美國(guó)政府利益聲明

本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)、國(guó)家癌癥研究所(nationalcancerinstitute)的計(jì)劃號(hào)ziabc010701下，在政府支持下進(jìn)行。美國(guó)政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

相關(guān)申請(qǐng)案

本申請(qǐng)案要求2014年7月31日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)案第62/031,793號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

背景技術(shù)：

本申請(qǐng)涉及結(jié)合epha4的單克隆抗體(mab)和抗原結(jié)合片段或它們的其它衍生物，以及這些抗體/片段/衍生物用語(yǔ)診斷和治療與epha4信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)有關(guān)的疾病和病狀(如腫瘤、神經(jīng)變性病癥和情緒障礙)的用途。

受體的產(chǎn)生紅血球生成素的肝細(xì)胞(eph)家族是受體酪氨酸激酶，其結(jié)合細(xì)胞膜錨定配位體并且至少在大腦、心臟、肺、肌肉、腎臟、胎盤(pán)、胰腺(fox等人,《癌基因(oncogene)》(1995)10:897)和黑色素細(xì)胞(easty等人,《國(guó)際癌癥雜志中表達(dá)(int.j.cancer)》(1997)71:1061)eph受體基于序列類(lèi)似性和其對(duì)糖基化磷脂酰肌醇連接的艾普瑞林-a(ephrin-a)配位體或跨膜結(jié)合艾普瑞林-b(ephrin-b)配位體的結(jié)合親和力分成兩個(gè)子類(lèi)，epha和ephb(分別由稱(chēng)為epha和ephb15的基因座編碼)。人類(lèi)中存在九種epha(epha1-8和epha10)。配位體與epha4的結(jié)合引起酪氨酸磷酸化并且產(chǎn)生具有src同源性2/3(sh2/sh3)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)。

epha4與若干種病變有關(guān)并且已鑒別這一受體是有前景的藥物目標(biāo)。已在治療不同病理學(xué)病狀時(shí)考慮epha4-艾普瑞林結(jié)合的調(diào)節(jié)。

舉例來(lái)說(shuō)，epha4在人類(lèi)血小板表面上表達(dá)，其在所述表面促進(jìn)血栓穩(wěn)定(prevost等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa)》(2005)102:9820-9825)。其已在不同類(lèi)型的癌細(xì)胞(ashida等人,《癌癥研究(cancerres)》(2004)64:5963-5972)以及腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(yamashita等人,《生物化學(xué)雜志(j.biolchem)》(2008)283:18926-18936)中檢測(cè)到。已證實(shí)epha4在乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌中上調(diào)(miyazaki等人,《生物醫(yī)學(xué)中心臨床病理學(xué)(bmcclinpathol)》(2013)13:19；giaginis等人,《生物醫(yī)學(xué)中心臨床病理學(xué)》(2014)14:8)。

還研究通過(guò)干擾epha/艾普瑞林-a系統(tǒng)來(lái)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病。舉例來(lái)說(shuō)，carmona等人(carmona,m.a.等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(2009)106:12524-9)檢驗(yàn)epha4抑制對(duì)谷氨酸傳遞的影響。其它研究已鑒別epha4抑制劑是用于治療肌肉萎縮性側(cè)索硬化(vanhoecke,a.等人,《自然醫(yī)學(xué)(natmed)》(2012)18:1418-1422)和脊髓損傷(goldshmit,y.等人,《科學(xué)公共圖書(shū)館綜合卷(plosone)》(2011)6:e24636)的潛在治療性候選物。eph受體對(duì)于突觸發(fā)育和突觸可塑性的調(diào)節(jié)也是重要的(klein,r.,《自然神經(jīng)科學(xué)(natneurosci)》(2009)12:15-20；pasquale,e.b.,《細(xì)胞(cell)》(2008)133:38-52)。盡管ephb通過(guò)其與nmda受體的相互相用增強(qiáng)突觸發(fā)育(sheffler-collins,s.i.和dalva,m.b,《神經(jīng)科學(xué)趨勢(shì)(trendsinneurosciences)》(2012)35:293-304；dalva,m.b.等人,(2000)《細(xì)胞》103,945-956)，但epha4(其主要在成年人海馬區(qū)中表達(dá))充當(dāng)神經(jīng)傳遞和海馬突觸可塑性的負(fù)調(diào)節(jié)劑(murai,k.k.和pasquale,e.b.，《神經(jīng)膠質(zhì)(glia)》(2011)59:1567-1578)。epha4由其配位體艾普瑞林的活化通過(guò)誘導(dǎo)受體集群和自體磷酸化來(lái)觸發(fā)正向信號(hào)傳導(dǎo)(pasquale,e.b.,《自然評(píng)論：分子細(xì)胞生物學(xué)(natrevmolcellbiol)》(2005)6:462-475)。這通過(guò)細(xì)胞周期素依賴性激酶5(cdk5)依賴性rhoa活化和細(xì)胞粘著降低引起樹(shù)突狀脊?fàn)盥∑鸬氖湛s(fu,w.y.等人,《自然神經(jīng)科學(xué)》(2007)10,67-76)。epha4還在動(dòng)態(tài)平衡可塑性期間引起突觸和表面ampa受體的移除，動(dòng)態(tài)平衡可塑性是確保神經(jīng)元輸出端在最佳范圍內(nèi)，由此提供神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性的可塑性形式(chen,y.,fu,a.k.y.和ip,n.y.,《細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(cellularsignalling)》(2012)24:606-611；fu,a.k.等人,《自然神經(jīng)科學(xué)》(2011)14:181-189)。引起關(guān)注的是，患有輕度認(rèn)知缺陷的個(gè)體呈現(xiàn)ephb和epha4表達(dá)失調(diào)(simon,a.m.等人,《阿爾茨海默病雜志(jalzheimersdis)》(2009)17:773-786)。最近，已研究epha4信號(hào)傳導(dǎo)與阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease；ad)中aβ誘導(dǎo)的突觸失效之間的關(guān)系。epha4介導(dǎo)ad中的海馬突觸功能障礙并且證實(shí)epha4的配位體結(jié)合域的阻斷可逆轉(zhuǎn)ad小鼠模型中的突觸損傷(fu,a.k.等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(2014)111:9959-9964)。

因此，將epha4視為cns的疾病和病癥以及身體中多種癌癥的重要治療目標(biāo)。本發(fā)明披露可結(jié)合人類(lèi)epha4的抗體。這些抗體可用于診斷和治療患有神經(jīng)退化性疾病(ad、pd、als、ms等)、情感障礙(如抑郁癥)以及各種癌癥形式(包括cns癌癥)的個(gè)體。一些這些適應(yīng)癥在下文更詳細(xì)地描述。這些疾病代表迫切的全球性需求，因?yàn)楫?dāng)前不存在可治療這些病狀的有效治療性干預(yù)。

阿爾茨海默病(ad)的特征在于學(xué)習(xí)力和記憶力的逐漸但進(jìn)行性衰退，并且是老年人的死亡起因。當(dāng)前，據(jù)估算全世界有3500萬(wàn)人罹患疾病，但預(yù)期由于更長(zhǎng)的平均壽命，這一數(shù)字在2050年將顯著上升到1億。不存在治愈并且疾病的病理生理學(xué)仍相對(duì)未知。存在僅四種獲fda批準(zhǔn)的可用于ad患者的藥物，但這些藥物僅緩解癥狀而非改變疾病病理學(xué)(其無(wú)法逆轉(zhuǎn)病狀或防止進(jìn)一步惡化)并且在嚴(yán)重病狀中無(wú)效。因此，早期治療性干預(yù)在ad的管理中是重要的。研究證實(shí)ad在記憶力喪失或認(rèn)知衰退的實(shí)際癥狀實(shí)際顯現(xiàn)之前很久就已經(jīng)影響大腦。然而，不存在用于早期檢測(cè)的診斷工具并且在使用當(dāng)前方法(其涉及主觀臨床評(píng)估)診斷患者患有ad時(shí)，病理學(xué)癥狀已處于晚期狀態(tài)。

帕金森病(pd)是繼ad之后的全世界第二流行的神經(jīng)退化性疾病。pd是主要影響運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的神經(jīng)退化性病癥。疾病的運(yùn)動(dòng)癥狀由黑質(zhì)(中腦區(qū)域)中產(chǎn)生多巴胺的細(xì)胞的死亡引起。最顯而易見(jiàn)的疾病癥狀與動(dòng)作有關(guān)，其包括動(dòng)作的抖動(dòng)、僵硬、緩慢，以及行走和步態(tài)困難。隨著疾病發(fā)展，思維和行為受到影響，其中癡呆通常在疾病晚期發(fā)生。抑郁癥是最常見(jiàn)的與所述疾病相關(guān)的精神癥狀。所述疾病的主要病理學(xué)標(biāo)志是α-突觸核蛋白聚集到神經(jīng)元中稱(chēng)為路易小體(lewybodies)的內(nèi)含物中，以及黑質(zhì)中產(chǎn)生多巴胺的細(xì)胞的死亡。當(dāng)前，通過(guò)臨床癥狀來(lái)診斷pd，所述癥狀包括震顫、動(dòng)作遲緩、僵硬和姿勢(shì)不平衡，因?yàn)樯袩o(wú)可用于pd的可靠診斷測(cè)試或標(biāo)記物。據(jù)估記全世界有約7百萬(wàn)人患有pd。此外，預(yù)計(jì)病例數(shù)目將由于老齡化人群而顯著增長(zhǎng)。在美國(guó)，預(yù)計(jì)pd患者的數(shù)目幾乎翻倍；但預(yù)計(jì)最大增長(zhǎng)將在亞洲的發(fā)展中國(guó)家(如中國(guó))出現(xiàn)，預(yù)計(jì)到2030年將有據(jù)估計(jì)5百萬(wàn)病例。然而，pd的實(shí)際發(fā)病率難以估計(jì)，因?yàn)橛捎谠\斷方法的局限性，所述疾病通常直到疾病進(jìn)行到晚期狀態(tài)才會(huì)被診斷。

肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)，也稱(chēng)為葛雷克氏病(lougehrig'sdisease)是最常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，其發(fā)病率是每100,000人中1-2例并且終生風(fēng)險(xiǎn)是1:800。als的特征在于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元從脊髓、腦干和大腦皮層的進(jìn)行性損失，最終在診斷后的兩到五年內(nèi)引起麻痹和死亡?；加衋ls的個(gè)體由于肌肉萎縮和肌肉痙攣、說(shuō)話(發(fā)音困難)、吞咽(吞咽困難)和呼吸(呼吸困難)困難而患有快速進(jìn)行性衰弱。盡管癥狀次序和速率在個(gè)體間不同，但最終大部分患者不能行走或使用其手掌和手臂，并且其失去說(shuō)話和吞咽其食物的能力。大部分患有als的人死于呼吸衰竭，通常在癥狀發(fā)作的三到五年內(nèi)。從發(fā)作到死亡的中值存活時(shí)間是約三年，并且僅4％的患有這一病狀的患者存活超過(guò)10年。約百分之十的als病例是由高滲透單基因疾病引起突變的家族形式引起。已鑒別一些與als的這些形式相關(guān)的特異性基因，包括超氧化歧化酶1基因sod1中的許多已知突變(pasinelli和brown,《自然神經(jīng)科學(xué)綜述(natrevneurosci)》(2006)7:710-23)。也發(fā)現(xiàn)epha4基因中的功能損失突變與肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)患者的更長(zhǎng)存活期相關(guān)(vanhoecke等人,《自然醫(yī)學(xué)》(2012)18(9):1418-22)。

多發(fā)性硬化(ms)是發(fā)炎性退化疾病，其中cns的大腦和脊髓中的髓鞘保護(hù)性神經(jīng)細(xì)胞受到免疫系統(tǒng)攻擊并且破壞，因此阻止cns內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞通信。所述疾病的特征在于多種癥狀，其可包括視力模糊、平衡缺失、協(xié)調(diào)性差、語(yǔ)言不清、震顫、麻木、極度疲勞、記憶力和注意力問(wèn)題、麻痹以及失明。不存在ms的已知的治愈病例，而臨床介入旨在改良發(fā)作之后的功能和預(yù)防新的發(fā)作。然而，當(dāng)前藥物的效力有限并且具有不良副作用。在全世界，估計(jì)約230萬(wàn)人受ms影響。然而，通?；诓≌骱桶Y狀來(lái)診斷ms，并且甚至與支持性醫(yī)學(xué)影像和實(shí)驗(yàn)室測(cè)試組合，從而難以診斷。這在癥狀不可見(jiàn)或與其它醫(yī)學(xué)病狀類(lèi)似時(shí)的早期尤其常見(jiàn)。

臨床抑郁癥是嚴(yán)重的衰弱性病癥。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization)，估計(jì)全世界有約3億5千萬(wàn)人患有嚴(yán)重抑郁癥并且其已變成世界范圍內(nèi)的功能障礙的起因。還估計(jì)在一生中，臨床抑郁癥將影響17％的人群至少一次。根據(jù)許多研究，平均發(fā)作年齡是將近30歲并且女性中報(bào)導(dǎo)臨床抑郁癥的數(shù)目是男性的約兩倍。抑郁癥是可治療的，但大部分人不接受其所需的護(hù)理和支持。此外，若干種獲fda批準(zhǔn)的藥物可用于改善抑郁癥狀。然而，病患對(duì)藥物的反應(yīng)變化并且需要更有效的治療。

鑒于與epha4信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的疾病和病狀的高發(fā)病率，存在研發(fā)可以高親和力和所需作用來(lái)結(jié)合人類(lèi)epha4的新型抗體(例如借助于其與epha4的結(jié)合來(lái)增強(qiáng)或抑制epha4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo))的顯著需要。這些抗體是用于診斷和/或治療與epha4信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)有關(guān)的多種疾病和病狀的有價(jià)值的工具。這類(lèi)疾病和病癥包括不同類(lèi)型的癌癥、神經(jīng)變性病(如阿爾茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、多發(fā)性硬化(ms)、肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)和情感障礙，如抑郁癥)。本發(fā)明解決這些和其它相關(guān)需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供新型單克隆抗體，其以高親和力和不同作用特異性結(jié)合epha4。還披露這些抗體的抗原結(jié)合片段、這些抗體的雙特異性形式以及抗體或其片段的衍生物，如這些抗體與效應(yīng)分子的結(jié)合物，包括多種融合蛋白，其包含所述抗體或片段之一。此外，披露編碼這些抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和呈融合蛋白形式的結(jié)合物的核酸。在一些實(shí)施例中，披露包括這些核酸的表達(dá)盒和載體，以及包括這些載體或盒的宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包括這些單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體、結(jié)合物、核酸和載體。在其它實(shí)施例中，這些單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體、結(jié)合物、核酸和載體具有用于鑒別和治療患有腫瘤的個(gè)體的用途。在其它實(shí)施例中，這些單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體、結(jié)合物、核酸和載體具有用于鑒別和治療患有神經(jīng)退化性病癥(如ad、pd、ms或als)的個(gè)體的用途。

在一些實(shí)施例中，經(jīng)分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包括：a)重鏈可變域，其包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；b)重鏈可變域，其包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括seqidno:7的氨基酸27-37、如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或c)重鏈可變域，其包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100，其中單克隆抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合epha4。

在其它實(shí)施例中，披露經(jīng)分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其包括：a)重鏈可變域，其包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；b)重鏈可變域，其包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括seqidno:7的氨基酸27-37、如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或c)重鏈可變域，其包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。

因此，在第一方面中，本發(fā)明提供抗epha4抗體，尤其單克隆抗體，其具有如上文所描述的重鏈(vh)和輕鏈(vl)可變域(例如seqidno:3和seqidno:6；seqidno:4和seqidno:7；或seqidno:5和seqidno:8)，尤其具有如上文指定的vh和vlcdr，或所述抗體的重鏈或輕鏈、所述抗體的結(jié)合片段、包含這類(lèi)結(jié)合片段的雙特異性抗體或其衍生物，如融合蛋白或具有另一個(gè)功能性部分的結(jié)合物，例如以便有助于檢測(cè)或提供具體生物活性。

在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段是完全人類(lèi)抗體。在一些實(shí)施例中，抗體是igg。在一些實(shí)施例中，抗原結(jié)合片段是scfv、fv、fab或f(ab)2抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體，其包含本文中所描述的抗體或抗原片段。在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段或其雙特異性抗體與效應(yīng)分子結(jié)合，所述效應(yīng)分子可以是可檢測(cè)標(biāo)記，如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗生物素蛋白、生物素或酶，或其可以是毒素或化學(xué)治療劑，如綠膿桿菌外毒素(pseudomonasexotoxin)。

在第二方面中，本發(fā)明提供多核苷酸序列，其編碼抗體或抗原結(jié)合片段或其雙特異性抗體或融合多肽結(jié)合物。任選地，聚核苷酸編碼序列可操作地連接于啟動(dòng)子，尤其異源啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，提供表達(dá)盒，其包含上述多核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，聚核苷酸編碼序列或表達(dá)盒作為載體(如病毒載體)的一部分存在。在一些實(shí)施例中，載體或表達(dá)盒以短暫或永久方式存在于宿主細(xì)胞中。

在第三方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中的艾普瑞林epha4的方法。所述方法包含這些步驟：使樣品在足以形成免疫復(fù)合物的條件下與本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物接觸；和檢測(cè)存在或不存在免疫復(fù)合物，其中存在免疫復(fù)合物表明生物樣品中存在epha4。在一些實(shí)施例中，樣品來(lái)自人類(lèi)個(gè)體或來(lái)自鼠類(lèi)個(gè)體。在一些實(shí)施例中，樣品與本文中所描述的結(jié)合物接觸。

在第四方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)個(gè)體中存在腫瘤的方法。所述方法包含這些步驟：使來(lái)自懷疑患有腫瘤的個(gè)體的生物樣品與有效量的本文中所描述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物接觸；和檢測(cè)所述單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體的結(jié)合，其中單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與對(duì)照物相比的結(jié)合增加表明個(gè)體患有腫瘤。在一些實(shí)施例中，對(duì)照物是參考標(biāo)準(zhǔn)或單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體與來(lái)自未患有腫瘤的健康個(gè)體的樣品的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，腫瘤是乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。在一些實(shí)施例中，樣品是血液、血清、血漿、痰液或活組織檢查樣品。

在第五方面中，本發(fā)明提供用于測(cè)定患有腫瘤的個(gè)體的預(yù)后的方法。所述方法包含這些步驟：使來(lái)自懷疑患有腫瘤的個(gè)體的生物樣品與有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物接觸；和檢測(cè)所述單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與樣品的結(jié)合，其中所述單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與對(duì)照物相比的結(jié)合增加表明患有腫瘤的個(gè)體的較差預(yù)后。在一些實(shí)施例中，對(duì)照物是參考標(biāo)準(zhǔn)或單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體與來(lái)自未患有任何腫瘤的健康個(gè)體的樣品的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，腫瘤是乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。在一些實(shí)施例中，樣品是血液、血清、血漿、痰液或活組織檢查樣品。

在第六方面中，本發(fā)明提供用于治療患有腫瘤的個(gè)體的方法，其包含向個(gè)體投與治療有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物，從而治療腫瘤。在一些實(shí)施例中，腫瘤是乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。在一些實(shí)施例中，所述治療包含減小腫瘤體積或減少轉(zhuǎn)移。

在第七方面中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)個(gè)體中存在神經(jīng)退化或情感障礙或評(píng)估個(gè)體中產(chǎn)生神經(jīng)退化或情感障礙的風(fēng)險(xiǎn)的方法。所述方法包含這些步驟：使來(lái)自個(gè)體的生物樣品與有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物接觸；和檢測(cè)單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物與epha4的結(jié)合，其中所述單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與對(duì)照物相比的與生物樣品中epha4的結(jié)合增加表明個(gè)體患有神經(jīng)退化或情感障礙或具有升高的發(fā)生神經(jīng)退化或情感障礙的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，對(duì)照物是參考標(biāo)準(zhǔn)或單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與來(lái)自未患有神經(jīng)退化或情感障礙或不具有發(fā)生神經(jīng)退化或情感障礙的風(fēng)險(xiǎn)的健康個(gè)體的樣品中epha4的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，神經(jīng)退化是ad、pd、ms或als，其可以是家族性或偶發(fā)性。在一些實(shí)施例中，情感障礙是抑郁癥。

在第八態(tài)樣中，本發(fā)明提供用于測(cè)定個(gè)體中神經(jīng)退化或情感障礙的預(yù)后的方法。所述方法包含這些步驟：使來(lái)自患有神經(jīng)退化或有效病癥的個(gè)體的生物樣品與有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物接觸；和檢測(cè)抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與生物樣品中epha4的結(jié)合，其中所述抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物相比對(duì)照物與epha4的結(jié)合增加表明個(gè)體的較差預(yù)后。在一些實(shí)施例中，對(duì)照物是參考標(biāo)準(zhǔn)或所述單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物與來(lái)自未患有神經(jīng)退化或情感障礙的健康個(gè)體的樣品中epha4的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，神經(jīng)退化是ad、pd、ms或als。als可以是家族性或偶發(fā)性。在一些實(shí)施例中，樣品是血液、血清、血漿、痰液或活組織檢查樣品。在一些實(shí)施例中，情感障礙是抑郁癥。

在第九態(tài)樣中，本發(fā)明提供用于治療患有神經(jīng)退化或情感障礙的個(gè)體的方法。所述方法包括向個(gè)體投與治療有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體或結(jié)合物的步驟，從而治療神經(jīng)退化或有效病癥。在一些實(shí)施例中，神經(jīng)退化是ad、pd、ms或als(包括家族性或偶發(fā)性als)。在一些實(shí)施例中，情感障礙是抑郁癥。在一些實(shí)施例中，單克隆抗體是igg1m105。

在第十態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本文中所描述的抗體或抗原結(jié)合片段或結(jié)合物、編碼所述抗體的核酸、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。在一些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物經(jīng)配制用于持續(xù)釋放。在一些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包含單克隆抗體igg1m101、igg1m105或igg1m119。

附圖說(shuō)明

圖1.來(lái)自文庫(kù)、第1輪、第2輪和第3輪淘選的噬菌體的多克隆噬菌體elisa。將噬菌體添加到經(jīng)小鼠epha4或人類(lèi)epha4涂布的孔中。使用hrp結(jié)合的抗m13-噬菌體ab進(jìn)行檢測(cè)。

圖2.通過(guò)elisa測(cè)量的igg1se1(m101)、e2、e5(m105)和e19(m119)與小鼠和人類(lèi)epha4的結(jié)合。將連續(xù)稀釋的igg1添加到經(jīng)epha4涂布的孔中。使用hrp結(jié)合的抗flagab進(jìn)行檢測(cè)。

