本發(fā)明是在政府支持下在由美國國家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的ca43460和ca62924下進(jìn)行。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。本發(fā)明涉及癌癥的領(lǐng)域。具體來說，它涉及癌癥治療。
背景技術(shù)：
：：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)為在微衛(wèi)星中測序錯(cuò)誤的累積。這在具有dna錯(cuò)配修復(fù)的缺陷的腫瘤中出現(xiàn)。msi存在于lynch綜合癥，這是使患者傾向于結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、卵巢癌、小腸癌、肝癌、肝膽癌、上泌尿道癌、腦癌和前列腺癌的遺傳性癌癥綜合癥。msi還存在于10％至20％的散發(fā)性結(jié)腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、壺腹癌和子宮內(nèi)膜癌。在0.3％和13％之間的胰腺癌還報(bào)告為msi。在控制腫瘤轉(zhuǎn)化的外生長中完整免疫監(jiān)測的重要性已知道數(shù)十年。累積的證據(jù)顯示在癌癥組織中的腫瘤-浸潤淋巴細(xì)胞(til)和各種惡性病的較好預(yù)后之間的相關(guān)性。具體來說，cd8+t細(xì)胞的存在和cd8+效應(yīng)t細(xì)胞/foxp3+調(diào)節(jié)t細(xì)胞的比率似乎與實(shí)體惡性病(如卵巢癌、結(jié)腸直腸癌和胰腺癌、肝細(xì)胞癌、惡性mel和rcc)的改善的預(yù)后和長期存活率相關(guān)。til可離體擴(kuò)增和重新注入，誘導(dǎo)癌癥如黑素瘤的持久目標(biāo)腫瘤應(yīng)答。pd-1受體-配體相互作用為由腫瘤劫持的主要路徑以抑制免疫控制。在健康條狀況下在活化t細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的pd-1的正常功能下調(diào)不需要的或過度的免疫應(yīng)答，包括自體免疫反應(yīng)。用于pd-1的配體(pd-l1和pd-l2)組成性表達(dá)或可在各種腫瘤中誘導(dǎo)。pd-1配體結(jié)合到pd-1抑制通過t細(xì)胞受體觸發(fā)的t細(xì)胞活化。pd-l1在各種非造血組織上，最顯著地在血管內(nèi)皮上以低水平表達(dá)，而pd-l2蛋白僅在淋巴組織或慢性發(fā)炎性環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的抗原呈遞細(xì)胞上可檢測地表達(dá)。pd-l2被認(rèn)為控制在淋巴器官中的免疫t細(xì)胞活化，而pd-l1用以減弱在外周組織中的不必要的t細(xì)胞功能。雖然健康器官表達(dá)極少(如果存在)pd-l1，但是證實(shí)多種癌癥表達(dá)充足水平的此t細(xì)胞抑制劑。在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)的pd-l1(和較小程度的pd-l2)已發(fā)現(xiàn)與各種癌癥類型的較差預(yù)后和存活率相關(guān)，所述癌癥類型包括腎細(xì)胞癌(rcc)、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌(nsclc)。此外，pd-1已被推薦調(diào)節(jié)在患有惡性mel的患者中腫瘤特異性t細(xì)胞擴(kuò)增。觀察的臨床預(yù)后與多種癌癥的pd-l1表達(dá)的相關(guān)性表明pd-1/pd-l1路徑在腫瘤免疫逃避中起重要作用，并且應(yīng)被視為用于治療性干預(yù)的有吸引力的目標(biāo)。免疫檢查點(diǎn)如細(xì)胞毒素t-淋巴細(xì)胞抗原-4(ctla-4)和程序性死亡-1(pd-1)的阻斷示出患有癌癥的患者的前景。ctla-4和pd-1在活化的t細(xì)胞上上調(diào)并且向進(jìn)行活化的t細(xì)胞提供抑制信號。在這些受體處導(dǎo)入的抑制抗體已經(jīng)示出破壞免疫耐受并且促進(jìn)抗腫瘤免疫力。mk-3475為針對pd-1的人類化單克隆igg4抗體并且示出在包括黑素瘤和非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的多種腫瘤類型中的活性。先前，不同pd-1阻斷抗體、bms-936558、完全人類化單克隆igg4抗體的活性還示出在黑素瘤、nsclc中的活性和在患有結(jié)腸直腸癌的單個(gè)患者中的完全應(yīng)答。mk-3475(先前被稱為sch900475)為被設(shè)計(jì)成直接阻斷pd-1和其配體，pd-l1和pd-l2之間的相互作用的igg4/κ同型的強(qiáng)力和高度選擇性人類化mab。mk-3475含有s228p穩(wěn)定突變并且不具有抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(adcc)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)活性。mk-3475強(qiáng)有力地增強(qiáng)在來自健康人類供體、癌癥患者和靈長類動(dòng)物的培養(yǎng)血細(xì)胞中的t淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。在使用人類供體血細(xì)胞的t細(xì)胞活化測定中，ec50在0.1nm到0.3nm的范圍內(nèi)。mk-3475還調(diào)節(jié)白介素-2(il-2)、腫瘤壞死因子α(tnfα)、干擾素γ(ifnγ)和其它細(xì)胞介素的水平?？贵w僅在抗原的存在下增強(qiáng)現(xiàn)有免疫應(yīng)答并且不非特異性活化t細(xì)胞。程序性死亡1(pd-1)路徑為抑制th1細(xì)胞毒素免疫應(yīng)答的負(fù)反饋系統(tǒng)，其如果未經(jīng)調(diào)節(jié)，那么可損壞宿主1-3。它在許多腫瘤和其周圍微環(huán)境中上調(diào)。借助pd-1或其配體的抗體阻斷此路徑已導(dǎo)致在患有許多不同癌癥類型的一些患者中顯著臨床應(yīng)答，所述癌癥類型包括黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌和霍奇金氏淋巴瘤4-10。在腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞的表面上pd-1的配體(pd-l1或pd-l2)的表達(dá)為重要的但不是用于對pd-1阻斷的應(yīng)答的決定性預(yù)測生物標(biāo)記4,6-8,11。我們被啟發(fā)，在人類腫瘤中的pd-1阻斷的影響的報(bào)告中，與很大比例的患有黑素瘤、腎細(xì)胞癌和肺腫瘤的患者相比，33位結(jié)腸直腸癌(crc)患者中的僅一位對此治療響應(yīng)10，12。關(guān)于此單個(gè)患者的不同是什么？我們假設(shè)此患者具有mmr缺陷，因?yàn)閙mr缺陷在小部分的晚期crc中出現(xiàn)，13，14在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變可通過患者自身的免疫系統(tǒng)識別，15并且mmr缺陷癌癥具有比mmr活性crc多10倍到100倍體細(xì)胞突變。16-18此外，mmr缺陷癌癥含有顯著的淋巴細(xì)胞浸潤，與免疫應(yīng)答一致19-22。并且在topalian等人10研究中大部分響應(yīng)于pd-1阻斷的腫瘤類型中的兩種具有高數(shù)量的體細(xì)胞突變，由于暴露于香煙煙霧(肺癌)或uv輻射(黑素瘤)23，24。我們的假設(shè)為恰當(dāng)?shù)模喉憫?yīng)于pd-1阻斷的單個(gè)crc患者的腫瘤為mmr缺陷。25因此我們假設(shè)mmr缺陷腫瘤比mmr活性腫瘤更響應(yīng)于pd-1阻斷。為了測試此假設(shè)，我們開始階段2臨床試驗(yàn)以評估在其腫瘤具有或不具有mmr缺陷的患者中的免疫檢查點(diǎn)阻斷。因?yàn)樵谀[瘤中的mmr缺陷通過兩個(gè)路線產(chǎn)生26-28，所以我們招募患有遺傳非息肉病結(jié)腸直腸癌(hnpcc，也被稱為lynch綜合癥)的患者，所述hnpcc由在四個(gè)mmr基因中的一個(gè)中的遺傳性生殖系缺陷接著在剩余野生型等位基因中第二失活軀體改變產(chǎn)生。我們還招募患有散發(fā)性mmr缺陷腫瘤的患者，其中mmr基因的兩個(gè)等位基因通過體細(xì)胞突變或通過表觀遺傳沉默而失活29。在任一情況下，產(chǎn)生的腫瘤具有數(shù)百或數(shù)千突變16，18。在所屬領(lǐng)域中存在持續(xù)需要來改進(jìn)癌癥治療使得患者的生命不被削減并且因此生活品質(zhì)不下降。