賦予玉蜀黍?qū)τ衩赘x(chóng)i的抗性的組合物和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/703,396的權(quán)益以及 2013年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/781，057的權(quán)益，將這兩篇專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi) 容以引用的方式并入本文。
[0003] 序列表的引用
[0004] 序列表作為于2013年9月19日創(chuàng)建的名為"BB2189PCT_Sequences_Listing"的 文本文件于2013年9月20日提交，大小為83, 193字節(jié)，特此根據(jù)37 C. F. R. § 1. 52 (e) (5) 以引用方式將其并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，并且具體而言，涉及可用于玉蜀黍植物中以賦予 對(duì)玉米根蟲(chóng)的抗性的重組DNA構(gòu)建體。
【背景技術(shù)】
[0006] 根葉甲屬（Diabrotica)甲蟲(chóng)的三個(gè)物種的幼蟲(chóng)形式即西部玉米根蟲(chóng) (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根蟲(chóng)(Diabrotica barberi Smith 和 Diabrotica barberi Lawrence)和南部玉米根蟲(chóng)（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)代表了美國(guó)中西部的嚴(yán)重玉米昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。大約3000萬(wàn)英畝（120, OOOkm2) 的玉米（總共種植8000萬(wàn)英畝）受玉米根蟲(chóng)的侵?jǐn)_，美國(guó)農(nóng)業(yè)部估計(jì)玉米根蟲(chóng)的幼蟲(chóng)可每 年引起大約10億美元的損失。
[0007] 有許多不同的管理措施針對(duì)玉米根蟲(chóng)的控制，包括玉米品種選擇、提早種植、殺蟲(chóng) 劑、輪作以及使用轉(zhuǎn)基因玉米品種；然而，沒(méi)有一種就其本身而言已被證實(shí)可有效管理害 蟲(chóng)。還另外存在復(fù)雜的情況，即玉米根蟲(chóng)昆蟲(chóng)已顯示出明顯的進(jìn)化出對(duì)若干控制措施（包 括殺蟲(chóng)劑、栽培措施以及已引入植物中的抗性基因）的抗性的能力。
[0008] 因而，仍不斷需要可納入進(jìn)一體化害蟲(chóng)管理策略中的新的玉蜀黍中的玉米根蟲(chóng)抗 性機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 提供了在玉蜀黍植株中提高對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)植食性的抗性的方法，其中編碼CRWl的 多核苷酸在玉蜀黍植株中表達(dá)。
[0010] 還提供的是鑒定ZmCrwl (或ZmCRWl)的給予玉蜀黍植株提高的對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)植食性 的抗性的變體并然后進(jìn)一步將該變體引入進(jìn)玉蜀黍植株中的方法。該變體可通過(guò)基因改組 實(shí)驗(yàn)鑒定或者可以是通過(guò)連鎖作圖（linkage mapping)或全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定的天然存 在的等位基因變體?；蚋慕M引起的變體可通過(guò)轉(zhuǎn)基因引入進(jìn)玉蜀黍植株中以給予它們提 高的抗性，而使用本文給出的方法鑒定的等位基因變體可使用分子育種摻入進(jìn)玉蜀黍植株 中。 toon] 在一些實(shí)施例中，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是鞘翅目昆蟲(chóng)。在其它實(shí)施例中，鞘翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng) 屬于根葉甲屬。在其他實(shí)施例中，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是玉米根蟲(chóng)，包括但不限于，西部玉米根蟲(chóng) (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根蟲(chóng)（Diabrotica barberi Smith 和 Diabrotica barberi Lawrence)和 / 或南部玉米根蟲(chóng)（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)〇
[0012] 在一些實(shí)施例中，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)。在其它實(shí)施例中，鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是歐 洲玉米螟。
[0013] 還提供了分離的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重組構(gòu)建體以及含有所述重組構(gòu) 建體的植物細(xì)胞。
[0014] 附圖和序列表的說(shuō)明
[0015] 由以下的"【具體實(shí)施方式】"及構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的附圖和序列表可以更完全地 理解本公開(kāi)。
[0016] 圖1示出了從葉取食選擇測(cè)定法獲得的結(jié)果，在該測(cè)定法中，將西部玉米根蟲(chóng) (WCR)甲蟲(chóng)放在具有來(lái)自玉蜀黍crwl-Ac突變株的葉子和來(lái)自其野生型親緣株的葉子的盒 子中。結(jié)果代表9份生物樣品的平均值。