圖3.通過(guò)elisa測(cè)量的igg1m101、m105和m119與小鼠和人類(lèi)epha4的結(jié)合。將連續(xù)稀釋的igg1添加到經(jīng)epha4涂布的孔中。使用hrp結(jié)合的抗fabab進(jìn)行檢測(cè)。

圖4.igg1m101、m105和m119識(shí)別人類(lèi)epha4配位體結(jié)合域(lbd)。將epha4lbd重組蛋白純化并且經(jīng)歷使用所示igg1進(jìn)行的西方印跡(westernblot)分析。

圖5.igg1m101、m105和m119呈現(xiàn)針對(duì)epha4lbd的強(qiáng)結(jié)合親和力。通過(guò)在細(xì)胞中將20μmephlbd蛋白質(zhì)與1μm抗體一起培育來(lái)進(jìn)行等溫滴定量熱法(itc)實(shí)驗(yàn)。(a)人類(lèi)igg未展示結(jié)合；(b)m101展示結(jié)合親和力，其中kd＝約83.0nm；(c)m105展示強(qiáng)結(jié)合親和力，其中kd＝約8.6nm；(d)m119展示結(jié)合親和力，其中kd＝約16.8nm。

圖6.igg1m101、m105和m119阻斷艾普瑞林-a1/epha4相互相用。曲線指示3種igg1能夠在納摩爾范圍(ic50：m101＝0.71nm；m105＝0.35nm；并且m119＝1.81nm)內(nèi)阻斷小鼠epha4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與小鼠艾普瑞林-a1之間的相互相用。

圖7.igg1m105展示阻斷epha4-配位體相互相用的特異性。不同配位體對(duì)小鼠epha4的抑制由ic50值指示(麥普瑞林(mephrin)-a1：0.34nm；麥普瑞林-a5：22.69nm；艾普瑞林-b2：1.81nm)。m105未能識(shí)別小鼠ephb2和阻斷其與艾普瑞林-b2的相互相用。

圖8.igg1m101與表現(xiàn)epha4的細(xì)胞的結(jié)合。將293t細(xì)胞或經(jīng)小鼠epha4轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞與igg1m101或天然epha4配位體艾普瑞林-a5-fc一起培育。使用fitc結(jié)合的抗人類(lèi)iggab進(jìn)行檢測(cè)。

圖9.igg1m119誘導(dǎo)所培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中epha4的酪氨酸磷酸化。用2μg/mlm101(101)、m105(105)、m119(119)和作為陽(yáng)性對(duì)照的艾普瑞林-a1(a1)處理div7皮層神經(jīng)元。收集細(xì)胞并且經(jīng)歷免疫沉淀和使用所示抗體進(jìn)行的西方印跡分析。

圖10.igg1m105抑制由艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4活化。(a)m105以劑量依賴性方式減弱艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4磷酸化。(b)在免疫沉淀之后epha4的p-tyr的定量；單向anova和事后t檢驗(yàn)，相對(duì)于igg+fc，***p<0.001；相對(duì)于igg+a1，###p<0.001。(c)epha4的tyr602磷酸化的定量；單向anova和事后t檢驗(yàn)，相對(duì)于igg+fc，*p<0.05，相對(duì)于igg+a1，#p<0.05。

圖11.aβ減少經(jīng)m105標(biāo)記的epha4受體與psd-95的共定位。如所指示，熒光影像展示在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)用500nmaβ處理的所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(約18-20div)。細(xì)胞用igg1m105和psd-95抗體免疫染色。圖式展示與psd-95共定位的epha4的減少。nepha4(n)表示通過(guò)超分辯率成像獲得的共定位數(shù)目(或定位計(jì)數(shù))。這一數(shù)字僅反映epha4(n)的相對(duì)豐度，但其不是蛋白質(zhì)的精確數(shù)目或甚至熒光標(biāo)簽的數(shù)目，因?yàn)槊總€(gè)染料分子在成像期間可切換多次。

圖12.m105抑制epha4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的生物功能。m105以劑量依賴性方式消除所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4集群。m105在抑制ehrin-a1介導(dǎo)的epha4叢集中的ic50是4.16μg/ml。

圖13.由m105抗體進(jìn)行的epha4信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷可緩解aβ(1-42)寡聚物介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞損傷。m105抗體(其阻斷內(nèi)源性epha4與艾普瑞林-a的相互相用)緩解aβ(1-42)寡聚物(500nm)介導(dǎo)的mepsc出現(xiàn)率降低。所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(22div)用2μg/mlm105處理30分鐘，接著用500nmaβ(1-42)處理24小時(shí)。

定義

投藥：通過(guò)所選擇的途徑將組合物引入個(gè)體。舉例來(lái)說(shuō)，如果所選擇的途徑是靜脈內(nèi)，那么通過(guò)將組合物引入個(gè)體的靜脈來(lái)投與組合物。

肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)：一種疾病，也被稱(chēng)為葛雷克氏病(lougehrig'sdisease)、馬恰病(maladiedecharcot)或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，其是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性引起的進(jìn)行性、致死性、神經(jīng)退化性疾病。病癥引起全身肌肉衰弱和萎縮，因?yàn)樯喜亢拖虏窟\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化和死亡，使得其不再神經(jīng)支配肌肉。肌肉逐漸衰弱、萎縮并且由于去神經(jīng)而發(fā)生肌束震顫(抽搐)。最終，大腦完全丟失其發(fā)起和控制自主運(yùn)動(dòng)的能力。疾病未必使患者的精神功能衰弱。通常，疾病晚期的個(gè)體保留與其在疾病發(fā)作之前所具有的相同的記憶、人格和智力。als分類(lèi)成兩組，家族性als和偶發(fā)性als?！斑t發(fā)型”als在年齡超過(guò)60歲的個(gè)體中發(fā)生?！霸绨l(fā)型”als在年齡小于60歲的個(gè)體中發(fā)生。

als的最早癥狀可包括肌肉抽搐、痙攣或僵硬；影響手臂或腿部的肌肉衰弱；和/或含糊不清和鼻音。這些一般不適接著發(fā)展成更明顯的衰弱或萎縮。受als的早期癥狀影響的身體部分取決于身體中哪些肌肉首先受到損壞。約75％的人經(jīng)歷“手臂發(fā)作型”als。通常，在“手臂發(fā)作型”als中，癥狀首先在手臂中出現(xiàn)。在一些個(gè)體中，癥狀最初影響一條腿，并且患者在行走或跑步時(shí)發(fā)生不協(xié)調(diào)或其發(fā)現(xiàn)其更頻繁地絆跌或絆腳。其它手臂發(fā)作型患者首先發(fā)現(xiàn)疾病影響手或手臂，因?yàn)槠湓谛枰止れ`巧性的簡(jiǎn)單任務(wù)(如扣襯衫或書(shū)寫(xiě))時(shí)遇到困難。約25％的als病例是“延髓發(fā)作型”als。這些患者首先發(fā)現(xiàn)明顯的說(shuō)話困難；其語(yǔ)音變混亂和含糊不清。鼻音和音量損失通常是最初癥狀；隨后出現(xiàn)困難吞咽，和舌部移動(dòng)性喪失。最終發(fā)生完全失聲和在吞咽時(shí)不能保護(hù)呼吸道。

與身體中首先受疾病影響的部分無(wú)關(guān)，肌肉衰弱和萎縮隨著疾病發(fā)展而擴(kuò)散到身體的其它部分。患者出現(xiàn)移動(dòng)、吞咽(吞咽困難)和說(shuō)話或成詞(發(fā)音困難)困難增加。涉及的上部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的癥狀包括繃緊的和僵硬的肌肉(痙攣)以及過(guò)度反射(反射過(guò)強(qiáng))，包括過(guò)度的反射。通常稱(chēng)為巴氏病征(babinski'ssign)的反射異常(在足底受刺激時(shí)大腳趾朝上伸展)也表示上部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害。下部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的癥狀包括肌肉衰弱和萎縮、肌肉痙攣和可在皮下發(fā)現(xiàn)的肌肉短暫抽搐(肌束震顫)。約15-45％患者經(jīng)歷假延髓病影響，也稱(chēng)為“情緒不穩(wěn)”，其由不可控制的大笑、哭泣或微笑組成。

riluzole^tm(力如太(rilutek))用于治療als。相信這種藥物通過(guò)減少谷氨酸釋放來(lái)較少對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損害。als患者的臨床試驗(yàn)表明利魯唑(riluzole)使存活期延長(zhǎng)若干個(gè)月，并且可使延髓發(fā)作患者具有更大的存活福利。藥物還延長(zhǎng)患者需要通氣支持之前的時(shí)間。

擴(kuò)增：核酸分子(如dna或rna分子)的擴(kuò)增指使用可增加樣品中核酸分子的拷貝數(shù)的技術(shù)。擴(kuò)增的實(shí)例是聚合酶鏈反應(yīng)，其中從個(gè)體收集的生物樣品在允許引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下與一對(duì)寡核苷酸引物接觸。引物在適合的條件下擴(kuò)展、從模板分離并且接著再結(jié)合、擴(kuò)展和分離以擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)。擴(kuò)增產(chǎn)物可由電泳、限制性核酸內(nèi)切酶裂解模式、寡核苷酸雜交或接合和/或使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的核酸測(cè)序表征。其它擴(kuò)增實(shí)例包括鏈置換擴(kuò)增，如美國(guó)專(zhuān)利案第5,744,311號(hào)中所披露；無(wú)轉(zhuǎn)錄型等溫?cái)U(kuò)增，如美國(guó)專(zhuān)利案第6,033,881號(hào)中所披露；修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增，如wo90/01069中所披露；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如ep-a-320308中所披露；間隙填充連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如美國(guó)專(zhuān)利案第5,427,930號(hào)中所披露；以及nasba^tmrna無(wú)轉(zhuǎn)錄型擴(kuò)增，如美國(guó)專(zhuān)利案第6,025,134號(hào)中所披露。

動(dòng)物：活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，包括例如哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的類(lèi)別。術(shù)語(yǔ)哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)和非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”包括人類(lèi)和家畜個(gè)體。

抗體：一種多肽配位體，其包含至少一個(gè)特異性識(shí)別并且特異性結(jié)合抗原的抗原決定基(如人類(lèi)epha4和/或小鼠epha4或其片段)的輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)。免疫球蛋白分子由重鏈和輕鏈組成，其中每一者具有可變區(qū)，稱(chēng)為可變重鏈(vh)區(qū)和可變輕鏈(vl)區(qū)?？傮w而言，在原生抗體中，vh區(qū)和vl區(qū)結(jié)合由抗體識(shí)別的抗原。在一些實(shí)施例中，僅需要重鏈可變域。舉例來(lái)說(shuō)，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在不存在輕鏈的情況下具有功能性并且穩(wěn)定(參見(jiàn)例如hamers-casterman等人,《自然(nature)》,363:446-448,1993；sheriff等人,《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(nat.struct.biol.)》3:733-736,1996)。

抗體包括完整免疫球蛋白?？乖Y(jié)合片段在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的，如單域抗體(例如vh域抗體)、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、單鏈fv蛋白質(zhì)(“scfv”)和二硫鍵穩(wěn)定fv蛋白質(zhì)(“dsfv”)。scfv蛋白質(zhì)是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過(guò)連接子結(jié)合，而在dsfv中，鏈已經(jīng)突變以引入雙硫鍵以使鏈的偶聯(lián)穩(wěn)定。所述術(shù)語(yǔ)還包括基因工程改造的形式，如嵌合抗體(例如人類(lèi)化鼠抗體)、異結(jié)合抗體(如雙特異性抗體)。還參見(jiàn)《皮爾斯目錄與手冊(cè)(piercecatalogandhandbook)》,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,il)；kuby,j.,《免疫學(xué)(immunology)》,第3版,w.h.freeman&co.,newyork,1997。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有由二硫鍵互連的重鏈(h)和輕鏈(l)。存在兩種輕鏈，lambda(λ)和kappa(κ)。存在五種決定抗體分子的功能活性的主要重鏈種類(lèi)(或同型)：igm、igd、igg、iga和ige。

每個(gè)重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)(所述區(qū)域也稱(chēng)為“結(jié)構(gòu)域”)?？偠灾?，重鏈和輕鏈可變區(qū)特異性結(jié)合抗原。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有間雜有三個(gè)高變區(qū)(也稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”)的“構(gòu)架”區(qū)。已定義構(gòu)架區(qū)和cdr的范圍。參見(jiàn)例如kabat等人(參見(jiàn)kabat等人,《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部(u.s.departmentofhealthandhumanservices),1991)和免疫遺傳學(xué)資料庫(kù)(immunogeneticsdatabase；imgt)(參見(jiàn)lefranc,《核酸研究(nucleicacidsres)》29:207-9,2001；以及//imgt.cines.fr/imgt_vquest/vquest？livret＝0&option＝humanig；)。kabat資料庫(kù)先進(jìn)在線上維護(hù)(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)的序列在物種(如人類(lèi))內(nèi)具有相對(duì)保存性。抗體的構(gòu)架區(qū)(其是成分輕鏈和重鏈的組合構(gòu)架區(qū))用于在三維空間中定位和對(duì)準(zhǔn)cdr。

cdr主要負(fù)責(zé)結(jié)合于抗原的抗原決定基。每個(gè)鏈的cdr通常稱(chēng)為cdr1、cdr2和cdr3，從n端開(kāi)始依序編號(hào)，并且也通常通過(guò)具體cdr所位于的鏈鑒別。因此，vhcdr3(或h-cdr3)位于發(fā)現(xiàn)其的抗體的重鏈的可變域中，而vlcdr1(或l-cdr1)是來(lái)自發(fā)現(xiàn)其的抗體的輕鏈的可變域的cdr1。結(jié)合epha4的抗體例如將具有特異性vh區(qū)和vl區(qū)序列，并且因此具有特異性cdr序列。具有不同特異性(亦即針對(duì)不同抗原的組合位點(diǎn))的抗體具有不同cdr。盡管抗體與抗體之間的cdr不同，但cdr內(nèi)僅有限數(shù)目的氨基酸位置直接涉及抗原結(jié)合。cdr內(nèi)的這些位置稱(chēng)為特異性決定基(sdr)。

對(duì)“vh”或“vh”的參考指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括fv、scfv、dsfv或fab的可變區(qū)。對(duì)“vl”或“vl”的參考指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括fv、scfv、dsfv或fab的可變區(qū)。

“單克隆抗體”或“mab”是由b-淋巴細(xì)胞的單一純系或由其中已轉(zhuǎn)染單一抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生mab，例如通過(guò)由骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合產(chǎn)生雜交抗體形成細(xì)胞。mab包括人類(lèi)化mab。

“嵌合抗體”具有來(lái)自一個(gè)物種(如人類(lèi))的構(gòu)架殘基和來(lái)自另一物種的cdr(其通常提供抗原結(jié)合)，如特異性結(jié)合epha4的鼠類(lèi)抗體。

“人類(lèi)”抗體(也稱(chēng)為“完全人類(lèi)”抗體)是包括人類(lèi)構(gòu)架區(qū)和所有來(lái)自人類(lèi)免疫球蛋白的cdr的抗體。在一個(gè)實(shí)例中，構(gòu)架和cdr來(lái)自相同的起始人類(lèi)重鏈和/或輕鏈氨基酸序列。然而，來(lái)自一個(gè)人類(lèi)抗體的構(gòu)架可經(jīng)工程改造以包括來(lái)自不同人類(lèi)抗體的cdr。“人類(lèi)化”免疫球蛋白是包括人類(lèi)構(gòu)架區(qū)和一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人類(lèi)(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的cdr的免疫球蛋白。提供cdr的非人類(lèi)免疫球蛋白稱(chēng)為“供體”，并且提供構(gòu)架的人類(lèi)免疫球蛋白稱(chēng)為“受體”。在一個(gè)實(shí)施例中，所有cdr都來(lái)自人類(lèi)化免疫球蛋白中的供體免疫球蛋白。恒定區(qū)未必存在，但如果其存在，那么其必須與人類(lèi)免疫球蛋白恒定區(qū)大體上一致，即至少約85至90％，如約95％或更加一致。因此，人類(lèi)化免疫球蛋白的所有部分(除外可能cdr)與天然人類(lèi)免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分大體上一致?！叭祟?lèi)化抗體”是包含人類(lèi)化輕鏈和人類(lèi)化重鏈免疫球蛋白的抗體。人類(lèi)化抗體與提供cdr的供體抗體結(jié)合于相同抗原。人類(lèi)化免疫球蛋白或抗體的受體架構(gòu)可具有由供體構(gòu)架獲得的有限數(shù)目的氨基酸取代。人類(lèi)化或其它mab可具有其他保守性氨基酸取代，其基本上不影響抗原結(jié)合或其它免疫球蛋白功能。人類(lèi)化免疫球蛋白可借助于遺傳工程改造構(gòu)筑(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第5,585,089號(hào))。

結(jié)合親和力：抗體針對(duì)抗原的親和力。在一個(gè)實(shí)施例中，親和力是通過(guò)由frankel等人,《分子免疫學(xué)(mol.immunol.)》,16:101-106,1979描述的史卡查方法(scatchardmethod)的改進(jìn)形式計(jì)算。在另一實(shí)施例中，結(jié)合親和力是通過(guò)抗原/抗體解離率測(cè)量。在另一實(shí)施例中，高結(jié)合親和力是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析測(cè)量。在另一實(shí)施例中，結(jié)合親和力是通過(guò)elisa測(cè)量。以高親和力“特異性結(jié)合”抗原決定基(如人類(lèi)epha4和/或小鼠epha4的抗原決定基)并且不顯著結(jié)合其它不相關(guān)抗原決定基的抗體。

雙特異性抗體：由兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部分組成并且因此結(jié)合于兩個(gè)不同的抗原決定基的重組型分子。雙特異性抗體包括兩個(gè)抗原結(jié)合部分的以化學(xué)或遺傳方式連接的分子?？乖Y(jié)合部分可使用連接子連接?？乖Y(jié)合部分可以是單克隆抗體、抗原結(jié)合片段(例如fab、scfv)、ead或其組合。雙特異性抗體可包括一個(gè)或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，但未必包括恒定域。

化學(xué)治療劑：任何在治療由異常細(xì)胞生長(zhǎng)表征的疾病中具有治療有效性的化學(xué)試劑。這類(lèi)疾病包括腫瘤、贅瘤和癌癥以及由增生性生長(zhǎng)表征的疾病，如牛皮癬。在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)治療劑是用于治療淋巴瘤、白血病或另一種腫瘤的藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)治療劑是放射性化合物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地鑒別可使用的化學(xué)治療劑(參見(jiàn)例如slapak和kufe,《癌癥療法原理(principlesofcancertherapy)》,《哈里森內(nèi)科原理(harrison'sprinciplesofinternalmedicine)》中的第86章,第14版；perry等人,《化學(xué)療法(chemotherapy)》,第2版《阿貝洛夫臨床腫瘤學(xué)(abeloff,clinicaloncology)》中的第17章,2000churchilllivingstone,inc；baltzer,l.,berkery,r.(編):《腫瘤學(xué)袖珍化療指南(oncologypocketguidetochemotherapy)》,第2版st.louis,mosby-yearbook,1995；fischer,d.s.,knobf,m.f.,durivage,h.j.(編):《癌癥化學(xué)療法手冊(cè)(thecancerchemotherapyhandbook)》,第4版st.louis,mosby-yearbook,1993)。組合化學(xué)療法是投與超過(guò)一種藥劑以治療癌癥。一個(gè)實(shí)例是與放射性或化合物組合使用的可結(jié)合epha4的抗體或其片段的投藥。

保守性變異體：“保守性”氨基酸取代是不會(huì)顯著影響或降低蛋白質(zhì)(如特異性結(jié)合epha4的抗體)的親和力的取代。舉例來(lái)說(shuō)，特異性結(jié)合epha4的人類(lèi)抗體可包括至多約1個(gè)、至多約2個(gè)、至多約5個(gè)和至多約10個(gè)或至多約15個(gè)保守性取代并且特異性結(jié)合epha4多肽。術(shù)語(yǔ)保守性變異還包括使用經(jīng)取代的氨基酸代替未經(jīng)取代的親本氨基酸，限制條件是抗體特異性結(jié)合epha4。非保守性取代是可降低活性或與epha4的結(jié)合的取代。

提供功能性類(lèi)似氨基酸的保守性氨基酸取代表是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。以下六個(gè)組是彼此視為保守性取代的氨基酸的實(shí)例：

1)丙氨酸(a)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)；

2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；

3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；

4)精氨酸(r)、賴氨酸(k)；

5)異亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，甲硫氨酸(m)，纈氨酸(v)；和

6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。

接觸：直接物理性締合的位置；包括固體和液體形式。

細(xì)胞毒性：分子對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的毒性，如免疫毒素(相對(duì)于生物體的其余細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施例中，相比之下，術(shù)語(yǔ)“毒性”指免疫毒素對(duì)除免疫毒素的靶向部分所欲靶向的細(xì)胞以外的細(xì)胞的毒性，并且術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物毒性”指通過(guò)免疫毒素對(duì)除免疫毒素所欲靶向的細(xì)胞以外的細(xì)胞的毒性而產(chǎn)生免疫毒素對(duì)動(dòng)物的毒性。

簡(jiǎn)并變異體：在本發(fā)明中，“簡(jiǎn)并變異體”指編碼多肽的聚核苷酸，如n個(gè)epha4多肽或結(jié)合epha4的抗體，其包括由于基因編碼而簡(jiǎn)并的序列。存在20種天然氨基酸，其中大部分由超過(guò)一個(gè)密碼子指定。因此，包括所有簡(jiǎn)并核苷酸序列，只要多肽(如epha4多肽)的氨基酸序列或結(jié)合epha4的抗體(其由核苷酸序列編碼)未改變即可。

診斷：鑒別病理性病狀(如(但不限于)癌癥或als)的存在或性質(zhì)。診斷方法在其敏感性和特異性方面不同。診斷分析的“敏感性”是測(cè)試呈陽(yáng)性的患病個(gè)體的百分比(真實(shí)陽(yáng)性百分比)。診斷分析的“特異性”是一減去假陽(yáng)性率，其中假陽(yáng)性率定義為測(cè)試呈陽(yáng)性的未患病個(gè)體的比例。盡管特定診斷方法可能并不提供病狀的決定性診斷，但在所述方法提供輔助診斷的陽(yáng)性指示時(shí)是合格的。“預(yù)后”是病理性病狀(如癌癥或als)的發(fā)展(例如嚴(yán)重性)機(jī)率。

