相關(guān)申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)，本申請(qǐng)要求2014年8月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/039,899的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過(guò)引用全文納入本文。
背景技術(shù)：
：：血腦屏障(blood-brainbarrier,bbb)是由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此緊密結(jié)合所形成的網(wǎng)絡(luò)，能夠限制小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞在系統(tǒng)性循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)間的自由交換。血腦屏障保護(hù)腦部免受病原體、毒素或其他原因(insults，應(yīng)該是results筆誤)造成的傷害，但這對(duì)于治療多種神經(jīng)疾病而言，是一種嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。例如，腫瘤、感染、梗塞/出血、物理性創(chuàng)傷和退行性疾病(例如，帕金森氏癥(parkinson'sdisease))等常見(jiàn)且嚴(yán)重的腦部疾病，其中，足夠的藥物輸送和準(zhǔn)確的影像診斷極為重要。由于目前可用的外科手術(shù)或治療方法有限，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病常造成嚴(yán)重發(fā)病率、死亡或行動(dòng)障礙。雖然，雖然存在用于治療這些疾病的潛在治療化合物的數(shù)量不斷增加但缺乏將這些藥物傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是腦部的適當(dāng)方法，限制了其用途。目前可用的藥物傳遞技術(shù)仍需仰賴(lài)系統(tǒng)性給藥、脊髓內(nèi)或顱內(nèi)等藥物施用途徑；然而，這些方法各有局限性。例如，許多化合物無(wú)法從循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因而限制了系統(tǒng)性給藥途徑的適用范圍。即使經(jīng)由系統(tǒng)性給藥的藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，但這種藥物的量通常過(guò)低，以至于無(wú)法引發(fā)理想的治療反應(yīng)。因此，本領(lǐng)域需要開(kāi)發(fā)出新的方法來(lái)促進(jìn)傳遞治療和診斷試劑通過(guò)血腦屏障，以治療或診斷腦部疾病。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本
發(fā)明內(nèi)容至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：當(dāng)在對(duì)該受試者施用所述制劑之前合適的時(shí)間窗內(nèi)(例如，45分鐘)，給予該受試者低劑量的vegf，vegf可協(xié)助傳遞包括小分子、大分子、納米粒子或干細(xì)胞等制劑通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦部。因此本發(fā)明一個(gè)方面特征在于一種治療腦腫瘤的方法，包括：(i)系統(tǒng)性地施用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)至患有腦腫瘤的受試者；以及(ii)在施用該所述vegf后5小時(shí)內(nèi)，系統(tǒng)性地施用有效量的抗癌劑至所述受試者。在某些實(shí)施例中，所述vegf的施用量可以是5至200ng/kg，例如，25ng/kg?；蛘呋蛄硗?，所述抗癌劑是在施用vegf后15至180分鐘內(nèi)施用；例如，在施用vegf后45分鐘或3小時(shí)施用。所述抗癌劑可以是烷化劑(例如，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、益樂(lè)鉑定(oxaliplatin)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丙氨酸(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、依弗酰胺(ifosfamide)、二甲磺酸丁酯(busulfan)、n-亞硝-n-甲脲(n-nitroso-n-methylurea,mnu)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環(huán)己亞硝脲(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、鏈脲佐霉素(streptozotocin)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、沙奧特帕(thiotepa)、絲裂霉素(mytomycin)或地亞農(nóng)(diaziquone)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，喜樹(shù)堿(camptothecin)、愛(ài)萊諾迪肯(irinotecan)、托普樂(lè)肯(topotecan)、依妥普賽(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)、替尼泊苷(teniposide)、諾波霉素(novobiocin)、美巴龍(merbarone)或阿柔比星(aclarubicin)、抗代謝物(例如，氟嘧啶(fluoropymidine)、脫氧核酸類(lèi)似物(deoxynucleosideanalogue)、硫嘌呤(thiopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)或培美曲塞(pemetrexed)、細(xì)胞毒性抗生素(例如，放線(xiàn)菌素(actinomycin)、博萊霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)、絲裂霉素(mitomycin)、多柔比星、柔紅霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、吡柔比星(piraubicin)、阿柔比星(alcarubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone)或生物制劑(例如，治療性抗體例如貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、平妥單抗(pemtumomab)、奧樂(lè)弗單抗(oregovomab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、埃達(dá)珠單抗(etaracizumab)、伏洛昔單抗(volociximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、ave1642、imc-a12、mk-0646、r1507、cp751871、馬帕木單抗(mapatumumab)、kb004或iiia4)。另一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)傳遞制劑(例如治療劑或診斷劑(如，造影劑))通過(guò)受試者血腦屏障的方法。所述方法包含在施用所述制劑前5小時(shí)內(nèi)，系統(tǒng)性地施用有效量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)至有需要的受試者，其中所述vegf的有效量為5至200ng/kg(例如，25ng/kg)，并且其中所述制劑為治療劑或診斷劑。在某些實(shí)施例中，所述vegf是在施用所述制劑前15分鐘至3小時(shí)內(nèi)施用，例如，vegf是在施用所述制劑前45分鐘或3小時(shí)內(nèi)施用。在本文所述任一方法中，所述受試者可以是人類(lèi)患者，患有或疑似患有腦部疾病或具有患腦部疾病的風(fēng)險(xiǎn)。所述腦部疾病的實(shí)例包含，但不限于，缺血性中風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)精神疾病。使用診斷劑時(shí)，本發(fā)明所述方法可進(jìn)一步包含定性或定量檢測(cè)所述受試者腦部區(qū)域中的診斷劑。所述診斷劑可通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層(computedtomography,ct)或核磁共振造影(magneticresonanceimaging,mri)檢測(cè)。此外，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括：(i)第一容器，內(nèi)含有第一配方，其包含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子vegf；以及(ii)第二容器，內(nèi)有第二配方，其包含治療劑(例如，如前所述的抗癌藥物)或診斷劑例如，例如，如本文所述的那些。所述試劑盒能用于治療或診斷腦部疾病(例如，腦腫瘤)，其中所述第一配方和第二配方可被系統(tǒng)性地施用至需要所述治療的受試者，且其中第一配方可在第二配方被施用前5小時(shí)內(nèi)施用。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括一種藥物組合物，用于與治療劑或診斷劑配合使用，以治療或診斷腦部疾病。所述藥物組合物包含vegf，其中所述藥物組合物在施用所述治療劑或診斷劑前5小時(shí)內(nèi)施用至有需要的受試者，其中施用至所述受試者的vegf的量為5至200ng/kg。在下文的描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)。可參考以下附圖和若干實(shí)施例的詳細(xì)描述，以及所附權(quán)利要求書(shū)更清楚了解本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1的包括顯示全身注射vegf能夠增加小鼠血腦屏障的通透性的圖；圖1a通過(guò)腦組織中伊凡氏藍(lán)(evansblue,eb)的含量，測(cè)量vegf不同的劑量對(duì)于血腦屏障通透性的影響；*＝p<0.05(相較于控制組)；以及**＝p<0.05(相較于vegf0.1μg/kg組)；圖1b顯示全身注射0.3μg/kgvegf后血腦障壁通透性的時(shí)間進(jìn)程，通過(guò)伊凡氏藍(lán)的量來(lái)測(cè)量；ns＝不顯著；*＝p<0.05(相較于控制組)；以及**＝p<0.05(相較于vegf30分鐘組)；所有條形代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±sd)；每組為n＝6。圖2包括顯示vegf預(yù)處理增加peg化熒光納米納米粒子穿過(guò)小鼠血腦屏障的圖；a.顯示了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的流程圖；b.為經(jīng)vegf預(yù)處理或未經(jīng)vegf預(yù)處理的納米納米粒子在腦中的生物分布ivis圖像；c.柱形圖顯示通過(guò)ivis分析熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果；d.顯示了組織切片的免疫熒光染色照片，表明經(jīng)vegf預(yù)處理后，納米所述不同粒徑的納米粒子在腦中的生物分布；小鼠經(jīng)0.3μg/kgvegf注射預(yù)處理，保持45分鐘，然后再注射peg化納米納米粒子(20、100或500納米nm)，然后通過(guò)ivis分析測(cè)量熒光強(qiáng)度；ns表示不顯著；*表示與對(duì)照相比p<0.05(相較于控制組)；所有條形代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，每組為n＝6。