ml裂解緩沖液懸浮，用手持式混合器勻漿并如上進(jìn)行離心。ib沉淀通過反復(fù)的懸浮(在50ml裂解緩沖液中)、洗滌、勻漿、超聲處理和離心，直到上清液變得無色，并且ib沉淀物變得堅(jiān)實(shí)且呈灰白色。為了最終洗滌，將ib沉淀懸浮于含有2mmedta的無菌過濾(0.22μm)蒸餾水中，并離心。將最終的沉淀懸浮于含有2mmedta的無菌過濾蒸餾水中，并以1ml等分試樣在-80℃下儲(chǔ)存。ib制備物中蛋白質(zhì)的sds-page分析和定量如下進(jìn)行：解凍1份1ml的ib沉淀，并用無菌過濾過的蒸餾水稀釋1:20。然后將稀釋的樣品與4x還原性樣品緩沖液[250mmtris，ph6.8，40％甘油(v/v)，0.4％溴苯酚藍(lán)(w/v)，8％sds(w/v)和8％β-巰基乙醇(v/v)]，并加載到用1xtris/甘氨酸/sds緩沖液(biorad)運(yùn)行的4-20％tris-甘氨酸、12+2孔凝膠(invitrogen)上。在200伏下跑凝膠60分鐘，然后用考馬斯藍(lán)(50％g-250/50％r-250，溶于45％甲醇，10％乙酸)染色，并用含7％乙酸，5％甲醇的蒸餾水脫色。通過將條帶的光密度值與在相同凝膠上跑膠的牛血清白蛋白(bsa)樣品進(jìn)行比較來定量靶標(biāo)條帶，用以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。包涵體的溶解。將來自pf克隆的含有dig-465、dig-473、dig-468、dig-483、dig-462、dig-463、dig-464、dig-466、dig-467、dig-469、dig-474、dig-482、dig-485或dig-487蛋白的6ml包涵體懸液在eppendorf5415c型離心機(jī)上以最高設(shè)置(約14,000xg)離心，以使包涵體沉淀。在50ml錐形管中，除去儲(chǔ)液上清液，并用25ml100mm碳酸鈉緩沖液(ph11)代替。使用移液器使懸浮液重新懸浮，并渦旋以混合完全。將管置于輕輕搖晃的平臺(tái)上4℃過夜以提取靶蛋白。提取物在4℃下以30,000×g離心30分鐘，所得上清液使用amiconultra-15再生纖維素離心過濾裝置(30,000分子量截留；millipore)濃縮5倍。然后使用一次性pd-10柱(gehealthcare，piscataway，nj)將樣品緩沖液變?yōu)?0mmcaps[3-(環(huán)己氨基)1-丙磺酸]ph10。凝膠電泳.將濃縮的提取物在含有5mm二硫蘇糖醇作為還原劑的樣品緩沖液(invitrogen)中稀釋1:50，并在95℃下加熱4分鐘，準(zhǔn)備好用于電泳。將樣品加載在4-12％凝膠的重復(fù)的泳道中，同時(shí)加入0.2至2μg/泳道的5個(gè)bsa標(biāo)準(zhǔn)品(用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線)。使用mopssds運(yùn)行緩沖液(invitrogen)施加200v電壓，直到跟蹤染料到達(dá)凝膠底部。凝膠用含45％甲醇、10％乙酸的0.2％考馬斯藍(lán)g-250中染色，然后脫色，首先用45％甲醇，10％乙酸短暫脫色，然后用7％乙酸、5％甲醇直到背景清除。脫色后，用bioradfluor-smultiimager掃描凝膠。使用該儀器的quantityonev.4.5.2軟件獲得背景扣減的染色蛋白質(zhì)條帶體積，并產(chǎn)生bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算dig-465，dig-473，dig-468，dig-483，dig-462，dig-463，dig-464，dig-466，dig-467，dig-469，dig-474，dig-482，dig-485或dig-487蛋白在儲(chǔ)液中的濃度。將dig-465，dig-473，dig-468，dig-483，dig-463，dig-464，dig-466，dig-467，dig-469，dig-474，dig-482，dig-485和dig-487的表達(dá)水平在熒光假單胞菌細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的表達(dá)水平與截短的cry1ca(dig-462)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。截短的cry1ca(dig-462)以約1g/l表達(dá)，而dig-473以約0.5g/l表達(dá)。dig-465的表達(dá)是截短的cry1ca的表達(dá)的約5倍，4.9g/l。這些體外結(jié)果表明，l57a突變導(dǎo)致截短的cry1ca蛋白的更大表達(dá)。實(shí)施例3在熒光假單胞菌中產(chǎn)生的dig蛋白質(zhì)的殺蟲活性b.t.殺蟲毒素dig-462，dig-463，dig-464，dig-465，dig-466，dig-467，dig-468，dig-469，dig-470，dig-473和dig-474被證明對(duì)鱗翅目物種，包括小菜蛾(dbm；plutellaxylostella(linnaeus))和秋粘蟲(faw，spodopterafrugiperda(smith))有活性。樣品制備和生物測定.將10mmcapsph10中的包涵體制備物在10mmcaps，ph10中適當(dāng)稀釋，所有生物測定均包含由該緩沖液組成的對(duì)照處理，用作對(duì)死亡率或生長抑制的背景檢查。通過凝膠電泳估計(jì)生物測定緩沖液中的蛋白質(zhì)濃度，使用bsa產(chǎn)生用于凝膠光密度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，光密度使用biorad成像系統(tǒng)(fluor-smultiimager，quantityone軟件版本4.5.2)測量。用基于考馬斯藍(lán)的染色劑染色凝膠基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，并在閱讀前脫色。用人工昆蟲餌食喂養(yǎng)的新生鱗翅目幼蟲進(jìn)行生物測定來測試純化的蛋白質(zhì)的殺蟲活性。從由養(yǎng)蟲飼養(yǎng)商(benzonresearchinc.，carlisle，pa)維持的群落獲得的卵孵出dbm和faq幼蟲。從來自專有群落(dowagrosciencesllc，indianapolis，in)的卵孵化rfaw的幼蟲。這些生物測定在專門設(shè)計(jì)用于昆蟲生物測定的128孔塑料托盤(c-dinternational，pitman，nj)中進(jìn)行。每個(gè)孔含有1.0ml多物種鱗翅目餌食(southlandproducts，lakevillage，ar)。