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，提供一種治療癌癥患者的方法。癌癥患者具有高突變負(fù)荷，如在微衛(wèi)星不穩(wěn)定癌癥(msi)中發(fā)現(xiàn)。向癌癥患者投予免疫檢查點(diǎn)抑制抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供一種治療癌癥患者的方法。測試來自癌癥患者的樣品的一種或多種微衛(wèi)星標(biāo)記，其選自由以下組成的群組：bat-25、bat-26、mon0-27、nr-21、nr-24、pentac和pentad，并且測定具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。癌癥選自由以下組成的群組：結(jié)腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胰腺癌和前列腺癌。向癌癥患者投予抗pd-1抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于對人類的腫瘤進(jìn)行分類的方法。測試來自人類的樣品以評估一種或多種微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性。在樣品中測定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。腫瘤被標(biāo)識為用于用免疫檢查點(diǎn)抑制抗體治療的良好候選物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，提供一種用于對人類的腫瘤進(jìn)行分類的方法。測試來自人類的樣品以評估一種或多種微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性。測定在樣品中的微衛(wèi)星穩(wěn)定性。腫瘤被標(biāo)識為用于用免疫檢查點(diǎn)抑制抗體治療的不良候選物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本說明書后將顯而易見的這些和其它實(shí)施例提供所屬領(lǐng)域中用于治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定的癌癥的方法。附圖說明圖1a至圖1b.對派立珠單抗的臨床應(yīng)答。(圖1a)生物化學(xué)應(yīng)答。測量血清蛋白生物標(biāo)記水平，其中每個(gè)循環(huán)和值表示從基線改變的百分比。如果基線腫瘤標(biāo)記值大于正常值上限，那么包括患者。ca-125用于患有子宮內(nèi)膜癌的患者；ca19-9用于一種膽管癌和一種壺腹癌；以及cea用于所有其它患者。綠色、紅色和黑色線分別表示患有mmr缺陷crc、mmr活性crc和mmr缺陷非crc的患者。(圖1b)放射應(yīng)答。每隔一定間隔測量腫瘤應(yīng)答并且值示出每個(gè)可測量腫瘤的最長直徑的總和(sld)從基線測量的最好的分率改變。圖2a至圖2d.根據(jù)mmr狀態(tài)派立珠單抗的臨床益處?？ㄆ仗m-邁耶曲線(kaplan-meiercurves)示出(圖2a)結(jié)腸直腸癌群體的無進(jìn)展存活期，(圖2b)結(jié)腸直腸癌群體的總體存活期，(圖2c)患有除結(jié)腸直腸外的mmr缺陷癌癥的患者的無進(jìn)展存活期(中值pfs＝5.4個(gè)月；95％ci，3％到不可估計(jì))，和(圖2d)患有除結(jié)腸直腸癌外的mmr缺陷癌癥的患者的整體存活期。在患有mmr缺陷腫瘤(crc和非crc)兩個(gè)群體中，未達(dá)到中值總體存活期。在患有mmr活性癌癥的群體中的患者具有2.2個(gè)月的中值pfs(95％ci1.4％到2.8％)和5.0個(gè)月的中值os(95％ci3.0到不可估計(jì))。圖3(圖s2.)放射應(yīng)答的蛛網(wǎng)圖。每隔一定間隔測量腫瘤應(yīng)答并且值示出每個(gè)可測量腫瘤的最長直徑的總和(sld)從基線測量的百分比改變。只有如果可獲得基線和在研究的治療掃描，那么才包括患者。綠色和紅色分別表示患有mmr缺陷crc和mmr活性crc的患者。藍(lán)色表示患有除crc外的mmr缺陷癌癥的患者。圖4a至圖4b(圖s3).在加入研究之前mmr活性crc和mmr缺陷crc具有可比的轉(zhuǎn)移性疾病的治療和持續(xù)時(shí)間。關(guān)于此派立珠單抗研究的(圖4a)緊接在加入研究之前治療時(shí)間(hr0.81，95％ci0.38到1.752，p＝.60)和(圖4b)在加入之前轉(zhuǎn)移性疾病的持續(xù)時(shí)間(hr1.13，95％ci0.49到2.62，p＝.78)的卡普蘭-邁耶估計(jì)在mmr缺陷crc群體和mmr活性crc群體之間為可比的。在治療難治性crc群體中期望之前治療的短持續(xù)時(shí)間。圖5(圖s4.)生物化學(xué)應(yīng)答的瀑布圖。測量血清蛋白生物標(biāo)記水平，其中每個(gè)循環(huán)和值表示從基線改變的最好百分比。如果基線腫瘤標(biāo)記值大于正常值上限，那么包括患者。ca-125用于患有子宮內(nèi)膜癌的患者；ca19-9用于1種膽管癌和1種壺腹癌；以及cea用于所有其它患者。綠色和紅色分別表示患有mmr缺陷crc和mmr活性crc的患者。藍(lán)色表示患有除crc外的mmr缺陷癌癥的患者。圖6a至圖6b(圖s5.)在mmr缺陷腫瘤和mmr活性腫瘤中的體細(xì)胞突變。每個(gè)腫瘤的總體細(xì)胞突變通過腫瘤的外顯子組測序識別并且匹配正常dna(圖6a)和與客觀應(yīng)答的相關(guān)性(圖6b)(非參數(shù)威爾科克森(wilcoxon)測試，p＝0.007和用于趨勢的jonckheere-terpstra測試，p＝0.02)。圖7(圖s6).cd8的免疫組織化學(xué)和pd-l1表達(dá)。從mmr缺陷crc(受試者#16，頂部)和mmr活性crc(受試者#3，底部)的侵襲性前緣(黃色虛線)。黃色虛線分離腫瘤(t)和正常(n)組織。在mmr缺陷腫瘤(上圖)患者中存在pd-l1(藍(lán)色箭頭)和cd8(棕色點(diǎn))的顯著表達(dá)，而在mmr活性腫瘤(下圖)中存在任一標(biāo)記的極少表達(dá)。在用cd8(棕色點(diǎn))的抗體免疫標(biāo)記的另一mmr缺陷crc(受試者#19，頂部)和mmr活性crc(受試者#3，底部)中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)的代表性圖像。注意，在mmr缺陷腫瘤中cd8細(xì)胞的浸潤。侵襲性前緣初始放大率10×和til20×。圖8(圖s7.)在mmr缺陷和mmr活性腫瘤微環(huán)境中的cd8和pd-l1表達(dá)。t細(xì)胞密度單位為細(xì)胞/mm2的腫瘤。侵襲性前緣是指在腫瘤和正常組織的接面處的免疫細(xì)胞(til和巨噬細(xì)胞)。使用未配對的t測試獲得p值。圖9(圖s8.)派立珠單抗的cd8表達(dá)和臨床益處。在瘤內(nèi)cd8+t細(xì)胞密度(細(xì)胞/mm2)和客觀應(yīng)答之間的相關(guān)性(用于趨勢的jonckheere-terpstra測試，p＝0.02)。圖10(表s1.)免疫相關(guān)和recist應(yīng)答判據(jù)(改編自wolchok等人《臨床癌癥研究(clin.can.res.)》2009；15：7412-20)的比較。圖11(表s2.)對治療的免疫相關(guān)應(yīng)答圖12(表s4.)總體細(xì)胞突變和突變相關(guān)聯(lián)新抗原(mana)與臨床結(jié)果的相關(guān)性圖13(表s5.)免疫標(biāo)記與臨床結(jié)果的相關(guān)性具體實(shí)施方式本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)抑制劑在具有高突變負(fù)荷的腫瘤中起作用最好。此外，錯(cuò)配修復(fù)的腫瘤缺陷對特定形式的免疫治療尤其敏感，因?yàn)榇吮憩F(xiàn)型以高頻率產(chǎn)生突變的持續(xù)累積。本發(fā)明人已開發(fā)用于顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性表現(xiàn)型或其它高突變負(fù)荷的癌癥患者的治療。治療包括用于免疫檢查點(diǎn)的抑制抗體。此類檢查點(diǎn)包括pd-1、ido、ctla-4、pd-l1和lag-3。也可使用其它免疫檢查點(diǎn)?？贵w可通過方便的任何方式給藥，其包括但不限于靜脈內(nèi)輸注、口服給藥、皮下給藥、舌下給藥、眼部給藥、鼻給藥等。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)腫瘤為dna錯(cuò)配修復(fù)的缺陷，其導(dǎo)致高自發(fā)突變率和新抗原的表達(dá)的可能。