效應(yīng)分子：嵌合分子中意圖對(duì)嵌合分子所靶向的細(xì)胞具有所需作用的部分。效應(yīng)分子也稱(chēng)為效應(yīng)部分(em)、治療劑或診斷劑，或類(lèi)似術(shù)語(yǔ)。

治療劑包括如核酸、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂質(zhì)、碳水化合物或重組型病毒等化合物。核酸治療和診斷部分包括反義核酸、用于與單螺旋或雙螺旋dna共價(jià)交聯(lián)的衍生寡核苷酸以及形成三鏈體的寡核苷酸?；蛘?，連接到靶向部分(如抗epha4抗體)的分子可以是密封系統(tǒng)，如脂質(zhì)體或微胞(其含有治療性組合物，如藥物)、核酸(如反義核酸)或另一治療性部分，其可避免直接暴露于循環(huán)系統(tǒng)。制備連接到抗體的脂質(zhì)體的手段是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第4,957,735號(hào)；和connor等人,《藥物療法(pharm.ther.)》28:341-365,1985)。診斷劑或部分包括放射性同位素和其它可檢測(cè)標(biāo)記。適用于這類(lèi)目的的可檢測(cè)標(biāo)記頁(yè)數(shù)所屬領(lǐng)域中眾所周知的，并且包括放射性同位素，如³⁵s、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸f、¹⁹f、^99mtc、¹³¹i、³h、¹⁴c、¹⁵n、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in和¹²⁵i、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶。

產(chǎn)生紅血球生成素的肝細(xì)胞(eph)a4：在大腦、心臟、肺、肌肉、腎臟、胎盤(pán)、胰腺(fox等人,《癌基因(oncogene)》10:897,1995)和黑色素細(xì)胞(easty等人,《國(guó)際癌癥雜志(int.j.cancer)》71:1061,1997)中表達(dá)的受體酪氨酸激酶。epha4結(jié)合細(xì)胞膜錨定配位體(艾普瑞林a1、a2、a3、a4、a5、b2和b3；pasquale,《細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(curr.opin.incellbiology)》,1997,9:608；以及配位體b61、al1/rags、lerk4、htk-l和elk-l3；martone等人,《大腦研究(brainresearch)》771:238,1997)，并且配位體結(jié)合引起酪氨酸殘基上的epha4自體磷酸化(ellis等人,癌基因12:1727,1996)。epha4酪氨酸磷酸化產(chǎn)生具有src同源性2/3(sh2/sh3)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)，如細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶p59fyn(ellis等人,見(jiàn)上文；cheng等人,《細(xì)胞激素和生長(zhǎng)因子綜述(cytokineandgrowthfactorreviews)》13:75,2002)。人類(lèi)和小鼠epha4的例示性氨基酸序列提供于下文中。

經(jīng)工程改造的抗體結(jié)構(gòu)域(ead)：也稱(chēng)為“單一結(jié)構(gòu)域抗體”，這種分子是單一單體可變抗體結(jié)構(gòu)域。可變區(qū)包括提供結(jié)合特異性的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，和構(gòu)架區(qū)，其是可變域中除cdr以外的部分。通常，ead具有僅12-15kda的分子量，并且因此小于具有兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈(約150-160kda)和制造片段(約50kda)的mab。在一個(gè)實(shí)施例中，ead包括可變重鏈結(jié)構(gòu)域，其具有h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3且特異性結(jié)合目標(biāo)抗原，但并不包括輕鏈cdr或輕鏈可變域。ead在微生物細(xì)胞培養(yǎng)物中大量表達(dá)，展示有利的生物物理特性，包括可溶性和溫度穩(wěn)定性，并且良好適合于通過(guò)活體外選擇系統(tǒng)(如噬菌體呈現(xiàn))進(jìn)行選擇和親和力成熟。ead作為單體也具有生物活性，并且歸因于其小尺寸和固有穩(wěn)定性，可格式化成較大分子以產(chǎn)生具有延長(zhǎng)的血清半衰期或其它藥理學(xué)活性的藥物。ead可包括任何適合的構(gòu)架區(qū)并且可以是人類(lèi)或人類(lèi)化的。

抗原決定基：抗原決定簇。這些是分子上具有抗原性(即引發(fā)特異性免疫反應(yīng))的具體化學(xué)基團(tuán)或肽序列?？贵w特異性結(jié)合多肽上的具體抗原決定基，如人類(lèi)epha4和/或小鼠epha4。

表達(dá)：將核酸轉(zhuǎn)譯到蛋白質(zhì)中。蛋白質(zhì)可被表達(dá)并且保持在細(xì)胞內(nèi)，變成細(xì)胞表面膜的組分，或分泌到細(xì)胞外基質(zhì)或培養(yǎng)基中。

表達(dá)盒：以重組或合成方式產(chǎn)生的核酸構(gòu)筑體，其具有允許具體多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄到宿主細(xì)胞中的一系列指定核酸元素。表達(dá)盒可以是質(zhì)體、病毒基因組或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)盒包括待轉(zhuǎn)錄的聚核苷酸(例如編碼抗epha4抗體或其結(jié)合片段的聚核苷酸)，其可操作地連接于啟動(dòng)子。

表達(dá)控制序列：調(diào)節(jié)其可操作地連接的異源核酸序列的表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄和(視需要)轉(zhuǎn)譯時(shí)，表達(dá)控制序列可操作地連接于核酸序列。因此，表達(dá)控制序列可包括適合的啟動(dòng)子、強(qiáng)化子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白質(zhì)編碼基因前的起始密碼子(即atg)(剪接內(nèi)含子的信號(hào)，維持所述基因的正確閱讀框架以允許mrna的適當(dāng)轉(zhuǎn)譯)和終止密碼子。術(shù)語(yǔ)“控制序列”意圖至少包括可影響表達(dá)的組分，并且也可以包括其它組分，其存在有利于例如前導(dǎo)序列和融合搭配物序列。表達(dá)控制序列可包括啟動(dòng)子。

啟動(dòng)子是足以直接轉(zhuǎn)錄的最小序列。還包括足以顯現(xiàn)對(duì)于細(xì)胞類(lèi)型特異性、組織特異性而言可控制或可由外部信號(hào)或試劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子依賴性基因表達(dá)，啟動(dòng)子元素；這類(lèi)元素可位于基因的5'或3'區(qū)域。包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如bitter等人,《酶學(xué)方法(methodsinenzymology)》153:516-544,1987)。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中選殖時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如噬菌體λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)的pl等。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中選殖時(shí)，可使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因體(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列；腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。也可以使用由重組型dna或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)核酸序列的轉(zhuǎn)錄。

構(gòu)架區(qū)：插在cdr之間的氨基酸序列。構(gòu)架區(qū)包括可變輕鏈和可變重鏈構(gòu)架區(qū)。構(gòu)架區(qū)用于保持cdr處于適用于抗原結(jié)合的定向。

宿主細(xì)胞：其中可繁殖載體表達(dá)其dna的細(xì)胞。細(xì)胞可以是原核或真核。所述術(shù)語(yǔ)還包括個(gè)體宿主細(xì)胞的任何后代。應(yīng)理解，所有后代可能不與親本細(xì)胞一致，因?yàn)樵趶?fù)制期間可能存在突變。然而，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”時(shí)，包括這類(lèi)后代。

免疫反應(yīng)：免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如b細(xì)胞、t細(xì)胞或單核細(xì)胞)對(duì)刺激的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，反應(yīng)對(duì)具體抗原具有特異性(“抗原特異性反應(yīng)”)。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫反應(yīng)是t細(xì)胞反應(yīng)，如cd4⁺反應(yīng)或cd8⁺反應(yīng)。在另一實(shí)施例中，反應(yīng)是b細(xì)胞反應(yīng)，并且引起產(chǎn)生特異性抗體。

免疫結(jié)合物：效應(yīng)分子與抗體、其抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體的共價(jià)連接。效應(yīng)分子可以是可檢測(cè)標(biāo)記或免疫毒素。毒素的特異性、非限制性實(shí)例包括(但不限于)相思子毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素(pseudomonasexotoxin)(pe，如pe35、pe37、pe38和pe40)、白喉毒素(dt)、肉毒桿菌毒素或其經(jīng)修飾的毒素，或其它直接或間接抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞的毒性試劑。舉例來(lái)說(shuō)，pe和dt是通常通過(guò)肝臟毒性引起死亡的高毒性化合物。然而，pe和dt可通過(guò)移除毒素的原生靶向組分(如pe的結(jié)構(gòu)域ia和dt的b鏈)并且用不同的靶向部分(如抗體)置換而修飾成適用作免疫毒素的形式?！扒逗戏肿印笔桥c效應(yīng)分子結(jié)合(偶合)的靶向部分，如配位體或抗體。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“連接”指使兩個(gè)多肽進(jìn)入一個(gè)相鄰多肽分子。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體接合到效應(yīng)分子。在另一實(shí)施例中，接合到效應(yīng)分子的抗體進(jìn)一步使脂質(zhì)或其它分子接合到蛋白質(zhì)或肽以增加其在身體中的半衰期。連接可以通過(guò)化學(xué)或重組手段實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，連接是化學(xué)方式，其中抗體部分與效應(yīng)分子之間的反應(yīng)產(chǎn)生在兩個(gè)分子之間形成的共價(jià)鍵以形成一個(gè)分子?？扇芜x地在抗體與效應(yīng)分子之間包括肽連接子(短肽序列)。因?yàn)槊庖呓Y(jié)合物最初由具有單獨(dú)功能的兩個(gè)分子(如抗體和效應(yīng)分子)產(chǎn)生，其有時(shí)也稱(chēng)為“嵌合分子”。因此，如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“嵌合分子”指結(jié)合(偶合)到效應(yīng)分子的靶向部分，如配位體或抗體。免疫結(jié)合物是非天然存在的分子。

免疫原性肽：包含等位基因特異性主結(jié)構(gòu)或其它序列的肽，如n端重復(fù)，使得所述肽將結(jié)合mhc分子并且誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(“ctl”)反應(yīng)，或針對(duì)衍生免疫原性肽的抗原的b細(xì)胞反應(yīng)(例如抗體產(chǎn)生)。

在一個(gè)實(shí)施例中，使用序列主結(jié)構(gòu)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法(如神經(jīng)網(wǎng)或多項(xiàng)式測(cè)定)鑒別免疫原性肽。通常，使用算法測(cè)定肽的“結(jié)合臨界值”，以選擇具有較高的以某一親和力結(jié)合的概率并且將是免疫原性的得分的肽。算法是基于對(duì)具體位置的具體氨基酸的mhc結(jié)合的作用、對(duì)具體位置的具體氨基酸的抗體結(jié)合的作用或?qū)兄鹘Y(jié)構(gòu)的肽中具體取代的結(jié)合的作用。在免疫原性肽的情形中，“保守殘基”是呈現(xiàn)比由肽中的具體位置處的隨機(jī)分布所預(yù)期顯著更高的頻率的殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，保守殘基是其中mhc結(jié)構(gòu)可提供與免疫原性肽的接觸點(diǎn)的殘基。在一個(gè)特定非限制性實(shí)例中，免疫原性多肽包括人類(lèi)epha4或其片段的一個(gè)區(qū)域，其中多肽在表達(dá)全長(zhǎng)人類(lèi)epha4多肽的宿主細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)。

免疫反應(yīng)性條件：包括對(duì)允許產(chǎn)生針對(duì)具體抗原決定基的抗體以按比結(jié)合于基本上所有其它抗原決定基的可檢測(cè)地更大的程度(和/或基本上排除)結(jié)合于所述抗原決定基的條件的參考。免疫反應(yīng)性條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的格式并且通常是免疫分析方案中使用的條件或活體內(nèi)遇到的條件。關(guān)于免疫分析格式和條件的說(shuō)明，參見(jiàn)harlow和lane,見(jiàn)上文。所述方法中使用的免疫反應(yīng)性條件是“生理?xiàng)l件”，其包括對(duì)通常在活的哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部遇到的條件(如溫度、容積滲透濃度、ph值)的參考。盡管認(rèn)識(shí)到一些器官遭遇極端條件，但生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境通常處于約ph7(即，ph6.0到ph8.0，更通常ph6.5到7.5)，含有水作為主要溶劑，并且存在高于0℃并且低于50℃的溫度。容積滲透濃度處于支持細(xì)胞存活和增殖的范圍內(nèi)。

抑制或治療疾?。阂种评缇哂屑膊?如腫瘤(例如癌癥，如乳癌))或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(如als)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中疾病或病狀的完全發(fā)展?！爸委煛敝钢委熜愿深A(yù)，其在疾病或病理學(xué)病狀開(kāi)始發(fā)展之后改善其病征或癥狀。如本文中所使用，對(duì)于疾病或病理學(xué)病狀，術(shù)語(yǔ)“改善”指任何可觀察的有利治療作用。有利作用可例如通過(guò)敏感個(gè)體中疾病的臨床癥狀的延遲發(fā)作、疾病的一些或所有臨床癥狀的嚴(yán)重度降低、更短的疾病進(jìn)程、癌轉(zhuǎn)移數(shù)目降低、個(gè)體的整體健康或幸福的改良或所屬領(lǐng)域中眾所周知的對(duì)具體疾病具有特異性的其它參數(shù)證明?！邦A(yù)防性”治療是出于降低產(chǎn)生病變的風(fēng)險(xiǎn)的目的而投與未呈現(xiàn)疾病病征或僅呈現(xiàn)早期病征的個(gè)體的治療。

分離：“經(jīng)分離的”生物組分(如核酸、蛋白質(zhì)(包括抗體)或細(xì)胞器)已大體上從天然產(chǎn)生所述組分的環(huán)境(如細(xì)胞)中的其它生物組分(即，其它染色體和染色體外dna和rna、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)分離或純化?！敖?jīng)分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋由宿主細(xì)胞以及化學(xué)合成的核酸中的重組型表達(dá)產(chǎn)生的核酸和蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，生物組分是至少95％、96％、97％、98％或99％純的。

標(biāo)記：一種可檢測(cè)化合物或組合物，其與另一分子(如抗體或蛋白質(zhì))直接或間接結(jié)合以促進(jìn)所述分子的檢測(cè)。標(biāo)記物的特異性、非限制性實(shí)例包括熒光標(biāo)簽、酶促連接和放射性同位素。在一個(gè)實(shí)例中，“經(jīng)標(biāo)記的抗體”指另一分子并入抗體中。舉例來(lái)說(shuō)，標(biāo)記是可檢測(cè)標(biāo)記物，如放射性標(biāo)記氨基酸并入或連接到可由經(jīng)標(biāo)記的抗生物素蛋白(例如含有可通過(guò)光學(xué)或色度方法檢測(cè)到的熒光標(biāo)記或酶促活性的抗生蛋白鏈菌素)檢測(cè)到的生物素基部分的多肽。所屬領(lǐng)域中已知并且可使用多種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法。用于多肽的標(biāo)記物的實(shí)例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(如³⁵s、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸f、¹⁹f、^99mtc、¹³¹i、³h、¹⁴c、¹⁵n、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in和¹²⁵i)、熒光標(biāo)記物(如異硫氰酸熒光素(fitc)、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體)、酶促標(biāo)記物(如辣根過(guò)氧化酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、生物素基、由第二報(bào)導(dǎo)子識(shí)別的預(yù)定多肽抗原決定基(如白胺酸拉鏈對(duì)序列、二級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合域、抗原決定基標(biāo)簽)或磁性試劑，如釓螯合劑。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記物由具有多種長(zhǎng)度的間隔基臂連接以降低潛在位阻。

連接子：在一些情況下，連接子是肽，如抗體結(jié)合片段(如fv片段)內(nèi)，其用于使可變重鏈間接結(jié)合到可變輕鏈?！斑B接子”還可以指用于使靶向部分(如抗體)連接到效應(yīng)分子(如細(xì)胞毒素或可檢測(cè)標(biāo)記)的肽。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”、“接合”、“粘合”或“連接”指使兩個(gè)多肽進(jìn)入一個(gè)相鄰多肽分子，或使放射性核種或其它分子共價(jià)附接到多肽，如scfv。在特定情形中，所述術(shù)語(yǔ)包括對(duì)使配位體(如抗體部分)接合到效應(yīng)分子的參考。連接可以通過(guò)化學(xué)或重組手段實(shí)現(xiàn)?！盎瘜W(xué)手段”指抗體部分與效應(yīng)分子之間的反應(yīng)，使得在兩個(gè)分子之間形成共價(jià)鍵以形成一個(gè)分子。

哺乳動(dòng)物：這一術(shù)語(yǔ)包括人類(lèi)和非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”包括人類(lèi)和家畜個(gè)體。

贅瘤形成、惡性疾病、癌癥或腫瘤：腫瘤是由過(guò)度的細(xì)胞分裂引起的組織或細(xì)胞的異常生長(zhǎng)。贅生性生長(zhǎng)可產(chǎn)生腫瘤。個(gè)體中腫瘤的量是“腫瘤負(fù)荷”，其可以腫瘤的數(shù)目、體積或重量形式測(cè)量。不會(huì)轉(zhuǎn)移的腫瘤稱(chēng)為“良性”。侵襲周?chē)M織和/或可轉(zhuǎn)移的腫瘤稱(chēng)為“惡性”。血液學(xué)腫瘤的實(shí)例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病和骨髓母細(xì)胞性、前髓細(xì)胞性、骨髓單核細(xì)胞性、單核細(xì)胞性和紅白血病)、慢性白血病(如慢性骨髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)(惰性和高級(jí)形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom'smacroglobulinemia)、重鏈疾病、骨髓發(fā)育不良綜合癥、毛狀細(xì)胞白血病和骨髓異常增生。

實(shí)體腫瘤(如肉瘤和癌瘤)的實(shí)例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌瘤、淋巴惡性疾病、胰臟癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、髓質(zhì)甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽液管癌、絨膜癌、威耳姆士腫瘤(wilms'tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細(xì)胞瘤、膀胱癌和cns腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)。在若干實(shí)例中，腫瘤是乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。

核酸：由通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核苷酸單元(核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變異體和合成性非天然存在的類(lèi)似物)組成的聚合物，其相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變異體和合成性非天然存在的類(lèi)似物。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和其之間的連接包括非天然存在的合成類(lèi)似物，如例如并且不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)等。這類(lèi)聚核苷酸可例如使用自動(dòng)dna合成器合成。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”通常指短聚核苷酸，通常不超過(guò)約50個(gè)核苷酸。應(yīng)理解，當(dāng)核苷酸序列由dna序列(即，a、t、g、c)表示時(shí)，這還包括其中“u”代替“t”的rna序列(即，a、u、g、c)。

本文中使用常規(guī)注解描述核苷酸序列：?jiǎn)喂珊塑账嵝蛄械淖髠?cè)末端是5'端；雙股核苷酸序列的左側(cè)方向稱(chēng)為5'方向。核苷酸添加到初生rna轉(zhuǎn)錄物的5'到3'方向稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄方向。與mrna具有相同序列的dna股稱(chēng)為“編碼股”；dna股上具有與由所述dna轉(zhuǎn)錄的mrna相同的序列并且位于rna轉(zhuǎn)錄物的5'到5'端的序列稱(chēng)為“上游序列”；dna股上具有與rna相同的序列并且是編碼rna轉(zhuǎn)錄物的3'到3'端的序列稱(chēng)為“下游序列”。

“cdna”指與mrna互補(bǔ)或一致的呈單股或雙股形式的dna。

“編碼”指聚核苷酸中核苷酸(如基因、cdna或mrna)的特異性序列的固有性質(zhì)，其充當(dāng)生物過(guò)程中具有已確定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或已確定的氨基酸序列和由其所得生物特性的其它聚合物和大分子的合成模板。因此，如果由基因產(chǎn)生的mrna的轉(zhuǎn)錄與翻譯在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，那么所述基因編碼蛋白質(zhì)?；蚧騝dna的編碼股(其核苷酸序列與mrna序列一致并且通常在序列表中提供)和非編碼股(用作轉(zhuǎn)錄模板)可稱(chēng)為編碼所述基因或cdna的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另外說(shuō)明，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互為簡(jiǎn)并版本并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和rna的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。

“重組型核酸”指具有非天然接合在一起的核苷酸序列的核酸。這包括核酸載體，其包含可用于轉(zhuǎn)型適合的宿主細(xì)胞的擴(kuò)增或組裝核酸。包含重組型核酸的宿主細(xì)胞稱(chēng)為“重組型宿主細(xì)胞”。接著基因在重組型宿主細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生如“重組型多肽”。重組型核酸也可以發(fā)揮至編碼功能(如啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。

如果其中序列是第一序列的聚核苷酸與其中序列是第二序列的聚核苷酸特異性雜交，那么第一序列相對(duì)于第二序列是“反義”的。

用于描述兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參考序列”、“選自”、“對(duì)比窗口”、“一致性”、“序列一致性百分比”、“大體上一致”、“互補(bǔ)”和“大體上互補(bǔ)”。

對(duì)于核酸序列的序列對(duì)比，通常一個(gè)序列充當(dāng)與測(cè)試序列進(jìn)行比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)。使用默認(rèn)程序參數(shù)。用于比較的序列比對(duì)方法在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。用于比較的序列的最佳比對(duì)可例如通過(guò)smith和waterman,《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(adv.appl.math.)》2:482,1981的局部同源算法、needleman和wunsch,《分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol)》48:443,1970的同源性比對(duì)演算法、搜索pearson和lipman,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(proc.nat'l.acad.sci.usa)》85:2444,1988的類(lèi)似性方法、這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方案(威斯康星遺傳軟件包(wisconsingeneticssoftwarepackage),遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(geneticscomputergroup),575sciencedr.,madison,wi)或手動(dòng)比對(duì)和目視檢驗(yàn)(參見(jiàn)例如最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(currentprotocolsinmolecularbiology)(ausubel等人編,1995,增刊))來(lái)進(jìn)行。

適用算法的一個(gè)實(shí)例是pileup。pileup使用feng和doolittle,《分子演進(jìn)學(xué)雜志(j.mol.evol.)》35:351-360,1987的進(jìn)行性比對(duì)方法的簡(jiǎn)化形式。所使用的方法與由higgins和sharp,加拿大bios協(xié)會(huì)(cabios)5:151-153,1989描述的方法類(lèi)似。使用pileup，使用以下參數(shù)比較參考序列與其它測(cè)試序列以測(cè)定序列一致性關(guān)系百分比：默認(rèn)間隙權(quán)數(shù)(3.00)、默認(rèn)間隙長(zhǎng)度權(quán)數(shù)(0.10)和加權(quán)末端間隙。pileup可從gcg序列分析軟件包(如版本7.0(devereaux等人,核酸研究(nuc.acidsres.)12:387-395,1984)獲得。