通過移液器將40μl等份的蛋白質(zhì)樣品施加到每個(gè)孔的1.5cm2的餌食表面(26.7μl/cm2)。cry蛋白濃度計(jì)算為每平方厘米(cm2)孔中表面積的dig蛋白的量(ng)。將經(jīng)處理的托盤保持在通風(fēng)櫥中，直到餌食表面上的液體蒸發(fā)或被吸收到餌食中。在破殼后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，用濕潤的駱駝毛刷拾取個(gè)體幼蟲，并將其放置在處理的餌食上，每孔一只幼蟲。然后將染蟲的孔用粘性透明塑料片密封，塑料片通有氣孔以允許氣體交換(c-dinternational，pitman，nj)。生物測定托盤在受控的環(huán)境條件(28℃，～60％相對(duì)濕度，16:8[光:暗])下保持5天，然后記錄暴露于每個(gè)蛋白質(zhì)樣品的昆蟲總數(shù)、死蟲數(shù)、以及存活昆蟲的重量。計(jì)算每次處理的百分比死亡率和生長抑制百分比。生長抑制(gi)計(jì)算如下：gi＝[1-(twit/tnit)/(twibc/tnibc)]其中twit是處理中昆蟲的總重量，tnit是處理中昆蟲的總數(shù)twibc是背景檢查(緩沖液對(duì)照)中的昆蟲的總重量，和tnibc是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖液對(duì)照)。在dbm生物測定中，測試了10和300ng/cm2的dig-462、dig-463、dig-464、dig-465、dig-466、dig-467、dig-468、dig-469、dig-470、dig-471、dig-472、dig-473和dig-474對(duì)該種昆蟲的作用。以1x和5x稀釋率的dig-462，dig-465，dig-473的包涵體制劑測試faw。比較死亡率百分比和生長抑制結(jié)果。對(duì)于dig-462，dig-463，dig-464，dig-465，dig-466，dig-468，dig-469，dig-473和dig-474處理，在300ng/cm2下的死亡率為100％(表2和表3)。對(duì)于dig-465和dig-473處理，生長抑制在10ng/cm2下為70-90％的生長抑制，在300ng/cm2下為100％的生長抑制(表2)。表2dig-462，dig-465和dig-473蛋白質(zhì)在dbm上的生物測定測試結(jié)果，測量死亡率和生長抑制蛋白質(zhì)死亡率生長抑制dig-462+++++++dig-465++++++dig-473+++++++對(duì)于死亡率，++＝10ng/cm2下0-20％，300ng/cm2下100％；+++＝10ng/cm2下30-60％，300ng/cm2下100％。對(duì)于生長抑制，++++＝10ng/cm2下70-90％的生長抑制，且300ng/cm2下100％的生長抑制。表3蛋白質(zhì)突變體的生物測定在10ng/cm2和300ng/cm2下對(duì)dbm測試對(duì)于所有處理，cry1ca核心毒素(dig-462)、dig-465和dig-473蛋白對(duì)faw幼蟲的生長抑制被確定為>40％(表4)。蛋白質(zhì)以全強(qiáng)度測試，并用緩沖液(10mmcaps，ph10)稀釋5倍。表4dig-462，dig-465和dig-473對(duì)faw的百分比生長抑制蛋白質(zhì)稀釋度％生長抑制dig-4621x43dig-4625x47dig-4651x81dig-4655x58dig-4731x56dig-4735x48緩沖液1x0評(píng)估純化蛋白質(zhì)的dbm活性和對(duì)胰凝乳蛋白酶消化的敏感性。一個(gè)預(yù)料之外的驚人發(fā)現(xiàn)是，dig-473對(duì)胰凝乳蛋白酶切割具有抗性，同時(shí)具有與dig-462相同的對(duì)dbm的效力。這與cry1ca核心(dig-462)和dig-465蛋白相反，此二者在體外均對(duì)胰凝乳蛋白酶切割敏感(表5)。表5具有針對(duì)dbm的活性的蛋白質(zhì)(dig-462為標(biāo)準(zhǔn))和蛋白質(zhì)對(duì)胰凝乳蛋白酶切割的抗性。實(shí)施例4歐洲玉米螟(ecb)、西南玉米螟(swcb)、和南方粘蟲(saw)生物測定生物測定在32孔測試盤中進(jìn)行。向每個(gè)孔中加入約5ml的2％水瓊脂溶液，使瓊脂完全固化。植物大約3周齡，并在t1代進(jìn)行測試。完成了t1葉材料的三個(gè)重復(fù)。切下一片葉子(1”×0.5”長方形)，并放置在托盤的單個(gè)孔中。每個(gè)孔都侵染了ecb、cry1fa、recb或swcb的10只昆蟲幼蟲(通常少于24小時(shí)齡)。對(duì)于saw，每孔侵染5只昆蟲幼蟲。來自b104近交系的基于種子的植物和黃色熒光蛋白(yfp)轉(zhuǎn)化植物作為陰性對(duì)照。然后將染蟲的孔用粘性透明塑料片密封，塑料片通有氣孔以允許氣體交換(c-dinternational，pitman，nj)。將托盤放置在conviron培養(yǎng)箱中，并保持在28℃(16:8h光照:黑暗，60％rh)3天，之后記錄每片葉片的損傷總量(0％、5％、10％、15％、25％、50％、75％損傷，等等，直至100％)。當(dāng)ecb和cry1fa抗性ecb(recb)昆蟲幼蟲暴露于含有截短的cry1ca修飾蛋白質(zhì)的植物時(shí)，由該昆蟲引起的攝食損傷減少。當(dāng)在餌食生物測定中測試修飾的cry1ca時(shí)，其中純化的全長cry1ca被放置在人造昆蟲餌食之上，并且讓個(gè)體昆蟲進(jìn)食含有毒素的餌食，發(fā)現(xiàn)修飾的cry1ca對(duì)ecb和recb無活性。然而，當(dāng)在玉米中表達(dá)濃度>120ng/cm2時(shí)，植物中cry1ca的表達(dá)針對(duì)由ecb，特別是recb引起的進(jìn)食損傷提供意想不到的保護(hù)。表6irdig544.12t1玉米飼喂歐洲玉米螟(ecb)和cry1fa抗性ecb(recb)時(shí)的生物測定結(jié)果當(dāng)西南玉米螟(swcb)和南方粘蟲(saw)昆蟲幼蟲暴露于含有截短的cry1ca修飾蛋白[蛋白表達(dá)范圍為140-340ng/cm2]的植物時(shí)，觀察到由二者引起的攝食損傷減少(表7)。平均表達(dá)為210ng/cm2，標(biāo)準(zhǔn)偏差為35。