圖3包括顯示vegf預(yù)處理能增強(qiáng)中風(fēng)后基于hmsc的細(xì)胞療法的療效；a.圖顯示了經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理或未經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理，再以能表達(dá)ds-red的hmsc處理后，在發(fā)光mcao大鼠中所測(cè)得熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果；b.圖顯示了經(jīng)表達(dá)ds-red的hmsc處理后的mcao大鼠(經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理或未經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理)的梗死面積；c.為mcao模型以2,3,5-氯化三苯四唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色的照片，其中灰白色區(qū)域?yàn)楣Ｈ娣e區(qū)域；d.顯示了伊凡氏藍(lán)(evansblue)染色的照片，表明梗塞區(qū)域中染色劑滯留；e.照片顯示了3天后，hmsc和hmsc/vegf處理組的mcao大鼠腦切片中梗死面積的減少。圖4包括顯示在gbm小鼠模型中，以vegf預(yù)處理后，再注射替莫唑胺(temozolomide,tmz)能有效延遲gbm腫瘤生長(zhǎng)；a.顯示以5mg/kgmg/kgtmz(經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理或未經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理)處理后的腫瘤體積；b.顯示以20mg/kgmg/kgtmz(經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理或未經(jīng)0.3μg/kgvegf預(yù)處理)處理后的腫瘤體積。圖5顯示vegf預(yù)處理能改善gbm小鼠的存活率。圖6顯示從經(jīng)vegf-165a(0.3μg/kg)或控制組溶液(生理食鹽水)預(yù)處理小鼠中的6個(gè)重要器官(腦、肺、肝、腎、脾和心臟)分離出的多柔比星(doxorubicin)的量；在vegf處理后，檢測(cè)到在腦部中測(cè)量的多柔比星顯著增加，其余重要器官?zèng)]有改變(每組n＝3)。圖7顯示在注射抗-nrcam抗體前45分鐘，靜脈注射0.3μg/kgvegf-165a或生理食鹽水對(duì)照的小鼠中腦部熒光信號(hào)強(qiáng)度定量分析的結(jié)果；結(jié)果顯示vegf處理后信號(hào)強(qiáng)度增加約5倍。圖8包括顯示經(jīng)vegf預(yù)處理后，注射釓(gadolinium)造影劑增加小鼠腦中造影劑的可檢測(cè)量(相較于生理鹽水控制組)的圖片；結(jié)果顯示相較于以生理鹽水預(yù)處理的小鼠(控制組)，以vegf預(yù)處理的小鼠，其腦中檢測(cè)到的釓的量增加約15.5％。具體實(shí)施方式目前已嘗試了多種方法以克服與傳遞藥物通過(guò)血腦屏障相關(guān)的挑戰(zhàn)，其中包含破壞血腦屏障、穿透血腦屏障、繞過(guò)血腦屏障或并用這些方式。滲透處理能破壞屏障，并且已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試?yán)脙?nèi)源性載體蛋白來(lái)攝取和傳遞藥物。也可直接注射藥物進(jìn)入腦脊液或直接進(jìn)入腦部，以完全避開(kāi)血腦屏障。然而，這些方法都呈現(xiàn)了其自己的挑戰(zhàn)，例如，離子失衡、神經(jīng)傳遞物質(zhì)泄漏、以及趨化因子釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中obermeieretal.,natmed19(12):1584-1596；2013。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)是細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)蛋白，能刺激血管生成(vasculogenesis)與血管新生(angiogenesis)。vegf是一種生長(zhǎng)因子，屬于血小板衍生生長(zhǎng)因子亞家族(platelet-derivedgrowthfactorsub-family)。vegf的正常功能是在胚胎發(fā)育過(guò)程中創(chuàng)造出新的血管、創(chuàng)傷后產(chǎn)生新的血管、運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生肌肉和產(chǎn)生新的血管(側(cè)枝循環(huán))以繞過(guò)阻塞的血管。哺乳類(lèi)vegf家族包含五個(gè)成員：vegf-a、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placentagrowthfactor,pgf)、vegf-b、vegf-c和vegf-d。另外，基于選擇性剪接，部分的vegf家族(即，vegf-a)中還有多種不同的異構(gòu)物。因?yàn)檠苄律c腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且vegf可促進(jìn)血管新生；因此，vegf被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生中扮演重要的角色。舉例而言，已知vegf介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)不僅與血管新生和血管通透性有關(guān)，也是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵方面，包含癌干細(xì)胞和腫瘤發(fā)生等習(xí)習(xí)相關(guān)(goel等人，naturereviewscancer13,871–882(2013))。本
發(fā)明內(nèi)容至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：vegf能暫時(shí)性地提高血腦屏障的通透性約3倍，通透性可于施用vegf后45分鐘左右達(dá)到高峰，并于施用后2小時(shí)恢復(fù)至正常通透性。并且，在二種動(dòng)物模型中，以vegf-a165對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理，能增強(qiáng)傳遞替莫唑胺(temozolomide，tmz)至侵襲性腦腫瘤區(qū)域；或增強(qiáng)人類(lèi)間葉干細(xì)胞(humanmesenchymalstemcell,hmsc)療法的療效，以降低腦卒中后的梗死損害。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)低劑量的vegf預(yù)處理，能改善tmz治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)的療效(即，降低腫瘤體積和增加存活率)，這一效果為基于本領(lǐng)域公知的vegf在腫瘤發(fā)生中所扮演角色所無(wú)法預(yù)期的。此外，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，意外地，vegf不僅能協(xié)助傳遞小分子藥物(例如，tmz和多柔比星)通過(guò)血腦屏障，也能增強(qiáng)傳遞大分子制劑通過(guò)血腦屏障，所述大分子制劑包括抗體、納米粒子和干細(xì)胞。這些結(jié)果表明在施用治療劑或診斷劑之前一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，全身施用(全身給藥)低劑量的vegf能夠暫時(shí)性地增加血腦屏障對(duì)于這些制劑之通透性，從而增強(qiáng)傳遞所述制劑至腦部。相應(yīng)地，本文提供了配合使用vegf和治療劑或診斷劑用以增強(qiáng)腦部疾病的治療或診斷效果的方法，以及用以完成所述方法的試劑盒。所述方法中，在施用治療劑或診斷劑之前一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，全身施用低劑量的vegf。定義為了方便，在此收集在本發(fā)明的上下文中使用的一些術(shù)語(yǔ)。除非本說(shuō)明書(shū)另有定義，本文所用的科學(xué)與技術(shù)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者所理解與慣用的意義相同。此外，除非上下文另有明確規(guī)定，本說(shuō)明書(shū)所用的單數(shù)名詞(“a”,“and”,和“the”)涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型。本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”是指得到期望的藥學(xué)和/或生理學(xué)上的效果；例如，延遲或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或減緩器官(例如，腦)缺血性損傷。所述的效果就完全或部分預(yù)防疾病或癥狀而言是預(yù)防性的；其中和/或，就部分或完全地治愈疾病和/或所述疾病導(dǎo)致的不良反應(yīng)而言，所述效果是治療性的。本文所用的“治療(treatment)”包含預(yù)防(preventative)(例如預(yù)防性)、治療(curative)或姑息治療(palliative)哺乳類(lèi)的疾病，尤其是人類(lèi)。所述治療包含：(1)預(yù)防(如，預(yù)防用藥)、治療或姑息治療個(gè)體的疾病或癥狀(例如，癌癥或心臟衰竭)，其中所述個(gè)體可能患有疾病但尚未被診斷；(2)抑制疾病(例如通過(guò)阻止其發(fā)展)；或(3)緩解疾病(例如，減少與所述疾病相關(guān)的癥狀)。所述術(shù)語(yǔ)“施用”(administered)(administering)(administration)在本文可互換使用，是指一種傳遞模式，包括，但不限于，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)或皮下施用本發(fā)明所述的制劑(例如，化合物或組合物)。在本
發(fā)明內(nèi)容的一實(shí)施方式中，可通過(guò)直接靜脈注射或顱內(nèi)注射將所述生長(zhǎng)因子(例如，vegf)、治療劑或造影劑施用至所述個(gè)體。全身施用為施用制劑至循環(huán)系統(tǒng)的路徑，使整個(gè)身體受到影響。所述施用可以是經(jīng)由腸道施用(由胃腸道吸收藥物)或腸胃外施用(注射、灌注或移植)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效量(effectiveamount)”，是指在劑量和需要的時(shí)間上有效地達(dá)到關(guān)于疾病治療的期望結(jié)果的量。舉例來(lái)說(shuō)，在癌癥的治療中，制劑(即，化合物或組合物)的用量，若能降低、預(yù)防、延緩或抑制或阻止癌癥的任何癥狀，即為有效量。制劑的有效量不需要能夠治愈疾病或癥狀，但能提供疾病或病癥的治療，使得疾病或癥狀的發(fā)生被延緩、阻礙或預(yù)防，或疾病或病征癥狀得到改善。所述有效量可以合適的形式型式分成一、二或更多劑量，以在指定期間內(nèi)以一次、二次或更多次施用。所述術(shù)語(yǔ)“受試者(subject)”或“患者(patient)”，是指可接受本
發(fā)明內(nèi)容的方法治療的動(dòng)物(包括，人類(lèi))。除非另有指明，術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”一般包含雄性與雌性。因此，所述“受試者”或“患者”包含可從本