此外，類似于黑素瘤，在msi陽性結(jié)腸癌中，常常存在顯著的淋巴細(xì)胞浸潤。為msi或以其它方式高突變負(fù)荷的任何腫瘤可根據(jù)本發(fā)明治療。它們可根據(jù)所屬領(lǐng)域中已知的任何方法測試msi的屬性，所述方法包括但不限于在下文實(shí)例1中所描述的。可測試一種或多種msi標(biāo)記中的任一種以測定msi表現(xiàn)型?？赏ㄟ^識別每個(gè)基因組具有至少100個(gè)、至少200個(gè)、至少300個(gè)、至少400個(gè)、至少500個(gè)、至少600個(gè)、至少700個(gè)、至少800個(gè)、至少900個(gè)、至少1000個(gè)、至少1100個(gè)、至少1200個(gè)、至少1300個(gè)、至少1400個(gè)、至少1500個(gè)或至少1600個(gè)突變的腫瘤來測試樣品的高突變負(fù)荷。高突變負(fù)荷意指相對于個(gè)人的正常組織在腫瘤中大量體細(xì)胞突變。在非msi腫瘤中的體細(xì)胞突變的平均數(shù)為約70個(gè)體細(xì)胞突變。可根據(jù)本發(fā)明測試和/或治療顯示msi表現(xiàn)型或高突變負(fù)荷的任何類型的腫瘤。這些包括但不限于結(jié)腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胰腺癌和前列腺癌。還可測試和/或治療壺腹、膽、腦的腫瘤，包括神經(jīng)膠瘤、乳房、肺、皮膚、食道、肝、腎臟、卵巢、肉瘤、子宮、子宮頸、膀胱、睪丸、口腔、舌和小腸及大腸的腫瘤。msi的測試可通過所屬領(lǐng)域中已知的任何方式實(shí)現(xiàn)?？蓽y試以下標(biāo)記中的一種或多種：五個(gè)幾乎單態(tài)單核苷酸重復(fù)標(biāo)記(bat-25、bat-26、mon0-27、nr-21和nr-24)和兩個(gè)高度多態(tài)的五核苷酸重復(fù)標(biāo)記(pentac和pentad)。在可使用的一個(gè)市售系統(tǒng)中，熒光標(biāo)記引物(標(biāo)記板)用于所有七個(gè)以上舉出的標(biāo)記的共擴(kuò)增。在擴(kuò)增之后檢測片段用于基因分型/表現(xiàn)型的分配?？蓽y試msi的樣品包括腫瘤組織以及含有從腫瘤脫落的核酸的體液。測試此類組織和體液中的腫瘤dna是眾所周知的?？墒褂玫目贵w的類型包括開發(fā)用于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的任何類型。這些可為單克隆或多克隆。它們可為全抗體的單鏈片段或其它片段，包括通過酶斷裂或重組dna技術(shù)制備的那些。它們可為任何同型，包括但不限于igg、igm、ige?？贵w可為任何物種來源，包括人類、山羊、兔、小鼠、奶牛、黑猩猩?？贵w可為人類化的或嵌合?？贵w可經(jīng)共軛或工程化以附接到另一部分，不管是治療分子還是示蹤劑分子。舉例來說，治療分子可為毒素。來自治療具有和不具有mmr的缺陷的腫瘤的派立珠單抗的少量的階段2試驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持mmr缺陷腫瘤比mmr活性腫瘤更響應(yīng)于pd-1阻斷的假設(shè)。mmr缺陷在許多癌癥中出現(xiàn)，包括結(jié)腸直腸、子宮、胃、膽道、胰腺、卵巢、前列腺和小腸的那些癌癥18,34-42?；加羞@些類型的mmr缺陷腫瘤的患者還得益于抗pd-1治療，可如其腫瘤含有其它dna修復(fù)缺陷的患者，如患有pold，pole或myh突變的那些。18，43，44mmr缺陷腫瘤刺激免疫系統(tǒng)的假設(shè)不是新想法45，并且已通過在mmr缺陷腫瘤中觀察的稠密免疫浸潤和th1相關(guān)聯(lián)細(xì)胞毒素富集環(huán)境支持。19-22,46最近的研究通過示出mmr缺陷腫瘤微環(huán)境強(qiáng)有力地表達(dá)若干免疫檢查點(diǎn)配體(包括pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3和ido)，表明其活性免疫微環(huán)境通過抵抗腫瘤去除的免疫抑制信號配衡47，改善這些傳統(tǒng)觀察結(jié)果。與mmr缺陷癌瘤相關(guān)聯(lián)的免疫浸潤在新抗原處導(dǎo)入為舊發(fā)現(xiàn)和新發(fā)現(xiàn)兩者的最可能解釋。對在黑素瘤41中的抗ctla-4和在肺癌48中的抗pd-1的較高突變負(fù)荷和較高應(yīng)答率的相關(guān)性為mana識別為內(nèi)源性抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要組成部分的想法提供另外的支持?；诋?dāng)前和先前研究的結(jié)果，我們建議大大(>20倍)增加的由mmr缺陷產(chǎn)生的突變相關(guān)聯(lián)新抗原的數(shù)目(圖12(表s4)；還在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)為用于癌癥的此基因限定子集的提高的抗pd-1應(yīng)答性的基礎(chǔ)。雖然我們對于在腫瘤中突變相關(guān)聯(lián)新抗原的數(shù)目的估計(jì)僅基于結(jié)合-親和力的經(jīng)由計(jì)算機(jī)預(yù)測，但是此建議與mmr活性腫瘤具有比mmr缺陷腫瘤少的多的淋巴細(xì)胞的浸潤的觀察一致(圖7(s6)、圖8(s7)和圖13(表s5)；在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。近來的研究49，50示出僅微小比例的預(yù)測的新表位實(shí)際在具有mhc的細(xì)胞表面上呈遞并且為內(nèi)源性t細(xì)胞應(yīng)答的目標(biāo)。似乎可能，盡管預(yù)測的突變相關(guān)聯(lián)新抗原的數(shù)目與實(shí)際突變相關(guān)聯(lián)新抗原的數(shù)目成比例，但是具有高數(shù)目的實(shí)際突變相關(guān)聯(lián)新抗原的腫瘤更可能刺激免疫系統(tǒng)以針對腫瘤起反應(yīng)。還應(yīng)考慮到引起在mmr缺陷和mmr活性腫瘤之間的抗pd-1應(yīng)答性的差異的替代機(jī)理。舉例來說，在mmr缺陷和mmr活性腫瘤中活化的不同信令路徑可產(chǎn)生可溶因子的分泌的差異，這可產(chǎn)生在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的pd-1路徑的差別活化26-28。基因差異可影響改變腫瘤相關(guān)聯(lián)自身抗原的表達(dá)的表觀遺傳差異，其繼而可改變腫瘤的抗原性。抗原特異性免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)分析以及免疫微環(huán)境的改變應(yīng)幫助限定這些因子對mmr缺陷腫瘤對pd-1抗體的顯著應(yīng)答性的相對貢獻(xiàn)。在本研究的過程期間得到若干值得注意的觀察結(jié)果。首先，在單劑量的治療之后血清蛋白生物標(biāo)記(比如cea)的改變與臨床益處一致。cea水平的降低在目標(biāo)放射證據(jù)之前若干個(gè)月；可能其它生物標(biāo)記(如循環(huán)腫瘤dna(ctdna))作為早期應(yīng)答的替代標(biāo)記還可為有益的。51，52第二，我們的結(jié)果表明腫瘤基因組的評估可幫助指導(dǎo)免疫治療。它們支持變異的數(shù)量和類型可證明適用于甚至在mmr活性癌癥中判定免疫檢查點(diǎn)抑制劑的可能效用的觀點(diǎn)41，48，53最重要的是，我們的結(jié)果顯示單獨(dú)基于基因狀態(tài)治療特定類的腫瘤的新方法：即，不考慮基礎(chǔ)腫瘤類型。以上公開內(nèi)容通常描述本發(fā)明。本文公開的所有參考文件以引用的方式明確地并入。參考以下具體實(shí)例可獲得更為徹底的理解，以下具體實(shí)例僅出于說明的目的而在本文提供，并且并不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例1msi測試msi測試已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化并且在clia認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行而不需要測定發(fā)展。存檔腫瘤樣品或新獲得的活檢體將用于測定msi。msi狀態(tài)將通過用于合格的clia認(rèn)證的免疫組織化學(xué)(ihc)或pcr類測試局部進(jìn)行?？稍u估患者將使用來自在約翰霍普金斯(johnshopkins)的普洛麥格(promega)的msi分析系統(tǒng)確認(rèn)。此測試將通過在五個(gè)幾乎單態(tài)單核苷酸重復(fù)標(biāo)記(bat-25、bat-26、mon0-27、nr-21和nr-24)中重復(fù)單元的插入或刪除測定msi狀態(tài)。