適用于測(cè)定序列一致性百分比和序列類(lèi)似性的算法的另一實(shí)例是blast和blast2.0算法，其描述于altschul等人,《分子生物學(xué)雜志》215:403-410,1990和altschul等人,核酸研究25:3389-3402,1977中。用于進(jìn)行blast分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)獲得。blastn程式(對(duì)于核苷酸序列)使用字長(zhǎng)值(w)11、比對(duì)值(b)50、期望值(e)10、m＝5、n＝-4和兩個(gè)股的對(duì)比作為默認(rèn)。blastp程式(對(duì)于氨基酸序列)使用字長(zhǎng)值(w)3和期望值(e)10以及blosum62計(jì)分矩陣作為默認(rèn)(參見(jiàn)henikoff和henikoff，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》89:10915,1989)。

可操作地連接：當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄兄梅懦膳c第二核酸序列具有功能關(guān)系時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例來(lái)說(shuō)，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，那么啟動(dòng)子(如cmv啟動(dòng)子)可操作地連接于編碼序列。通常，可操作地連接的dna序列是相鄰的，并且必要時(shí)在相同閱讀框架中接合兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)。

肽：長(zhǎng)度在3與30個(gè)氨基酸之間的氨基酸鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，肽長(zhǎng)度是約10到約25個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施例中，肽長(zhǎng)度是約11到約20個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施例中，肽長(zhǎng)度是約9到12個(gè)氨基酸。

“人類(lèi)epha4肽”是來(lái)自人類(lèi)epha4蛋白質(zhì)的一系列相鄰氨基酸殘基?！靶∈骵pha4肽”是來(lái)自小鼠epha4蛋白質(zhì)的一系列相鄰氨基酸殘基。

在一個(gè)實(shí)例中，關(guān)于包含人類(lèi)epha4肽的免疫原性組合物，所述術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步指這些肽的變異形式，其中存在氨基酸的保守性取代，只要所述變異形式不改變超過(guò)約20％(如不超過(guò)約1％、約5％或約10％)的肽的能力以產(chǎn)生b細(xì)胞反應(yīng)或(當(dāng)結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體i類(lèi)分子時(shí))活化針對(duì)表達(dá)野生型人類(lèi)epha4蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞即可。使用合成肽和ctl細(xì)胞毒性分析的ctl的誘導(dǎo)教示于例如美國(guó)專(zhuān)利案第5,662,907號(hào)中。

肽修飾：多肽(如epha4多肽)包括本文中所描述的肽的合成實(shí)施例。此外，本文所描述的方法中可使用這些蛋白質(zhì)的類(lèi)似物(非肽有機(jī)分子)、衍生物(由所披露的肽序列作為起始而獲得的化學(xué)功能化肽分子)和變異體(同系物)。每個(gè)多肽包含氨基酸序列，其可以是l-和/或d-氨基酸、天然存在和其它氨基酸序列。

肽可通過(guò)多種化學(xué)技術(shù)修飾以產(chǎn)生具有與未經(jīng)修飾的肽基本上相同的活性并且任選地具有其它所需特性的衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的羧酸基(無(wú)論羧基端或側(cè)鏈)可以藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的鹽或酯化的形式提供以形成c1-c16酯，或轉(zhuǎn)化成式nr1r2的酰胺，其中r1和r2各自獨(dú)立地是h或c1-c16烷基，或組合以形成雜環(huán)，如5或6元環(huán)。肽的氨基(無(wú)論氨基端或側(cè)鏈)可呈藥學(xué)上可接受的酸加成鹽形式，如hcl、hbr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、馬來(lái)酸、酒石酸和其它有機(jī)鹽，或可修飾成c1-c16烷基或二烷基氨基或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成酰胺。

肽側(cè)鏈的羥基可使用公認(rèn)的技術(shù)轉(zhuǎn)化成c1-c16烷氧基或c1-c16酯。肽側(cè)鏈的苯基和酚環(huán)可經(jīng)一個(gè)或多個(gè)鹵素原子(如氟、氯、溴或碘)或c1-c16烷基、c1-c16烷氧基、羧酸和其酯或這類(lèi)羧酸的酰胺取代。肽側(cè)鏈的亞甲基可擴(kuò)展成同源c2-c4烯烴。硫醇可由許多公認(rèn)保護(hù)基中的任一種保護(hù)，如乙酰胺基團(tuán)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到用于將環(huán)狀結(jié)構(gòu)引入epha4肽以選擇和提供可產(chǎn)生增強(qiáng)的穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)的構(gòu)形限定。

設(shè)想肽模擬和有機(jī)模擬實(shí)施例，由此這類(lèi)肽模擬物和有機(jī)模擬物的化學(xué)成分的三維配置模擬肽主鏈和組分氨基酸側(cè)鏈的三維配置，引起epha4多肽的這類(lèi)肽模擬物和有機(jī)模擬物具有可測(cè)量或增強(qiáng)的產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。對(duì)于計(jì)算機(jī)模型化應(yīng)用，藥效團(tuán)是生物活性的結(jié)構(gòu)要求的理想化、三維定義。肽模擬物和有機(jī)模擬物可經(jīng)設(shè)計(jì)以擬合每個(gè)藥效團(tuán)與當(dāng)前計(jì)算機(jī)模型化軟體(使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)或cadd)。關(guān)于cadd中使用的技術(shù)的說(shuō)明，參見(jiàn)walters,《藥物的計(jì)算機(jī)輔助模型化(computer-assistedmodelingofdrugs)》,klegerman和groves編,1993,《醫(yī)藥學(xué)生物技術(shù)(pharmaceuticalbiotechnology)》,interpharmpress,buffalogrove,il,第165-174頁(yè)和《藥理學(xué)原理(principlesofpharmacology)》munson(編)1995,第102章。還包括使用這類(lèi)技術(shù)制備的模擬物。

藥劑：在適當(dāng)?shù)赝杜c個(gè)體或細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)所需治療性或預(yù)防性作用的化合物或組合物。

藥物學(xué)上可接受的載劑：使用的藥物學(xué)上可接受的載劑是常規(guī)的?！独酌黝D醫(yī)藥科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences)》,e.w.martin,mackpublishingco.,easton,pa,第15版,1975描述適用于本文中所披露的抗體的醫(yī)藥學(xué)傳遞的組合物和配制物。

通常，載劑的性質(zhì)將取決于所使用的具體投藥模式。舉例來(lái)說(shuō)，非經(jīng)腸配制物通常包含包括醫(yī)藥學(xué)上和生理學(xué)上可接受的流體的可注射流體，如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等來(lái)作為媒劑。對(duì)于固體組合物(如粉末、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規(guī)無(wú)毒性固體載劑可包括例如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除生物中性載劑以外，待投與的藥物組合物可以含有微量無(wú)毒輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑以及ph值緩沖劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。

預(yù)防、治療或改善疾?。骸邦A(yù)防”疾病指抑制疾病的完全發(fā)展?！爸委煛敝冈诩膊』虿±韺W(xué)病狀開(kāi)始發(fā)展后可改善疾病或病理學(xué)病狀的病征或癥狀的治療性干預(yù)，如腫瘤負(fù)荷降低、癌轉(zhuǎn)移的尺寸的數(shù)目降低或運(yùn)動(dòng)技能增加?！案纳啤敝讣膊?如腫瘤或als)的病征或癥狀的數(shù)目或嚴(yán)重度降低。

啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是引導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列的陣列。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核酸序列，例如在聚合酶ii型啟動(dòng)子(tata元素)情況下。啟動(dòng)子還任選地包括末端強(qiáng)化子或抑制子元素，其可位于來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的多達(dá)數(shù)千個(gè)堿基對(duì)。包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如bitter等人,《酶學(xué)方法(methodsinenzymology)》153:516-544,1987)。

可使用的啟動(dòng)子的特異性、非限制性實(shí)例包括來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因體(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒(入反轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列；腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。還可以使用由重組型dna或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子。可將聚核苷酸插入含有啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子序列有助于宿主的所插入的基因序列的有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子以及特異性核酸序列，其允許經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞的表現(xiàn)型選擇。

純化：術(shù)語(yǔ)純化不需要絕對(duì)純度；相反，意為相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，舉例來(lái)說(shuō)，純化的肽制劑是其中肽或蛋白質(zhì)比肽或蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的其天然環(huán)境中更加富集的制劑。在一個(gè)實(shí)施例中，制劑經(jīng)純化使得蛋白質(zhì)或肽占制劑的總肽或蛋白質(zhì)含量的至少50％。

本文中所披露的epha4多肽、特異性結(jié)合epha4的抗體、抗原結(jié)合片段和雙特異性抗體可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法中的任一種純化。參見(jiàn)例如《蛋白質(zhì)純化指導(dǎo)(guidetoproteinpurification)》,deutscher編,《酶學(xué)方法(meth.enzymol.)》185,academicpress,sandiego,1990；和scopes,《蛋白質(zhì)純化：原理和實(shí)踐(proteinpurification:principlesandpractice)》,springerverlag,newyork,1982?；旧霞兓硎緩钠渌鞍踪|(zhì)或細(xì)胞組分純化。基本上純化的蛋白質(zhì)是至少60％、70％、80％、90％、95％或98％純的。因此，在一個(gè)特異性、非限制性實(shí)例中，基本上純化的蛋白質(zhì)是90％不含其它蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分。

重組型：重組型核酸是具有非天然存在的序列或具有通過(guò)序列的兩個(gè)以其它方式分離的區(qū)段的人工組合而制得的序列的核酸。這種人工組合通常通過(guò)化學(xué)合成或核酸的經(jīng)分離的區(qū)段的人工操作實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)遺傳工程改造技術(shù)。

重組型毒素：其中細(xì)胞靶向部分(如抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體)與毒素融合的嵌合蛋白(pastan等人,《科學(xué)(science)》,254:1173-1177,1991)。如果細(xì)胞靶向部分是抗體的fv部分，那么分子稱(chēng)為重組型免疫毒素(chaudhary等人,《自然(nature)》,339:394-397,1989)。毒素部分以基因方式改變使得其不能結(jié)合于大部分正常細(xì)胞上的毒素受體。重組型免疫毒素選擇性殺死由抗原結(jié)合域識(shí)別的細(xì)胞。這些重組型毒素和免疫毒素可用于例如治療腫瘤，例如其中表達(dá)人類(lèi)epha4的腫瘤。重組型毒素是非天然存在的。

樣品(或生物樣品)：含有從個(gè)體獲得的基因組dna、rna(包括mrna)、蛋白質(zhì)或其組合的生物樣品。實(shí)例包括(但不限于)末梢血液、組織、細(xì)胞、尿液、唾液、組織活檢、細(xì)針穿刺物、手術(shù)樣品和尸檢材料。在一個(gè)實(shí)例中，樣品包括hcc組織活檢。

序列一致性：根據(jù)序列之間的類(lèi)似性來(lái)表示氨基酸與核酸序列之間的類(lèi)似性，或稱(chēng)為序列一致性。序列一致性經(jīng)常依據(jù)一致性百分比(或相似性或同源)測(cè)量；百分比越高，兩個(gè)序列越相似。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)準(zhǔn)時(shí)，多肽或核酸分子的同系物或變異體將具有相對(duì)較高的序列一致性程度。

用于比較的序列比對(duì)方法在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。多種程序和比對(duì)算法描述于以下文獻(xiàn)中：smith和waterman,《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》2:482,1981；needleman和wunsch,《分子生物學(xué)雜志》48:443,1970；pearson和lipman,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》,85:2444,1988；higgins和sharp,《基因(gene)》73:237,1988；higgins和sharp,加拿大bios協(xié)會(huì)5:151,1989；corpet等人,核酸研究16:10881,1988；以及pearson和lipman,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》,85:2444,1988。altschul等人,自然遺傳學(xué)6:119,1994呈現(xiàn)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的具體考慮因素。

ncbi基本查詢工具(ncbibasiclocalalignmentsearchtool；blast)(altschul等人,《分子生物學(xué)雜志》215:403,1990)可從若干來(lái)源獲得，包括美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncbi,bethesda,md)和因特網(wǎng)，以與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx結(jié)合使用。如何使用這種程序測(cè)定序列一致性的說(shuō)明課在因特網(wǎng)上的ncbi網(wǎng)站獲得。

通過(guò)使用ncbiblast2.0(空隙blastp設(shè)定成默認(rèn)參數(shù))與抗體的氨基酸序列的全長(zhǎng)比對(duì)，特異性結(jié)合epha4多肽的抗體的vl或vh的同系物和變異體通常由擁有至少約75％，例如至少約80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性計(jì)數(shù)表征。對(duì)于超過(guò)約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列的比較，使用設(shè)定成默認(rèn)參數(shù)的默認(rèn)blosum62矩陣，使用blast2序列功能(間隙存在成本是11，并且每個(gè)殘基間隙成本是1)。當(dāng)比對(duì)短肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，應(yīng)使用blast2序列功能，使用設(shè)定成默認(rèn)參數(shù)的pam30矩陣(開(kāi)放間隙9，延伸間隙1罰分)進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)通過(guò)這種方法評(píng)估時(shí)，與參考序列具有甚至更大類(lèi)似性的蛋白質(zhì)將展示增加的百分比標(biāo)識(shí)，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性。當(dāng)小于全部序列比較序列一致性時(shí)，同系物和變異體在10-20個(gè)氨基酸的短窗口內(nèi)通常將具有至少80％序列一致性，并且視其與參考序列的類(lèi)似性可具有至少85％或至少90％或95％的序列標(biāo)識(shí)。用于測(cè)定這類(lèi)短窗口內(nèi)的序列一致性的方法可在因特網(wǎng)上的ncbi網(wǎng)站獲得。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，僅出于指導(dǎo)目的而提供這些序列一致性范圍；完全有可能獲得處于所提供的范圍以外的強(qiáng)顯著同系物。

特異性結(jié)合劑：大體上僅結(jié)合于既定目標(biāo)的試劑。因此，epha4特異性結(jié)合劑是大體上結(jié)合于epha4多肽(如人類(lèi)和/或小鼠epha4)的試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，特異性結(jié)合劑是特異性結(jié)合epha4多肽的人類(lèi)單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段，或雙特異性抗體。

關(guān)于抗原(如epha4)，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指抗體或其它配位體(整體或部分)與攜有所述抗原的細(xì)胞或組織的優(yōu)先偶聯(lián)并且不與不含所述抗原的細(xì)胞或組織(如表達(dá)不同epha的細(xì)胞)偶聯(lián)。當(dāng)然，認(rèn)識(shí)到分子與非目標(biāo)細(xì)胞或組織之間可存在某種程度的非特異性相互相用。然而，特異性結(jié)合可由通過(guò)抗原的特異性識(shí)別來(lái)介導(dǎo)而區(qū)分。盡管選擇性反應(yīng)性抗體結(jié)合抗原，但其可能以低親和力結(jié)合。另一方面，特異性結(jié)合引起抗體(或其它配位體)與攜有抗原的細(xì)胞之間的比結(jié)合抗體(或其它配位體)與不含所述抗原的細(xì)胞之間的更強(qiáng)的偶聯(lián)。與不含多肽的細(xì)胞或組織相比，特異性結(jié)合通常引起結(jié)合抗體或其它配位體(每單位時(shí)間)與攜有epha4多肽的細(xì)胞或組織的量增加超過(guò)2倍，如超過(guò)5倍、超過(guò)10倍或超過(guò)100倍。在這類(lèi)條件下特異性結(jié)合于抗體需要針對(duì)其對(duì)具體蛋白質(zhì)的特異性選擇的抗體。多種免疫分析格式適于選擇與具體蛋白質(zhì)具有特異性免疫反應(yīng)性的抗體或其它配位體。舉例來(lái)說(shuō)，固相elisa免疫分析通常用于選擇與蛋白質(zhì)具有特異性免疫反應(yīng)性的mab。關(guān)于可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)性的免疫分析格式和條件的說(shuō)明，參見(jiàn)harlow和lane,《抗體實(shí)驗(yàn)指南(antibodies,alaboratorymanual)》,coldspringharborpublications,newyork(1988)。

個(gè)體：活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，包括人類(lèi)和家畜個(gè)體的類(lèi)別，包括人類(lèi)和非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。

治療有效量：足以在所治療的個(gè)體中實(shí)現(xiàn)所需作用的特定物質(zhì)的量。舉例來(lái)說(shuō)，這可以是抑制或抑止腫瘤生長(zhǎng)所必需的量。在一個(gè)實(shí)施例中，治療有效量是消除、減小尺寸或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的量。當(dāng)投與個(gè)體時(shí)，通常將使用可實(shí)現(xiàn)已證實(shí)可實(shí)現(xiàn)所需活體外作用的目標(biāo)組織濃度(例如腫瘤中)的劑量。

毒素：對(duì)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的分子。毒素包括相思子毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素(pe)、白喉毒素(dt)、肉毒桿菌毒素、沙泊寧(saporin)、局限曲菌素(restrictocin)或白樹(shù)素(gelonin)或其經(jīng)修飾的毒素。舉例來(lái)說(shuō)，pe和dt是通常通過(guò)肝臟毒性引起死亡的高毒性化合物。然而，pe和dt可通過(guò)移除毒素的原生靶向組分(如pe的結(jié)構(gòu)域ia和dt的b鏈)并且用不同的靶向部分(如抗體)置換而修飾成適用作免疫毒素的形式。

載體：引入宿主細(xì)胞的核酸分子，從而產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)型的宿主細(xì)胞。載體可包括核酸序列，其允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制，如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包括一個(gè)或多個(gè)可選標(biāo)記基因和所屬領(lǐng)域中已知的其它基因元素。

除非另外闡述，否則本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。除非上下文另外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式包含復(fù)數(shù)個(gè)指示物。除非上下文另外明確指示，否則短語(yǔ)“a或b”意圖包括a、b以及a和b。因此，“包含a或b”意謂包括a、b或“a和b”。還應(yīng)理解，關(guān)于核酸或多肽提供的所有堿基尺寸或氨基酸尺寸以及所有分子量或分子量值都是近似值，并且提供用于說(shuō)明目的。雖然可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用類(lèi)似于或等效于本文中所描述的那些方法和材料的方法和材料，但在下文描述合適的方法和材料。本文中所提到的所有公開(kāi)案、專(zhuān)利申請(qǐng)案、專(zhuān)利案以及其它參考文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。所有寄存編號(hào)以引用的方式并入本文中，如同其出現(xiàn)在2011年9月5日的資料庫(kù)中。在有矛盾的情況下，將以本說(shuō)明書(shū)(包括術(shù)語(yǔ)的解釋)為準(zhǔn)。此外，材料、方法以及實(shí)例僅僅是說(shuō)明性的并且不打算作為限制。

具體實(shí)施方式

i.說(shuō)明

本發(fā)明提供特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體，以及這些抗體的抗原結(jié)合片段(如單鏈抗體、fab或f(ab')2、重鏈或輕鏈的可變區(qū)，即，vh或vl)、這些抗體的雙特異性形式以及這些抗體/片段與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)分子的結(jié)合物(包括呈融合蛋白形式的結(jié)合物)。此外，披露編碼這些抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和呈融合蛋白形式的結(jié)合物的核酸。在一些實(shí)施例中，披露包括這些核酸的載體，和包括這些載體的宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物包括這些單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體、結(jié)合物、核酸和載體。這些單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體、結(jié)合物、核酸和載體可用于鑒別和治療患有腫瘤的個(gè)體，并且還可用于鑒別和治療患有神經(jīng)退化性疾病(例如ad、pd、als、ms等)或情感障礙(如抑郁癥)的個(gè)體。

更確切地說(shuō)，本發(fā)明涵蓋具有不同活性的若干種完全人類(lèi)單克隆epha4抗體。igg1m101、m105和m119特異性識(shí)別epha4的配位體結(jié)合域。舉例來(lái)說(shuō)，igg1m105特異性抑制epha4與艾普瑞林-a/b的相互相用，但不干擾艾普瑞林-b與ephb2受體之間的相互相用?？贵w還呈現(xiàn)針對(duì)epha4配位體結(jié)合域的強(qiáng)結(jié)合親和力。m101和m119igg1以1nmol/l的ec50結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4，而m105igg1以次納摩爾ec50結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4。此外，igg1m119通過(guò)刺激epha4活化來(lái)充當(dāng)促效抗體，而igg1m105充當(dāng)epha4拮抗劑，其減弱艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4活化。igg1m105的拮抗活性使這一抗體稱(chēng)為用于治療神經(jīng)變性病(如ad、pd、ms或als)的潛在高效治療工具。igg1m105不影響ephb與其配位體的結(jié)合，并且其展示針對(duì)具有不同同源配位體成員的epha4的不同拮抗活性?？贵w顯示對(duì)其拮抗活性的特異性。當(dāng)由aβ刺激時(shí)，igg1m105結(jié)合神經(jīng)元上的epha4受體，aβ是引起ad中突觸損傷的主要試劑。據(jù)本發(fā)明人所知，這是第一種拮抗性epha4抗體。盡管若干更早的專(zhuān)利文件描述多種epha4抗體，但無(wú)一與本發(fā)明的完全人類(lèi)單克隆抗體類(lèi)似。舉例來(lái)說(shuō)，us7,604,799披露epha4促效抗體。然而，這些更早的抗體與本發(fā)明的抗體不同。不僅在于其具有不同的cdr氨基酸序列，這些更早的抗體還不具有高親和力結(jié)合epha4和本發(fā)明的抗體的特異性。類(lèi)似地，未報(bào)導(dǎo)us8,003,098和20090191211a1中所披露的抗體具有拮抗性活性。

ii.單克隆抗體和抗原結(jié)合片段

本發(fā)明披露新型抗epha4抗體。本文中披露抗體和抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合epha4，如人類(lèi)和小鼠epha4。在一些實(shí)施例中，抗體以0.1×10^-8m、至少約0.3×10^-8m、至少約0.5×10^-8m、至少約0.75×10^-8m、至少約1.0×10^-8m、至少約1.3×10^-8m、至少約1.5×10^-8m或至少約2.0×10^-8m的結(jié)合親和力結(jié)合epha4。

在一個(gè)實(shí)施例中，人類(lèi)epha4具有如以下闡述的氨基酸序列：

還參見(jiàn)genebank寄存編號(hào)aah26327.1，如可在2005年7月30日獲得，其以引用的方式并入本文中。

在其它實(shí)施例中，小鼠epha4具有如以下闡述的氨基酸序列：

還參見(jiàn)genebank寄存編號(hào)aah04782，2003年10月3日，其以引用的方式并入本文中。

在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括m101的重鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m101的重鏈的氨基酸序列是：

qvqlqqsgaevkkpgssvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycatapmvcsstscylrgfdywgqgtlvtvss(seqidno:3，其中cdr由粗體和下劃線表示)。