[0017] 圖2示出了玉蜀黍Crwl基因、crwl-Ac突變株系中的突變的位置以及公共的多樣 性株系Cd 09和NC316中的插入位置的示意圖。
[0018] 圖3繪出了 Crwl突變植株（MT)和野生型（WT)植株響應(yīng)機(jī)械創(chuàng)傷（"機(jī)械創(chuàng)傷"） 和秋粘蟲(chóng)毛蟲(chóng)（Fall Armyworm caterpillar)反合（"反合（Regurgitant)"）的茉莉酸 (JA)的定量。與野生型植株（WT)相比Crwl突變植株積累較高水平的JA，但僅響應(yīng)所施加 的應(yīng)激。
[0019] 圖4繪出了來(lái)自Crwl突變植株（MT)和野生型植株（WT)的幼葉和成葉的對(duì)香豆 酸和阿魏酸水平的差異。
[0020] 圖5繪出了 Crwl突變植株（MT)和野生型植株（WT)的葉木質(zhì)素含量的差異。
[0021] 圖6A-6C示出了來(lái)自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-Ac突變等位基因 的比對(duì)，該突變等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac轉(zhuǎn)座子而得到的。外顯子1 中的8bp插入（加框顯示）導(dǎo)致預(yù)測(cè)的肽鏈在插入位點(diǎn)處過(guò)早終止。
[0022] 圖7A-7C示出了來(lái)自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-CO 09等位基因 的比對(duì)。該crwl-CO 09等位基因與其野生型親緣株相比，在外顯子2中添加了 Ibp的插入 和兩個(gè)其他的bp變化（參見(jiàn)圖7A中的箭頭，其指示插入以及bp變化的位置）。在外顯子 2中插入Ibp導(dǎo)致CRWl肽的過(guò)早終止。
[0023] 圖8A-8C示出了來(lái)自野生型親緣株的Crwl的cDNA序列與crwl-NC316等位基因 的比對(duì)。該crwl-NC316等位基因具有Ibp插入（參見(jiàn)圖8A中的箭頭）并在第二外顯子中 具有45bp插入。該Ibp插入的存在導(dǎo)致在45bp插入的位點(diǎn)處出現(xiàn)過(guò)早終止密碼子。
[0024] 圖 9A-9L 示出了 SEQ ID NO :3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比對(duì)。當(dāng)某個(gè)位置處的所有殘基匹配共有序 列的殘基時(shí)，則顯示該殘基；否則顯示為另外，精確匹配共有序列的殘基加框顯示。
[0025] 圖10示出了圖9A-9L中所示的多肽的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)和趨 異值（divergence value) 〇
[0026] 圖 11 示出了 Tl 植株中事件 #8909. 102. I. 17. 4 的 RT-PCR 結(jié)果。
[0027] SEQ ID NO :1是野生型玉米（Zea mays)基因組Crwl的核苷酸序列。
[0028] SEQ ID NO :2是野生型玉米Crwl (ZmCrwl) cDNA的編碼區(qū)的核苷酸序列。
[0029] SEQ ID NO :3是野生型玉米CRWl (CRWlZmCRWl)蛋白的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO :4是突變crwl-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0031] SEQ ID NO :5是突變crwl-Ac等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO :6是來(lái)自玉蜀黍近交系C0109的Crwl cDNA(crwl-C0109)的核苷酸序 列。
[0033] SEQ ID NO :7是SEQ ID NO :6編碼的多肽的氨基酸序列。
[0034] SEQ ID N0:8是來(lái)自玉蜀黍近交系NC316的Crwl cDNA(crwl-NC316)的核苷酸序 列。
[0035] SEQ ID NO :9是SEQ ID NO :8編碼的多肽的氨基酸序列。
[0036] SEQ ID NO : 10是來(lái)自水稻（Oryza sauva)的次生壁NAC轉(zhuǎn)錄因子2的氨基酸序 列（UniProt 條目 G3M8D2)。
[0037] SEQ ID NO :11是來(lái)自水稻的推定的NAM蛋白（0sNAC7)的氨基酸序列（標(biāo)識(shí)符 0s06g04090.1 ;UniProt 條目 Q9SNM6)。
[0038] SEQ ID NO :12是來(lái)自高粱（Sorghum bicolor)的推定的未表征的蛋白的氨基酸 序列（標(biāo)識(shí)符 Sb07g001550.1 ;UniProt 條目 C5YM23)。
[0039] SEQ ID NO :13是來(lái)自高粱的推定的NAM蛋白的氨基酸序列（標(biāo)識(shí)符 Sbl0g002120.1 ;UniProt 條目 Q5NKS7)。
[0040] SEQ ID NO :14是來(lái)自中國(guó)栽培大豆（Glycine max)的未表征的蛋白的氨基酸序 列（標(biāo)識(shí)符 Glymal6g02200.1 ;UniProt 條目 I1MKD6)。
[0041] SEQ ID N0:15是來(lái)自中國(guó)栽培大豆的未表征的蛋白的氨基酸序列（標(biāo)識(shí)符 Glyma07g05660.1 ;UniProt 條目 I1KHQ4)。
[0042] SEQ ID NO :16是來(lái)自擬南芥（Arabidopsis thaliana)的含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白43 的氨基酸序列（標(biāo)識(shí)符At2g46770.1 ;UniProt條目Q84WP6)。
[0043] SEQ ID NO :17是來(lái)自擬南芥的含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白12的氨基酸序列 (Atlg32770.1 ;UniProt 條目 Q9LPI7)。