在中群體a和群體c中需要至少2個(gè)msi基因座以為可評估的?；颊呖苫谄章妍湼駵y試結(jié)果被指派到新群體和/或被替換。實(shí)例2方法患者從三個(gè)參與中心招募用于此階段2研究的治療難治性進(jìn)行性轉(zhuǎn)移性癌癥患者(表1)。評估三個(gè)群體：群體a由患有mmr缺陷結(jié)腸直腸腺癌的患者構(gòu)成；群體b由患有mmr活性結(jié)腸直腸腺癌的患者構(gòu)成；以及群體c由患有除結(jié)腸直腸外的類型的mmr缺陷癌癥的患者構(gòu)成。研究監(jiān)督可在nejm.org發(fā)現(xiàn)的方案由每個(gè)場所的倫理審查委員會審批通過，并且所述研究根據(jù)赫爾辛基宣言(declarationofhelsinki)和良好臨床實(shí)踐規(guī)范的國際協(xié)調(diào)會(theinternationalconferenceonharmonizationguidelinesforgoodclinicalpractice)議進(jìn)行。在進(jìn)入研究之前所有患者提供書面知情同意書。首席顧問調(diào)查員(d.l.)和研究發(fā)起者(l.a.d.)負(fù)責(zé)研究的監(jiān)督。默克公司(merck)捐贈(zèng)研究藥物，審查方案和此手稿的最終草案。臨床研究主要通過慈善支持提供資金。研究設(shè)計(jì)此階段2試驗(yàn)使用green-dahlberg二步法設(shè)計(jì)進(jìn)行并且由上文所描述的三個(gè)并行群體組成。研究試劑，派立珠單抗(默克公司)每14天以10mg/kg靜脈內(nèi)給藥。派立珠單抗為阻斷在pd-1和其配體(pd-l1和pd-l2)之間的相互作用的igg4/κ同型的人類化單克隆抗pd-1抗體。在每個(gè)治療之前進(jìn)行安全評定。在每個(gè)循環(huán)的開始處進(jìn)行經(jīng)由血清生物標(biāo)記的測量的總腫瘤負(fù)荷的評定。在12周和其后每8周進(jìn)行放射性評定。關(guān)于臨床方案的另外的細(xì)節(jié)在實(shí)例3中提供。錯(cuò)配修復(fù)狀態(tài)的分析已知在mmr路徑中具有基因缺陷的腫瘤具有數(shù)千體細(xì)胞突變，尤其在被稱為微衛(wèi)星的重復(fù)dna的區(qū)域中。在基因組的這些區(qū)域中突變的累積被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)26-28。在腫瘤中使用來自普洛麥格的msi分析系統(tǒng)評估m(xù)mr狀態(tài)，通過選擇的微衛(wèi)星的評估當(dāng)mmr受損時(shí)序列尤其傾向于復(fù)制錯(cuò)誤26-28。參見額外細(xì)節(jié)的補(bǔ)充附錄?；蝮w和生物信息學(xué)分析原發(fā)性腫瘤樣品和匹配的正常外周血液試樣從患有mmr缺陷的受試者和患有mmr活性癌瘤的其他受試者的子集獲得，其中足夠的腫瘤組織可用于外顯子組測序30和hla單倍型分析。為了評估可能的突變體肽結(jié)合，與個(gè)別患者的mhci類hla單倍型組合的體細(xì)胞外顯子組數(shù)據(jù)應(yīng)用到表位預(yù)測算法31，32。此算法提供在每個(gè)腫瘤中突變相關(guān)聯(lián)新抗原的總數(shù)的估計(jì)。額外細(xì)節(jié)在補(bǔ)充附錄中提供(在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。統(tǒng)計(jì)分析群體a和群體b的主要終點(diǎn)為使用免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)(irrc)33評估的在20周時(shí)免疫相關(guān)客觀應(yīng)答率(irorr)和免疫相關(guān)無進(jìn)展存活期(irpfs)率。群體c的主要終點(diǎn)為在20周時(shí)irpfs率。免疫相關(guān)判據(jù)(即，用于評估免疫類治療的判據(jù))基于放射應(yīng)答，并且與recist判據(jù)不同，在疾病進(jìn)展之后疾病的捕獲程度；定義這些判據(jù)并且與在圖10(表s1)中的recistv1.1相比。使用recistv1.1和irrc(圖10(表s1))，評估在20周時(shí)的應(yīng)答率和pfs率并且在此研究中報(bào)告。通過卡普蘭-邁耶方法概括pfs和總體存活期。假設(shè)、拒絕虛假設(shè)的決策規(guī)則和用于有效和無效的早期停止規(guī)則以及統(tǒng)計(jì)方法的細(xì)節(jié)在補(bǔ)充附錄中提供。實(shí)例3補(bǔ)充方法患者符合參與此研究中條件為，患者必須至少18歲的年齡，具有先前治療的進(jìn)行性癌瘤的組織學(xué)上確認(rèn)證據(jù)。在入選之前所有患者進(jìn)行mmr狀態(tài)測試。所有患者具有如由實(shí)體腫瘤的應(yīng)答評估判據(jù)(recist)，版本1.1，東部腫瘤協(xié)作組(ecog)性能狀態(tài)評分為0或1定義的至少一個(gè)可測量的病變和足夠血液功能、肝功能和腎功能?；加衏rc的符合條件的患者必須已接受至少2種之前癌癥治療并且患有其它癌癥類型的患者必須已接受至少1種之前癌癥治療。排除具有未經(jīng)治療腦癌轉(zhuǎn)移、hiv病史、b型肝炎、c型肝炎、臨床上顯著腹水/積液，或自體免疫疾病的患者。研究監(jiān)督手稿的初始草案由作者的子集準(zhǔn)備并且所有作者提供最終手稿。所有作者做出決策提交用于公布的手稿。首席顧問調(diào)查員和研究發(fā)起者保證報(bào)告的數(shù)據(jù)的精確性和完整性以及對方案的遵守。hla分型hla-a、hla-b和hla-c基于序列的分型可分成三個(gè)不同步驟，如下所述。a通用、a*02特異性、b通用、b基團(tuán)特異性、c通用和c*07特異性pcr和測序混合物在jhu核心機(jī)構(gòu)中制得。celera的alleleseqrhla-b基于序列的分型試劑盒用于b通用sbt。hla-a分型流程由兩個(gè)pcr反應(yīng)，a通用和a*02特異性構(gòu)成。a通用擴(kuò)增子涵蓋部分外顯子1-部分外顯子5。a*02擴(kuò)增子涵蓋部分內(nèi)含子1-部分外顯子5。hla-b分型流程由兩個(gè)pcr反應(yīng)，b通用和b基團(tuán)特異性構(gòu)成。b通用pcr為含有涵蓋外顯子2-外顯子3和外顯子4-外顯子7的兩個(gè)pcr擴(kuò)增子的多工化反應(yīng)。b基團(tuán)特異性擴(kuò)增子涵蓋部分內(nèi)含子1-部分外顯子5。hla-c分型流程由兩個(gè)pcr反應(yīng)，c通用和c*07特異性構(gòu)成。c通用和c*07特異性擴(kuò)增子涵蓋外顯子1-7。hla-a和bpcr的特異性采用amplitaqgolddna聚合酶。geneamp高保真度酶用于hla-c和c*07pcr混合物。此酶為兩種聚合酶的混合物：amplitaqdna聚合酶(未校正聚合酶)和校正聚合酶。此酶混合物為產(chǎn)生較大全長hla-c擴(kuò)增子的高效和魯棒擴(kuò)增所必需的。pcr產(chǎn)物純化使用核酸外切酶i和蝦堿性磷酸酶進(jìn)行a通用和b通用擴(kuò)增子針對外顯子2、3、4雙向測序。c通用擴(kuò)增子針對外顯子2、3雙向測序并且針對外顯子1、4、5、6、7在單方向上測序。a*02特異性、b基團(tuán)特異性和c*07特異性擴(kuò)增子針對外顯子2、3在單方向上測序。所有測序反應(yīng)用來自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)的bigdyeterminatorv1.1進(jìn)行并且用abiprism3500xl基因分析器測序。conexiogenomic的“指派sbt(assignsbt)”等位基因分配軟件用于處理數(shù)據(jù)文件。錯(cuò)配修復(fù)狀態(tài)測試1，2將腫瘤和正常(不包括淋巴結(jié)或切除的界限)的六個(gè)載片切割(每個(gè)5微米)、去石蠟(二甲苯)，并且一個(gè)用蘇木精和曙紅(h+e)染色。含有至少20％贅生性細(xì)胞的腫瘤區(qū)域，由委員會認(rèn)證的解剖學(xué)病理學(xué)家指定，使用pinpointdna分離系統(tǒng)(加利福尼亞州爾灣的zymo研究(zymoresearch,irvine,ca))整個(gè)切下，在蛋白酶k中消化8小時(shí)并且dna使用qiaampdna迷你試劑盒(加利福尼亞州巴倫西亞的凱杰(qiagen,valencia,ca))分離。msi使用msi分析系統(tǒng)(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格(promega,madison,wi))評估，由檢測msi的5種擬單態(tài)單核苷酸重復(fù)序列(bat-25、bat-26、nr-21、nr-24和mono-27)和證實(shí)在正常和腫瘤樣品之間的標(biāo)識的2-五核苷酸重復(fù)基因座(pentac和pentad)構(gòu)成，根據(jù)制造商的說明書。