因此，在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115中的一個(gè)或多個(gè)。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括m105的重鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m105的重鏈的氨基酸序列是：

evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarellycsstscgthgfdiwgqgtmvtvss(seqidno:4，其中cdr由粗體和下劃線表示)

因此，在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115中的一個(gè)或多個(gè)。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、seqidno:4的氨基酸51-58和如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

在其它實(shí)施例中，重鏈可變域抗體或抗原結(jié)合片段包括m119的重鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m119的重鏈的氨基酸序列是：

eivltqsplslpvtpgepasiscrssqsllhgngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpwtfgqgtkveik(seqidno:5，其中cdr由粗體和下劃線表示)

因此，在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一個(gè)或多個(gè)。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括實(shí)施例，抗體的重鏈包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一個(gè)或多個(gè)。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈可變域包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括m101的輕鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m101的輕鏈的氨基酸序列是：

dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpitfgqgtrleik(seqidno:6，其中cdr由粗體和下劃線表示)

因此，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域可包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括m105的輕鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m105的輕鏈的氨基酸序列是：

dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtplafgggtkveik(seqidno:7，其中cdr由粗體和下劃線表示)

因此，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域可包括如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:7闡述的氨基酸序列中闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括m119的輕鏈cdr中的一個(gè)或多個(gè)。m105的輕鏈的氨基酸序列是：

eivltqsplslpvtpgepasiscrssqsllhgngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtpwtfgqgtkveik(seqidno:8，其中cdr由粗體和下劃線表示)

因此，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域可包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它實(shí)施例中，抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列。在所有這些實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合epha4。

本文中所披露的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段和雙特異性抗體可以是完全人類(lèi)的。完全人類(lèi)單克隆抗體包括人類(lèi)構(gòu)架區(qū)。重鏈構(gòu)架區(qū)可以是seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5(這些序列包括cdr序列以及構(gòu)架序列)中的構(gòu)架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)。然而，重鏈構(gòu)架區(qū)可以來(lái)自另一來(lái)源。輕鏈構(gòu)架區(qū)可以是seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8中闡述的構(gòu)架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)。然而，輕鏈構(gòu)架區(qū)可以來(lái)自另一來(lái)源。在一些實(shí)施例中，在以治療方式使用時(shí)，使用人類(lèi)構(gòu)架區(qū)可降低對(duì)抗體的反應(yīng)。還提供所披露的抗體的嵌合形式，其中重鏈構(gòu)架區(qū)和/或輕鏈構(gòu)架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)自另一物種，如小鼠、大鼠或兔抗體。在一些實(shí)施例中，選擇具有低免疫原性的構(gòu)架區(qū)。

本文中所披露的重鏈可變域中的任一個(gè)可以與本文中所披露的任何輕鏈可變域區(qū)域組合，限制條件是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合epha4。在一些實(shí)施例中，單克隆抗體或抗原結(jié)合片段包括以下中的一個(gè)：

a)重鏈可變域，其包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；

b)重鏈可變域，其包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括seqidno:7的氨基酸27-37、如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或

c)重鏈可變域，其包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。

在其它實(shí)施例中，單克隆抗體或抗原結(jié)合片段包括以下中的一個(gè)：

a)重鏈可變域，其包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如seqidno:3闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、seqidno:6的氨基酸55-57和如seqidno:6闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；

b)重鏈可變域，其包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如seqidno:4闡述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、seqidno:7的氨基酸55-57和如seqidno:7闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或

c)重鏈可變域，其包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:5闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和輕鏈可變域，其包括seqidno:8的氨基酸27-37、如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如seqidno:8闡述的氨基酸序列的氨基酸94-100。

在一些實(shí)施例中，單克隆抗體或抗原結(jié)合片段包括以下中的一個(gè)：

a)重鏈可變域，其包括如seqidno:3闡述的氨基酸序列，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:6闡述的氨基酸序列；

b)重鏈可變域，其包括如seqidno:4闡述的氨基酸序列，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:7闡述的氨基酸序列；或

c)重鏈可變域，其包括如seqidno:5闡述的氨基酸序列，和輕鏈可變域，其包括如seqidno:8闡述的氨基酸序列。

本文中所披露的單克隆抗體可以具有任何同型。單克隆抗體可以是例如igm或igg抗體，如igg1、igg2、igg3或igg4。根據(jù)眾所周知的程序，可用另一種抗體替換特異性結(jié)合epha4的抗體類(lèi)別(例如igg可換成igm)。類(lèi)別變換也可用于將一種igg子類(lèi)別轉(zhuǎn)換成另一種，如從igg1到igg2。

本發(fā)明涵蓋抗體片段，如fab、f(ab')2和fv，其包括重鏈和輕鏈可變區(qū)并且能夠結(jié)合epha4上的抗原決定基。這些抗體片段保留與抗原選擇性結(jié)合的能力。雙特異性抗體中可包括抗原結(jié)合片段。這些抗原結(jié)合片段包括：

(1)fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，其可通過(guò)用番木瓜酶消化完全抗體以產(chǎn)生完整輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分來(lái)產(chǎn)生；

(2)fab'，可通過(guò)用胃蛋白酶處理完全抗體，接著還原以產(chǎn)生完整輕鏈和重鏈的一部分而獲得的抗體分子的片段；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)fab'片段；

(3)(fab')2，可通過(guò)用胃蛋白酶處理完全抗體且無(wú)后續(xù)還原而獲得的抗體的片段；f(ab')2是由兩個(gè)二硫鍵保持在一起的兩個(gè)fab'片段的二聚體；

(4)fv，含有表達(dá)為兩個(gè)鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)的經(jīng)基因工程改造的片段；和

(5)單鏈抗體(如scfv)，定義為含有輕鏈的可變區(qū)、重鏈的可變區(qū)(由適合的多肽連接子連接)的經(jīng)基因工程改造的分子，如基因融合單鏈分子。

(6)單鏈抗體的二聚體(scfv2)，定義為scfv的二聚體。其been稱(chēng)為“微型抗體”。

制造這些片段的方法是所屬領(lǐng)域中已知的(參見(jiàn)例如harlow和lane,《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(antibodies:alaboratorymanual)》,coldspringharborlaboratory,newyork,1988)。在若干實(shí)例中，抗體中所包括的可變區(qū)是m610.27的可變區(qū)。在一組實(shí)施例中，抗體具有vhcdrsm610.27，或這些cdr的組合，如上文所討論。

在另一組實(shí)施例中，抗體是fv抗體，其通常是約25kda并且含有完全抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中每個(gè)重鏈和每個(gè)輕鏈具有三個(gè)cdr。為了產(chǎn)生這些抗體，vh和vl可由宿主細(xì)胞中兩個(gè)個(gè)別核酸構(gòu)筑體表達(dá)。如果非連續(xù)地表達(dá)vh和vl，那么fv抗體的鏈通常由非共價(jià)相互作用保持在一起。然而，這些鏈傾向于在稀釋時(shí)分解，因此已研發(fā)方法以使鏈通過(guò)戊二醛、分子間二硫鍵或肽連接子交聯(lián)。因此，在一個(gè)實(shí)例中，fv可以是二硫鍵穩(wěn)定化fv(dsfv)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)二硫鍵化學(xué)連接。

在另一實(shí)例中，fv片段包含由肽連接子連接的vh和vl鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(scfv)是通過(guò)建構(gòu)包含編碼由寡核苷酸連接的vh和vl結(jié)構(gòu)域的dna序列的結(jié)構(gòu)基因來(lái)制備。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體隨后被引入如大腸桿菌的宿主細(xì)胞中。重組型宿主細(xì)胞合成單個(gè)多肽鏈，其中連接肽橋接兩個(gè)v域。用于產(chǎn)生scfv的方法是所屬領(lǐng)域中已知的(參見(jiàn)whitlow等人,《方法：酶學(xué)方法手冊(cè)(methods:acompaniontomethodsinenzymology)》,第2卷,第97頁(yè),1991；bird等人,科學(xué)242:423,1988；美國(guó)專(zhuān)利案第4,946,778號(hào)；pack等人,《生物技術(shù)(bio/technology)》11:1271,1993；以及sandhu,見(jiàn)上文)。還涵蓋單鏈抗體的二聚體(scfv2)。

抗體片段可通過(guò)抗體的蛋白水解或在編碼片段的dna的大腸桿菌中的表達(dá)來(lái)制備?？贵w片段可以通過(guò)以常規(guī)方法，通過(guò)完全抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化來(lái)獲得。舉例來(lái)說(shuō)，抗體片段可通過(guò)用胃蛋白酶進(jìn)行抗體的酶促裂解以提供5s片段(表示為f(ab')2)來(lái)產(chǎn)生?？梢允褂脦€基還原劑，以及任選地由二硫鍵裂解產(chǎn)生的巰基的保護(hù)基團(tuán)來(lái)進(jìn)一步裂解這一片段以產(chǎn)生3.5sfab'單價(jià)片段?；蛘?，使用胃蛋白酶進(jìn)行的酶促裂解直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)fab'片段和一個(gè)fc片段(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第4,036,945號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第4,331,647號(hào)，以及其中所含的參考文獻(xiàn)；nisonhoff等人,《生物化學(xué)與生物物理學(xué)集刊(arch.biochem.biophys.)》89:230,1960；porter,《生物化學(xué)雜志(biochem.j.)》73:119,1959；edelman等人,酶學(xué)方法,第1卷,第422頁(yè),academicpress,1967；以及coligan等人,第2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4章)。

其它裂解抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，進(jìn)一步裂解片段的方法或其它酶、化學(xué)或遺傳技術(shù)也可使用，只要所述片段結(jié)合到被完整抗體識(shí)別的抗原即可。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可產(chǎn)生抗體的保守性變異體?？贵w片段(如dsfv片段或scfv片段)中使用的這類(lèi)保守性變異體將保留對(duì)于vh和vl區(qū)域之間的正確折疊和穩(wěn)定化來(lái)說(shuō)所必需的關(guān)鍵氨基酸殘基，并且將保留殘基的電荷特征以保留分子的低pi和低毒性?？稍趘h和vl區(qū)中進(jìn)行氨基酸取代(如至多一個(gè)、至多兩個(gè)、至多三個(gè)、至多四個(gè)或至多五個(gè)氨基酸取代)以增加產(chǎn)率。提供功能性類(lèi)似氨基酸的保守性氨基酸取代表是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)上文)。因此，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易評(píng)論上文展示的序列、鑒別保守性取代以及使用眾所周知的分子技術(shù)產(chǎn)生保守性變異體。

本文中還提供雙特異性抗體。一種衍生抗體是通過(guò)使兩個(gè)(或更多個(gè))不同抗體、抗原結(jié)合片段和/或經(jīng)工程改造的抗體結(jié)構(gòu)域ead交聯(lián)以產(chǎn)生雙特異性抗體來(lái)產(chǎn)生。適合的交聯(lián)劑包括異型雙功能性、具有由適合的間隔基間隔的兩個(gè)明顯反應(yīng)性基團(tuán)(如間順丁烯二酰亞胺苯甲?；?n-羥基丁二酰亞胺酯)或同型雙功能性(如辛二酸二丁二酰亞氨酯)交聯(lián)劑。這類(lèi)連接子可從piercechemicalcompany,rockford,ill獲得。因此，兩個(gè)所披露的epha抗體或其抗原結(jié)合片段可組合以形成雙特異性抗體。所披露的抗體和抗原結(jié)合片段還可以與ead組合以產(chǎn)生雙特異性抗體。

本文中提供所披露的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段和雙特異性抗體的結(jié)合物。多肽通常含有多個(gè)官能團(tuán)；如羧酸(cooh)、自由胺(-nh2)或硫氫基(-sh)，其可用于與抗體上適合的官能團(tuán)反應(yīng)以引起效應(yīng)分子的結(jié)合。或者，抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體經(jīng)衍生以暴露或連接其它反應(yīng)性官能團(tuán)。所述衍生作用可以涉及連接許多連接分子中的任一個(gè)，如購(gòu)自piercechemicalcompany,rockford,il的連接分子。連接子可以是任何用于使抗體與效應(yīng)分子接合的分子。連接子能夠形成與抗體和效應(yīng)分子的共價(jià)鍵。適合的連接子是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的并且包括(但不限于)直鏈或分支鏈碳連接子、雜環(huán)碳連接子或肽連接子。當(dāng)單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體和效應(yīng)分子是多肽時(shí)，連接子可通過(guò)其側(cè)面基團(tuán)(如通過(guò)與半胱氨酸的二硫鍵)與成分氨基酸接合或與末端氨基酸的α碳氨基和羧基接合。實(shí)際上，可使用類(lèi)似方法形成雙特異性抗體，或多價(jià)抗體，如通過(guò)使單克隆抗體或抗原結(jié)合片段連接到另一相關(guān)抗體。

本文中所披露的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗體片段和雙特異性抗體可關(guān)于與另一分子(如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì))的連接而衍生。通常，抗體或其部分經(jīng)衍生使得與epha4的結(jié)合不受衍生作用或標(biāo)記的不利影響。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體可功能性連接(通過(guò)化學(xué)偶合、基因融合、非共價(jià)偶聯(lián)或以其它方式)到一個(gè)或多個(gè)其它分子實(shí)體，如另一抗體(例如以形成雙特異性抗體)、檢測(cè)劑、藥劑、毒素和/或蛋白質(zhì)或肽，其可介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一分子(如抗生蛋白鏈菌素核心區(qū)或多組氨酸標(biāo)簽)的偶聯(lián)。

共價(jià)和非共價(jià)連接手段都可以用于效應(yīng)分子的連接。用于使效應(yīng)分子連接到單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體的程序根據(jù)效應(yīng)子的化學(xué)結(jié)構(gòu)而變化。在一些情況下，當(dāng)免疫結(jié)合物到達(dá)其目標(biāo)位點(diǎn)時(shí)，需要使效應(yīng)分子脫離單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體。因此，在這些情形中，免疫結(jié)合物將包含可在目標(biāo)位點(diǎn)附近裂解的連接。連接子裂解以從單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體釋放效應(yīng)分子可通過(guò)目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部或目標(biāo)位點(diǎn)附近的酶促活性或免疫結(jié)合物經(jīng)歷的條件來(lái)促進(jìn)。鑒于已報(bào)導(dǎo)大量的用于連接多種放射診斷化合物、放射性治療化合物、標(biāo)記物(如酶或熒光分子)藥物、毒素和其它試劑的方法，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠確定用于使既定試劑連接到抗體或其它多肽的適合方法。

在若干實(shí)施例中，連接子可包括間隔元素，其在存在時(shí)增加連接子的尺寸使得效應(yīng)分子或可檢測(cè)標(biāo)記物與抗體(或抗原結(jié)合片段)之間的距離增加。例示性間隔基是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并且包括美國(guó)專(zhuān)利案第7,964,5667號(hào)、第498,298號(hào)、第6,884,869號(hào)、第6,323,315號(hào)、第6,239,104號(hào)、第6,034,065號(hào)、第5,780,588號(hào)、第5,665,860號(hào)、第5,663,149號(hào)、第5,635,483號(hào)、第5,599,902號(hào)、第5,554,725號(hào)、第5,530,097號(hào)、第5,521,284號(hào)、第5,504,191號(hào)、第5,410,024號(hào)、第5,138,036號(hào)、第5,076,973號(hào)、第4,986,988號(hào)、第4,978,744號(hào)、第4,879,278號(hào)、第4,816,444號(hào)和第4,486,414號(hào)以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第20110212088號(hào)和第20110070248號(hào)中列出的間隔基，其中每一個(gè)以全文引用的方式并入。

特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體可用可檢測(cè)部分標(biāo)記。適用檢測(cè)劑包括熒光化合物，包括螢光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、5-二甲基胺-1-萘磺?；?、藻紅蛋白、鑭系磷光體等。還可以使用生物發(fā)光標(biāo)記物，如熒光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體還可以用適用于檢測(cè)的酶標(biāo)記，如辣根過(guò)氧化酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等?？蓹z測(cè)酶可通過(guò)添加酶用于產(chǎn)生可辨別的反應(yīng)產(chǎn)物的其它試劑來(lái)檢測(cè)。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)存在試劑辣根過(guò)氧化酶時(shí)，添加過(guò)氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺可產(chǎn)生彩色的反應(yīng)產(chǎn)物，其可目視檢測(cè)。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體還可以用生物素標(biāo)記，并且通過(guò)抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的間接測(cè)量來(lái)檢測(cè)。應(yīng)注意，抗生物素蛋白本身可用酶或熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。

單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體可用磁性試劑標(biāo)記，如釓。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體也可以用鑭系元素(乳銪和鏑)和錳標(biāo)記。還可以使用順磁粒子(如超順磁氧化鐵)作為標(biāo)記物。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體還可以用可由第二報(bào)導(dǎo)子(如白胺酸拉鏈對(duì)序列、二級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合域、抗原決定基標(biāo)簽)識(shí)別的預(yù)定多肽抗原決定基標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記物由具有多種長(zhǎng)度的間隔基臂連接以降低潛在位阻。

單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體也可以用放射性標(biāo)記氨基酸標(biāo)記。放射性標(biāo)記可以用于診斷和治療目的。舉例來(lái)說(shuō)，放射性標(biāo)記可用于通過(guò)x射線、發(fā)射光譜或其它診斷技術(shù)檢測(cè)epha4。用于多肽的標(biāo)記物的實(shí)例包括(但不限于)以下放射性同位素或放射性核種：³h、¹⁴c、¹⁵n、³⁵s、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in、¹²⁵i、¹³¹i。在一些實(shí)施例中，這些結(jié)合物可用于治療腫瘤，例如乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。在其它實(shí)施例中，這些毒素可用于治療肌肉萎縮性側(cè)索硬化。

單克隆抗體、抗原結(jié)合片段和雙特異性抗體可與治療劑(如化學(xué)治療劑)結(jié)合以產(chǎn)生抗體藥物結(jié)合物(adc)。在若干實(shí)施例中，多種化學(xué)治療劑可與所提供的抗體結(jié)合以產(chǎn)生結(jié)合物。在一些實(shí)施例中，這些結(jié)合物可用于治療腫瘤，例如乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。

毒素可與特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體以及這些抗體的抗原結(jié)合片段一起使用。例示性毒素包括綠膿桿菌外毒素(pe)、蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素和其子單元、核糖體毒素、核糖核酸酶、沙泊寧和卡奇霉素(calicheamicins)，以及肉毒桿菌毒素a到f。這些毒素在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的并且許多可以從商業(yè)來(lái)源(例如sigmachemicalcompany,st.louis,mo)獲得。預(yù)期毒素還包括所述毒素的變異體(參見(jiàn)例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,079,163號(hào)和第4,689,401號(hào))。在一些實(shí)施例中，這些結(jié)合物可用于治療腫瘤，例如乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。在其它實(shí)施例中，這些毒素可用于治療肌肉萎縮性側(cè)索硬化。

沙泊寧是來(lái)源于石堿草(saponariaofficinalis)的毒素，其通過(guò)不活化核糖體復(fù)合物的60s部分來(lái)干擾蛋白質(zhì)合成(stirpe等人,生物技術(shù)，10:405-412,1992)。然而，毒素不具有用于特異性進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制，并且因此需要與識(shí)別內(nèi)化細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的抗體(或抗原結(jié)合片段)結(jié)合以被細(xì)胞有效吸收。

從白喉?xiàng)U菌(corynebacteriumdiphtheriae)分離白喉毒素。通常，用于免疫毒素的白喉毒素經(jīng)突變以降低或消除非特異性毒性。從1970年代已知稱(chēng)為crm107的突變體，其具有完全酶促活性但非特異性毒性顯著降低(laird和groman,《病毒學(xué)雜志(j.virol.)》19:220,1976)，并且已用于人類(lèi)臨床試驗(yàn)中。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,792,458號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第5,208,021號(hào)。

蓖麻毒素是來(lái)自蓖麻(ricinuscommunis)(蓖麻豆)的凝集素rca60。關(guān)于蓖麻毒素的實(shí)例，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,079,163號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第4,689,401號(hào)。蓖麻凝集素(rca)以稱(chēng)為rca60和rca120的兩種形式產(chǎn)生(分別根據(jù)其分子量是約65和120kd)(nicholson和blaustein,《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(j.biochim.biophys.acta)》266:543,1972)。a鏈負(fù)責(zé)不活化蛋白質(zhì)合成和殺死細(xì)胞。b鏈?zhǔn)贡吐槎舅嘏c細(xì)胞表面半乳糖殘基結(jié)合并且促進(jìn)a鏈傳遞到細(xì)胞溶質(zhì)中(olsnes等人,自然249:627-631,1974和美國(guó)專(zhuān)利案第3,060,165號(hào))。

核糖核酸酶也與適用作免疫毒素的靶向分子結(jié)合(參見(jiàn)suzuki等人,自然生物技術(shù)17:265-70,1999)。例示性核糖體毒素(如α-八疊球菌和局限曲菌素)討論于例如rathore等人,《基因》190:31-5,1997；和goyal和batra,《生物化學(xué)(biochem.)》345pt2:247-54,2000中?？ㄆ婷顾厥紫葟募咝捂呔?micromonosporaechinospora)分離并且是烯二炔抗腫瘤抗生素家族的成員，其引起dna中的雙鏈破壞，從而引起細(xì)胞凋亡(參見(jiàn)例如lee等人,《抗生素雜志(j.antibiot.)》42:1070-87,1989)。藥物是臨床試驗(yàn)中免疫毒素的毒性部分(參見(jiàn)例如gillespie等人,《腫瘤學(xué)年鑒(ann.oncol.)》11:735-41,2000)。

相思子毒素包括來(lái)自相思子(abrusprecatorius)的毒性凝集素。毒性成分(相思子毒素a、b、c和d)具有約63和67kd的分子量并且由兩個(gè)二硫鍵連接的多肽鏈a和b組成。a鏈抑制蛋白質(zhì)合成；b鏈(相思子毒素-b)結(jié)合于d-半乳糖殘基(參見(jiàn)funatsu等人,《農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)(agr.biol.chem.)》52:1095,1988；和olsnes,酶學(xué)方法50:330-335,1978)。