表7irdig544.12t1玉米植物飼喂給西南玉米螟(swcb)和南方粘蟲(saw)時(shí)的生物測定植物名swcb平均損傷saw平均損傷112726[1]-015.aj001.04723.0112726[1]-015.aj001.03043.0112726[1]-015.aj001.01911.3112726[1]-015.aj001.03422.0yfp陰性對(duì)照98.394.3yfp陰性對(duì)照93.362.5yfp陰性對(duì)照10027.5yfp陰性對(duì)照92.767.5yfp陰性對(duì)照97.730.0yfp陰性對(duì)照10045.0b10498.394.3b10410091.7b10410097.0b1046570.0b10410086.7玉米螟的田間試驗(yàn)在兩個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行：一個(gè)在美國印第安納州(in)，另一個(gè)在美國密西西比州(ms)。每種處理測試了多個(gè)構(gòu)建體和事件。cry1ab和cry1f作為ecb試驗(yàn)中的陽性對(duì)照。無效植物(null)作為陰性對(duì)照。為了評(píng)估ecb功效，每個(gè)植物在v6-v7階段植物的葉輪中接受了10只第二齡的ecb幼蟲。在ms，也用西南玉米螟(swcb)二齡幼蟲人工侵染v9玉米的葉輪(每株植物22只幼蟲)。所使用的ecb和swcb均從benzon實(shí)驗(yàn)室獲得。在這兩個(gè)ecb試驗(yàn)中，均在侵染后2周對(duì)植物進(jìn)行葉面損傷評(píng)估(guthrie1-9量表)(guthrie等，1960)，其中1為無明顯損傷，9為大部分葉有長的損害(表8)。在msswcb試驗(yàn)中，在評(píng)估葉輪后4-5天評(píng)估植物的莖損傷和活昆蟲數(shù)。收集的數(shù)據(jù)包括每條莖上孔道的數(shù)量，孔道的長度和活幼蟲/蛹數(shù)。表8玉米螟評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(葉輪損傷)分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)1沒有可見的葉損傷，或者在少數(shù)葉上有少量穿孔型損傷2少數(shù)葉上有少量穿孔型損傷3若干葉上有普遍的穿孔損傷4若干葉上有穿孔和細(xì)長的損害5若干葉上有細(xì)長的損害6若干葉上有細(xì)長的損害(約1英寸).7在一半的葉上普遍有長的損害8在2/3的葉上普遍有長的損害9大部分葉上有長的損害ecb田間試驗(yàn)。測量ecb葉輪損傷以測試cry1ca活性，與無效植物相比顯示出顯著更好的葉輪保護(hù)作用。cry1ca事件活性在統(tǒng)計(jì)上不等效于cry1ab和cry1f提供的葉輪保護(hù)。在ms產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)一步佐證了cry1ca的出人預(yù)料的高水平植物保護(hù)。在該研究中建立了較高的攝食壓力。與無效植物上的葉和莖損傷相比，測得cry1ca產(chǎn)生了顯著的控制。在cry1ca莖中發(fā)現(xiàn)的存活昆蟲很少。當(dāng)與無效植物相比時(shí)，測得cry1ab和cry1f事件的產(chǎn)生了顯著的葉輪和莖保護(hù)。表9ecb葉輪數(shù)據(jù)，in(多個(gè)事件間的平均)基因事件平均葉輪損傷評(píng)級(jí)(1-9評(píng)級(jí))均值的范圍cry1ca42.31b2.00-2.65cry1ab81.00a1.00cry1f121.03a1.00-1.20無效植物14.65c后隨不同的字母的均值是顯著不同的(p≤0.05)表10ecb葉輪和莖數(shù)據(jù)，ms(不同事件之間的平均)對(duì)于所有數(shù)據(jù)列，所有基因事件都與無效植物的值有顯著差異(p<0.05)。在每個(gè)列中，后隨不同字母的均值是顯著不同的(p≤0.05)。在swcb試驗(yàn)中，每種b.t.僅測試了2個(gè)事件。該研究中建立了較高的攝食壓力。對(duì)cry1ab、cry1f和cry1ca事件均測量到了統(tǒng)計(jì)學(xué)上等效的莖保護(hù)和每條莖的幼蟲與蛹數(shù)。表11swcb葉輪和莖數(shù)據(jù)，ms在每個(gè)列中，后隨不同字母的均值是顯著不同的(p≤0.05)。cry1ca的活性形式由氨基酸29-628組成。全長(1-1164)或經(jīng)切割的形式(1-628和29-628)當(dāng)被提供給昆蟲時(shí)是有活性的，因?yàn)樗鼈儽患庸こ?9-628的形式。實(shí)施例5玉米穗蛾田間試驗(yàn)在fowler，in用多個(gè)構(gòu)建體和事件(seqidno:31)進(jìn)行了玉米穗蛾的田間試驗(yàn)。無效植物作為陰性對(duì)照。每株植物在玉米棒的綠色絲中接受五只第一齡幼蟲。cew獲自benzonlaboratory。每個(gè)事件每個(gè)地塊評(píng)估10個(gè)玉米棒，以評(píng)估用cew感染的玉米棒顆粒損傷程度。與無效植物相比，所有轉(zhuǎn)基因事件提供了顯著較低的顆粒損傷水平。對(duì)幼蟲攝食cry1ca植物有顯著抑制(表12)。表12cew顆粒進(jìn)食數(shù)據(jù)，in實(shí)施例6土壤桿菌轉(zhuǎn)化使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建二元植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)質(zhì)粒。使用技術(shù)(invitrogen，carlsbad，ca)工程化含有cry1ca表達(dá)盒的土壤桿菌二元質(zhì)粒，并用于土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。限制性內(nèi)切核酸酶得自newenglandbiolabs(neb；ipswich，ma)，t4dna連接酶(invitrogen)用于dna連接。使用lr酶混合物(invitrogen)進(jìn)行g(shù)ateway反應(yīng)。使用質(zhì)粒制備試劑盒或axxtramidi試劑盒(均來自macherey-nagel)，按照制造商的說明進(jìn)行質(zhì)粒制備。凝膠分離后，使用qiaquickpcr純化試劑盒或qiaexii凝膠提取試劑盒(均來自qiagen)純化dna片段。包含編碼殺蟲蛋白或其片段的核苷酸序列的dna片段由商業(yè)供應(yīng)商(例如dna2.0，menlopark，ca)合成并以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體中的克隆片段提供，或通過對(duì)其他含有適當(dāng)核苷酸序列的構(gòu)建體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作而獲得。鑒定每個(gè)基因內(nèi)部的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，并合成每個(gè)基因的片段，每個(gè)片段含有特定的缺失或插入。