在50ng至100dna的擴(kuò)增之后，在應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3130xl毛細(xì)電泳法儀器(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰(invitrogen,calsbad,ca))上測定螢光pcr產(chǎn)物尺寸。五核苷酸基因座確認(rèn)在所有情況下的標(biāo)識。對照包括作為陰性對照的水和作為陽性對照的80％生殖系dna與20％msi癌癥dna的混合物。針對每個(gè)微衛(wèi)星基因座測定堿基的尺寸，并且如果與生殖系dna相比兩種或更多種單核苷酸基因座在長度上變化，那么腫瘤稱為msi。測序分析樣品提供樣品作為進(jìn)行病理檢查以測定腫瘤細(xì)胞性的ffpe區(qū)塊或冷凍組織。整個(gè)切下腫瘤以去除受到污染的正常組織，產(chǎn)生含有>20％贅生性細(xì)胞的樣品。提供匹配的正常樣品，如血液、唾液或從手術(shù)獲得的正常組織。樣品制備和下一代測序3腫瘤和正常樣品的樣品制備、文庫構(gòu)建、外顯子組捕獲、下一代測序和生物信息學(xué)分析在個(gè)人基因組診斷公司(personalgenomediagnostics,inc.)(馬里蘭州巴爾的摩(baltimore,maryland))進(jìn)行。簡單來說，使用qiagendnaffpe組織試劑盒或qiagendna血液迷你試劑盒(加利福尼亞州的凱杰)從冷凍或福馬林固定的石蠟嵌入(ffpe)組織連同匹配的血液或唾液樣品提取dna。使來自腫瘤和正常樣品的基因體dna片段化并且根據(jù)制造商的說明書或如先前描述4用于illuminatruseq文庫構(gòu)建(加利福尼亞州圣地亞哥的伊路米那)。簡單來說，使在100微升(μl)的te中的50納克(ng)至3微克(μg)的基因體dna在covaris超聲發(fā)生器(馬薩諸塞州沃本(woburn,ma)的covaris)中片段化到150bp至450bp的尺寸。為了去除小于150bp的片段，根據(jù)制造商的說明書，dna使用以1.0比0.9的pcr產(chǎn)物與珠粒的比率的agencourtampurexp珠粒(印第安納州的貝克曼庫爾特公司(beckmancoulter,in))純化兩次并且使用70％乙醇洗滌。經(jīng)純化、片段化的dna與36μl的h2o、10μl的末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液、5的末端修復(fù)酶混合物(目錄號e6050，馬薩諸塞州伊普威治的neb(neb,ipswich,ma))混合。根據(jù)制造商的說明書，100μl末端修復(fù)混合物在20℃下培育30min，并且使用以1.0比1.25的pcr產(chǎn)物與珠粒的比率的agencourtampurexp珠粒(印第安納州的貝克曼庫爾特公司)純化并且使用70％乙醇洗滌。對于a-尾部，42μl的經(jīng)末端修復(fù)的dna與5μl的10×da加尾反應(yīng)緩沖液和3μl的klenow(胞外-)(目錄號e6053，馬薩諸塞州伊普威治的neb)混合。根據(jù)制造商的說明書，50μl混合物在37℃下培育30min，并且使用以1.0比1.0的pcr產(chǎn)物與珠粒的比率的agencourtampurexp珠粒(印第安納州的貝克曼庫爾特公司)純化并且使用70％乙醇洗滌。對于接頭連接，25μl的a-加尾dna與6.7μl的h2o、3.3μl的pe-接頭(伊路米那)、10μl的5×連接緩沖液和5μl的quickt4dna連接酶(目錄號e6056，馬薩諸塞州伊普威治的neb)混合。根據(jù)制造商的說明書，連接反應(yīng)混合物在20℃下培育15min，并且使用以1.0比0.95和1.0的pcr產(chǎn)物與珠粒的比率的agencourtampurexp珠粒(印第安納州的貝克曼庫爾特公司)純化并且使用70％乙醇洗滌。為了獲得擴(kuò)增文庫，設(shè)置每個(gè)25μl的十二個(gè)pcr，每個(gè)包括15.5μl的h2o、5μl的5×phusionhf緩沖液、0.5μl的含有每個(gè)10mmdntp的dntp混合物、1.25μl的dmso、0.25μl的illuminape引子#1、0.25μl的illuminape引子#2、0.25μl的hotstartphusion聚合酶以及2μl的dna。使用的pcr程序?yàn)椋?8℃維持2分鐘；12個(gè)循環(huán)的98℃維持15秒，65℃維持30秒，72℃維持30秒；以及72℃維持5min。根據(jù)制造商的說明書，dna使用以1.0比1.0的pcr產(chǎn)物與珠粒的比率的agencourtampurexp珠粒(印第安納州的貝克曼庫爾特公司)純化并且使用70％乙醇洗滌。根據(jù)制造商的說明書(加利福尼亞州圣克拉拉的安捷倫(agilent,santaclara,ca))使用agilentsureselectv.4試劑盒在溶液中捕獲外顯子或目標(biāo)區(qū)域。捕獲的文庫隨后用qiagenminelute柱純化試劑盒純化并且在17μl的70℃eb中洗提以獲得15μl的捕獲的dna文庫。(5)捕獲的dna文庫以以下方式擴(kuò)增：設(shè)置八個(gè)30ulpcr反應(yīng)，每個(gè)含有19μl的h2o、6μl的5×phusionhf緩沖液、0.6μl的10mmdntp、1.5μl的dmso、0.30μl的illuminape引子#1、0.30μl的illuminape引子#2、0.30μl的hotstartphusion聚合酶以及2μl的捕獲的外顯子組文庫。使用的pcr程序?yàn)椋?8℃維持30秒；14個(gè)循環(huán)(外顯子組)或16個(gè)循環(huán)(目標(biāo))的98℃維持10秒，65℃維持30秒，72℃維持30秒；以及72℃維持5min。為了純化pcr產(chǎn)物，按照制造商的說明書使用nucleospinextractii純化試劑盒(賓夕法尼亞州的macherey-nagel(macherey-nagel,pa))。使用illuminahiseq2000/2500和illuminamiseq儀器(加利福尼亞州圣地亞哥的伊路米那)進(jìn)行成對端測序，對于外顯子組文庫從片段的每個(gè)末端產(chǎn)生100個(gè)堿基并且對于目標(biāo)文庫從片段的每個(gè)末端產(chǎn)生150個(gè)堿基。下一代測序數(shù)據(jù)的主要處理和推定的體細(xì)胞突變的識別3使用用于識別匹配的腫瘤和正常樣品中的突變的variantdx定制軟件(馬里蘭州巴爾的摩的個(gè)人基因組診斷)識別體細(xì)胞突變。在稱為突變之前，使用illuminacasava軟件(v1.8)對腫瘤和正常樣品兩者進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的主要處理，包括接頭序列的掩蔽。使用needleman-wunsch方法5使用具有選擇區(qū)域的附加再比對的eland對照人類參考基因組(版本hg18)比對序列讀段。隨后使用在全部外顯子組或關(guān)注區(qū)任一者兩端的variantdx識別由點(diǎn)突變、插入和刪除構(gòu)成的候選體細(xì)胞突變。variantdx檢查腫瘤樣品對照匹配的正常的序列比對同時(shí)應(yīng)用過濾器以排除比對和測序偽影。簡單來說，應(yīng)用比對過濾器以排除在腫瘤中的質(zhì)量不合格讀段、不成對的讀段和不良映射的讀段。應(yīng)用堿基質(zhì)量過濾器以限制包括具有報(bào)告的phred質(zhì)量評分>30(對于腫瘤)和>20(對于正常)的堿基。僅當(dāng)(i)不同的成對讀段含有腫瘤中的突變；(ii)含有腫瘤中的特定突變的不同成對讀段的數(shù)目為讀段對的至少10％；(iii)錯(cuò)配堿基不存在于匹配的正常樣品中的>1％的讀段中以及不存在于衍生自dbsnp的常見生殖系變體的定制數(shù)據(jù)庫中；以及(iv)位置以>150×覆蓋在腫瘤和正常兩者中時(shí)，腫瘤中的突變被標(biāo)識為候選體細(xì)胞突變。通過搜索參考基因組識別并且排除由錯(cuò)位基因組比對產(chǎn)生的突變(包括平行同源序列)?；诨蜃⑨屵M(jìn)一步過濾候選體細(xì)胞突變以識別在蛋白編碼區(qū)中出現(xiàn)的那些。使用snpeff和使用從ucsc(https://genome.ucsc.edu/)在hg18上可獲得的最新轉(zhuǎn)錄版本的ccds、refseq和ensembl注釋的定制數(shù)據(jù)庫預(yù)測功能結(jié)果。當(dāng)獲得時(shí)，排序預(yù)測以偏好具有典型開始和終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物和在ensembl上的ccds或refseq轉(zhuǎn)錄物。