在一個(gè)實(shí)施例中，毒素是綠膿桿菌外毒素(pe)(美國(guó)專(zhuān)利案第5,602,095號(hào))。如本文中所使用，pe包括全長(zhǎng)原生(天然存在的)pe或已經(jīng)修飾的pe。這類(lèi)修飾可包括(但不限于)結(jié)構(gòu)域ia的消除、結(jié)構(gòu)域ib、ii和iii中的多種氨基酸缺失、單一氨基酸取代和羧基端處一個(gè)或多個(gè)序列的添加(例如參見(jiàn)siegall等人,《生物化學(xué)雜志》264:14256-14261,1989)。

與所提供的抗體一起使用的pe可包括原生序列、原生序列的細(xì)胞毒性片段和原生pe的保守性修飾變異體以及其細(xì)胞毒性片段。pe的細(xì)胞毒性片段包括具有或不具有后續(xù)蛋白水解或目標(biāo)細(xì)胞中的其它處理的細(xì)胞毒性片段。pe的細(xì)胞毒性片段包括pe40、pe38和pe35。關(guān)于pe和其變體的其它說(shuō)明，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第4,892,827號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,512,658號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,602,095號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,608,039號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,821,238號(hào)；以及美國(guó)專(zhuān)利案第5,854,044號(hào)；wo99/51643；pai等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》,88:3358-3362,1991；kondo等人,《生物化學(xué)雜志》,263:9470-9475,1988；pastan等人,《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》,1333:c1-c6,1997。在一些實(shí)例中，pe是pe38。

本文中還涵蓋蛋白酶耐受性pe變異體和具有降低的免疫原性的pe變異體，如(但不限于)pe-lr、pe-6x、pe-8x、pe-lr/6x和pe-lr/8x(參見(jiàn)例如weldon等人,《血液學(xué)(blood)》113(16):3792-3800,2009；onda等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》105(32):11311-11316,2008；wo2007/016150、wo2009/032954和wo2011/032022)。

在一些實(shí)例中，pe是對(duì)溶酶體降解具有抗性的變異體，如pe-lr(weldon等人,《血液學(xué)》113(16):3792-3800,2009；wo2009/032954)。在其它實(shí)例中，pe是稱(chēng)為pe-lr/6x的變異體(wo2011/032022)。在其它實(shí)例中，pe是稱(chēng)為pe-lr/8m的變異體(wo2011/032022)。

單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體也可以用化學(xué)基團(tuán)衍生，如聚乙二醇(peg)、甲基或乙基或碳水化合物基團(tuán)。這些基團(tuán)可適用于改良抗體的生物特征，如增加血清半衰期或增加組織結(jié)合。

結(jié)合物中每個(gè)抗體(或抗原結(jié)合片段)的效應(yīng)分子或可檢測(cè)標(biāo)記物部分的平均數(shù)目可例如在每個(gè)抗體(或抗原結(jié)合片段)1到20個(gè)部分范圍內(nèi)。對(duì)于一些結(jié)合物，每個(gè)抗體(或抗原結(jié)合片段)的效應(yīng)分子或可檢測(cè)標(biāo)記物部分的平均數(shù)目可由抗體(或抗原結(jié)合片段)上連接位點(diǎn)的數(shù)目限制。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)連接是半胱氨酸硫醇時(shí)，抗體(或抗原結(jié)合片段)可僅具有一個(gè)或若干個(gè)半胱氨酸硫醇基，或可僅具有一個(gè)或若干個(gè)充分反應(yīng)性硫醇基(連接子可通過(guò)其連接)。在某些實(shí)施例中，結(jié)合物中每個(gè)抗體(或抗原結(jié)合片段)的效應(yīng)分子或可檢測(cè)標(biāo)記物部分的平均數(shù)目在1到約8個(gè)；約2到約6個(gè)；約3到約5個(gè)；約3到約4個(gè)；約3.1約3.9個(gè)；約3.2到約3.8個(gè)；約3.2到約3.7個(gè)；約3.2到約3.6個(gè)；約3.3到約3.8個(gè)；或約3.3到約3.7個(gè)范圍內(nèi)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第7,498,298號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)。結(jié)合物制劑中每個(gè)抗體(或抗原結(jié)合片段)的效應(yīng)分子或可檢測(cè)標(biāo)記物部分的平均數(shù)目可由常規(guī)手段(如質(zhì)譜和elisa分析)表征。

可以不同方式控制結(jié)合物的負(fù)荷(例如效應(yīng)分子/抗體比率)，例如通過(guò)：(i)限制效應(yīng)分子-連接子中間物或連接子試劑相對(duì)于抗體的摩爾過(guò)量，(ii)限制結(jié)合反應(yīng)時(shí)間或溫度，(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修飾的還原條件，(iv)通過(guò)重組技術(shù)對(duì)抗體的氨基酸序列進(jìn)行工程改造，使得半胱氨酸殘基的數(shù)目和位置經(jīng)修飾以控制連接子效應(yīng)分子連接的數(shù)目或位置(如根據(jù)wo2006/034488中所披露制備的thiomab或thiofab)。

iii.核酸和宿主細(xì)胞

本文還提供編碼所披露的重鏈和輕鏈可變域的氨基酸序列的核酸。核酸分子可以是cdna。編碼所披露的抗體和抗原結(jié)合片段的重組型核酸分子可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用本文中提供的氨基酸序列和基因碼容易地產(chǎn)生。此外，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地構(gòu)筑多種含有功能等效核酸的純系，如序列不同但編碼相同蛋白質(zhì)序列的核酸。因此，本文中提供編碼所披露的抗體和抗原結(jié)合片段以及其組分、結(jié)合物、雙特異性形式和結(jié)合物的核酸分子。

編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物和雙特異性抗體的核酸序列可通過(guò)任何適合的方法制備，包括例如適合的序列的克隆或通過(guò)如以下方法進(jìn)行直接化學(xué)合成：如narang等人,《酶學(xué)方法》68:90-99,1979中的磷酸三酯方法的方法；brown等人,《酶學(xué)方法》68:109-151,1979中的磷酸二酯方法；beaucage等人,《四面體通訊(tetra.lett.)》22:1859-1862,1981的二乙基氨基磷酸酯方法；由beaucage和caruthers,《四面體通訊》22(20):1859-1862,1981描述的固相氨基磷酸三酯方法，例如使用自動(dòng)合成器，如例如needham-vandevanter等人,《核酸研究》12:6159-6168,1984中所描述；以及美國(guó)專(zhuān)利案第4,458,066號(hào)中的固體載體方法。化學(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可通過(guò)與互補(bǔ)序列雜交或通過(guò)使用單股作為模板與dna聚合酶聚合來(lái)轉(zhuǎn)化成雙股dna。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將識(shí)別到，盡管dna的化學(xué)合成通常受限于約100個(gè)堿基的序列，但可通過(guò)較短序列的接合來(lái)獲得更長(zhǎng)的序列。

編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物和雙特異性抗體的例示性核酸可通過(guò)克隆技術(shù)制備。適合的克隆和測(cè)序技術(shù)以及足以指導(dǎo)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆實(shí)踐的指令的實(shí)例見(jiàn)于sambrook等人,見(jiàn)上文，berger和kimmel(編),見(jiàn)上文和ausubel,見(jiàn)上文中。來(lái)自生物試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的制造商的產(chǎn)品信息也提供適用的信息。這類(lèi)制造商包括sigmachemicalcompany(saintlouis,mo)、r&dsystems(minneapolis,mn)、pharmaciaamersham(piscataway,nj)、clontechlaboratories,inc.(paloalto,ca)、chemgenescorp.、aldrichchemicalcompany(milwaukee,wi)、glenresearch,inc.、gibcobrllifetechnologies,inc.(gaithersburg,md)、flukachemica-biochemikaanalytika(flukachemieag,buchs,switzerland)、invitrogen(sandiego,ca)和appliedbiosystems(fostercity,ca)，以及所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多其它商業(yè)來(lái)源。

核酸也可以通過(guò)擴(kuò)增方法制備。擴(kuò)增方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)、自身持續(xù)序列復(fù)制系統(tǒng)(3sr)。許多克隆方法、宿主細(xì)胞和活體外擴(kuò)增方法是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。

在一個(gè)實(shí)例中，所使用的抗體是通過(guò)將編碼來(lái)自抗體的可變區(qū)的cdna插入包含編碼效應(yīng)分子(em)的cdna的載體(如酶或標(biāo)記)中來(lái)制備。進(jìn)行插入使得框內(nèi)讀取可變區(qū)和em，使得產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)多肽。因此，經(jīng)編碼的多肽含有功能性fv區(qū)域和功能性em區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼酶的cdna接合到scfv，使得酶位于scfv的羧基端。在若干實(shí)例中，編碼辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶的cdna或相關(guān)多肽標(biāo)記物接合到scfv，使得酶(或多肽標(biāo)記物)位于scfv的氨基端。在另一實(shí)例中，標(biāo)記位于scfv的氨基端。在另一個(gè)實(shí)例中，編碼蛋白質(zhì)或多肽標(biāo)記物的cdna接合抗體的重鏈可變區(qū)，使得酶或多肽標(biāo)記物位于重鏈可變區(qū)的羧基端。重鏈可變區(qū)可接著使用二硫鍵接合到抗體的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)例中，編碼酶或多肽標(biāo)記物的cdna接合抗體的輕鏈可變區(qū)，使得酶或多肽標(biāo)記物位于輕鏈可變區(qū)的羧基端。輕鏈可變區(qū)可接著使用二硫鍵接合到抗體的重鏈可變區(qū)。

在分離和選殖編碼可特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段和/或雙特異性抗體的核酸后，蛋白質(zhì)可使用適合的表達(dá)載體在以重組方式經(jīng)工程改造的細(xì)胞(如細(xì)菌、植物、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)。一個(gè)或多個(gè)編碼抗體或其片段的dna序列可通過(guò)dna轉(zhuǎn)移到適合的宿主細(xì)胞中來(lái)活體外表達(dá)。細(xì)胞可以是原核或真核。所述術(shù)語(yǔ)還包括個(gè)體宿主細(xì)胞的任何后代。應(yīng)理解，所有后代可能不與親本細(xì)胞一致，因?yàn)樵趶?fù)制期間可能存在突變。穩(wěn)定轉(zhuǎn)移(意謂外來(lái)dna在宿主中持續(xù)保持)的方法是所屬領(lǐng)域中已知的。本發(fā)明還涵蓋表達(dá)相關(guān)抗體的融合瘤。

編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物和雙特異性抗體的聚核苷酸序列可操作地連接于表達(dá)控制序列。接合可操作地連接于編碼序列的表達(dá)控制序列，使得在與表達(dá)控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)控制序列包括(但不限于)適合的啟動(dòng)子、強(qiáng)化子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白質(zhì)編碼基因前的起始密碼子(即atg)(剪接內(nèi)含子的信號(hào)，維持所述基因的正確閱讀框架以允許mrna的適當(dāng)轉(zhuǎn)譯)和終止密碼子。

可插入表達(dá)載體中的編碼抗體、經(jīng)標(biāo)記的抗體或其功能片段的聚核苷酸序列包括(但不限于)質(zhì)體、病毒或其它媒劑，其可經(jīng)操作以實(shí)現(xiàn)序列的插入或并入并且可以在原核細(xì)胞或真核生物中表達(dá)。宿主可包括微生物、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物生物體。在原核細(xì)胞中表達(dá)具有真核或病毒序列的dna序列的方法在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。能夠在宿主中表達(dá)和復(fù)制的生物功能性病毒和質(zhì)體dna載體是所屬領(lǐng)域中已知的。

用重組型dna進(jìn)行的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)型作用可通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知。當(dāng)宿主是原核生物(如大腸桿菌)時(shí)，能夠進(jìn)行dna捕捉的勝任細(xì)胞可由所收集的細(xì)胞在指數(shù)生長(zhǎng)期并且接著使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的程序通過(guò)cacl2方法處理之后制備?；蛘?，可使用mgcl2或rbcl。也可以在(如果需要)形成宿主細(xì)胞的原生質(zhì)體之后或通過(guò)電致孔進(jìn)行轉(zhuǎn)型作用。

當(dāng)宿主是真核生物時(shí)，可使用如磷酸鈣共沉淀物、常規(guī)機(jī)械程序(如微注射)、電致孔、插入包覆在脂質(zhì)體中的質(zhì)體或病毒載體等dna轉(zhuǎn)染方法。真核細(xì)胞也可以由編碼抗體、經(jīng)標(biāo)記的抗體或其功能性(抗原結(jié)合)片段的聚核苷酸序列和編碼可選表現(xiàn)型(如單純皰疹病毒胸苷激酶基因)的第二外來(lái)dna分子共轉(zhuǎn)型。另一種方法是使用真核病毒載體(如猴病毒40(sv40)或牛乳頭瘤病毒)以短暫感染或轉(zhuǎn)型真核細(xì)胞和表達(dá)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)例如《真核病毒載體(eukaryoticviralvectors)》,coldspringharborlaboratory,gluzman編,1982)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地使用表達(dá)系統(tǒng)，如用于在細(xì)胞(包括高級(jí)真核細(xì)胞，如cos、cho、hela和骨髓瘤細(xì)胞系)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的質(zhì)體和載體。

可通過(guò)常規(guī)手段(包括制備型色譜和免疫分離)進(jìn)行以重組方式表達(dá)的多肽的分離和純化。在表達(dá)后，抗體、經(jīng)標(biāo)記的抗體或其功能片段可根據(jù)所屬領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)程序純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、管柱色譜等(通常參見(jiàn)r.scopes,《蛋白質(zhì)純化(proteinpurification)》,springer-verlag,n.y.,1982)。本文中所披露的大體上純組合物具有至少約90到95％均質(zhì)性，并且對(duì)于醫(yī)藥學(xué)目的，可使用98到99％或更高的均質(zhì)性。在純化后(視需要部分或純化成均質(zhì))，如果在治療學(xué)上使用，那么多肽應(yīng)基本上不含內(nèi)毒素。

已描述用于單鏈抗體的表達(dá)和/或從細(xì)菌(如大腸桿菌)再折疊成適合的活性形式(包括單鏈抗體)的方法并且是眾所周知的，并且適用于本文中所披露的抗體。參見(jiàn)buchner等人,《分析生物化學(xué)(anal.biochem.)》205:263-270,1992；普魯克通,《生物技術(shù)(biotechnology)》9:545,1991；huse等人,《科學(xué)》246:1275,1989和ward等人,《自然》341:544,1989。

通常，從包涵體分離來(lái)自大腸桿菌或其它細(xì)菌的功能性異源蛋白質(zhì)并且需要使用強(qiáng)變性劑溶解，并且隨后再折疊。在溶解步驟期間，如所屬領(lǐng)域中眾所周知，必須存在還原劑以分離二硫鍵。具有還原劑的例示性緩沖液是：0.1mtrisph8、6m胍、2mmedta、0.3mdte(二硫赤蘚糖醇)。二硫鍵的再氧化可在呈還原和氧化形式的低分子量硫醇試劑存在下進(jìn)行，如saxena等人,《生物化學(xué)(biochemistry)》9:5015-5021,1970中所描述，并且尤其如buchner等人,見(jiàn)上文所描述。

復(fù)性通常通過(guò)在再折疊緩沖液中稀釋(例如100倍)經(jīng)變性和還原的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例示性緩沖液是0.1mtris，ph8.0、0.5ml-精氨酸、8mm氧化谷胱甘肽(gssg)和2mmedta。

作為兩鏈型抗體純化方案的改良，單獨(dú)地溶解和還原重鏈和輕鏈區(qū)域并且接著在再折疊溶液中組合。當(dāng)這兩種蛋白質(zhì)以一種蛋白質(zhì)相比另一種蛋白質(zhì)不超過(guò)5倍摩爾過(guò)量的摩爾比的方式混合時(shí)，獲得例示性產(chǎn)率?？稍谘趸€原-重排完成之后，將過(guò)量的經(jīng)氧化的谷胱甘肽或其它氧化低分子量化合物添加到再折疊溶液中。

除重組型方法以外，本文中所披露的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物和雙特異性抗體也可以完全或部分使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成構(gòu)筑。長(zhǎng)度小于約50個(gè)氨基酸的多肽的固相合成可通過(guò)使序列的c端氨基酸連接到不溶性載體，接著依序添加序列中的其余氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于固相合成的技術(shù)由barany和merrifield,《肽：分析、合成、生物學(xué)(thepeptides:analysis,synthesis,biology.)》,第2卷:《肽合成中的特別方法，部分a(specialmethodsinpeptidesynthesis,parta.)》,第3-284頁(yè)；merrifield等人,《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(j.am.chem.soc.)》85:2149-2156,1963和stewart等人,《固相肽合成(solidphasepeptidesynthesis)》,第2版,piercechem.co.,rockford,ill.,1984描述。更大長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)可通過(guò)較短片段的氨基和羧基端的縮合來(lái)合成。通過(guò)羧基末端的活化(如通過(guò)使用偶合劑n,n'-二環(huán)己基碳化二亞胺)來(lái)形成肽鍵的方法在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。

vi.組合物和治療方法

提供組合物，其包括治療有效量的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和/或其結(jié)合物中的一種或多種和載劑。提供組合物，其包括含治療有效量的一種或多種編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和/或結(jié)合物的核酸的載劑。組合物可以用于投與個(gè)體(如患有腫瘤、神經(jīng)退化性病癥或情緒障礙的個(gè)體)的單位劑型形式制備。組合物可配制用于持續(xù)釋放。

在一些實(shí)施例中，個(gè)體患有腫瘤，包括惡性腫瘤?？墒褂帽疚闹兴兜目贵w、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和結(jié)合物治療任何表達(dá)(尤其過(guò)度表達(dá))epha4的腫瘤。腫瘤可以是例如乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。

在其它實(shí)施例中，個(gè)體患有神經(jīng)退化性病癥，如阿爾茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、多發(fā)性硬化(ms)或肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)。這類(lèi)疾病的一個(gè)實(shí)例是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，如who的icd-10分類(lèi)中的g12疾病。在一些實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是前角病變。在其它實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)或脊髓性肌萎縮(sma)。在其它實(shí)施例中，個(gè)體患有情感障礙，如抑郁癥。

在一些情況下，接受本發(fā)明的治療性組合物的投藥的患者尚未呈現(xiàn)相關(guān)疾病的任何決定性癥狀；實(shí)際上，其可視為由于例如異常高含量的epha4表達(dá)(如通過(guò)例如本發(fā)明的診斷方法測(cè)定)而在稍后的時(shí)間具有增加的產(chǎn)生這類(lèi)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。換句話說(shuō)，本文中所描述的組合物可以用于治療性目的以及預(yù)防性目的。

不希望受理論約束，在一些實(shí)施例中，抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和結(jié)合物可結(jié)合于epha4(如人類(lèi)和/或小鼠epha4)并且抑制epha4的活性(如酪氨酸激酶活性)。在一些實(shí)施例中，抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和結(jié)合物阻斷epha4的自體磷酸化，引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)減少。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，如在患有als的個(gè)體中。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，如在患有癌癥的個(gè)體中。

在一些實(shí)施例中，個(gè)體患有als，其可以是家族性als或偶發(fā)性als。個(gè)體可患有手臂發(fā)作型als或延髓發(fā)作型als。在其它實(shí)施例中，個(gè)體患有ad。在一些非限制性實(shí)例中，個(gè)體可患有“延遲發(fā)作型”als或ad，其在年齡超過(guò)60歲的個(gè)體中發(fā)生。因此，個(gè)體年齡可超過(guò)60、65、70、75、80或85歲。在其它非限制性實(shí)例中，個(gè)體可患有“早發(fā)型”als或ad，其在年齡超過(guò)60歲或更年輕的個(gè)體中發(fā)生。因此，個(gè)體可以是18到60歲的成年個(gè)體，如年齡在20、25、30、35、35、40、45、50、55歲與60歲之間的個(gè)體。個(gè)體可以是年輕的成年人(例如20到39歲)，或中年人(例如40-64歲)，或老年人(例如超過(guò)65歲)。個(gè)體還可以用riluzole^tm(力如太)治療，或可在不存在用riluzole^tm(力如太)進(jìn)行的治療的情況下投與抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物或雙特異性抗體。

投藥的量和時(shí)間由治療醫(yī)師判斷以實(shí)現(xiàn)所需目的。特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物可經(jīng)配制以用于全身或局部(如腫瘤內(nèi))投藥。在一個(gè)實(shí)例中，醫(yī)藥組合物經(jīng)配制以用于非經(jīng)腸投藥，如靜脈內(nèi)投藥。在其它實(shí)例中，醫(yī)藥組合物經(jīng)配制以用于肌肉內(nèi)投藥。

用于投藥的組合物可包括特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的溶液，或編碼特異性的結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的核酸，其溶解于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中，如水性載劑。在一些實(shí)例中，單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物或雙特異性抗體結(jié)合于epha4并且干擾信號(hào)傳導(dǎo)以改良存活期，如在患有als或腫瘤的個(gè)體中?？墒褂枚喾N水性載劑，例如緩沖生理食鹽水等。這些溶液是無(wú)菌的并且通常不含不合需要的物質(zhì)。這些組合物可以通過(guò)常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)滅菌。組合物可視需要含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的助劑物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，如ph值調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些配制物中的抗體濃度可廣泛變化，并且將根據(jù)所選擇的具體投藥模式和個(gè)體需要而主要基于流體體積、粘度、體重等選擇。

用于靜脈內(nèi)投藥的典型醫(yī)藥組合物包括約0.1到10mg抗體/個(gè)體/天。可使用0.1到約100mg/個(gè)體/天的劑量，尤其在藥劑投與隔離位點(diǎn)并且不進(jìn)入循環(huán)或淋巴系統(tǒng)(如進(jìn)入體腔或進(jìn)入器官腔)時(shí)。用于制備可投與的組合物的實(shí)際方法將是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或顯而易見(jiàn)的并且更詳細(xì)地描述于如《雷明頓的藥物科學(xué)(remington'spharmaceuticalscience)》,第19版,mackpublishingcompany,easton,pa(1995)等公開(kāi)案中。

特異性結(jié)合epha4、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的單克隆抗體可以凍干形式提供并且在投藥之前用無(wú)菌水復(fù)原，但其也以已知濃度的無(wú)菌溶液形式提供。接著將抗體溶液添加到含有0.9％氯化鈉的輸液包(usp)中，并且通常以0.5到15mg/kg體重的劑量投與。所屬領(lǐng)域中可獲得許多投與抗體藥物的經(jīng)驗(yàn)，自從1997年獲得批準(zhǔn)，其已在美國(guó)市售?？贵w可通過(guò)緩慢輸注而非靜脈內(nèi)推注或推注來(lái)投與。在一個(gè)實(shí)例中，投與較高起始劑量，隨后以較低含量投與維持劑量。舉例來(lái)說(shuō)，4mg/kg的初始起始劑量可在約90分鐘時(shí)間內(nèi)輸注，接著如果前述劑量被良好耐受，那么在30分鐘時(shí)間內(nèi)輸注2mg/kg的每周維持劑量持續(xù)4-8周。