將修飾的cry片段亞克隆到其他cry片段中的適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，以獲得編碼所需全長蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、或缺失的變體蛋白質(zhì)的區(qū)域。制備根癌土壤桿菌菌株z707s(z707的鏈霉素抗性衍生物；hepburn等人，1985)的電感受態(tài)細(xì)胞，并使用電穿孔(weigel和glazebrook，2002)轉(zhuǎn)化。電穿孔后，將1mlyep肉湯(gm/l：酵母提取物，10；蛋白胨，10；nacl，5)加入到電轉(zhuǎn)杯中，將細(xì)胞yep懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml培養(yǎng)管中，在28℃下水浴中持續(xù)攪拌下溫育4小時(shí)。將細(xì)胞接種在含壯觀霉素(200μg/ml)和鏈霉素(250μg/ml)的yep+瓊脂(25gm/l)上，并將板在28℃下溫育2-4天。選擇良好分離的單個(gè)菌落，并劃線到新鮮的如前所述的含有壯觀霉素和鏈霉素的yep+瓊脂平板上，并在28℃溫育1-3天。從選出的土壤桿菌菌落制備模板質(zhì)粒dna，使用載體特異性引物進(jìn)行pcr分析，來檢驗(yàn)殺蟲蛋白基因插入物在二元植物轉(zhuǎn)化載體中的存在。從在如前所述的含壯觀霉素和鏈霉素的yep中生長的15ml過夜培養(yǎng)物取4ml等份離心沉淀細(xì)胞，使用qiagenspinminipreps根據(jù)制造商的說明提取細(xì)胞。作為對(duì)照的質(zhì)粒dna來自土壤桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化所使用的二元載體。使用來自invitrogen的taqdna聚合酶，按照制造商的說明書，以0.5x濃度完成pcr反應(yīng)。pcr反應(yīng)在編程為包括以下條件的mjresearchpeltier熱循環(huán)儀中進(jìn)行：步驟1)94℃3分鐘；步驟2)94℃45秒；步驟3)55℃30秒；步驟4)72℃，每kb預(yù)期產(chǎn)物長度1分鐘；步驟5)29次至步驟2；步驟6)72℃10分鐘。反應(yīng)在循環(huán)后保持在4℃。通過瓊脂糖凝膠電泳(例如0.7％至1％瓊脂糖，w/v)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過溴化乙錠染色觀察。選擇一個(gè)其產(chǎn)物與質(zhì)粒對(duì)照相同的菌落。表13用于在玉米中表達(dá)dig-465和dig-473的質(zhì)粒的描述。質(zhì)粒描述pdab115752zmubi1/dig-465/zmper5::scbv(mam)v2/aad-1v3/zmlippdab115753zmubi1/dig-473/zmper5::scbv(mam)v2/aad-1v3/zmlippdab112725zmubi1/cry1ca(zm)/zmper5::scbv(mam)/aad-1v3/zmlippdab112726zmubi1/cry1ca(hgc)/zmper5::scbv(mam)/aad-1v3/zmlip實(shí)施例7在單子葉植物中生產(chǎn)dig-465和dig-473b.t.的殺蟲蛋白和變體土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化.將來自highiif1雜交種子(armstrong等，1991)的種子種植在含有95％metro-mix360無土栽培培養(yǎng)基(sungrohorticulture，bellevue，wa)和5％粘土/壤土的5加侖盆中。植物在溫室中使用高壓鈉和金屬鹵化物燈的組合在16:8小時(shí)的光:暗光周期下生長。為了獲得用于轉(zhuǎn)化的未成熟的f2胚胎，進(jìn)行受控同胞傳粉。在授粉后8-10天，當(dāng)胚胎大小為1.0至2.0mm時(shí)，分離未成熟的胚胎。感染和共同培養(yǎng).玉米棒如下表面消毒：用液皂搓洗，浸入70％乙醇中2分鐘，然后浸入20％商業(yè)漂白劑(0.1％次氯酸鈉)中30分鐘，然后用無菌水沖洗。細(xì)菌在28℃下、在含有100mg/l壯觀霉素、10mg/l四環(huán)素和250mg/l鏈霉素的yep固體培養(yǎng)基上生長2-3日，將1-2環(huán)這樣的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到5ml含有100μm乙酰丁香酮的液體感染培養(yǎng)基(lsbasalmedium(linsmaierandskoog，1965)，n6維生素(chu等，1975)，1.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)，68.5gm/l蔗糖，36.0gm/l葡萄糖，6mml-脯氨酸，ph5.2)中，制備含有超二元載體的土壤桿菌細(xì)胞懸液。將溶液渦旋直到達(dá)到均勻的懸液，并使用具有紫色濾鏡的klett-summerson色度計(jì)將濃度調(diào)節(jié)至200kylett的最終密度。將未成熟的胚直接分離到含有2ml感染培養(yǎng)基的微量離心管中。去除培養(yǎng)基，并用密度為200klett單位的1ml土壤桿菌溶液代替，并將土壤桿菌和胚溶液在室溫下一起溫育5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(lsbasalmedium，n6維生素，1.5mg/l2,4-d，30.0gm/l蔗糖，6mml-脯氨酸，0.85mg/lagno3，100μm乙酰丁香酮，3.0gm/l結(jié)冷膠(phytotechnologylaboratories，lenexa，ks)ph5.8)在25℃，黑暗條件下培養(yǎng)5天。共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基，之后在約8周的過程中獲得轉(zhuǎn)化的分離株。對(duì)于用含植物可表達(dá)的pat或bar選擇標(biāo)記基因的超二元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的玉米組織的選擇，用基于ls的培養(yǎng)基(ls基礎(chǔ)培養(yǎng)基，n6維生素，1.5mg/l2,4-d，0.5gm/lmes(2-(n-嗎啉代)乙磺酸一水合物；phytotechnologieslabr.)，30.0gm/l蔗糖，6mml-脯氨酸，1.0mg/lagno3，250mg/l頭孢噻肟，2.5gm/l結(jié)冷膠，ph5.7)與雙丙氨膦(goldbiotechnology)一起使用。