最后過濾突變以排除內(nèi)含子和沉默改變，同時(shí)保持產(chǎn)生錯(cuò)義突變、無義突變、移碼或剪接位點(diǎn)變異的突變。人工目檢步驟用于進(jìn)一步去除人為改變。突變體肽mhc結(jié)合預(yù)測基于個(gè)別患者的hla單倍型對預(yù)測產(chǎn)生氨基酸改變的體細(xì)胞移碼、插入、刪除和錯(cuò)義突變分析可能的mhci類結(jié)合。我們的初始分析集中于hla-a和hla-b。氨基酸突變與其相對應(yīng)的ccds寄存編號有關(guān)，并且在其中這為不可獲得的情況下，refseq或集合轉(zhuǎn)錄用于提取蛋白序列。為了識別8mer、9mer和10mer表位，識別圍繞每個(gè)突變的氨基酸片段。通過表位預(yù)測程序netmhc3.4分析這些15、17和19突變體氨基酸片段。預(yù)測的親和力<50nm的6個(gè)表位被認(rèn)為是強(qiáng)可能結(jié)合子，并且預(yù)測的親和力<500nm的表位被認(rèn)為是弱可能結(jié)合子，如通過netmhc基團(tuán)6表明。為了進(jìn)一步改善總新抗原負(fù)荷，我們對于每個(gè)突變體肽重復(fù)對于互補(bǔ)野生型肽的相同過程。當(dāng)互補(bǔ)野生型肽預(yù)測為弱可能結(jié)合子時(shí)，隨后我們過濾為強(qiáng)可能結(jié)合子的突變體肽。這些突變體肽被稱作突變相關(guān)聯(lián)新抗原(mana)。在具有(例如情況1、17和21)單個(gè)mhc單倍型的患者不通過netmhc3.4支持的情況下，個(gè)別單倍型未包括在我們的分析中。統(tǒng)計(jì)方法試驗(yàn)的設(shè)計(jì)7此試驗(yàn)使用并行二步法設(shè)計(jì)進(jìn)行以同時(shí)評估作為對于抗pd-1治療的治療選擇標(biāo)記的mk-3475和msi的功效。它由在本文中描述的在三個(gè)患者群體中平行的二步法階段2研究組成。研究試劑(mk-3475)每14天以10mg/kg靜脈內(nèi)給藥。對于群體a和群體b中的每個(gè)，共主要終點(diǎn)在20周時(shí)為無進(jìn)展存活期(irpfs)，并且使用免疫相關(guān)判據(jù)評估客觀應(yīng)答(iror)。步降守門程序用于保存總體i型誤差。二步法green-dahlberg設(shè)計(jì)用于評估irpfs，分別在15個(gè)和25個(gè)患者之后具有過渡和最終分析。在階段1，在20周時(shí)需要15個(gè)中≥1個(gè)無進(jìn)展以繼續(xù)第二階段，并且隨后在20周時(shí)需要25個(gè)中≥4個(gè)無進(jìn)展以繼續(xù)對于iror的測試，其中25個(gè)應(yīng)答者中≥4個(gè)(ircr或irpr)表明在該群體中有前景的功效。一旦在20周時(shí)確認(rèn)≥4個(gè)無進(jìn)展和≥4個(gè)應(yīng)答，每個(gè)群體可出于功效而被終止，或一旦在階段1中在20周時(shí)15個(gè)中0個(gè)為無進(jìn)展或≥22個(gè)受試者通過20周具有疾病進(jìn)展，每個(gè)群體出于無效而被終止。此設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)檢測25％的20-周irpfs率的90％能力和檢測21％的iror率(irorr)的80％能力，具有在5％的20-周irpfs率和5％的irorr的虛假設(shè)下0.05的總體i型誤差。對于群體c，主要終點(diǎn)為在20周時(shí)的irpfs。使用二步法green-dahlberg二步法設(shè)計(jì)，在14個(gè)和21個(gè)患者之后具有過渡和最終分析；在階段1，在20周時(shí)需要14個(gè)中≥1個(gè)無進(jìn)展以繼續(xù)第二階段，其中在20周最后時(shí)21個(gè)中≥4個(gè)無進(jìn)展表明在群體c中的足夠功效。一旦確認(rèn)在20周時(shí)≥4個(gè)無進(jìn)展，所述群體可被終止。設(shè)計(jì)具有檢測25％的20-周irpfs率的81％能力，具有在5％的20-周irpfs率的虛假設(shè)下5％的i型誤差。統(tǒng)計(jì)分析使用recistv1.1和摘自wolchok等人8的免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)(irrc)評估應(yīng)答和進(jìn)展，所述免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)使用二維腫瘤測量的結(jié)果的總和并且將新型病變并入總和。在20-周時(shí)的無進(jìn)展存活期(pfs)率和irpfs率估計(jì)為在派立珠單抗開始之后在20周時(shí)為無疾病進(jìn)展并且存活的患者的比例。在20周之前具有疾病進(jìn)展或在核對研究數(shù)據(jù)時(shí)參與>20周的患者包括在用于估計(jì)20-周pfs(irpfs)率的分析中。由于毒性或惡化疾病提前退出并且因此不具有20-周腫瘤評定的患者被視為具有進(jìn)行性疾病。orr(irorr)為實(shí)現(xiàn)cr或pr(ircr或irpr)的最好總體應(yīng)答的患者的比例。在所述研究中足夠長以具有腫瘤應(yīng)答評估的患者包括在用于估計(jì)應(yīng)答率的分析中。在響應(yīng)(cr或pr)的那些中，應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間為對疾病進(jìn)展的時(shí)間的第一recist應(yīng)答的時(shí)間，并且在對于不進(jìn)展的應(yīng)答者的最后一個(gè)可評估腫瘤評定時(shí)檢查。pfs和irpfs被定義為從初始劑量的日期到疾病進(jìn)展的日期或由于任何原因死亡的日期的時(shí)間，無論哪個(gè)首先出現(xiàn)。在記錄對于存活和無進(jìn)展患者的不存在進(jìn)行性疾病的最后一個(gè)可評估腫瘤評定的日期檢查pfs和irpfs。總體存活期(os)被定義為從初始劑量日期到由于任何原因死亡的時(shí)間。對于在分析時(shí)仍然存活的患者，在已知患者存活的最后一個(gè)日期檢查os時(shí)間。通過卡普蘭-邁耶方法概括存活期時(shí)間。作為事后分析，對數(shù)秩測試用于比較群體a和群體b，并且基于cox模型估計(jì)危害比。使用標(biāo)志分析基于cox回歸模型評估在1個(gè)循環(huán)之后％cea下降與pfs或os的關(guān)聯(lián)。對于相關(guān)研究，非參數(shù)威爾科克森測試用于比較在mmr缺陷和mmr活性患者之間的突變負(fù)荷。分別使用邏輯回歸和cox回歸檢查基線突變負(fù)荷和免疫標(biāo)記對應(yīng)答和存活期時(shí)間的影響。免疫組織化學(xué)和圖像分析呈現(xiàn)b7-h1表達(dá)的膜性模式的惡性細(xì)胞的分率和在侵襲性前緣處的百分比通過如先前報(bào)告的三個(gè)病理學(xué)家(r.a.a.、f.b.和j.m.t.)定量9，10。圖像分析用于測定cd8二氨基聯(lián)苯胺(dab)染色的細(xì)胞的數(shù)目。對于每種情況使用h&e染色的載片，我們識別以下區(qū)域：i)腫瘤ii)侵襲性前緣(惡性和非惡性組織之間的邊界)，和ⅲ)正常組織。在aperioscanscopeat上以20×等效放大率(0.49微米每像素)掃描cd8染色的載片。使用aperioimagescopev12.1.0.5029在單獨(dú)的層上注釋對應(yīng)于腫瘤、侵襲性前緣和正常組織(在上方，來自h&e)的區(qū)域。使用在pip11中實(shí)施的定制算法計(jì)算在以上區(qū)域中的每個(gè)中的cd8陽性淋巴細(xì)胞密度。結(jié)果使用vips文庫12轉(zhuǎn)化成deepzoom圖像并且使用openseadragon查看器(http://openseadragon.github.io)觀測。僅用于實(shí)例3的參考文獻(xiàn)1.bacherjw，flanaganla，smalleyrl，等人。用于檢測msi高腫瘤的螢光多重測定的發(fā)展(developmentofafluorescentmultiplexassayfordetectionofmsi-hightumors)?！都膊?biāo)記(diseasemarkers)》2004；20：237-50。2.murphykm，zhangs，geigert，等人。用于測定結(jié)腸直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析系統(tǒng)和bethesda板的比較(comparisonofthemicrosatelliteinstabilityanalysissystemandthebethesdapanelforthedeterminationofmicrosatelliteinstabilityincolorectalcancers)?！