也可以投與個(gè)體治療有效量的編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的核酸。一種投與核酸的方法是用質(zhì)體dna進(jìn)行直接免疫接種，如用哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)體。編碼所披露的抗體的核苷酸序列可受啟動(dòng)子控制以增加分子的表達(dá)。由核酸構(gòu)筑體進(jìn)行免疫接種是所屬領(lǐng)域中眾所周知并且教示于例如美國(guó)專(zhuān)利案第5,643,578號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第5,593,972號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第5,817,637號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,880,103號(hào)中，其描述若干種向生物體傳遞編碼免疫原性肽或其它抗原的核酸的方法。所述方法包括核酸的脂質(zhì)體傳遞。

在另一種使用方法中，核酸也可以由經(jīng)滅毒的病毒宿主或載體或細(xì)菌載體表達(dá)?？墒褂弥亟M型牛痘病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、巨細(xì)胞病毒、痘病毒或其它病毒載體表達(dá)抗體。舉例來(lái)說(shuō)，牛痘描述于美國(guó)專(zhuān)利案第4,722,848號(hào)中。bcg(卡介菌(bacilluscalmetteguerin))提供另一種用于所披露的抗體的表達(dá)的載體(參見(jiàn)stover,《自然》351:456-460,1991)。

在一個(gè)實(shí)施例中，可將編碼所披露的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的核酸直接引入細(xì)胞以用于表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸裝載到金微米球上并且通過(guò)如bio-rad's基因槍等裝置引入皮膚。核酸可以是“裸”的，由受強(qiáng)啟動(dòng)子控制的質(zhì)體組成。

通常，將dna注射到肌肉中，但其也可以直接注射到其它位點(diǎn)。注射劑量通常是約0.5mg/kg到約50mg/kg，并且通常是約0.005mg/kg到約5mg/kg(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利案第5,589,466號(hào))。

在一個(gè)實(shí)例中，個(gè)體是人類(lèi)?？贵w可投與患有腫瘤的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(如小鼠、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或食蟹獼猴(cynomolgus)或恒河猴(rhesusmonkey))，所述腫瘤表達(dá)所述抗體、抗原結(jié)合片段、結(jié)合物或雙特異性抗體可交叉反應(yīng)的epha4受體?？贵w還可以投與作為als的模型系統(tǒng)的動(dòng)物。應(yīng)注意，動(dòng)物模型(如小鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型)可適用于評(píng)估作用機(jī)制和確定抗體療效。

可向患有疾病或病癥的個(gè)體投與特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物，其中已證實(shí)或懷疑所述疾病或病癥中存在大量epha4受體活性可引起疾病或病癥的病理生理學(xué)或是促進(jìn)疾病或病癥惡化的因素。因此，預(yù)期抑制epha4活性或表達(dá)所述受體的細(xì)胞可緩解病癥的癥狀和/或進(jìn)程。這類(lèi)病癥可例如通過(guò)細(xì)胞表面上epha4的受體含量增加或患有病癥的個(gè)體中epha4的量增加來(lái)證明。

特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物可在活體內(nèi)或活體外減緩或抑制細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)生長(zhǎng)。在活體內(nèi)應(yīng)用中，以足以抑制腫瘤生長(zhǎng)或抑制腫瘤的病征或癥狀的量投與個(gè)體治療有效量的抗體。適合的個(gè)體可包括患有表達(dá)epha4受體的腫瘤的個(gè)體，如患有乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌的個(gè)體。在一些實(shí)例中，所述方法引起腫瘤的重量或體積不再增加或降低重量或體積。在其它實(shí)例中，所述方法引起轉(zhuǎn)移減少。

可向患有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(如(但不限于)als，如家族性或偶發(fā)性als)的個(gè)體投與特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物。相關(guān)個(gè)體披露于上文中。單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物可用于降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中epha的活性。在一些實(shí)施例中，減緩疾病的進(jìn)程。單克隆抗體可用于測(cè)定與als相關(guān)的epha4表達(dá)量，或降低的epha4表達(dá)可用于監(jiān)測(cè)對(duì)療法的反應(yīng)。

通常，將評(píng)估一種或多種癥狀或參數(shù)以檢驗(yàn)個(gè)體中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的進(jìn)程。治療可降低肌肉衰弱和/或萎縮。治療可減少一種或多種癥狀，如行動(dòng)、吞咽(吞咽困難)和說(shuō)話或成詞(發(fā)音困難)困難。治療還可以減少肌肉的繃緊和僵硬(痙攣)和過(guò)度反射(反射過(guò)強(qiáng))，包括減少嘔吐反射。治療可改變巴氏病征的(在足底受刺激時(shí)大腳趾朝上伸展)，其表示上部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害減少。治療可延緩或減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，以及延緩或減少肌肉衰弱和萎縮、肌肉痙攣和可在皮下發(fā)現(xiàn)的肌肉短暫抽搐(肌束震顫)。治療也可以降低假延髓病影響，也稱(chēng)為“情緒不穩(wěn)”，由此減少不可控制的大笑、哭泣或微笑的出現(xiàn)。

用于這一用途的有效量將取決于疾病嚴(yán)重度和患者的一般健康狀況。治療有效量的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物，或編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的核酸提供癥狀的主觀緩解或可客觀識(shí)別的改良，如由臨床醫(yī)師或其它合格觀測(cè)員指出。在一些實(shí)施例中，所述治療降低細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，如通過(guò)降低epha4的酪氨酸激酶活性和/或epha4的自體磷酸化。

所披露的組合物可與另一種藥劑結(jié)合投與(同時(shí)或依序)，如用于治療als的藥劑。在特異性非限制性實(shí)例中，個(gè)體患有als，并且投與個(gè)體另一種用于治療als的藥劑。在特異性非限制性實(shí)例中，還投與治療有效量的riluzole^tm(力如太)。

對(duì)于治療腫瘤，所披露的組合物可與化學(xué)治療劑一起投與。所屬領(lǐng)域中當(dāng)前已知的許多化學(xué)治療劑。在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)治療劑選自由以下組成的群組：有絲分裂抑制劑、烷基化劑、抗代謝劑、插層抗生素、生長(zhǎng)因子抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗存活劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、抗激素劑(例如抗雄激素劑)和抗血管生成劑。

抗血管生成劑(如mmp-2(基質(zhì)-金屬蛋白酶2)抑制劑、mmp-9(基質(zhì)-金屬蛋白酶9)抑制劑和cox-ii(環(huán)加氧酶ii)抑制劑)可與所披露的抗體、抗原結(jié)合片段和結(jié)合物結(jié)合使用以用于治療腫瘤。適用的cox-ii抑制劑的實(shí)例包括celebrex^tm(阿萊昔布(alecoxib))、伐地考昔(valdecoxib)和羅非考昔(rofecoxib)。適用的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的實(shí)例描述于wo96/33172、wo96/27583、wo98/07697、wo98/03516、wo98/34918、wo98/34915、wo98/33768、wo98/30566、歐洲專(zhuān)利公開(kāi)案606,046、歐洲專(zhuān)利公開(kāi)案931,788、wo90/05719、wo99/52910、wo99/52889、wo99/29667、美國(guó)專(zhuān)利案第5,863,949號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,861,510號(hào)和歐洲專(zhuān)利公開(kāi)案780,386中。在一個(gè)實(shí)例中，mmp抑制劑在投藥時(shí)不誘導(dǎo)關(guān)節(jié)痛。在另一實(shí)例中，mmp抑制劑與其它基質(zhì)-金屬蛋白酶(如mmp-1、mmp-3、mmp-4、mmp-5、mmp-6、mmp-7、mmp-8、mmp-10、mmp-11、mmp-12和mmp-13)相比選擇性抑制mmp-2和/或mmp-9。可使用的mmp抑制劑的一些特定實(shí)例是ag-3340、ro32-3555、rs13-0830、3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨甲酰基-環(huán)戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧-雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-甲酸羥基酰胺；(2r,3r)-1-[4-(2-氯-4-氟-苯甲氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-甲酸羥基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫-吡喃-4-甲酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨甲?；?環(huán)丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫-吡喃-4-甲酸羥基酰胺；(r)-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫-吡喃-3-甲酸羥基酰胺；(2r,3r)-1-[4-(4-氟-2-甲基-苯甲氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-甲酸羥基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥基氨甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羥基氨甲?；?四氫-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧環(huán)[3.2.1]辛-3-甲酸羥基酰胺；3-內(nèi)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧-環(huán)[3.2.1]辛-3-甲酸羥基酰胺；和(r)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫-呋喃-3-甲酸羥基酰胺；以及所述化合物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物。

所披露的特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物，或編碼特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物的核酸也可以與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(如可抑制egf-r(表皮生長(zhǎng)因子受體)反應(yīng)的試劑，如egf-r抗體、egf抗體和作為egf-r抑制劑的分子)；vegf(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)抑制劑，如vegf受體和可抑制vegf的分子；以及erbb2受體抑制劑，如結(jié)合于erbb2受體的有機(jī)分子或抗體(例如herceptin^tm(genentech,inc.))一起使用。egf-r抑制劑描述于例如wo95/19970、wo98/14451、wo98/02434和美國(guó)專(zhuān)利案第5,747,498號(hào)(1998年5月5日頒布)中。egfr抑制劑還包括(但不限于)mabc225和抗egfr22mab(imclonesystemsincorporated)、abx-egf(abgenix/cellgenesys)、emd-7200(merckkgaa)、emd-5590(merckkgaa)、mdx-447/h-477(medarexinc.和merckkgaa)以及化合物zd-1834、zd-1838和zd-1839(astrazeneca)、pki-166(novartis)、pki-166/cgp-75166(novartis)、ptk787(novartis)、cp701(cephalon)、來(lái)氟米特(leflunomide)(pharmacia/sugen)、cl-1033(warnerlambertparkedavis)、cl-1033/pd183,805(warnerlambertparkedavis)、cl-387,785(wyeth-ayerst)、bbr-1611(boehringermannheimgmbh/roche)、那米定a(naamidinea)(bristolmyerssquibb)、rc-3940-ii(pharmacia)、bibx-1382(boehringeringelheim)、olx-103(merck&co.)、vrctc-310(ventechresearch)、egf融合毒素(serageninc.)、dab-389(seragen/lilgand)、zm-252808(imperialcancerresearchfund)、rg-50864(inserm)、lfm-a12(parkerhughescancercenter)、whi-p97(parkerhughescancercenter)、gw-282974(glaxo)、kt-8391(kyowahakko)和egf-r疫苗(yorkmedical/centrodeimmunologiamolecular(cim))。

vegf抑制劑(例如su-5416和su-6668(sugeninc.)、sh-268(schering)和nx-1838(nexstar))也可以與特異性結(jié)合epha4的抗體結(jié)合使用。vegf抑制劑描述于例如wo99/24440、wo95/21613、wo99/61422、美國(guó)專(zhuān)利案第5,834,504號(hào)、wo98/50356、美國(guó)專(zhuān)利案第5,883,113號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,886,020號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利案第5,792,783號(hào)、wo99/10349、wo97/32856、wo97/22596、wo98/54093、wo98/02438、wo99/16755和wo98/02437中。一些特異性vegf抑制劑的其它實(shí)例是im862(cytraninc.)；genentech,inc.的抗vegfmab；以及安吉酶(angiozyme)，一種來(lái)自ribozyme和chiron的合成核糖核酸酶。這些和其它vegf抑制劑可與特異性結(jié)合epha4的抗體結(jié)合使用。

erbb2受體抑制劑(如gw-282974(glaxowellcome))以及mabar-209(aronexpharmaceuticalsinc.)和2b-1(chiron)也可以與所披露的抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體和結(jié)合物組合，例如wo98/02434、wo99/35146、wo99/35132、wo98/02437、wo97/13760、wo95/19970和美國(guó)專(zhuān)利案第5,587,458號(hào)中所指示。

視患者需要和耐受的劑量和頻率，投與組合物的單次或多次投藥，如投與患有als或腫瘤的個(gè)體。在任何情況下，組合物應(yīng)提供足以有效治療患者的量的至少一種本文中所披露的抗體。劑量可一次性投與，但可周期性施用直到獲得治療結(jié)果或直到副作用迫使停止療法。在一個(gè)實(shí)例中，每隔一天經(jīng)三十分鐘輸注一定劑量的抗體、抗原結(jié)合片段、雙特異性抗體或結(jié)合物。在這一實(shí)例中，可投與約一次到約十次給藥，如可每隔一天投與三次或六次給藥。在另一個(gè)實(shí)例中，持續(xù)約五到約十天投與連續(xù)輸注?？梢砸?guī)則間隔(如每月一次)治療個(gè)體直到獲得所需治療結(jié)果。通常，所述劑量足以治療或改善疾病的癥狀或病征而不對(duì)患者產(chǎn)生不可接受的毒性。

可以植入物、油狀注射物或粒狀系統(tǒng)形式制得控制釋放非經(jīng)腸配制物。關(guān)于蛋白質(zhì)傳遞系統(tǒng)的廣泛概述，參見(jiàn)banga,a.j.,《治療性肽和蛋白質(zhì)：配制物、處理和傳遞系統(tǒng)(therapeuticpeptidesandproteins:formulation,processing,anddeliverysystems)》，technomicpublishingcompany,inc.,lancaster,pa,(1995)，其以引用的方式并入本文中。粒狀系統(tǒng)包括微米球、微米粒子、微膠囊、納米膠囊、納米球和納米粒子。微膠囊含有治療性蛋白質(zhì)(如細(xì)胞毒素或藥物)作為中心核心。在微米球中，治療性物質(zhì)分散遍布粒子。約1μm的粒子、微米球和微膠囊通常分別稱(chēng)為納米粒子、納米球和納米膠囊。毛細(xì)管具有約5μm直徑使得僅靜脈內(nèi)投與納米粒子。微米粒子的直徑通常是約100μm并且是皮下或肌肉內(nèi)投與。參見(jiàn)例如kreuter,j.,《膠態(tài)藥物傳遞系統(tǒng)(colloidaldrugdeliverysystems)》,j.kreuter編,marceldekker,inc.,newyork,ny,第219-342頁(yè)(1994)；和tice和tabibi,《受控藥物傳遞論述(treatiseoncontrolleddrugdelivery)》,a.kydonieus編,marceldekker,inc.newyork,ny,第315-339頁(yè),(1992)，其皆以引用的方式并入本文中。

聚合物可用于本文中所披露的組合物的離子控制釋放。多種用于控制藥物傳遞的可降解和不可降解聚合基質(zhì)是所屬領(lǐng)域中已知的(langer,《化學(xué)研究報(bào)告(accountschem.res.)》26:537-542,1993)。舉例來(lái)說(shuō)，嵌段共聚物，泊洛沙姆(polaxamer)407，在低溫下以粘稠但流動(dòng)性液體形式存在，但在體溫下形成半固體凝膠。已證實(shí)其是用于重組型白介素-2和尿素酶的配制和持續(xù)傳遞的有效媒劑(johnston等人,《藥物研究(pharm.res.)》9:425-434,1992；和pec等人,《遺傳科學(xué)技術(shù)雜志(j.parent.sci.tech.)》44(2):58-65,1990)?；蛘?，已使用羥基磷灰石作為用于蛋白質(zhì)的控制釋放的微載體(ijntema等人,《國(guó)際制藥學(xué)雜志(int.j.pharm.)》112:215-224,1994)。在另一個(gè)方面中，脂質(zhì)體用于脂質(zhì)囊封藥物的控制釋放以及藥物靶向(betageri等人,《脂質(zhì)體藥物傳遞系統(tǒng)(liposomedrugdeliverysystems)》,technomicpublishingco.,inc.,lancaster,pa(1993))。已知用于治療性蛋白質(zhì)的控制傳遞的許多其它系統(tǒng)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,055,303號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,188,837號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第4,235,871號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第4,501,728號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第4,837,028號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第4,957,735號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,019,369號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,055,303號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,514,670號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,413,797號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,268,164號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,004,697號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第4,902,505號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,506,206號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,271,961號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利案第5,254,342號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利案第5,534,496號(hào))。

v.診斷方法和試劑盒

本文中提供用于活體外或活體內(nèi)檢測(cè)epha4的方法。在一個(gè)實(shí)例中，在生物樣品中檢測(cè)epha4的表達(dá)。樣品可以是任何樣品，包括(但不限于)來(lái)自活檢體的組織、尸檢材料和病變樣品。生物樣品還包括組織切片，例如采集用于組織學(xué)目的的冷凍切片。生物樣品還包括體液，如血液、血清、血漿、痰液、脊髓液或尿液。生物樣品通常從哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))獲得。

在若干實(shí)施例中，提供用于檢測(cè)腫瘤或評(píng)估產(chǎn)生腫瘤(如乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌)的風(fēng)險(xiǎn)的方法。還提供用于測(cè)定患有這些惡性病中的任一種的個(gè)體的預(yù)后的方法。個(gè)體可以是任何相關(guān)個(gè)體，如懷疑患有腫瘤的個(gè)體。與對(duì)照物相比，來(lái)自個(gè)體的樣品中epha4的含量增加表明個(gè)體患有腫瘤或具有增加的在稍后的時(shí)間產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。在特異性非限制性實(shí)例中，樣品是血液、血清、血漿、痰液或活組織檢查樣品。

在其它實(shí)施例中，提供用于檢測(cè)或評(píng)估產(chǎn)生神經(jīng)退化性病癥(如阿爾茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、多發(fā)性硬化(ms)或肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als))的風(fēng)險(xiǎn)的方法。這類(lèi)疾病的一個(gè)實(shí)例是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，如who的icd-10分類(lèi)中的g12疾病。在一些實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是前角病變。在其它實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)或脊髓性肌萎縮(sma)。在其它實(shí)施例中，個(gè)體患有情感障礙，如抑郁癥。在其它實(shí)施例中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是脊髓性肌萎縮(sma)。個(gè)體可以是任何相關(guān)個(gè)體，如懷疑患有神經(jīng)退化性病癥(如ad、pd、ms或als)或具有增加的產(chǎn)生神經(jīng)退化性病癥的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。與對(duì)照物相比，來(lái)自個(gè)體的樣品中epha4的含量增加表明個(gè)體患有病癥(如als的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病)或具有增加的產(chǎn)生病癥的風(fēng)險(xiǎn)。在特異性非限制性實(shí)例中，樣品包括神經(jīng)元。

在其它實(shí)施例中，提供用于測(cè)定個(gè)體中神經(jīng)退化性病癥(如ad、pd、ms或als)的發(fā)作或進(jìn)程的方法，其包含測(cè)定個(gè)體的樣品中的epha4含量。根據(jù)其它特定實(shí)施例，降低的epha4含量和/或活性表示發(fā)作延遲(在具有產(chǎn)生神經(jīng)退化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中)和/或存活期延長(zhǎng)和/或癥狀較少。epha4含量增加表明早發(fā)(在具有產(chǎn)生神經(jīng)退化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中)和/或存活期(或疾病持續(xù)時(shí)間)縮短和/或疾病的癥狀(如ad、pd、ms和als)增加。疾病可以是家族性或偶發(fā)性?？墒褂孟嗤囊话惴椒y(cè)定個(gè)體中情感障礙(如抑郁癥)的發(fā)作或進(jìn)程，包含測(cè)定個(gè)體的樣品中的epha4含量和比較所述含量與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物或先前測(cè)定的來(lái)自相同類(lèi)型的樣品中的epha4含量。與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照值或先前測(cè)量值相比增加表明疾病的發(fā)作或進(jìn)程。

提供用于檢測(cè)生物樣品中的epha4的方法，其中所述方法包括使生物樣品與特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段在有助于形成免疫復(fù)合物的條件下接觸，并且檢測(cè)所述免疫復(fù)合物，以檢測(cè)生物樣品中的epha4。在一個(gè)實(shí)例中，檢測(cè)到樣品中epha4增加表明個(gè)體患有惡性疾病。在另一實(shí)例中，檢測(cè)到樣品中epha4增加表明個(gè)體傾向于轉(zhuǎn)移。在其它實(shí)例中，腫瘤是乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌。

可比較樣品中epha4的量與對(duì)照值。對(duì)照物可以是參考標(biāo)準(zhǔn)或來(lái)自未患有腫瘤或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的個(gè)體(如健康個(gè)體)的樣品。

當(dāng)做出陽(yáng)性診斷時(shí)，例如測(cè)定患者患有腫瘤、神經(jīng)退化性病癥或情緒障礙或具有增加的產(chǎn)生腫瘤、神經(jīng)退化性病癥或情緒障礙的風(fēng)險(xiǎn)，患者可接受其它測(cè)試以確認(rèn)基于epha4結(jié)果的發(fā)現(xiàn)。在一些情況下，可使用一種或多種臨床上批準(zhǔn)的治療性或預(yù)防性方法向患者提供適用于其病狀的治療。此外，患者可接受后續(xù)測(cè)試和治療以繼續(xù)維持和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

在一個(gè)實(shí)施例中，特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段用可檢測(cè)標(biāo)記直接標(biāo)記。在另一實(shí)施例中，特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段(第一抗體)未經(jīng)標(biāo)記并且可與特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合的第二抗體或其它分子經(jīng)標(biāo)記。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知，選擇能夠特異性結(jié)合第一抗體的特定物種和種類(lèi)的第二抗體。舉例來(lái)說(shuō)，如果第一抗體是人類(lèi)igg，那么二級(jí)抗體可以是抗人類(lèi)lgg。其它可結(jié)合于抗體的分子包括(但不限于)蛋白質(zhì)a和蛋白質(zhì)g，其都可以從市場(chǎng)獲得。

適用于特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段和二級(jí)抗體的標(biāo)記物描述于上文中，并且包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、磁性試劑和放射性物質(zhì)。適合的酶的非限制性實(shí)例包括辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。適合的輔基復(fù)合物的非限制性實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。適合的熒光材料的非限制性實(shí)例包括傘酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白。非限制性例示性發(fā)光材料是魯米諾(luminol)；非限制性例示性磁性試劑是釓，并且非限制性例示性放射性標(biāo)記物包括¹²⁵i、¹³¹i、³⁵s或³h。