發(fā)明內(nèi)容的治療方法受益的任何動(dòng)物。所述術(shù)語(yǔ)“腫瘤”和“癌癥”，在此可互換使用。所述“腫瘤”和“癌癥”是指任一細(xì)胞性惡性腫瘤，其特點(diǎn)在于其失去正常調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，缺乏分化和/或能夠侵襲局部組織和轉(zhuǎn)移。人類(lèi)腦部腫瘤包含，但不限于，膠質(zhì)瘤(gliomas)、轉(zhuǎn)移瘤(metastases)、腦膜瘤(meningiomas)、垂體腺瘤(pituitaryadenoma)和聽(tīng)神經(jīng)瘤(acousticneuromas)。舉例而言，膠質(zhì)瘤包含星形細(xì)胞瘤(astrocytoma)、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤(pilocytic)、低度惡性星形細(xì)胞瘤(low-gradeastrocytoma)、間變性星形細(xì)胞(anaplasticastrocytoma)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme)、腦干膠質(zhì)瘤(brainstemglioma)、室管膜瘤(ependymoma)、亞室管膜瘤(subependymoma)、神經(jīng)節(jié)瘤(ganglioneuroma)、混合膠質(zhì)瘤(mixedglioma)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendroglioma)和視神經(jīng)膠質(zhì)瘤(opticnerveglioma)。非神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤(non-glialtumors)的實(shí)例包含聽(tīng)神經(jīng)瘤(acousticneuroma)、脊索瘤(chordoma)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(cnslymphoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、血管母細(xì)胞瘤(hemangioblastoma)、髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)、腦膜瘤(meningioma)、松果體瘤(pinealtumors)、垂體瘤(pituitarytumors)、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(primitiveneuroectodermaltumors,pnet)、橫紋肌樣瘤(rhabdoidtumors)和神經(jīng)鞘瘤(schwannoma)。影響顱神經(jīng)(cranialnerves)的腫瘤，包括視神經(jīng)膠質(zhì)瘤、第八對(duì)顱神經(jīng)的神經(jīng)纖維瘤(neurofibromasof8thcranialnerve)、第五對(duì)顱神經(jīng)的神經(jīng)纖維瘤(neurofibromasof5thcranialnerve)。良性腫瘤包括蛛網(wǎng)膜(arachnoid)、皮樣(dermoid)、表皮樣(epidermoid)、膠體(colloid)和神經(jīng)上皮囊腫(neuroepithelialcysts)及任何其它緩慢生長(zhǎng)的腫瘤。如前述起源于腦部的原發(fā)性腦瘤，以及轉(zhuǎn)移性腦瘤(起源于身體其他部位的癌癥的繼發(fā)性腦腫瘤)為最常見(jiàn)的腦腫瘤。轉(zhuǎn)移性腦瘤可由其他部位的原發(fā)性癌癥轉(zhuǎn)移至腦部，包括，但不限于起源于肺部、皮膚(黑色素瘤)、腎臟、大腸和乳腺的癌癥。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腦卒中(stroke)”是指任何妨礙和減少全部或部分腦部血液供應(yīng)的事件。腦卒中可以由血栓(thrombosis)、栓塞(embolism)或出血(hemorrhage)所造成，且可稱(chēng)為缺血性腦卒中(ischemicstroke)或出血性腦卒中(hemorrhagicstroke)。缺血性腦卒中包含血栓形成性腦卒中(thromboticstroke)、和栓塞性腦卒中(embolicstroke)，以及由血栓形成(thrombosis)、栓塞(embolism)、系統(tǒng)性灌注低下(systemichypo-perfusion)等造成。出血性腦梗塞可以是由腦出血(intracerebralhemorrhage)、蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage)、硬膜下出血(subduralhemorrhage)或硬膜外出血(epiduralhemorrhage)等所造成。如本文所用腦卒中不包含熱中暑(heat-stroke)和短暫性腦缺血發(fā)作(transientischemicattacks,tia)。熱中暑是由體溫升高所引起的，其大腦的臨床癥狀和在此所述的卒中不同(即，血液供應(yīng)中斷與腦部氧氣量降低相關(guān))。tia有時(shí)被稱(chēng)為“輕微腦卒中(ministrokes)”，然而，因其能夠在發(fā)生后24小時(shí)內(nèi)完全解決，因而和在此定義的腦卒中不同。腦卒中可通過(guò)神經(jīng)檢查、血液檢查、和/或醫(yī)學(xué)影像技術(shù)來(lái)診斷，所述醫(yī)學(xué)影像技術(shù)包括例如，計(jì)算機(jī)斷層(computedtomography,ct)掃描(例如沒(méi)有造影劑)、核磁共振造影(magneticresonanceimaging,mri)掃描、多普勒超聲波(dopplerultrasound)和動(dòng)脈血管攝影術(shù)(arteriography)。所述術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)精神疾病(neuropsychiatricdisorder)”是指神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，其典型的識(shí)別方式系依據(jù)可能受到影響的四組心智活動(dòng)中的哪一組來(lái)區(qū)分。舉例而言，第一組包含思考和認(rèn)知障礙，例如，精神分裂癥(schizophrenia)和譫妄癥(delirium)；第二組包含情緒障礙，例如，情感障礙(affectivedisorders)和焦慮(anxiety)；第三組包含社會(huì)行為障礙，例如，性格缺陷(characterdefects)和人格障礙(personalitydisorders)；以及第四組包含學(xué)習(xí)、記憶和智能障礙，例如，心智發(fā)育遲緩(mentalretardation)和失智癥(dementia)。因此，本
發(fā)明內(nèi)容的神經(jīng)精神疾病包含精神分裂癥、譫妄癥、阿爾茨海默病(ad)、抑郁癥、躁狂癥(mania)、注意力缺陷障礙(attentiondeficitdisorders,add)、注意力不足過(guò)動(dòng)障礙(attentiondeficithyperactivitydisorders,adhd)、藥物成癮(drugaddiction)、輕度認(rèn)知障礙(mildcognitiveimpairment)、失智癥(dementia)、情緒激動(dòng)(agitation)、無(wú)情感(apathy)、焦慮(anxiety)、精神病(psychoses)、創(chuàng)傷后壓力癥候群(post-traumaticstressdisorders)、易怒(irritability)和雙極性疾患(bipolardisorders)。如本文所用，所述“神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativedisease)”是指一種病癥，其特征在于所述受影響的受試者神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致功能缺陷。本
發(fā)明內(nèi)容的神經(jīng)退行性疾病包含阿爾茨海默癥(alzheimer’sdisease,ad)、嗜銀顆粒病(argyrophilicgraindisease)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,als)、關(guān)島型帕金森失智肌萎縮側(cè)索硬化綜合癥(als-parkinsonismdementiacomplexofguam)、血管性失智癥(vasculardementia)、額顳葉失智癥(frontotemporaldementia)、語(yǔ)意性失智癥(semanticdementia)、路易體失智癥(dementiawithlewybodies)、亨丁頓舞蹈癥(huntington’sdisease)、包涵體肌病(inclusionbodymyopathy)、包涵體肌炎(inclusionbodymyositis)和帕金森氏癥(parkinson’sdisease、pd)。vegf協(xié)助傳遞治療劑/診斷劑通過(guò)血腦屏障的用途本
發(fā)明內(nèi)容一方面特征在于一種涉及共同使用vegf和治療劑或診斷劑來(lái)治療或診斷腦部疾病的方法，其中在施用治療劑或診斷劑之前一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，先全身施用低劑量的vegf至受試者。除了vegf外，其他生長(zhǎng)因子例如igf-i和igf-ii，也可用于本文所述方法中。(i)vegf本文所述的vegf五個(gè)家族中任一vegf都適用于本文公開(kāi)的方法。vegf可來(lái)自合適來(lái)源，例如人類(lèi)、猴子、小鼠、大鼠、豬、狗和貓。在一些實(shí)施方式中，本文所述方法中所使用的vegf分子為vegf-a分子，例如，vegf-a165異構(gòu)物。人類(lèi)vegf-a165的氨基酸序列為：apmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqenpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprr(seqidno:1)。在一些實(shí)例中，本文所述方法中所使用的vegf分子為野生型vegf。在其他實(shí)例中，所述vegf可以是經(jīng)修飾的變體，其保留了與野生型對(duì)應(yīng)物相同或類(lèi)似的生物活性。這種經(jīng)修飾的變體可以相對(duì)于所述野生型對(duì)應(yīng)物具有至少85％的序列相同性(例如，90％、95％、97％、99％或以上)。使用由karlin和altschul改進(jìn)(proc.natl.acad.sci.usa90:5873-77,1993)的karlin和altschul(proc.natl.acad.sci.usa87:2264-68,1990)的算法，檢測(cè)兩個(gè)氨基酸序列的“百分比相同性”。該算法被引入altschul等人，j.mol.biol.215:403-10,1990的nblast和xblast程序(2.0版)。可以采用xblast程序開(kāi)展blast蛋白研究，設(shè)定分?jǐn)?shù)＝50，字長(zhǎng)(wordlength)＝3，從而獲得與感興趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。當(dāng)兩序列間存在間隙時(shí)，可以采用altschul等人，核酸研究(nucleicacidsres.)25(17):3389-3402,1997中描述的gappedblast。當(dāng)使用blast和gappedblast程序時(shí)，可以使用各程序(如xblast和nblast)的默認(rèn)參數(shù)。在一些實(shí)施方式中，相較于野生型對(duì)應(yīng)物而言，經(jīng)修飾的vegf變體由一或多個(gè)保守性氨基酸殘基取代分子所組成。