斗肿釉\斷學(xué)雜志(thejournalofmoleculardiagnostics)》：jmd2006；8：305-11。3.joness，anagnostouv，lytlek，等人。用于癌癥突變發(fā)現(xiàn)和解釋的個(gè)人化基因體分析(personalizedgenomicanalysesforcancermutationdiscoveryandinterpretation)?！犊茖W(xué)翻譯醫(yī)學(xué)(sciencetranslationalmedicine)》2015；7：283ra53。4.sausenm，learyrj，joness，等人。集成的基因體分析識別在兒童癌癥神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的arid1a和arid1b變異(integratedgenomicanalysesidentifyarid1aandarid1balterationsinthechildhoodcancerneuroblastoma)?！蹲匀弧みz傳學(xué)(naturegenetics)》2013；45：12-7。5.needlemansb，wunschcd。一種適用于探索兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性的通用方法(ageneralmethodapplicabletothesearchforsimilaritiesintheaminoacidsequenceoftwoproteins)?！斗肿由飳W(xué)雜志(j.moi.biol.)》1970；48：443-53。6.lundegaardc，lamberthk，harndahlm，buuss，lundo，nielsenm。netmhc-3.0：對于長度8至11的肽的人類、小鼠和猴mhci類親和力的可接入預(yù)測的精確網(wǎng)(netmhc-3.0:accuratewebaccessiblepredictionsofhuman,mouseandmonkeymhcclassiaffinitiesforpeptidesoflength8-11)?！逗怂嵫芯?nucleicacidsresearch)》2008；36：w509-12。7.buysem，michielss，sargentdj，grotheya，mathesona，degramonta。在臨床試驗(yàn)中整合生物標(biāo)記(integratingbiomarkersinclinicaltrials)?！斗肿釉\斷學(xué)專家綜述(expertreviewofmoleculardiagnostics)》2011；11：171-82。8.wolchokjd，hoosa，o'days，等人。在實(shí)體腫瘤中的免疫治療活性的評估的指導(dǎo)原則：免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)(guidelinesfortheevaluationofimmunetherapyactivityinsolidtumors:immune-relatedresponsecriteria)。《臨床癌癥研究：美國癌癥研究協(xié)會的官方雜志(clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch)》2009；15：7412-20。9.llosanj，cruisem，tama，等人。通過多種對抗抑制檢查點(diǎn)平衡微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌的強(qiáng)免疫微環(huán)境(thevigorousimmunemicroenvironmentofmicrosatelliteinstablecoloncancerisbalancedbymultiplecounter-inhibitorycheckpoints)?！栋┌Y發(fā)現(xiàn)(cancerdiscov)》2015：43-51。10.taubejm，andersra，younggd，等人。在人類黑素細(xì)胞病變中的具有b7-h1表達(dá)的發(fā)炎性應(yīng)答的共定位支持免疫逃避的適應(yīng)性抗性機(jī)制(colocalizationofinflammatoryresponsewithb7-h1expressioninhumanmelanocyticlesionssupportsanadaptiveresistancemechanismofimmuneescape)?！犊茖W(xué)翻譯醫(yī)學(xué)(sciencetranslationalmedicine)》2012；4：127ra37。11.cukan，hempelh，sfanosk，demarzoa，cornisht。pip：用于全部載片圖像的多線程圖像分析的開放源框架(pip:anopensourceframeworkformultithreadedimageanalysisofwholeslideimages)?！秾?shí)驗(yàn)室調(diào)查(laboratoryinvestigation)》2014；94：398a-a。12.cupittj，martinezk。vips：用于大圖像的圖像處理系統(tǒng)(vips:animageprocessingsystemforlargeimages)?！峨娮映上瘢嚎茖W(xué)和技術(shù)(electronicimaging:science&technology)》；1996：光學(xué)和光子國際學(xué)會(internationalsocietyforopticsandphotonics)。第19-28頁。實(shí)例4患者41個(gè)連續(xù)患者參與并且在2013年9月和2015年1月之間治療。(表1)。招募包括追求臨床實(shí)驗(yàn)選擇的已知患有具有錯(cuò)配修復(fù)的腫瘤或患有未知狀態(tài)的腫瘤隨后測試的患者。在mmr缺陷crc群體中的一個(gè)患者在允許等級3膽紅素水平的irb合格放棄下參與?？偣?2個(gè)crc患者參與到群體a和群體b中。除已接受一個(gè)化學(xué)治療和一個(gè)(非pd1類)免疫治療療程的一個(gè)mmr活性患者以外，所有crc患者接受>2個(gè)之前化療療程(中值＝4)。診斷患有除crc外的mmr缺陷實(shí)體腫瘤的九個(gè)受試者參與到群體c。所有群體c患者接受>1個(gè)之前癌癥治療(中值＝2)。實(shí)例5主要終點(diǎn)評估對于群體a在20周時(shí)的irorr和irpfs(圖11(表s2))為40％(10個(gè)患者中的4個(gè)；95％ci，12％到74％)和78％(9個(gè)患者中的7個(gè)；95％ci，40％到97％)，并且對于群體c為71％(7個(gè)患者中的5個(gè)；95％ci，29％到96％)和67％(6個(gè)患者中的4個(gè)；95％ci，22％到96％)。在群體b中，其由患有mmr活性crc的患者組成，irorr和20-周irpfs為0％(95％ci，0％到20％)和11％(18個(gè)患者中的2個(gè)；95％ci，1％到35％)。當(dāng)在20周時(shí)四個(gè)受試者為無疾病進(jìn)展并且基于免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)觀察到四個(gè)客觀應(yīng)答時(shí)，mmr缺陷群體a和群體c兩者達(dá)到其預(yù)先確定的對于功效的提早停止規(guī)則(圖11(表s2)；在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中；以及上述補(bǔ)充方法)。對于患者的跟蹤中值時(shí)間，對于患有mmr缺陷crc的患者(群體a)為32周(范圍，5周至51周)，對于患有mmr活性crc的患者(群體b)為12周(范圍，2周至56周)，并且對于患有mmr缺陷非crc腫瘤的患者(群體c)為12周(范圍，4周至42周)?？稍u估20周irpfs的所有患者追蹤至少20周。實(shí)例6放射評估在群體a中的十個(gè)可評估m(xù)mr缺陷crc患者中，通過recist判據(jù)四個(gè)(40％；95％ci，12％至74％)實(shí)現(xiàn)客觀應(yīng)答(表2，圖1和圖3(s2))。除非患者進(jìn)行12-周掃描，否則患者被認(rèn)為不可評估。疾病控制率被定義為實(shí)現(xiàn)客觀應(yīng)答或其疾病穩(wěn)定的患者的分率，并且在群體a中為90％(10個(gè)患者中的9個(gè)；95％ci，55％至100％)。參與在群體c中的患有除crc外的mmr缺陷癌癥類型七個(gè)可評估患者中，使用recist判據(jù)，五個(gè)(71％；95％ci，29％至96％)實(shí)現(xiàn)客觀應(yīng)答(表2，圖3(s2)和圖1)并且疾病控制率為71％(7個(gè)患者中的5個(gè)；95％ci，29％至96％)。