在替代性實(shí)施例中，可利用標(biāo)記有可檢測(cè)物質(zhì)的epha4標(biāo)準(zhǔn)和未經(jīng)標(biāo)記的特異性結(jié)合epha4的人類(lèi)抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫分析來(lái)分析生物樣品中的epha4。在這一分析中，組合生物樣品、經(jīng)標(biāo)記的epha4標(biāo)準(zhǔn)和特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或特異性結(jié)合epha4的抗原結(jié)合片段，并且測(cè)定結(jié)合于未經(jīng)標(biāo)記的抗體的經(jīng)標(biāo)記的epha4標(biāo)準(zhǔn)的量。生物樣品中epha4的量與結(jié)合于特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或特異性結(jié)合epha4的抗原結(jié)合片段的經(jīng)標(biāo)記的epha4標(biāo)準(zhǔn)的量成反比。取決于相關(guān)樣品，epha4可以是人類(lèi)或小鼠epha4。

本文中所披露的免疫分析和方法可用于許多目的。在一個(gè)實(shí)施例中，特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段可用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞產(chǎn)生epha4。在另一實(shí)施例中，抗體可用于檢測(cè)生物樣品中epha4的量。epha4的表達(dá)增加與若干種癌癥(包括乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和胰臟癌)相關(guān)聯(lián)。因此，如上文所披露，epha4的含量可用于診斷個(gè)體中的乳癌、食道癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌或胰臟癌或測(cè)定其預(yù)后。還已知epha4的表達(dá)增加與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(如als)的存在和嚴(yán)重度相關(guān)。因此，如上文所披露，來(lái)自個(gè)體的樣品中的epha4含量可用于診斷患有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥(如als)的個(gè)體或測(cè)定其預(yù)后。

在一個(gè)實(shí)施例中，提供用于檢測(cè)生物樣品(如血液樣品或活組織檢查樣品)中的epha4的試劑盒。用于檢測(cè)多肽的試劑盒將通常包含特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，如本文中所披露的抗體或抗原結(jié)合片段中的任一種。在一些實(shí)施例中，試劑盒中包括抗體片段，如fv片段。對(duì)于活體內(nèi)用途，抗體可以是scfv片段。在另一實(shí)施例中，標(biāo)記(例如用熒光、放射性或酶促標(biāo)記)特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體。

在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括說(shuō)明材料，其披露特異性結(jié)合epha4的抗體的使用方法。說(shuō)明材料可以是書(shū)面材料、電子形式(如計(jì)算機(jī)磁盤(pán)或光盤(pán))或可以是可視形式(如視頻文件)。試劑盒還可以包括其它組分以促進(jìn)所設(shè)計(jì)的試劑盒的具體應(yīng)用。因此，舉例來(lái)說(shuō)，試劑盒可額外含有用于檢測(cè)標(biāo)記的工具(如用于酶促標(biāo)記物的酶襯底、用于檢測(cè)熒光標(biāo)記物的過(guò)濾器組、適合的第二標(biāo)記物(如二級(jí)抗體)等)。試劑盒可額外包括緩沖液和其它通常用于實(shí)踐具體方法的試劑。這類(lèi)試劑盒和適合的內(nèi)含物是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。

在一個(gè)實(shí)施例中，診斷試劑盒包含免疫分析。盡管免疫分析的細(xì)節(jié)可隨所使用的具體格式而變化，但檢測(cè)生物樣品中epha4的方法通常包括使生物樣品與在免疫反應(yīng)性條件下與epha4多肽(如人類(lèi)或小鼠epha4)特異性反應(yīng)的抗體接觸的步驟。使抗體在免疫反應(yīng)性條件下特異性結(jié)合以形成免疫復(fù)合物，并且直接或間接檢測(cè)免疫復(fù)合物(結(jié)合的抗體)的存在。

特異性結(jié)合epha4的單克隆抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體可與其它化合物結(jié)合，包括(但不限于)酶、磁珠、膠態(tài)磁珠、半抗原、熒光染料、金屬化合物、放射性化合物或藥物?？贵w也可以用于免疫分析中，如(但不限于)放射免疫分析(ria)、酶連接免疫吸附分析(elisa)或免疫組織化學(xué)分析?？贵w也可以用于熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)。facs使用多個(gè)顏色通道、低角度和鈍角光散射檢測(cè)通道以及阻抗通道以及其它更復(fù)雜的檢測(cè)程度以分離或分選細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利案第5,061,620號(hào))。這些分析中可使用如本文中所披露的特異性結(jié)合epha4的抗體、抗原結(jié)合片段或雙特異性抗體中的任一種。因此，抗體可用于常規(guī)免疫分析中，包括(但不限于)elisa、ria、facs、組織免疫組織化學(xué)、西方印跡或免疫沉淀。

實(shí)例

提供以下實(shí)例僅作為說(shuō)明并且不具有限制性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地識(shí)別出多種可被改變或修改以產(chǎn)生基本相同或類(lèi)似結(jié)果的非關(guān)鍵參數(shù)。

epha4(艾普瑞林的受體)在多種人類(lèi)惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，包括(但不限于)胃癌和非小細(xì)胞肺癌(nsclc)。epha4與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)聯(lián)。此外，還發(fā)現(xiàn)epha4與神經(jīng)退化性疾病肌肉萎縮性側(cè)索硬化(als)相關(guān)聯(lián)，其中不含epha4基因使als患者與具有完整基因的患者相比存活顯著更長(zhǎng)時(shí)間。本文中提供結(jié)合于人類(lèi)epha4和小鼠epha4的若干人類(lèi)單克隆抗體(mab)的鑒別和表征。這些mab可以裸mab、雙特異性格式和/或抗體-藥物結(jié)合物形式用作als和癌癥治療劑。

實(shí)例1：5種重組型epha4的表達(dá)和純化

為了從噬菌體文庫(kù)有效選擇抗體，需要經(jīng)純化的重組型抗原，在這種情況下，epha4。為了增加epha4分子的免疫原性，使人類(lèi)和小鼠epha4基因與人類(lèi)igg1fc融合。通過(guò)蛋白質(zhì)g純化的人類(lèi)和小鼠epha4-fc在聚丙烯酰胺凝膠上的純度>95％。使用經(jīng)純化的小鼠epha4-fc融合蛋白淘選來(lái)源于健康人類(lèi)血液的原生人類(lèi)fab噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)。

實(shí)例2：fab與重組型epha4的高親和力結(jié)合

在293個(gè)自由式細(xì)胞中產(chǎn)生的小鼠epha4-fc用生物素標(biāo)記并且用于大型fab文庫(kù)的淘選。在第三輪淘選(圖1)之后，篩選200個(gè)純系并且鑒別幾十個(gè)具有不同序列的陽(yáng)性純系。與其它純系相比，純系e1、e2、e5和e19以較高親和力結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4并且被選擇用于進(jìn)一步表征。以5、2和20nmol/l的ec50(如通過(guò)elisa(圖2)所測(cè)量)結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4的fabe1(m101)、e5(m105)和e19(m119)轉(zhuǎn)化成igg1格式。m101和m119igg1以1nmol/l的相同ec50結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4，而m105igg1以次納摩爾ec50結(jié)合于人類(lèi)和小鼠epha4(圖3)。

實(shí)例3：igg1sm101、m105和m119特異性地識(shí)別epha4的配位體結(jié)合域

為了研究igg1m101、m105和m119對(duì)epha4的結(jié)合性質(zhì)，表達(dá)和純化gst-人類(lèi)epha4配位體結(jié)合域(lbd)。通過(guò)西方印跡分析來(lái)測(cè)定3種igg1m101、m105和m119的epha4lbd識(shí)別。在sds-page上操作epha4lbd蛋白質(zhì)并且其用3種igg1進(jìn)行免疫印跡法(圖4)。通過(guò)進(jìn)行等溫滴定量熱法(itc)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步分析3種igg1與epha4lbd相互相用的動(dòng)力學(xué)。用敏感性量熱計(jì)測(cè)量由epha4lbd重組型蛋白質(zhì)與igg1的相互相用產(chǎn)生的熱。igg1m101、m105和m119呈現(xiàn)針對(duì)epha4lbd的強(qiáng)結(jié)合親和力(圖5)。

實(shí)例4：igg1m101、m105和m119緩解小鼠艾普瑞林-a1與小鼠epha4的相互相用

進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性elisa以證明igg針對(duì)epha4的結(jié)合和針對(duì)epha4和其配位體艾普瑞林-a的相互相用的抑制。elisa盤(pán)預(yù)先用小鼠epha4重組型蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域涂布并且接著與igg1m101、m105或m119在不同濃度下一起培育，接著進(jìn)行若干輪洗滌，并且最終與生物素化重組型小鼠艾普瑞林-a1fc嵌合蛋白質(zhì)一起培育。通過(guò)抗生蛋白鏈菌素-生物素檢測(cè)方法測(cè)定由igg1s滅毒的epha4與艾普瑞林-a的相互相用。測(cè)定3種igg1的ic50。如圖6中所見(jiàn)，3種igg1能夠在納摩爾范圍(ic50：m101＝0.71nm；m105＝0.35nm；并且m119＝1.81nm)內(nèi)阻斷小鼠epha4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與小鼠艾普瑞林-a1之間的相互相用。

實(shí)例5：igg1m105特異性減弱epha4與艾普瑞林-a/b的相互相用，但不減弱艾普瑞林-b與ephb2受體之間的相互相用

為了測(cè)定igg1m105減弱epha4與其配位體的特異性，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性elisa證明igg1m105阻斷epha4-配位體的相互相用。小鼠epha4重組型蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或小鼠ephb2重組型蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域首先與igg1m105一起培育，接著與不同生物素化重組型小鼠艾普瑞林-a/艾普瑞林-bfc嵌合蛋白培育。接著通過(guò)抗生蛋白鏈菌素-生物素檢測(cè)方法測(cè)定igg1m105對(duì)epha4/ephb2與艾普瑞林-a/艾普瑞林-b的相互相用的作用。如圖7中所見(jiàn)，igg1m105展示阻斷epha4與艾普瑞林-a和艾普瑞林b的特異性。

實(shí)例6：mab與細(xì)胞表面偶聯(lián)epha4的特異性結(jié)合

治療性或診斷性抗體應(yīng)識(shí)別原生蛋白質(zhì)。多種臨床應(yīng)用需要不同尺寸和價(jià)態(tài)的抗體以實(shí)現(xiàn)最佳作用。舉例來(lái)說(shuō)，小尺寸優(yōu)選用于靶向和成像，而全尺寸抗體(igg)在循環(huán)中具有顯著更長(zhǎng)的半衰期，并且一些全尺寸抗體能夠介導(dǎo)效應(yīng)子功能。因此，測(cè)試igg1e1(m101)與細(xì)胞表面偶聯(lián)原生epha4的結(jié)合。在這些實(shí)驗(yàn)中，293t細(xì)胞用小鼠epha4短暫轉(zhuǎn)染，并且測(cè)試m101與經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合。如圖8中所示，m101以與epha4的天然配位體(艾普瑞林-a5-fc)相同的效力特異性結(jié)合于epha4-293t細(xì)胞，表明所鑒別的mab可特異性結(jié)合細(xì)胞表面偶聯(lián)epha4。

實(shí)例7：igg1m119刺激epha4活化

igg1m101、m105和m119結(jié)合于epha4并且干擾epha4與艾普瑞林的相互相用。檢驗(yàn)其充當(dāng)促效劑以活體內(nèi)調(diào)節(jié)epha4活化的能力。通過(guò)經(jīng)igg1處理的所培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中epha4的酪氨酸磷酸化來(lái)測(cè)定由igg1進(jìn)行的epha4受體的活化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，所培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元用igg1m101、m105或m119以2μg/ml的濃度處理。epha4蛋白質(zhì)與來(lái)自蛋白質(zhì)溶解物的epha4抗體一起免疫沉淀，在sds-page上操作并且接著與酪氨酸磷酸化抗體一起進(jìn)行免疫印跡法(參見(jiàn)圖9)。

實(shí)例8：igg1m105充當(dāng)減弱艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4活化的epha4拮抗劑

igg1m101、m105和m119結(jié)合于epha4lbd并且干擾epha4與艾普瑞林的相互相用。在所培養(yǎng)的神經(jīng)元中檢驗(yàn)其充當(dāng)拮抗劑以減弱epha4活化的能力。在7div下，所培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元用所示igg1預(yù)先處理，接著用預(yù)先集群的艾普瑞林-a1處理。對(duì)于m105，這是2μg/ml(較低劑量，指示為105l)和5μg/ml(較高劑量，指示為105h)，而m101(101)、119(119)和igg都是5μg/ml。接著收集細(xì)胞并且經(jīng)歷免疫沉淀和使用所示抗體進(jìn)行的西方印跡分析。如圖10(a)中所見(jiàn)，m105以劑量依賴性方式減弱艾普瑞林-a1誘導(dǎo)的epha4磷酸化。曲線展示在免疫沉淀之后epha4的p-tyr的定量(圖10(b))和epha4的tyr602磷酸化的定量(圖10(c))。

實(shí)例9：igg1m105識(shí)別所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中的epha4：aβ降低經(jīng)m105標(biāo)記的epha4受體與突觸后標(biāo)記物psd-95的共定位

如圖11中所示，aβ降低經(jīng)m105標(biāo)記的epha4受體與psd-95的共定位。如所指示，熒光影像展示在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)用500nmaβ處理的所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(約18-20div)。細(xì)胞用igg1m105和psd-95抗體免疫染色。圖式展示與psd-95共定位的epha4含量降低。nepha4(n)表示通過(guò)超分辯率成像獲得的共定位數(shù)目(或定位計(jì)數(shù))。這一數(shù)字僅反映epha4(n)的相對(duì)豐度，但其不是蛋白質(zhì)的精確數(shù)目或甚至熒光標(biāo)簽的數(shù)目，因?yàn)槊總€(gè)染料分子在成像期間可切換多次。

實(shí)例10：阻斷epha4正向信號(hào)傳導(dǎo)可緩解aβ(1-42)寡聚物介導(dǎo)的突觸傳遞損傷

為了檢驗(yàn)igg1m105抑制epha4信號(hào)傳導(dǎo)的能力，進(jìn)行epha4集群分析。如圖12中所示，通過(guò)計(jì)算軸突上epha4叢集的總面積(tau陽(yáng)性面積)的比例來(lái)定量epha4叢集。

阻斷epha4正向信號(hào)傳導(dǎo)可緩解aβ(1-42)寡聚物介導(dǎo)的突觸傳遞和突觸可塑性的損傷。如圖13中所見(jiàn)，m105抗體(其阻斷內(nèi)源性epha4與艾普瑞林-a的相互相用)可緩解aβ(1-42)寡聚物(500nm)介導(dǎo)的mepsc的出現(xiàn)頻率降低。所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(22div)用2μg/mlm105處理30分鐘，接著用500nmaβ(1-42)處理24小時(shí)。

材料和方法

制備epha4蛋白質(zhì)。由genscript(piscataway,nj)合成人類(lèi)和小鼠epha4基因區(qū)段。將編碼與igg1fc和avi標(biāo)簽(epha4-fc)融合的人類(lèi)或小鼠epha4的質(zhì)體轉(zhuǎn)染到293個(gè)自由式細(xì)胞(invitrogen)中以用于短暫表達(dá)，并且使用小鼠epha4-fc進(jìn)行生物淘選。由sds-page判定蛋白質(zhì)純度，并且以分光光度法(nanovue,gehealthcare)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。

epha4特異性fab的選擇、表達(dá)和純化以及對(duì)igg1的轉(zhuǎn)化。使用與磁珠結(jié)合的生物素標(biāo)記的小鼠epha4-fc融合蛋白(英杰公司)淘選使用來(lái)自40名健康志愿者的pmbccdna構(gòu)筑的大型噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)和另一個(gè)使用來(lái)自10名供體的臍血構(gòu)筑的噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)。在第一、第二和第三輪生物淘選期間，10¹²個(gè)噬菌體呈現(xiàn)fab的擴(kuò)增文庫(kù)分別與5、3和1μgepha4-fc一起在室溫下培育2小時(shí)。使用多克隆和單克隆噬菌體elisa，從第三輪淘選鑒別結(jié)合于epha4-fc的純系。對(duì)這些純系的vh和vl域進(jìn)行測(cè)序，并且鑒別顯性純系。對(duì)于轉(zhuǎn)化成igg1，擴(kuò)增fab的重鏈和輕鏈并且再克隆到pdr12載體(由d.burton,scrippsresearchinstitute,lajolla,ca提供)中。如先前所描述表達(dá)fab和igg1。由sds-page評(píng)估蛋白質(zhì)純度>95％并且以分光光度法(nanovue,gehealthcare)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。

elisa。在4℃下，將epha4蛋白質(zhì)以50納克/孔涂于96孔盤(pán)(costar)上，在pbs中過(guò)夜。對(duì)于噬菌體elisa，來(lái)自每一輪淘選的噬菌體(多克隆噬菌體elisa)或從受感染的tg1細(xì)胞隨機(jī)收集的純系(單克隆噬菌體elisa)與經(jīng)固定的抗原一起培育。用抗m13-hrp多克隆ab檢測(cè)結(jié)合的噬菌體(pharmacia,piscataway,nj)。對(duì)于可溶性fab結(jié)合分析，使用hrp結(jié)合的小鼠抗flag標(biāo)簽ab(sigma-aldrich)檢測(cè)fab結(jié)合。對(duì)于igg1結(jié)合分析，使用hrp結(jié)合的抗fabab(sigma-aldrich)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性elisa分析，將小鼠epha4重組型蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或小鼠ephb2重組型蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域預(yù)先涂布到elisa盤(pán)上并且接著與不同的igg1在室溫下一起培育1小時(shí)。在用dpbs洗滌若干次之后，epha4或ephb2蛋白質(zhì)接著與不同的生物素化重組型小鼠艾普瑞林-a/艾普瑞林-bfc嵌合體蛋白質(zhì)一起在室溫下培育1小時(shí)。通過(guò)抗生蛋白鏈菌素-生物素偵測(cè)方法測(cè)定epha4/ephb2和艾普瑞林-a/艾普瑞林-b的相互相用。

流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)。為了測(cè)量igg1與epha4的相互作用，293t細(xì)胞或經(jīng)小鼠epha4轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞的等分試樣與igg1或艾普瑞林-a5-fc一起在250μl補(bǔ)充有10％胎牛血清的rpmi中、在冰上培育1小時(shí)。用培養(yǎng)基洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。二級(jí)抗體fitc結(jié)合的抗人類(lèi)igg(fc特異性)抗體(sigma-aldrich)與細(xì)胞一起培育30分鐘。洗滌細(xì)胞并且再懸浮于pbs加0.5％牛血清白蛋白(bsa)中以用于在(bectondickinson)上進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)。

免疫沉淀分析。所培養(yǎng)的神經(jīng)元與多種蛋白酶抑制劑一起溶解于放射免疫沉淀分析(ripa)緩沖液(1％tritonx-100、1％脫氧膽酸鈉、0.1％sds、150mmnacl、10mm磷酸鈉、2mmedta和0.2％釩酸鈉)中。蛋白質(zhì)溶解物與epha4抗體一起在4℃下免疫沉淀2小時(shí)，接著與蛋白質(zhì)g-瓊脂糖一起在4℃下培育1小時(shí)。樣品用ripa緩沖液或緩沖液a洗滌并且再懸浮于sds樣品緩沖液中。使用4g10抗體通過(guò)西方印跡分析檢測(cè)epha4的酪氨酸磷酸化。

免疫細(xì)胞化學(xué)分析。所培養(yǎng)的神經(jīng)元通過(guò)含4％多聚甲醛和5％蔗糖的pbs固定。在用1％牛血清白蛋白、4％山羊血清和0.1％tritonx-100(sigma)阻斷20分鐘之后，細(xì)胞與相應(yīng)的初級(jí)抗體一起在4℃下培育過(guò)夜并且接著用1×pbs洗滌3次。在室溫下，在黑暗中經(jīng)1小時(shí)添加alexafluor二級(jí)抗體與1％牛血清白蛋白。通過(guò)超分辨率成像系統(tǒng)分析epha4的細(xì)胞定位。

epha4集群。將大鼠海馬神經(jīng)元以6000個(gè)細(xì)胞/孔接種到經(jīng)聚-d-賴氨酸(50μg/ml)涂布的48孔盤(pán)上。在3div下，神經(jīng)元用igg1預(yù)先處理20分鐘并且接著再用預(yù)先集群的艾普瑞林-a1(0.25μg/ml)處理40分鐘。固定細(xì)胞并且用抗epha4和抗tau-1抗體免疫染色以觀察epha4叢集和標(biāo)識(shí)性軸突。使用incellanalyzer6000高含量分析系統(tǒng)(gehealthcare)進(jìn)行epha4叢集的細(xì)胞成像和定量。

mepsc。所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(約22-26div)用aβ處理24小時(shí)。對(duì)于mepsc記錄，細(xì)胞保持在-70mv下。這些實(shí)驗(yàn)的滴管電阻通常是3-5mω，而串聯(lián)電阻是15-20mω。在各種條件下，從各細(xì)胞經(jīng)1分鐘記錄mepsc。通過(guò)用于測(cè)量amparepsc的minianalysisprogram(synaptosoft)測(cè)量mepsc。僅分析其中串聯(lián)和輸入電阻變化<10％的記錄時(shí)期。

在本申請(qǐng)案中列舉的所有專(zhuān)利案、專(zhuān)利申請(qǐng)案和其它公開(kāi)案(包括genbank寄存編號(hào))都以全文引用的方式并入以用于所有目的。

序列表

<110>美國(guó)政府（由衛(wèi)生和人類(lèi)服務(wù)部的部長(zhǎng)所代表）

迪米特爾·s·迪米特羅夫

應(yīng)天磊

<120>針對(duì)epha4的人類(lèi)單克隆抗體和其用途

<130>4239-93116-01

<160>8

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>949

<212>prt

<213>人類(lèi)

<400>1

metalaglyilephetyrphealaleuphesercysleupheglyile

151015

cysaspalavalthrglyserargvaltyrproalaasngluvalthr

202530

leuleuaspserargservalglnglygluleuglytrpilealaser

354045

proleugluglyglytrpglugluvalserilemetaspglulysasn

505560

thrproileargthrtyrglnvalcysasnvalmetgluprosergln

65707580

asnasntrpleuargthrasptrpilethrarggluglyalaglnarg

859095

valtyrilegluilelysphethrleuargaspcysasnserleupro

100105110

glyvalmetglythrcyslysgluthrpheasnleutyrtyrtyrglu

115120125

seraspasnasplysgluargpheilearggluasnglnphevallys

130135140

ileaspthrilealaalaaspgluserphethrglnvalaspilegly

145150155160

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