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者當(dāng)可理解可在vegf分子中進(jìn)行保守性氨基酸取代，以提供功能上等同的變體，即變體保留特定vegf的功能能力。如本文所用「保守性氨基酸取代」是指蛋白質(zhì)中進(jìn)行氨基酸取代后，氨基酸取代不改變所述蛋白質(zhì)的相對(duì)電荷或尺寸特征?？梢罁?jù)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者已知的修飾肽序列的方法來(lái)制備變體，例如在編譯這些方法的參考文獻(xiàn)中找到的那些，例如分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),j.sambrook,等人.,編輯.,第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約,1989或分子生物學(xué)通用方法(currentprotocolsinmolecularbiology),f.m.ausubel,等人,編輯,johnwiley&sons,inc.,newyork.。氨基酸的保守性取代包括在以下各組中的氨基酸之間進(jìn)行的取代：(a)m、i、l、v；(b)f、y、w；(c)k、r、h；(d)a、g；(e)s、t；(f)q、n；以及(g)e、d。通?？赏ㄟ^(guò)改變編碼所述變體的核酸，進(jìn)行vegf的氨基酸序列內(nèi)的保守性氨基酸取代，產(chǎn)生與vegf功能上等同的變體。所述取代可利用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者已知的多種方法進(jìn)行。例如，利用pcr定向突變法、根據(jù)kunkel(kunkel,pnas82:488-492,1985)中所述的定點(diǎn)突變法或通過(guò)化學(xué)合成編碼vegf變體的核酸分子。用于本文所述方法的任一vegf分子可以利用常規(guī)方法制備。例如，可以在常規(guī)蛋白質(zhì)純化程序之后，從適當(dāng)?shù)奶烊毁Y源中分離?；蛘撸淇梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)重組技術(shù)在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。(ii)藥物組合物用于本文所述方法的任何活性制劑(例如，vegf、治療劑和診斷劑)可與藥學(xué)上可接受載體(賦形劑)混合，包括緩沖液，以形成藥物組合物，所述藥物組合物用于抑制硬骨素表達(dá)(sclerostinexpression)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化(osteoblastdifferentiation)和/或促進(jìn)骨折愈合(bonefracturehealing)。所述“可接受(acceptable)”是指所述載體可與組合物中的活性成分相容(并且較佳的，能夠穩(wěn)定所述活性成分)，且對(duì)接受治療的受試者無(wú)害。。藥學(xué)上可接受賦形劑(載體)包括緩沖液，可以是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中已知的賦形劑。參見(jiàn)，例如，remington:藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(thescienceandpracticeofpharacy)第20版.(2000)lippincottwilliams和wilkins,編輯.k.e.hoover。本方法所使用的藥學(xué)組合物可包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，且該組合物可以是凍干制劑或水溶液(參見(jiàn)remington:藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(thescienceandpracticeofpharmacy)第20版.(2000)lippincottwilliams和wilkins,編輯.k.e.hoover)。藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑所使用的劑量和濃度對(duì)于個(gè)體必須是無(wú)毒的。藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑可包含緩沖液，例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包含抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如，十八烷基二甲基芐基氯化氨(octadecyldimethylbenzylammoniumchloride)；氯化六烴季銨(hexamethoniumchloride)；氯化芐二甲烴銨(benzalkoniumchloride)、氯化芐乙氧銨(benzethoniumchloride)；苯酚(phenol)、丁醇或芐醇(butyl或benzylalcohol)；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(alkylparabens)例如，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯(methylparaben)或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯(propylparaben)；鄰苯二酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環(huán)己醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)和間甲酚(m-cresol))；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；氨基酸，例如：甘氨酸(glycine)、谷氨酰胺(glutamine)、天冬酰胺(asparagine)、組氨酸(histidine)、精氨酸(arginine)或賴(lài)氨酸(lysine)；單醣(monosaccharides)、雙醣(disaccharides)和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖(mannose)或葡聚醣(dextrans)；螯合劑，例如，edta；糖類(lèi)，例如蔗糖、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨醇(sorbitol)；鹽形成平衡離子(salt-formingcounter-ions)，例如，鈉；金屬?gòu)?fù)合物(即，zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性制劑，例如，tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(polyethyleneglycol,peg)。藥學(xué)上可接受的賦形劑在本文中進(jìn)一步描述。在一實(shí)施例中，一或多個(gè)活性制劑可配制成液體藥物組合物。所述液體藥學(xué)組合物是無(wú)菌溶液或懸浮液，其施用可以通過(guò)例如靜脈注射、肌肉內(nèi)注射、皮下注射或腹腔注射。適合用于制造無(wú)菌注射液或懸浮液的稀釋劑或溶劑包含，但不限于，1,3-丁二醇(butanediol)、甘露醇(mannitol)、水、林格氏溶液(ringer’ssolution)和等滲透壓氯化鈉溶液(isotonicsodiumchloridesolution)。脂肪酸(fattyacids)(例如，十八烯酸(oleicacid)和其甘油酯衍生物(glyceridederivatives)也適用于制備注射劑，且所述油類(lèi)為天然藥學(xué)上可接受的油，例如，橄欖油(oliveoil)或蓖麻油(castoroil)。所述油溶液或懸浮液也可包含醇稀釋劑(alcoholdiluent)或羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)或類(lèi)似的分散劑(dispersingagent)。其他常用的表面活性制劑，例如，tweens或spans或其他類(lèi)似的乳化劑(emulsifyingagents)或經(jīng)常被用以制備藥學(xué)上可接受的劑型的生物利用增強(qiáng)劑(bioavailabilityenhancers)，也可以用于配制的目的。在某些實(shí)施例中，本文所述的藥物組合物包含脂質(zhì)體，其含有一活性物質(zhì)(例如，vegf)。所述藥物組合物可利用本領(lǐng)域已知的方法制備而成，參見(jiàn)epstein,等人,proc.natl.acad.sci.usa82:3688(1985)；hwang,等人,proc.natl.acad.sci.usa77:4030(1980)以及美國(guó)4,485,045號(hào)專(zhuān)利和美國(guó)4,544,545號(hào)專(zhuān)利等文獻(xiàn)。另外，美國(guó)5,013,556號(hào)專(zhuān)利公開(kāi)了脂質(zhì)體能增強(qiáng)循環(huán)時(shí)間。通過(guò)使用包含卵磷脂(phosphatidylcholine)、膽固醇(cholesterol)和peg衍生磷脂酰乙醇胺(peg-derivatizedphosphatidylethanolamine,peg-pe)的脂質(zhì)組合物的反相蒸發(fā)法可以產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。利用擠壓方式使脂質(zhì)體通過(guò)預(yù)定孔徑大小的過(guò)濾器，以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。所述活性物質(zhì)(例如，vegf分子)也可被制備的微膠囊包覆，例如，利用凝聚技術(shù)(coacervationtechniques)或通過(guò)界面聚合法(interfacialpolymerization)制備，例如在膠體藥物遞送系統(tǒng)(colloidaldrugdeliverysystems)，(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納納米膠囊)可使用羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)，或者在巨乳劑中可使用明膠微膠囊(gelatin-microcapsules)和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊(poly-(methylmethacylate)microcapsules)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)remington,藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(thescienceandpracticeofpharmacy)第20th版mack出版(2000)。適用于體內(nèi)(invivo)施用的藥學(xué)組合物必須是無(wú)菌的。這可利用例如通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾容易地實(shí)現(xiàn)。治療性組合物通常置于容器內(nèi)，且該容器具有無(wú)菌存取口；例如，靜脈輸液袋(intravenoussolutionbag)或瓶子，其上設(shè)有可供皮下注射針頭穿刺的塞子。本文所述的藥物組合物可以是單位劑型，例如片劑(tablet)、藥丸(pills)、膠囊(capsules)、粉末(powders)、顆粒(granules)、溶液(solutions)或懸浮液(suspensions)、或栓劑(suppositories)，供口服、腸胃外或直腸途徑施用，或通過(guò)吸入或吹入施用。