在群體c中的患者比在群體a中的患者應(yīng)答更快(通過recist的12周對28周的應(yīng)答中值時(shí)間，p＝0.03)。此外，不與lynch綜合癥相關(guān)聯(lián)的所有六種mmr缺陷腫瘤(100％)實(shí)現(xiàn)客觀應(yīng)答，而與lynch綜合癥相關(guān)聯(lián)的十一種腫瘤中僅三種(27％)響應(yīng)(表s3；p＝0.009；可在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；并且以引用的方式并入本文中)。無其它基線特征示出與客觀應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)顯著關(guān)聯(lián)。在群體b中患有mmr活性crc的18個(gè)患者中，使用recist判據(jù)未觀察到客觀應(yīng)答(表2，圖3(s2)和圖1)，并且疾病控制率為11％(18個(gè)患者中的2；95％ci，1％到35％)。通過recist判據(jù)實(shí)現(xiàn)應(yīng)答的所有患者(圖11(表2))還通過免疫相關(guān)應(yīng)答判據(jù)實(shí)現(xiàn)應(yīng)答(圖11(表s2))。實(shí)例7存活期在群體a中，患有mmr缺陷crc的患者，未達(dá)到中值無進(jìn)展存活期(pfs)和中值總體存活期(os)(圖2)。相比之下，在群體b中患有mmr活性癌癥的患者實(shí)現(xiàn)僅2.2個(gè)月的pfs(95％ci，1.4至2.8)和5.0個(gè)月的中值os(95％ci，3.0到不可估計(jì))。在群體c(mmr缺陷非crc)中，中值pfs為5.4個(gè)月(95％ci，3到不可估計(jì))并且未達(dá)到中值os。mmr缺陷和活性crc群體的事后(圖2)比較示出對于疾病進(jìn)展的危害比率(hr)(hr＝0.10；95％ci，0.03至0.37；p<0.001)和總體存活期(hr＝0.22；95％ci，0.05至1.00；p＝0.05)，有利于患有mmr缺陷crc的患者。為了評估存活期的差異是否可由于預(yù)測差異，我們測量已診斷患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者的持續(xù)時(shí)間和在入選之前關(guān)于其先前療程的患者的臨床表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)在mmr缺陷對mmr活性crc患者之間在關(guān)于其之前方案的轉(zhuǎn)移性疾病的持續(xù)時(shí)間(p＝0.77；對數(shù)秩測試)或中值pfs(p＝0.60，對數(shù)秩測試)方面不存在顯著差異(圖4(s3))。我們還進(jìn)行pfs和os的附加多變量分析以檢查調(diào)節(jié)自從初始診斷經(jīng)過的時(shí)間的在mmr缺陷crc和mmr活性腫瘤之間結(jié)果的差異。在調(diào)節(jié)此可能差異之后，對于pfs(hr0.04，95％ci0.01至0.21，p<0.001)和os(hr0.18，95％ci0.03至1.01，p＝0.05)維持危害比率的量級，其表示在mmr缺陷和活性腫瘤之間派立珠單抗的不同影響。實(shí)例8安全評定出現(xiàn)在>5％的患者中的不良事件在表3中列出。選擇不良事件包括皮疹/瘙癢(24％)、甲狀腺炎/甲狀腺功能低下/垂體炎(10％)和無癥狀的胰臟炎(15％)。雖然數(shù)量為少量的，但是甲狀腺功能異常限于mmr缺陷群體(表3)。實(shí)例9腫瘤標(biāo)記在兩個(gè)crc群體中，在入選之前的32個(gè)患者中的29個(gè)中，基線cea為可評估并且高于正常值上限(3mg/d1)。主要cea降低在十個(gè)患有mmr缺陷crc的患者中的七個(gè)中出現(xiàn)，而在19個(gè)患有mmr活性crc的患者中沒有出現(xiàn)，其中cea為可評估的(圖1和圖5(s4))。在非crcmmr缺陷患者中，在四個(gè)患者中腫瘤標(biāo)記水平(cea、ca19-9或ca-125)高于正常值上限。>70％的ca19-9或ca-125降低在這些四個(gè)患者中的三個(gè)中出現(xiàn)。所有3個(gè)群體的腫瘤標(biāo)記動(dòng)力學(xué)在圖1中示出。在1劑量(在14天和28天之間)的派立珠單抗之后cea下降的水平預(yù)測無進(jìn)展(p＝0.01)和總體存活期結(jié)果p＝0.02)兩者。cea應(yīng)答在疾病控制的放射確認(rèn)之前很好地出現(xiàn)(范圍，10周到35周)。相比之下，進(jìn)展的患者在開始治療的30天內(nèi)示出快速生物標(biāo)記上升。因此，cea水平的改變顯著在之前并且與最終放射改變相關(guān)。實(shí)例10基因體分析相較于在mmr活性患者(n＝6)中每個(gè)腫瘤73個(gè)突變，全部外顯子組序列的分析示出在mmr缺陷患者(n＝9)中每個(gè)腫瘤1,782個(gè)體細(xì)胞突變的平均值(非參數(shù)威爾科克森測試p＝0.007)(圖6a至圖6b(s5)；同樣參見表s3，其在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。預(yù)測這些突變的大部分(63％)改變氨基酸。隨后在每個(gè)患者的個(gè)別mhc單倍型的情形下評估這些突變的免疫原性可能。由此我們分別從mmr缺陷和mmr活性患者的腫瘤識別578個(gè)和21個(gè)潛在突變相關(guān)聯(lián)新抗原的平均值(表s3；其在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。在所有體細(xì)胞突變中潛在突變相關(guān)聯(lián)新抗原的分率在兩個(gè)群體中類似(在mmr缺陷和活性患者中取平均值分別為32％和29％)。高數(shù)量的體細(xì)胞突變和潛在突變相關(guān)聯(lián)新抗原與改善的無進(jìn)展存活期相關(guān)聯(lián)并且與有利于客觀應(yīng)答的趨勢相關(guān)聯(lián)(圖13(s5)和圖12(表s4)；同樣在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。實(shí)例11免疫組織化學(xué)在其中腫瘤組織可獲得的30種情況下通過免疫組織化學(xué)在腫瘤內(nèi)和在腫瘤的侵襲性前緣處評估cd8和pd-l1的表達(dá)，(圖7(s6)；同樣在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。來自群體a和群體c中的患者的腫瘤含有確實(shí)比來自群體b患者的腫瘤更大密度的cd8陽性淋巴細(xì)胞(圖8(s7)；p＝0.10)，并且cd8標(biāo)記與有助于客觀應(yīng)答和穩(wěn)定疾病的趨勢相關(guān)聯(lián)(圖9(s8)和圖13(表s5)；同樣在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》在線獲得；以引用的方式并入本文中)。此cd8陽性淋巴浸潤在腫瘤的侵襲性前緣處尤其顯著(圖8(s7)；p＝0.04)。顯著膜性pd-l1表達(dá)僅在mmr缺陷患者中出現(xiàn)并且在位于腫瘤的侵襲性前緣處的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)和腫瘤相關(guān)聯(lián)的巨噬細(xì)胞上顯著(圖8(s7)；p＝0.04)。cd8和pd-l1的表達(dá)不以統(tǒng)計(jì)方式與pfs或os相關(guān)聯(lián)(圖13(表s5))。表1.患者的人口統(tǒng)計(jì)和基線特征mmr，錯(cuò)配修復(fù)；crc，結(jié)腸直腸癌1mmr缺陷crc對mmr活性crc2ecog，東部腫瘤協(xié)作組表2.目標(biāo)recist應(yīng)答1轉(zhuǎn)化成在20周時(shí)的cr的在12周時(shí)的原始pr2在12周時(shí)一個(gè)pr3如果患者由于臨床進(jìn)展不進(jìn)行第12周掃描，那么認(rèn)為患者不可評估。4疾病控制率被定義為具有完全應(yīng)答、部分應(yīng)答或穩(wěn)定疾病維持12周或更多的患者的百分比。5對于mmr活性crc患者無應(yīng)答記錄表3.藥物相關(guān)不良事件1不良事件在大于5％的患者中出現(xiàn)2胰臟炎的所有情況為無癥狀的3一個(gè)肺炎發(fā)病率(2％)參考文獻(xiàn)所引用的每一文獻(xiàn)的公開內(nèi)容明確地并入本文中。1.nishimurah，okazakit，tanakay，等人。在pd-1受體缺陷小鼠中的自體免疫擴(kuò)張型心肌癥(aut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