將胚胎轉(zhuǎn)移到含有3mg/l雙丙氨膦的選擇培養(yǎng)基中，直至獲得胚性分離物。通過每隔2周轉(zhuǎn)移到新鮮選擇培養(yǎng)基來擴(kuò)大回收的分離物用于再生和進(jìn)一步分析。再生和種子生產(chǎn).為了再生，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到“28”誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ms鹽和維生素，30gm/l蔗糖，5mg/l芐氨基嘌呤，0.25mg/l2，4-d，3mg/lbialaphos，250mg/l頭孢噻肟，2.5gm/l結(jié)冷膠，ph5.7)在低光條件(14μem-2s-1)下1周，然后在高光條件下(約89μem-2s-1)1周。隨后將組織轉(zhuǎn)移到“36”再生培養(yǎng)基(與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，但缺乏植物生長調(diào)節(jié)劑)。當(dāng)小植物的長度長到3-5厘米時(shí)，轉(zhuǎn)移到含有shga培養(yǎng)基(schenk和hildebrandt鹽和維生素(1972)；phytotechnologieslabr.)，1.0gm/l肌醇，10gm/l蔗糖的玻璃培養(yǎng)管和2.0gm/l結(jié)冷膠，ph5.8)以允許枝條和根的進(jìn)一步生長和發(fā)育。將植物移植到如前所述的相同的土壤混合物中，并在溫室中生長至開花。進(jìn)行種子生產(chǎn)的受控授粉。構(gòu)建體115752表達(dá)dig-465的水平和構(gòu)建體115753表達(dá)dig-473的水平在圖1中示出。二者以相似的水平表達(dá)各自的蛋白質(zhì)，使用葉沖孔器獲得組織樣品，在葉中測得的水平約70-80ng/cm2。從表達(dá)編碼全長cry1ca蛋白(mr-1206)(mw130kda)的基因的玉米獲得提取物，進(jìn)行sds-page。使用針對(duì)cry1ca的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡，檢測出至少5種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。檢測到由插入玉米的基因所編碼的全長(130kda)蛋白質(zhì)。其他條帶代表該蛋白質(zhì)的蛋白水解產(chǎn)物。一條由代表核心毒素的氨基酸序列1-628組成的蛋白質(zhì)片段的分子量為70kda。68kda帶表示由氨基酸29-628組成的蛋白質(zhì)，其中n末端的前28個(gè)氨基酸被缺失。前三個(gè)條帶對(duì)草地貪夜蛾和其他鱗翅目昆蟲具有功能活性。第四條帶代表由氨基酸74-628(mw62kda)組成的經(jīng)切割蛋白，第五條帶表示進(jìn)一步加工成氨基酸74-596(mw59kda)的cry1ca蛋白。62kda和59kda的條帶對(duì)草地貪夜蛾和其他鱗翅目昆蟲沒有功能活性，但代表主要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因玉米的生物測定通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(參見例如huang等人，2006)證明了在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的dig-465和dig-473蛋白質(zhì)和變體的生物活性。功效可以通過在受控飼養(yǎng)環(huán)境中給靶昆蟲喂食衍生自產(chǎn)生dig-465或dig-473蛋白或變體的植物的各種植物組織或組織片來證明?；蛘撸梢援a(chǎn)生dig-465或dig-473蛋白質(zhì)或變體的植物獲得各種植物組織，從中制備蛋白質(zhì)提取物，并將蛋白質(zhì)提取物摻入如前所述的人工餌食生物測定中。應(yīng)當(dāng)理解，這種攝食測定的結(jié)果將要與使用適當(dāng)對(duì)照組織的類似進(jìn)行的生物測定比較，所述對(duì)照組織來自不產(chǎn)生dig-465或dig-473蛋白或變體的宿主植物，或者要與其他對(duì)照樣品比較。測試了來自構(gòu)建物115752(dig-465)的玉米中產(chǎn)生的各種事件的生物活性，測試其是否可防止由faw或cry1fa抗性faw(rfaw)的攝食活動(dòng)導(dǎo)致的葉損傷。結(jié)果表明，表達(dá)dig-465蛋白的事件與不表達(dá)該蛋白質(zhì)的植物相比表現(xiàn)出較少的攝食損傷，而且效果為劑量依賴性，dig-465的表達(dá)水平越高，導(dǎo)致faw或rfaw所致的攝食損傷越少，這種影響對(duì)rfaw的影響似乎更大(表14和圖2)。類似地，測試了來自構(gòu)建物115753(dig-473)的玉米中產(chǎn)生的各種事件防止由faw或cry1fa抗性faw(rfaw)的攝食活動(dòng)引起的葉損傷的生物活性。結(jié)果表明，表達(dá)dig-473蛋白的事件與不表達(dá)該蛋白質(zhì)的植物相比表現(xiàn)出較少的攝食損傷，且效果為劑量依賴性，dig-473表達(dá)越高，導(dǎo)致faw或rfaw引起的攝食損傷越少，對(duì)于rfaw，影響似乎更大(表14和圖3)。表14暴露于dig-465，dig-473或?qū)φ战M時(shí)的faw生物測定數(shù)據(jù)實(shí)施例9在雙子葉植物中生產(chǎn)bt殺蟲蛋白和變體擬南芥轉(zhuǎn)化.使用浸花法(weigelandglazebrook，2002)轉(zhuǎn)化擬南芥col-01。使用選定的土壤桿菌菌落接種1ml至15ml含有選擇用的適當(dāng)抗生素的yep肉湯培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在28℃220rpm的恒定攪拌下溫育過夜。使用每種培養(yǎng)物接種兩個(gè)500ml的含有適當(dāng)?shù)倪x擇用抗生素的yep肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，并將新培養(yǎng)物在28℃恒溫?cái)嚢柘聹赜^夜。將細(xì)胞在室溫下以約8700×g離心10分鐘，棄去所得上清液。將細(xì)胞沉淀輕輕重懸于500ml的滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng)基含有：1/2xmurashige和skoog鹽(sigma-aldrich)/gamborg'sb5維生素(goldbiotechnology，st.louis，mo)，10％(w/v)蔗糖，0.044μm芐氨基嘌呤(10μl/l的1mg/mldmso儲(chǔ)液)和300μl/lsilwetl-77。