為了制備固體組合物如片劑，可將主要活性成分與藥物載體混合，例如，常規(guī)的壓片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹(shù)膠，以及其它藥物稀釋劑，例如，水，以制成含有本發(fā)明化合物或其無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的鹽的均質(zhì)混合物的固體預(yù)制劑組合物。所述均質(zhì)化的預(yù)制劑組合物是指活性化合物均勻分散在組合物當(dāng)中，因此，所述組合物可容易地再分成等效的單位劑型，例如，片劑、藥丸和膠囊。所述固體預(yù)制劑組合物可再分成含有本發(fā)明活性成份0.1至約500毫克的上述類(lèi)型的單位劑型。新穎組合物的藥片或藥丸可涂覆外層或是以其他方式復(fù)合以提供長(zhǎng)效劑型。例如，所述藥片或藥丸可包含內(nèi)部劑量和外部劑量成分，其中外部成分作為包覆內(nèi)部成分的外膜。為了抵抗組合物在胃部被分解，二種成分可以被腸溶層分開(kāi)，使內(nèi)部成分能完整進(jìn)入十二指腸，或延遲其釋放。多種材料可用于這種腸溶層或涂覆層，這些材料包括多種聚合酸和聚合酸與這樣的材料如紫膠(shellac)、十六烷醇(cetylalcohol)或醋酸纖維素(celluloseacetate)的混合物。合適的表面活性劑(surface-activeagents)特別包括非離子試劑(non-ionicagents)，例如，聚氧乙烯山梨醇酐(polyoxyethylenesorbitans)(例如，tweentm20、40、60、80或85)和其他山梨醇酐(例如，spantm20、40、60、80或85)。具有表面活性制劑的組合物的表面活性制劑的含量通常為0.05％至5％。并且可以在0.1％至2.5％之間。應(yīng)當(dāng)理解，如果需要，可添加其他成分，例如，甘露醇或其它藥學(xué)上可接受的載體。合適的乳劑可以使用市售的脂肪乳劑，例如，intralipidtm、liposyntm、infonutroltm、lipofundintm和lipiphysantm來(lái)制備。所述活性成分可以溶于預(yù)先混合的乳液組合物中或者可以將其溶于油(例如，大豆油(soybeanoil)、紅花油(saffloweroil)、棉籽油(cottonseedoil)、芝麻油(sesameoil)、玉米油(cornoil)或杏仁油(almondoil))中，然后將其與磷脂(例如，卵磷脂(eggphospholipids)、大豆磷脂(soybeanphospholipid)或大豆卵磷脂)和水混合形成乳劑。應(yīng)當(dāng)理解，本制劑也可添加其他成分，例如，甘油或葡萄糖，以調(diào)整乳劑的滲透壓。適用于本發(fā)明的乳劑的油含量至多為20％；例如，5％至20％。脂肪乳劑可以包含0.1至1.0.im，特別是0.1和0.5.im之間的脂肪小滴，且其ph范圍為5.5至8.0。乳液組合物可以是通過(guò)將vegf或治療劑/診斷劑與intralipidtm或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制備的組合物。適用于吸入或吹入的藥物組合物包含在藥學(xué)上可接受的，水性或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液以及粉末。所述液體或固體組合物可包含上述合適的藥學(xué)上可接受賦形劑。在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)經(jīng)口或經(jīng)鼻呼吸道途徑施用所述組合物，達(dá)到局部或施用全身效果。優(yōu)選無(wú)菌藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物可以通過(guò)利用氣體進(jìn)行霧化。霧化溶液可直接從霧化裝置吸入，或者是以面罩、帳幕或間歇性正壓呼吸器與霧化裝置相連接。溶液，懸浮液或粉末組合物可以以適當(dāng)?shù)姆绞綇倪f送所述制劑的裝置施用(給藥)，優(yōu)選口服或經(jīng)鼻途徑給藥。(iii)治療應(yīng)用vegf(以及其他生長(zhǎng)因子)可以和治療劑或診斷劑共同使用(co-use)來(lái)治療或診斷腦部疾病，包括腦腫瘤、腦卒中、神經(jīng)精神疾病或神經(jīng)退行性疾病、例如本文所述的那些。本發(fā)明所述的方法也可應(yīng)用于腦部成像。為了實(shí)施本文所述的方法，依序施用含vegf(例如，人類(lèi)vegf-a165)的藥物組合物和含適當(dāng)治療劑或診斷劑的藥物組合物至任一需要所述治療的受試者(例如，本文所述的那些)。vegf可以在施用治療劑或診斷劑前的合適的時(shí)間窗內(nèi)施用。例如，vegf是在施用治療劑或診斷劑前少于5小時(shí)施用。在一些實(shí)施方式中，所述vegf是在施用治療劑或診斷劑前15-180分鐘(例如，15-120、15-90、15-60、30-120、30-90或30-60分鐘)內(nèi)施用。在一些實(shí)施方式中，生長(zhǎng)因子是在施用治療劑或診斷劑前15、20、25、30、35、40、45或50分鐘施用。在一個(gè)實(shí)施例中，vegf是在施用治療劑或診斷劑前45分鐘施用。在另一實(shí)施例中，vegf是在施用治療劑或診斷劑前3小時(shí)施用。另外，生長(zhǎng)因子和治療劑/診斷劑可以同時(shí)施用(concomitantly)。可通過(guò)任何給藥途徑來(lái)施用生長(zhǎng)因子和治療劑/診斷劑至哺乳類(lèi)，優(yōu)選人，所述途徑是指能有效傳遞生長(zhǎng)因子和/或治療劑至適當(dāng)或期望的作用區(qū)域的給藥途徑，例如，經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、經(jīng)皮或腸胃外。所述經(jīng)皮給藥途徑可以是被動(dòng)傳遞或離子電滲傳遞(iontophoreticdelivery)。例如，腸胃外的施用途徑可以是直腸內(nèi)、植入式儲(chǔ)劑、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)、小腦內(nèi)(intra-cerebella)、皮下、眼用溶液或軟膏。另外，可同時(shí)或順序施用本發(fā)明的生長(zhǎng)因子與治療劑。在一些實(shí)施方式中，生長(zhǎng)因子(如，vegf)可通過(guò)常規(guī)的全身途徑給藥；例如，靜脈注射。注射組合物可包含多種載體，例如，植物油(vegetableoils)、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺(dimethyformamide)、乳酸乙酯(ethyllactate)、碳酸乙酯(ethylcarbonate)、肉荳蔻酸異丙酯(isopropylmyristate)、乙醇(ethanol)和多元醇(polyols)(甘油、丙二醇，聚乙二醇液體及其類(lèi)似物)。對(duì)于靜脈注射，可以通過(guò)滴注法施用水溶性試劑如vegf，從而注入含該試劑和生理上可接受的賦形劑的藥物制劑。生理上可接受的賦形劑可包括，例如5％葡萄糖、0.9％食鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。制備肌肉內(nèi)劑型，例如，試劑的合適的可溶性鹽形式的無(wú)菌制劑可將制劑溶于藥學(xué)賦形劑中并以該形式施用。所述藥學(xué)賦形劑可以是注射用水、0.9％食鹽水或5％葡萄糖溶液?？墒┯玫蛣┝康纳L(zhǎng)因子(例如，vegf)至受試者。在一些實(shí)施例中，vegf施用至受試者(例如，人類(lèi)受試者)的量為5至200ng/kg。所選擇的生長(zhǎng)因子(例如，vegf)的劑量應(yīng)足夠高以增加血腦屏障的通透性，但不足以破壞血腦屏障的整體結(jié)構(gòu)，這不可避免地導(dǎo)致對(duì)腦部的后續(xù)損傷(例如水腫)。因此，生長(zhǎng)因子如vegf優(yōu)選以約10至100ng/kg的量施用至受試者(例如，人類(lèi)受試者)，例如，約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/kg。更優(yōu)選地，，所述生長(zhǎng)因子被施用至受試者的量為15-50ng/kg，例如約15、20、25、30、35、40、45、或50ng/kg。最優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)因子被施用至受試者的量為約25ng/kg。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的生長(zhǎng)因子和/或治療劑的劑量將因患者而異，不僅依據(jù)所選擇的特定生長(zhǎng)因子或治療劑、給藥途徑，以及生長(zhǎng)因子或治療劑在患者體內(nèi)產(chǎn)生預(yù)期反應(yīng)的能力，而且，所述劑量亦可依據(jù)其他因素改變，例如，疾病病程、要緩解的病癥的嚴(yán)重程度、患者的年齡、性別、體重、患者目前的狀況，以及所治療的病理嚴(yán)重程度、合并用藥或患者特殊飲食后的狀況；此外，所述劑量的改變也可依據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可識(shí)別的其它因素其中適當(dāng)?shù)膭┝孔罱K由主治醫(yī)生酌情決定。另外，也可調(diào)整劑量施用方案以提供預(yù)期反應(yīng)。在較佳的實(shí)施方式中，在一定期間內(nèi)施用一定量的本發(fā)明生長(zhǎng)因子，以使血腦屏障的通透性增加，接著至少一種劑量的治療劑隨后施用至所述受試者以達(dá)到改善的治療效果。在某些實(shí)施方式中，本文所述的方法適用于治療腦腫瘤例如神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)(例如多型性神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiform))。根據(jù)本文提供的公開(kāi)內(nèi)容，抗癌藥物如本文所述的那些藥物可與vegf(以及本文所述的另一生長(zhǎng)因子)共同使用。發(fā)現(xiàn)低劑量的vegf能增加血腦屏障對(duì)不僅僅是小分子藥物，還有蛋白質(zhì)藥物、納米顆粒、干細(xì)胞的通透性納米。因此，如本文所述，小分子抗癌藥物和生物制劑都可與vegf共同使用以增強(qiáng)腦腫瘤的治療效果。在某些實(shí)施方式中，本文所述方法可用于治療腦部疾病，包括但不限于腦卒中、神經(jīng)精神疾病或神經(jīng)退行性疾病。本文提供了這些腦疾病的實(shí)例。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本文提供的公開(kāi)內(nèi)容，可并用干細(xì)胞(如，msc)和vegf(以及本文所述的其它生長(zhǎng)因子)以治療腦卒中或神經(jīng)退行性疾病。在其他情況下，可并用抗凝血?jiǎng)?例如本文所述的那些)和vegf以治療腦卒中。此外，包括本文所述的任何一種的抗精神病或抗癡呆藥可與vegf并用，來(lái)治療精神病或癡呆。這些目標(biāo)疾病的實(shí)例也在本發(fā)明中提供。在其他實(shí)施方式中，本文所述的方法可應(yīng)用于腦部造影，所述方法是通過(guò)并用vegf(或其他生長(zhǎng)因子)與成像劑，例如造影劑。所述造影劑可以是任一種使用計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)例如正子放射式斷層掃描(positronemissiontomography,pet)或單光子放射計(jì)算機(jī)斷層掃描(singlephotonemissioncomputedtomography,spect)，或核磁共振成像(mri)能檢測(cè)到的試劑。用于治療或診斷腦部疾病的試劑盒本發(fā)明還提供了用于本文所述用于治療或診斷腦疾病的方法的試劑盒。所述試劑盒包含至少兩個(gè)容器，其中一個(gè)容器含有包含vegf的第一制劑，另一個(gè)容器包含第二制劑，所述第二制劑含有本文所述的治療劑(例如，抗癌劑)或本文所述的診斷劑(例如，成像劑)。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包括根據(jù)本文所述的任何方法使用的說(shuō)明書(shū)。。