[0044] SEQ ID NO : 18是來(lái)自擬南芥的含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白66的氨基酸序列（標(biāo)識(shí)符 At3g61910.1 ;UniProt 條目 Q9M274)。
[0045] SEQ ID NO : 19是來(lái)自玉米的次生壁NAC轉(zhuǎn)錄因子2的氨基酸序列（UniProt條目 B4FPS5)
[0046] SEQ ID NO :20是來(lái)自玉米的推定的NAM蛋白的氨基酸序列（UniProt條目 Q5NKQ3)〇
[0047] SEQ ID NO :21 是來(lái)自二糖短柄草（Brachypodium distachyon)的含 NAC 結(jié)構(gòu)域 的蛋白43樣的氨基酸序列（NCBI Gl No. 357139497,本文中稱(chēng)為BdCRWl)。
[0048] SEQ ID NO :22是來(lái)自葡萄（Vitis vinifera)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序 列（UniProt 條目 F6HU82)。
[0049] SEQ ID NO :23是來(lái)自中國(guó)栽培大豆的含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白43樣的氨基酸序列 (NCBI Gl No. 356522480,本文中稱(chēng)為 GmCRWl)。
[0050] SEQ ID NO :24是來(lái)自陸地棉（Gossypium hirsutum)的含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白的氨 基酸序列（UniProt條目G4V2G0)。
[0051] SEQ ID NO :25是來(lái)自蘋(píng)果（Pyrus malus)的NAC結(jié)構(gòu)域類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子（NAC12)的 氨基酸序列（UniProt條目D9ZJ90)。
[0052] SEQ ID NO :26是來(lái)自大麥（Hordeum vulgare)的預(yù)測(cè)的蛋白的氨基酸序列 (UniProt 條目 F2DV83)。
[0053] SEQ ID NO :27是來(lái)自擬南芥的NAM樣蛋白的氨基酸序列（NCBI Gl No. 3510262 ; UniProt 條目 Q84WP6)。
[0054] SEQ ID NO :28和SEQ ID NO :29分別是有義鏈引物和反義鏈引物，用于從玉蜀黍 基因組DNA擴(kuò)增Crwl片段。
[0055] SEQ ID NO :30是引物phn 11317的核苷酸序列，其為該轉(zhuǎn)基因的UBI啟動(dòng)子 5' UTR區(qū)中的引物。
[0056] SEQ ID NO :31是引物phnl40720的核苷酸序列，其位于Crwl-3<端并且包括終止 密碼子。
[0057] SEQ ID NO :32是引物phnl40719的核苷酸序列，其為Crwl的Y端中的引物。
[0058] 本申請(qǐng)隨附的序列說(shuō)明和序列表符合美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)37 C. F. R. § 1. 821 1. 825中 設(shè)定的關(guān)于專(zhuān)利申請(qǐng)中的核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的指導(dǎo)規(guī)則。
[0059] 該序列表含有遵照Nucleic Acids Res.(《核酸研宄》）13 :3021 3030(1985)中和 Biochemical J.(《生物化學(xué)雜志》）219 (No. 2) :345 373(1984)中描述的 IUPAC IUBMB 標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行定義的核苷酸序列字符的單字母代碼和氨基酸的三字母代碼，將所述文獻(xiàn)以引用方 式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合37 C.F.R. § 1.822中設(shè)定 的規(guī)則。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
[0061] 本文中和隨附的權(quán)利要求書(shū)中所用名詞形式上為單數(shù)，但包括復(fù)數(shù)指代，除非上 下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及"植物（植株）"則包括多株此類(lèi)植物（植株）， 提及"細(xì)胞"則包括一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
[0062] 如本文所用：
[0063] 術(shù)語(yǔ)"單子葉植物"和"單子葉的植物"在本文可互換使用。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"雙子葉植物"和"雙子葉的植物"在本文可互換使用。
[0065] 術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)互補(bǔ)序列"和"全長(zhǎng)的互補(bǔ)序列"在本文可互換使用，是指給定核苷酸 序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是 100 %互補(bǔ)的。
[0066] "表達(dá)序列標(biāo)簽"（"EST"）是源自cDNA文庫(kù)的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄 的序列。EST通常通過(guò)cDNA插入片段的單程測(cè)序（single sequencing pass)獲得。將完 整的cDNA插入片段的序列稱(chēng)為"全長(zhǎng)插入片段序列"（"FIS"）。"重疊群（Contig) "序列 是由可選自但不限于EST、FIS和PCR序列的兩種或更多種序列裝配成的序列。