將大約1個(gè)月大的植物浸入該培養(yǎng)基中15秒鐘，小心地確保最新的花序被淹沒。然后將植物放倒并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，用水洗滌并豎立。植物在22℃、16:8光:暗的光周期培育。浸漬約4周后，收獲種子。擬南芥生長和選擇將新鮮收獲的t1種子在室溫下在干燥劑存在下干燥至少7天。將種子懸浮于0.1％瓊脂/水(sigma-aldrich)溶液中，然后在4℃下分層2天。為了準(zhǔn)備種植，用細(xì)小的蛭石覆蓋10.5英寸×21英寸萌發(fā)托盤(toplasticsinc.，clearwater，mn)的sunshinemixlp5(sungrohorticultureinc.，bellevue，wa))，用hoagland氏溶液(hoagland和arnon，1950)底下灌溉直到濕潤，然后排水24小時(shí)。將分層種子播種到蛭石上并蓋上保濕蓋(kordproducts，bramalea，ontario，canada)，過7天。在長白晝條件下(16:8光:暗光周期)，以120-150μmol/m2秒的光強(qiáng)度，在conviron(型號(hào)cmp4030或cmp3244；controlledenvironmentslimited，winnipeg，manitoba，canada)中在恒定溫度(22℃)和濕度(40-50％)下使種子萌發(fā)。最初用hoagland氏溶液澆灌植物，隨后用去離子水澆灌以保持土壤濕潤但不潮濕。在播種后5-6天除去保濕蓋，并用化學(xué)選擇劑噴灑植物以殺死從未轉(zhuǎn)化的種子發(fā)芽的植物。例如，如果由二元植物轉(zhuǎn)化載體提供的植物可表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因是pat或bar基因(wehrmann等人，1996)，則可以通過噴灑1000x的finale溶液(5.78％草銨膦，farnamcompaniesinc.，phoenix，az.)來選擇轉(zhuǎn)化的植物。隨后以5-7天的間隔進(jìn)行兩次噴灑。在最終噴灑7-10天之后確定存活者(活躍生長的植物)，并移植到準(zhǔn)備有sunshinemixlp5的盆中。將移植的植物用保濕蓋覆蓋3-4天，并在上述生長條件下置于conviron培養(yǎng)箱中。雙子葉植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，當(dāng)使用其他植物可表達(dá)的選擇標(biāo)記基因(例如除草劑耐受基因)時(shí)，其它選擇轉(zhuǎn)化植物的方法是可用的。實(shí)施例10包含dig蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆如本領(lǐng)域所知的，包括例如通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生10-20株轉(zhuǎn)基因t0大豆植物，這些植物攜帶包含cry1ca蛋白核酸的表達(dá)載體。將成熟的大豆(glycinemax)栽培種種子用氯氣過夜滅菌16個(gè)小時(shí)。用氯氣滅菌之后，將種子置于開放容器中，放置在laminartm層流罩內(nèi)，以驅(qū)散氯氣。接著，使用黑盒在24℃黑暗中用無菌h2o使滅菌后的種子吸漲16小時(shí)。分割的大豆種子的準(zhǔn)備包含部分胚軸的分割的大豆種子的規(guī)程要求準(zhǔn)備大豆種子材料，使用固定在手術(shù)刀上的#10刀片，沿著種子的種臍縱向切割大豆種子材料，以分離和除去種皮，并將種子分割成兩個(gè)子葉部分。仔細(xì)地部分除去胚軸，其中大約1/2–1/3的胚軸保留附著于子葉的節(jié)端(nodalend)。接種然后將含有胚軸的部分的分割的大豆種子浸沒在含有包含dig蛋白的雙元質(zhì)粒的根癌土壤桿菌菌株(例如eha101或eha引物105)的溶液中約30分鐘。在浸沒包含胚軸的子葉之前，將根癌土壤桿菌溶液稀釋到終濃度為λ＝0.6od650。共培養(yǎng)接種后，在用濾紙片覆蓋的培養(yǎng)皿中讓分割的大豆種子與根癌土壤桿菌菌株在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(wang,kan.agrobacteriumprotocols.2.1.newjersey,humanapress,2006.print.)上共培養(yǎng)5天。芽誘導(dǎo)共培養(yǎng)5天后，將分割的大豆種子在液體芽誘導(dǎo)(si)培養(yǎng)基中清洗，該培養(yǎng)基的組成為：b5鹽、b5維生素、28mg/l亞鐵(ferrous)、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、100mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟和50mg/l萬古霉素(ph5.7)。然后，在芽誘導(dǎo)i(sii)培養(yǎng)基上培養(yǎng)分割的大豆種子，該培養(yǎng)基的組成為：b5鹽、b5維生素、7g/lnoble瓊脂、28mg/l亞鐵(ferrous)、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬古霉素(ph5.7)，使子葉的平側(cè)(flatside)朝上，子葉的節(jié)端浸沒在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2周后，將自經(jīng)轉(zhuǎn)化的分割大豆種子產(chǎn)生的外植體轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)ii(siii)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有sii培養(yǎng)基并補(bǔ)充6mg/l草銨膦芽伸長在siii培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，從外植體除去子葉，并通過在子葉的基部進(jìn)行切割，切出含有子葉的平齊芽墊。將來自子葉的分離芽墊轉(zhuǎn)移到芽伸長(se)培養(yǎng)基上。se培養(yǎng)基的組成為：ms鹽、28mg/l亞鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖和0.6g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、0.1mg/liaa、0.5mg/lga3、1mg/l玉米素核糖苷、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬古霉素、6mg/l草銨膦、7g/lnoble瓊脂(ph5.7)。