所述包括的說(shuō)明書(shū)可以包含施用vegf和/或治療劑/診斷劑以治療或診斷本文所述的目標(biāo)腦疾病的描述。所述試劑盒還可以包括基于鑒定該個(gè)體是否具有目標(biāo)疾病來(lái)選擇適合于該治療的個(gè)體的描述。在另外的其它實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)可以包括對(duì)具有目標(biāo)疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體施用vegf或治療/診斷劑的描述。關(guān)于使用vegf和/或治療劑/診斷劑的說(shuō)明書(shū)通常包括關(guān)于預(yù)期治療或診斷的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。所述容器可以是單位劑量、批量包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。本文所述試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)一般為紙本說(shuō)明書(shū)，可標(biāo)示于包裝上或置于包裝內(nèi)(例如，置于試劑盒內(nèi)的書(shū)面說(shuō)明書(shū))。此外，說(shuō)明書(shū)也可為機(jī)器可讀說(shuō)明書(shū)(例如，儲(chǔ)存于磁盤(pán)或光盤(pán)內(nèi)的電子說(shuō)明書(shū))。包裝上的標(biāo)示或包裝內(nèi)部的紙本說(shuō)明書(shū)指出所述化合物是用以治療/診斷、延遲發(fā)病和/或減輕本文所述的腦部疾病或病癥?？梢砸罁?jù)本發(fā)明所提供的說(shuō)明書(shū)，來(lái)實(shí)施本文所述的任一方法。本發(fā)明的試劑盒可以適當(dāng)?shù)姆绞桨b。所述包裝包含，但不限于，小瓶(vial)、罐(bottle)、廣口瓶(jars)、軟包裝(flexiblepackaging)(例如，密封的薄膜(mylar)或塑料袋)等。還可以想到的是與特定裝置組合使用的包裝，例如，吸入器、鼻部給藥裝置(例如，霧化器)或輸液裝置(如，微型泵)。所述試劑盒可包含一無(wú)菌進(jìn)入口(例如所述容器可以是具有一可被皮下注射針頭穿刺的塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。所述容器還可以具有無(wú)菌進(jìn)入口(例如，所述容器還可以是具有一可被皮下注射針頭穿刺的塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。試劑盒可以可選地提供附加組件，例如，緩沖液體和說(shuō)明信息。一般而言，所述試劑盒包含一容器，以及在容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含上述試劑盒的內(nèi)容物的制品。常規(guī)技術(shù)除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)(molecularcloning:alaboratorymanual),第二版(sambrook,等人,1989)coldspringharbor出版社；寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)(m.j.gait,ed.,1984)；分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology),humana出版社；細(xì)胞生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(cellbiology:alaboratorynotebook)(j.e.cellis,編輯,1998)學(xué)術(shù)出版社；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(animalcellculture)(r.i.freshney,編輯,1987)；細(xì)胞和組織培養(yǎng)的介紹(introductiontocellandtissueculture)(j.p.matherandp.e.roberts,1998)plenum出版社；細(xì)胞和組織培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)室程序(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)(a.doyle,j.b.griffiths,和d.g.newell,編輯,1993-8)j.wiley和sons；酶學(xué)方法(methodsinenzymology)(學(xué)術(shù)出版社公司)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(handbookofexperimentalimmunology)(d.m.weir和c.c.blackwell,編輯)；用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(genetransfervectorsformammaliancells)(j.m.miller和m.p.calos,編輯,1987)；分子生物學(xué)的當(dāng)前方案(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.ausubel,等人,編輯,1987)；pcr:聚合酶鏈反應(yīng),(mullis,等人,編輯,1994)；免疫學(xué)的當(dāng)前方案(currentprotocolsinimmunology)(j.e.coligan等人,編,1991)；分子生物學(xué)的短小方案(shortprotocolsinmolecularbiology)(wiley和sons,1999)；免疫生物學(xué)(c.a.janeway和p.travers,1997)；抗體(p.finch,1997)；抗體：實(shí)踐方法(antibodies:apracticalapproach)(d.catty.,編輯,irl出版社,1988-1989)；單克隆抗體：實(shí)用方法(monoclonalantibodies:apracticalapproach)(p.shepherd和c.dean,編,牛津大學(xué)出版社,2000)；使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(usingantibodies:alaboratorymanual)(e.harlow和d.lane(coldspringharborlaboratory出版社,1999)；抗體(theantibodies)(m.zanetti和j.d.capra,編輯,harwoodacademicpublishers,1995)。無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)描述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述描述最大程度地利用本發(fā)明。因此，以下具體實(shí)施例應(yīng)被解釋為僅僅是說(shuō)明性的，而不以任何方式限制本發(fā)明的其余部分。本文引用的所有出版物，通過(guò)引用并入本文用于參考的目的或主題。實(shí)施例1：在小鼠模型中vegf能增強(qiáng)血腦屏障屏障通透性材料和方法(i)藉由伊凡氏藍(lán)(evansblue，eb)滲出量測(cè)定血腦屏障通透性通過(guò)伊凡氏藍(lán)(fluka)以定量評(píng)估血腦屏障的通透性。以靜脈注射方式施用伊凡氏藍(lán)(2％或4％v/v溶于食鹽水，4ml/kg)。為了分析滲出狀況，灌注50毫升0.9％食鹽水(含10i.u./毫升的肝素)至動(dòng)物體內(nèi)以移除血管內(nèi)的染料，直至從動(dòng)物動(dòng)脈、腎臟和肝臟采樣到的體液為無(wú)色液體為止。然后，處死動(dòng)物并稱(chēng)量其腦部重量，在n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide)(sigma-aldrich公司)(1ml/150mg組織重量)中將腦組織均質(zhì)化，在55℃下培養(yǎng)18小時(shí)，并進(jìn)行離心(14000rpm/20分鐘)。以分光度計(jì)(在620nm)分析染劑上清液。于mcao大鼠模型中，將腦部區(qū)分成梗塞側(cè)和非梗塞側(cè)，并測(cè)量分別取自于梗塞側(cè)和非梗塞側(cè)的上清液。(ii)測(cè)定vegf對(duì)血腦屏障通透性的影響依據(jù)所施用vegf劑量的不同，將小鼠分成6組，分別為：控制組(僅施用食鹽水)、0.1微克/公斤、0.3微克/公斤、0.5微克/公斤、1.0微克/公斤和2.0微克/公斤的vegf。如上所述，在注射vegf后一小時(shí)，以伊凡氏藍(lán)分析法(ebassay)測(cè)定血腦屏障的通透性。選擇能夠獲得最大血腦屏障通透性的最少劑量的vegf，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在注射vegf最佳劑量后的不同的時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、45、60、120分鐘)檢驗(yàn)伊凡氏藍(lán)(eb)的滲出量，建立遞送vegf及藥物的最佳時(shí)間。(iii)納米粒子的制備與注射依據(jù)在先公開(kāi)文獻(xiàn)所示步驟(nance等人,scitranslmed4(149):149ra119；2012)，以甲氧基(meo)-peg-氨基(nh2)共價(jià)修飾經(jīng)cooh改性的納米粒子(20至500納米)。利用peg化熒光納米粒子(20納米、100納米和500納米)來(lái)研究fvb小鼠經(jīng)靜脈注射和灌注后的生物分布性和滲漏狀況。通過(guò)ivis和免疫組織化學(xué)法定量納米粒子。(iv)ivis造影利用xenogenivis光譜裝置(perkinelmer,waltham,ma)拍攝ivis影像。(v)統(tǒng)計(jì)分析用graphpadprism5軟件分析數(shù)據(jù)。如圖所示，結(jié)果以平均值及其標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(sem)或標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)表示。單向方差分析(one-wayanova)用于進(jìn)行多重比較。在比較二組時(shí)，使用單尾學(xué)生的t檢驗(yàn)法(one-tailedstudent’st-test)來(lái)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p<0.05代表結(jié)果間具有顯著差異。結(jié)果(i)于一段適當(dāng)時(shí)間內(nèi)，以低劑量vegf進(jìn)行預(yù)處理，可增加血腦屏障的通透性在本實(shí)施例中，研究了施用vegf預(yù)處理以增加血腦屏障的通透性的適當(dāng)時(shí)間和劑量。先分別以食鹽水(對(duì)照組)或不同劑量的vegf-165a(0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg)來(lái)處理小鼠，然后，在vegf處理后不同時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、45、60和120分鐘)施用伊凡氏藍(lán)(evanblue，eb)。依據(jù)材料與方法部分中所描述的步驟，測(cè)量小鼠腦組織內(nèi)伊凡氏藍(lán)含量，以評(píng)估血腦屏障的通透性。結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，圖a中，所有測(cè)試過(guò)的vegf劑量，都能增加伊凡氏藍(lán)通過(guò)血腦屏障。