每2周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮se培養(yǎng)基上。讓培養(yǎng)物在24℃的convirontm生長室內(nèi)，18h光照、光強(qiáng)為80-90μmol/m2sec的條件下生長。生根對(duì)于從子葉芽墊發(fā)出的伸長芽，通過在子葉芽墊基部切割伸長芽，并將伸長芽浸入1mg/liba(吲哚3-丁酸)中1-3分鐘來促進(jìn)生根。接著，將伸長芽轉(zhuǎn)移到植物生長托盤(phytatray)內(nèi)的生根培養(yǎng)基中(ms鹽、b5維生素、28mg/l亞鐵、38mg/lna2edta、20g/l蔗糖和0.59g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、7g/lnoble瓊脂，ph5.6)。培養(yǎng)在24℃、18h光周期的convirontm生長室中培養(yǎng)1-2周后，將已發(fā)根的芽轉(zhuǎn)移到有蓋的圣代杯(sundaecup)中的土壤預(yù)混物中，并放置在convirontm生長室中(型號(hào)cmp4030和cmp3244,controlledenvironmentslimited,winnipeg,manitoba,canada)的長白晝條件下(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)，光強(qiáng)為120-150μmol/m2sec，恒溫(22℃)恒濕(40-50％)，以便使小植株適應(yīng)環(huán)境。生了根的小植株在圣代杯中適應(yīng)環(huán)境數(shù)周，之后轉(zhuǎn)移到溫室中進(jìn)行進(jìn)一步的環(huán)境適應(yīng)并建立強(qiáng)壯的轉(zhuǎn)基因大豆植物。將轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行比較。比較了植物根、芽、葉和繁殖特征。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)化植物的根長度和生長模式?jīng)]有可觀察到的差異。植株特征如高度、葉數(shù)和大小、開花時(shí)間、花朵大小和外觀相似。大體上，在體外培養(yǎng)和在溫室中的土壤中，轉(zhuǎn)基因株系和沒有表達(dá)dig蛋白質(zhì)的株系之間沒有可觀察到的形態(tài)學(xué)差異。實(shí)施例11其他作物物種的轉(zhuǎn)化通過利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，基本上與美國專利7,838,733的實(shí)施例9、或pct國際專利公開號(hào)wo2007/053482的實(shí)施例12的實(shí)施例12中描述的相同的技術(shù)，用b.t.蛋白質(zhì)(帶有或不帶有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)轉(zhuǎn)化棉花蛋白質(zhì)以提供對(duì)鱗翅目昆蟲的控制。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能想到其各種修改或改變，并且這些修改或改變將被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)和所附權(quán)利要求的范圍中。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地產(chǎn)生和使用本文所述的各種毒素和多核苷酸序列。序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司j·j·希茨k·納爾瓦t·米德t·d·海伊s·y·坦a·j·埃特爾t·p·格蘭西j·m·阿姆斯特朗t·e·克拉姆k·m·馬杜里j·e·金r·m·李g·林j·李<120>cry1camutantsusefulforcontrolofinsectpests<130>70951<160>40<170>patentinversion3.5<210>1<211>1878<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的編碼區(qū)<400>1atggataacaaccccaacattaacgagtgcatcccgtacaactgcctctcgaatccagaa60gaagtgctcttggatggcgagaggatttcgactggcaacagctccatcgacatttccctc120tccttggttcagttccttgtgtctaacttcgtccctggcggtggcttccttgttggcctt180atcgacttcgtctggggaattgtccagtgggatgcgtttctggtgcagatagagcagctg240atcaacgagaggatcgctgagttcgcgagaaatgctgcaatcgccaaccttgaagggctt300ggcaacaacttcaacatctacgtggaggcgttcaaggagtgggaagaggaccctaagaat360ccagcgaccagaacgagggttatagatcggttccgcatcctcgatggccttttggagagg420gacatcccgagcttccgcatttcgggatttgaggttcctctgctctcagtctacgctcaa480gctgctaatctgcatctggccatcttgagggattcagtcatctttggcgaacgctggggt540cttacgactatcaacgtgaacgagaactacaatcggttgattcggcacatagacgagtat600gccgaccactgtgctaacacctacaataggggtctgaacaatctgccaaagtcaacgtat660caagactggataacctacaataggctcagacgggacctcactctcaccgtgctggacata720gctgccttctttccgaactacgacaaccggagatatcctattcaacccgttggtcagctc780actcgcgaggtctacaccgatcccctcatcaacttcaatccccagctgcaatcggtcgca840cagctgcccaccttcaatgtgatggaaaactcagcgatccggaatccccatctgtttgac900atacttaacaacctcactatcttcaccgattggttttcagttggacgcaacttctactgg960ggagggcacagagtgatttcaagcctcattggaggagggaacattacatcgcctatctat1020ggaagggaggccaaccaagagccaccaaggtctttcaccttcaacggtccggtgttcaga1080acacttagcaatcccacattgcgcttgctgcaacagccgtggccagcaccaccattcaat1140ctgaggggagtggagggtgtggagttctcgacgcctacaaactcctttacgtacagaggc1200agagggacagtggactcactgacagaactcccacctgaggacaactctgttcctccgagg1260gagggctactcgcaccggctttgccatgccaccttcgtccagaggtctggcacgcctttt1320ctgaccactggggttgtctttagctggactcaccgctcagcgacgctgaccaacacaatc1380gacccagagaggatcaatcagatccctctggtgaagggctttcgcgtttggggtggcaca1440agcgtgatcaccggacctggtttcactggtggggatatcctcagacgcaatacgtttggc1500gatttcgtgagccttcaagtcaacatcaattccccaatcacccagagatatcggctccgc1560ttcagatacgcctcatccagagacgcaagggtcatcgtccttactggagcagccagcacc1620ggagtcggaggccaagttagcgtcaacatgccgttgcagaaaacgatggaaatcggtgaa1680aacctcaccagcagaacctttcgctatacagatttcagcaaccctttctccttcagagcc1740aatccggacataatcggcatatccgagcagcccttgttcggtgctgggtccatctcttct1800ggcgagctgtacatcgacaagattgagatcattctcgcagatgcgactctggaggctgaa1860tcggatcttgaaaggtga1878<210>2<211>625<212>prt<213>人工序列<220><223>自合成的編碼區(qū)翻譯的<400>2metaspasnasnproasnileasnglucysileprotyrasncysleu151015serasnproglugluvalleuleuaspglygluargileserthrgly202530asnserserileaspileserleuserleuvalglnpheleuvalser354045asnphevalproglyglyglypheleuvalglyleuileasppheval505560trpglyilevalglntrpaspalapheleuvalglnilegluglnleu65707580ileasngluargilealagluphealaargasnalaalailealaasn859095leugluglyleuglyasnasnpheasniletyrvalglualaphelys100105110glutrpglugluaspprolysasnproalathrargthrargvalile115120125aspargpheargileleuaspglyleuleugluargaspileproser130135140pheargileserglyphegluvalproleuleuservaltyralagln145150155160alaalaasnleuhisleualaileleuargaspservalilephegly165170175gluargtrpglyleuthrthrileasnvalasngluasntyrasnarg180185190leuilearghisileaspglutyralaasphiscysalaasnthrtyr195200205asnargglyleuasnasnleuprolysserthrtyrglnasptrpile210215220thrtyrasnargleuargargaspleuthrleuthrvalleuaspile225230235240alaalaphepheproasntyraspasnargargtyrproileglnpro245250255valglyglnleuthrarggluvaltyrthraspproleuileasnphe260265270asnproglnleuglnservalalaglnleuprothrpheasnvalmet275280285gluasnseralaileargasnprohisleupheaspileleuasnasn290295300leuthrilephethrasptrppheservalglyargasnphetyrtrp305310315320glyglyhisargvalileserserleuileglyglyglyasnilethr325330335serproiletyrglyargglualaasnglngluproproargserphe340345350thrpheasnglyprovalpheargthrleuserasnprothrleuarg355360365leuleuglnglnprotrpproalapropropheasnleuargglyval370375380gluglyvalglupheserthrprothrasnserphethrtyrarggly385390395400argglythrvalaspserleuthrgluleuproprogluaspasnser405410415valproproarggluglytyrserhisargleucyshisalathrphe420425430valglnargserglythrpropheleuthrthrglyvalvalpheser435440445trpthrhisargseralathrleuthrasnthrileaspprogluarg450455460ileasnglnileproleuvallysglypheargvaltrpglyglythr465470475480servalilethrglyproglyphethrglyglyaspileleuargarg485490495asnthrpheglyaspphevalserleuglnvalasnileasnserpro500505510ilethrglnargtyrargleuargpheargtyralaserserargasp515520525alaargvalilevalleuthrglyalaalaserthrglyvalglygly530535540glnvalservalasnmetproleuglnlysthrmetgluileglyglu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