研究中進(jìn)一步測(cè)試0.3μg/kg的vegf誘導(dǎo)血腦屏障通透性改變的時(shí)間進(jìn)程，結(jié)果如圖1b所示。注射vegf15分鐘后再注入伊凡氏藍(lán)，觀(guān)察到血腦屏障通透性的顯著增加，且通透性增加的效果能持續(xù)至少60分鐘，且血腦屏障通透性在第45分鐘時(shí)達(dá)到最高。因此，從該研究獲得的結(jié)果表明，以低劑量的vegf進(jìn)行預(yù)處理，能夠增加試劑的血腦屏障通透性，這表明可以使用低劑量的vegf協(xié)助傳遞藥物通過(guò)血腦屏障。(ii)在小鼠模型中，vegf預(yù)處理能增加peg化熒光納米粒子通過(guò)血腦屏障研究了以低劑量vegf預(yù)處理增強(qiáng)peg化熒光納米粒子通過(guò)小鼠血腦屏障的效果。先靜脈注射低劑量的vegf(0.3μg/kg)至小鼠。在注射vegf后45分鐘，向小鼠注射具有各種尺寸(直徑為20、100或200納米)的peg化納米粒子。在注射納米粒子后30分鐘，以常規(guī)步驟灌注小鼠，并通過(guò)ivis成像和免疫組織化學(xué)分析腦部組織。結(jié)果如圖2a所示。通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定來(lái)確定在腦組織中積累的納米粒子的量(即，通過(guò)血腦屏障的量)。結(jié)果如圖2b-d所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以低劑量的vegf預(yù)處理，能夠協(xié)助納米粒子通過(guò)血腦屏障，且其中相對(duì)于大粒子(例如，500nm粒子)來(lái)說(shuō)，小粒子(例如，20nm粒子)的穿透率更高。(iii)小鼠模型中，vegf預(yù)處理能增加抗體穿透血腦屏障在對(duì)fvb小鼠(8周齡；公鼠)注射抗-nrcam抗體之前45分鐘，先經(jīng)由靜脈注射0.3μg/kg的vegf-165a或食鹽水(正常對(duì)照組)。上述抗-nrcam抗體可使用帶有標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行組織切片染色檢測(cè)。在移除小鼠腦組織并將之制成組織切片之前，讓所述抗體在小鼠體內(nèi)循環(huán)1小時(shí)。在陽(yáng)性對(duì)照組中，直接注射帶有標(biāo)記的抗-nrcam抗體至小鼠腦組織中。第二抗體被用作陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠則是先注射食鹽水，然后再注射帶有標(biāo)記的抗-nrcam抗體。將小鼠處死，制備其腦組織，使用與alexa-488偶聯(lián)的第二抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。經(jīng)vegf處理的動(dòng)物腦組織中顯示較強(qiáng)的信號(hào)，表明更多的注射的抗-nrcam抗體已經(jīng)滲透進(jìn)入腦部。結(jié)果見(jiàn)圖7。在imagej中(每組樣本數(shù)n＝3)定量熒光信號(hào)強(qiáng)度，背景值以陰性對(duì)照組校正。結(jié)果顯示，經(jīng)vegf預(yù)處理的小鼠，信號(hào)強(qiáng)度增加約5倍。該研究表明，以低劑量vegf預(yù)處理，能協(xié)助傳遞大分子(例如，抗體)通過(guò)血腦屏障。實(shí)施例2：vegf預(yù)處理能增強(qiáng)腦卒中后基于hmsc的細(xì)胞治療的效果腦卒中卒中(也稱(chēng)為腦血管病變(cerebrovascularaccident,cva)是輸送血液至腦部的過(guò)程受到干擾，造成腦功能迅速喪失。有兩種類(lèi)型的卒中卒中：分別為出血性腦卒中或缺血性腦卒中。造成出血性腦卒中的原因是顱內(nèi)動(dòng)脈破裂造成急性顱內(nèi)血腫。缺血性腦卒中(亦稱(chēng)為腦梗塞)是腦部血流阻斷(例如，血栓或遠(yuǎn)端栓塞)區(qū)域中腦細(xì)胞死亡所造成。目前對(duì)于缺血性腦卒中的二種標(biāo)準(zhǔn)治療方式分別是，注射溶血栓劑和血管內(nèi)手術(shù)，二種治療方法的目的是盡可能在最短時(shí)間內(nèi)，重新建立局部血流并快速降低對(duì)腦組織的缺氧損傷。間質(zhì)干細(xì)胞(msc)是多能基質(zhì)干細(xì)胞之異源族群，能分化形成成骨細(xì)胞(osteoblasts)、軟骨細(xì)胞(chondrocytes)和脂肪細(xì)胞(adipocytes)。以前研究表明，msc能夠活化腦損傷后內(nèi)源恢復(fù)性反應(yīng)(endogenousrestorativeresponse)(horita等人,journalofneuroscienceresearch84(7):1495-1504；2006；和li等人,neuroscilett456(3):120-123；2009)。因此，在本實(shí)施例中，發(fā)明人探索了以低劑量vegf協(xié)助傳遞(1)人類(lèi)間質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)或(2)造影劑通過(guò)血腦屏障，以治療(1)腦卒中或(2)改善腦部計(jì)算機(jī)斷層掃描或核磁共振成像(mri)的效果。利用大腦中動(dòng)脈梗塞(middlecerebralarteryocclusion,mcao)大鼠模型來(lái)研究低劑量vegf預(yù)處理對(duì)于hmsc通過(guò)血腦屏障的效果。依據(jù)boyko等人發(fā)表的文章(boyko,等人,journalofneurosciencemethods193(2):246-253；2010)中公開(kāi)的步驟來(lái)建立大鼠大腦動(dòng)脈梗塞(mcao)的動(dòng)物模型。簡(jiǎn)言之，以自動(dòng)牽開(kāi)器(self-retractor)使左側(cè)頸動(dòng)脈分支外露。然后，從周邊軟組織中小心地分離出腦內(nèi)動(dòng)脈(internalcerebralartery,ica)，并在ica近端處創(chuàng)造出一小開(kāi)口。將4-0尼龍線(xiàn)(涂覆硅)從該開(kāi)口端插入并往前穿送至大腦中動(dòng)脈(middlecerebralartery,mca)起始處。利用o2c血氧計(jì)經(jīng)顱監(jiān)測(cè)同側(cè)mca血流。一旦成功降低血流后，將尼龍縫合線(xiàn)原位固定，以模擬缺血性腦卒中。在缺血性損傷發(fā)生90分鐘后，移除尼龍線(xiàn)，使血液能再度灌注。依據(jù)此步驟可創(chuàng)造出穩(wěn)定且可再現(xiàn)的腦梗塞模型。對(duì)于hmsc細(xì)胞療法，在缺血性腦損傷后90分鐘，施用2x106hmsc(在800微升α-mem培養(yǎng)基中)。對(duì)于所有的vegf處理，在缺血性損傷發(fā)生后立即靜脈注射0.3μg/kg的vegf至大鼠體內(nèi)。將mcao大鼠模型分成4組，分別為：僅mcao、僅施用hmsc的mcao、僅施用vegf的mcao，以及以vegf預(yù)處理然后進(jìn)行hmsc治療的mcao。在以vegf預(yù)處理的mcao組中，在vegf預(yù)處理后35分鐘施用hmsc。利用表達(dá)圓盤(pán)珊瑚海葵紅色熒光(discosomasp.red,ds-red)之人類(lèi)間指干細(xì)胞(hmsc)進(jìn)行mcao細(xì)胞治療。以常規(guī)方式培養(yǎng)細(xì)胞，并在dmem(含10％fbs)中保持，37℃且含5％co2。為了評(píng)估梗死面積，在缺血性再灌注損傷和治療三天后將大鼠處死。提取大鼠腦部組織并切片，切片為厚度2mm的冠狀切片，并用2％2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色20分鐘。然后掃描腦部切片，并通過(guò)使用imagej軟件測(cè)量淺色區(qū)域來(lái)計(jì)算梗死面積，以。圖3c-e。mcao大鼠經(jīng)低劑量vegf預(yù)處理后35min，用表達(dá)ds-red的hmsc處理。定量ds-red所發(fā)射出的熒光強(qiáng)度，確認(rèn)相較于對(duì)照組老鼠，在卒中后經(jīng)低劑量vegf預(yù)處理的老鼠中，更多hmsc被傳遞至腦部，圖3a。vegf預(yù)處理還能降低腦部梗死，圖3b。本實(shí)施例的結(jié)果證實(shí)，低劑量vegf能增加受試者血腦屏障的通透性約1小時(shí)，其中血腦屏障最大通透性發(fā)生在vegf預(yù)處理后約45分鐘時(shí)。這些結(jié)果表明，低劑量的vegf能協(xié)助傳遞治療劑或診斷劑通過(guò)血腦屏障至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)。實(shí)施例3：vegf預(yù)處理能延遲抗癌藥物治療的小鼠腦部腫瘤的生長(zhǎng)和改善gbm小鼠存活率多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiform,gbm)(也稱(chēng)為第4級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤)為腦部組織中最常見(jiàn)且最具侵襲性的一類(lèi)惡性腫瘤。目前對(duì)于所述腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方式是，外科手術(shù)切除、放射線(xiàn)治療及化學(xué)治療的組合。gbm具有高侵襲性并且會(huì)浸潤(rùn)健康組織，并且大多數(shù)的患者在被確診為gbm時(shí)，對(duì)于外科手術(shù)方式移除而言，其腫瘤體積往往已過(guò)大且散布。因此，即使進(jìn)行現(xiàn)代治療，gbm患者的中位數(shù)存活率(mediansurvivalrate)為治療開(kāi)始起算12-15個(gè)月，是所有人類(lèi)癌癥5年存活率中最低的一個(gè)。由于外科手術(shù)切除的成功率不高，藥物治療是最有希望改善的領(lǐng)域。目前已有合適的抗癌藥物，但血腦屏障卻會(huì)阻礙藥物被傳遞至腦腫瘤處(patel等人,jneurooncol.61(3):203-207；2003)。在此，本發(fā)明研究在gbm小鼠模型中，低劑量vegf預(yù)處理對(duì)于傳遞抗癌藥物(即，tmz和多柔比星)通過(guò)血腦屏障的效果。用人類(lèi)表達(dá)熒光素膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(humanluciferase-expressingglioblastomacellline)u-87mg進(jìn)行所有g(shù)bm實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)于emem(含10％fbs)，在37℃，含5％co2環(huán)境下。以立體定位方式(相對(duì)于前囪的位置為右側(cè)2mm和后側(cè)1mm，相對(duì)硬腦膜的深度為3.5mm)，注射u87神膠質(zhì)瘤細(xì)胞(2x105)原位異種移植至balb/c裸鼠腦部。在不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、7…每7天測(cè)量一次，直到第60天)，通過(guò)ivis測(cè)量小鼠腫瘤進(jìn)程。在gbm小鼠模型中，以dna甲基化藥物替莫唑胺(temozolomide，tmz)作為治療藥劑。6-8周齡balb/c-nu/nu小鼠被分為四組：假手術(shù)組(sham)、載體對(duì)照組(食鹽水)、tmz(5mg/kgmg/kg在食鹽水中)組，以及經(jīng)vegf預(yù)處理(0.3μg/kg)的tmz組。通過(guò)體內(nèi)生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)狀況。觀(guān)察小鼠60天，并以kaplan-meier存活曲線(xiàn)記錄其存活率。依據(jù)上述步驟建立的具有異種移植物的gbm小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(載體)、tmz(5或20mg/kgmg/kg)和tmz+vegf組，并測(cè)量各組的腫瘤大小和存活進(jìn)程。圖3顯示腫瘤體積時(shí)間進(jìn)程，其中經(jīng)有/無(wú)低劑量vegf預(yù)處理的gbm小鼠以(a)5mg/kgtmz或(b)20mg/kgtmz處理。發(fā)現(xiàn)5mg/kgtmz足以延遲gbm生長(zhǎng)至少20天(與未經(jīng)tmz處理的gbm小鼠相比)，并且用vegf(0.3μg/kg)預(yù)處理能進(jìn)一步增強(qiáng)tmz延遲腫瘤生長(zhǎng)的效果。利用tmz(20mg/kg)處理的小鼠中，可觀(guān)察到相似的結(jié)果(圖3b)。與低劑量tmz(5mg/kg)處理組相比，高劑量的tmz(20mg/kg)沒(méi)有表現(xiàn)出改善的治療效果。試驗(yàn)動(dòng)物的存活率總結(jié)在表1中。表1低劑量vegf預(yù)處理能改善gbm小鼠存活率總之，低劑量vegf預(yù)處理能改善tmz抗gbm的效果，這表現(xiàn)在試驗(yàn)動(dòng)物的壽命增加。經(jīng)低劑量vegf預(yù)處理組動(dòng)物的中位數(shù)存活率比單獨(dú)施用tmz(5mg/kg)組高出約10％。此外，研究了低劑量vegf預(yù)處理對(duì)于傳遞抗癌藥物-多柔比星(doxorubicin)至六個(gè)重要器官，腦、肺、肝臟、腎臟、脾臟和心臟的效果。使用的動(dòng)物為balb/cnu小鼠(12周齡；雄性)，該些小鼠之前已植入可表達(dá)熒光素酶的u87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(3x106)。允許腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)三周，并在施用vegf/對(duì)照/多柔比星前，先通過(guò)ivis確認(rèn)。在vegf/對(duì)照預(yù)處理后3小時(shí)，施用多柔比星(8mg/kg)。以全身灌注方式對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌注50毫升生理食鹽水，收集器官，從組織中提取多柔比星(8mg/kg)，并用hplc定量。經(jīng)vegf處理后，檢測(cè)到腦中多柔比星濃度顯著增加，而多柔比星濃度在其他重要器官中則無(wú)改變。每組n＝3。圖6。這些結(jié)果表明，低劑量vegf預(yù)處理能協(xié)助傳遞藥物通過(guò)血腦屏障至腦部，但對(duì)于該藥物被傳遞至其他器官的量則無(wú)影響。實(shí)施例4：vegf預(yù)處理能增強(qiáng)腦部成像腦部成像是診斷cva的關(guān)鍵因素之一。腦部成像用以確認(rèn)梗塞區(qū)域的大小及其位置，并排除表現(xiàn)類(lèi)似癥狀的其它損傷；例如，腦腫瘤或顱內(nèi)出血(inter-cerebralhaemorrhage)。在美國(guó)，目前用于疑似腦卒中的第一線(xiàn)造影方法是，無(wú)顯影劑計(jì)算機(jī)斷層掃描(noncontrastcomputedtomography,ct)，但是使用注射造影劑的計(jì)算機(jī)斷層血管造影正在變得越來(lái)越常用(computedtomographyangiogram,cta)(birenbaum等人,westernjournalofemergencymedicine12(1)；2011.)。cta是一種更強(qiáng)大的技術(shù)，能隨時(shí)間捕獲血管3d影像，更精確的觀(guān)察動(dòng)脈阻塞處。這些信息對(duì)于醫(yī)療團(tuán)隊(duì)來(lái)說(shuō)非常有用，當(dāng)決定是否開(kāi)出血栓溶解劑處方，并且在嘗試機(jī)械血栓清除血管造影術(shù)時(shí)對(duì)外科手術(shù)團(tuán)隊(duì)是必需的信息。造影劑用于改善血管的可視化效果。對(duì)于較大的血管(例如主動(dòng)脈)適用低劑量造影劑，但較小的動(dòng)脈適用高劑量造影劑。然而，這些制劑價(jià)格昂貴且具有一些毒性，可能與腎臟損傷相關(guān)，并且在一些患者中是禁忌的。在此所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)vegf預(yù)處理能增加腦中隨后施用的造影劑的可檢測(cè)水平。這樣的增加允許用于腦部成像的造影劑的劑量減少，因此，能降低成本、發(fā)生副作用的風(fēng)險(xiǎn)，以及潛在地使得腦中的小動(dòng)脈更好地顯示。簡(jiǎn)言之，首先，先對(duì)3只小鼠(fvb小鼠，25克，8周齡)靜脈(尾靜脈)注射vegf(0.3μg/kg)，經(jīng)45分鐘后，用釓(gadolinium)造影劑(0.2mmol/kg)注射小鼠。在注射vegf之后，注射造影劑前，攝取腦部圖像，然后在造影劑注射后5分鐘，攝取t1和t2加權(quán)圖像(weightedimage)。對(duì)照組的小鼠則是注射生理食鹽水(圖8)。vegf處理的小鼠的三次重復(fù)，一致地顯示在腦中檢測(cè)到的釓造影劑水平的增加，這種增加具有統(tǒng)計(jì)上的顯著性。vegf處理后，三只小鼠的信號(hào)噪聲比(signaltonoiseratio,snr)分別增強(qiáng)17％、14％和15.5％。這些對(duì)于、皮質(zhì)部(cortex)、紋狀體(striatum)和大腦兩側(cè)的結(jié)果是一致的。在健康的對(duì)照小鼠中，任何對(duì)比度增強(qiáng)不超過(guò)5.0％。結(jié)果表明，經(jīng)vegf預(yù)處理后，造影劑的可檢測(cè)水平平均增加15.5％(表2)。表2.低劑量vegf預(yù)處理改善了可檢測(cè)腦中釓造影劑的可檢測(cè)水平實(shí)驗(yàn)中所使用的7tmri掃描參數(shù)(pharmascan7t16-cm孔水平mri系統(tǒng)(borehorizontalmrisystem))如下：se-t1wi參數(shù)：tr＝400ms；te＝10.8ms；fov＝2x2cm；nex＝8；層面厚度(slice-thickness)＝0.8mm,16層(slices)；時(shí)間(time)＝6min49sec；矩陣(matrix)＝256*128恢復(fù)到(recoto)256*256。fse-t2wi參數(shù)：tr＝4000ms；teeff＝70ms；fov＝2x2cm；nex＝4；層面厚度(slice-thickness)＝0.8mm,16層(slices)；時(shí)間(time)＝4min16sec；矩陣(matri)x＝256*128恢復(fù)到(recoto)256*256。應(yīng)當(dāng)理解，本文提供的實(shí)施例的描述僅以示例的方式給出，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可進(jìn)行各種修改。上述說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和數(shù)據(jù)提供了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和用途的完整描述。雖然上面已經(jīng)以某種程度的特殊性或參考一個(gè)或多個(gè)個(gè)別實(shí)施例來(lái)描述了本發(fā)明的多種實(shí)施方式本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可以對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例進(jìn)行大量的修改，而不脫離本
發(fā)明內(nèi)容的精神或范圍。以下提供多個(gè)具體的實(shí)施例：一種協(xié)助傳遞制劑通過(guò)受試者血腦屏障的方法，包含以接續(xù)或同時(shí)施用的方式，施用(i)有效量的生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子選自下組：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子i(igf-1)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子ii(igf-ii)、其一部分或其組合；和(ii)所述試劑，其可以是任何治療劑或成像劑至所述受試者；其中，所述生長(zhǎng)因子的施用量能夠暫時(shí)性增加受試者的血腦屏障通透性，從而允許傳遞所述試劑通過(guò)血腦屏障。一種治療患有腦瘤、腦卒中、神經(jīng)精神疾病和/或神經(jīng)退行性疾病的受試者的方法，包含以接續(xù)或同時(shí)施用的方式，施用第一有效量的生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子選自下組：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子i(igf-1)和類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子ii(igf-ii)其一部分或其組合；和第二有效量的治療劑至所述受試者；從而改善與腦瘤、腦卒中、神經(jīng)精神疾病和/或神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的一種或多種癥狀。在上述任何方式中，所述生長(zhǎng)子的施用量為5至200ng/kg。所述造影劑是適用于計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)或核磁共振造影的造影劑。所述治療劑是抗癌藥物、抗精神病藥物、抗凝血?jiǎng)?、蛋白質(zhì)或干細(xì)胞。所述抗癌藥物是烷化劑(alkylatingagent)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(topoisomeraseinhibitor)，抗代謝物(anti-metabolite)，或細(xì)胞毒性抗生素(cytotoxicityantibiotic)。所述烷化劑可以是是順鉑、卡鉑(carboplatin)、益樂(lè)鉑定(oxaliplatin)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、氮芥苯丙氨酸(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、依弗酰胺(ifosfamide)、二甲磺酸丁酯(busulfan)、n-亞硝-n-甲脲(n-nitroso-n-methylurea，mnu)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環(huán)己亞硝脲(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、鏈脲佐霉素(streptozotocin)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、沙奧特帕(thiotepa)、絲裂霉素(mytomycin)或地亞農(nóng)(diaziquone)。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑可以是喜樹(shù)堿、愛(ài)萊諾迪肯、托普樂(lè)肯、依妥普賽、多柔比星、替尼泊苷、諾波霉素、美巴龍或阿柔比星。所述抗代謝物可以是氟嘧啶、脫氧核酸類(lèi)似物、硫嘌呤、甲氨蝶呤或培美曲塞。細(xì)胞毒性抗生素可以放線(xiàn)菌素、博萊霉素、普卡霉素、絲裂霉素、多柔比星、柔紅霉素、表阿霉素、伊達(dá)比星、吡柔比星、阿柔比星或米托蒽醌。抗凝血?jiǎng)┛梢允前⑺酒チ?aspirin)、氯吡格雷(clopidoqrel)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)、華法林(warfarin)或肝素(heparin)。所述蛋白質(zhì)可以是組織纖溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator,tpa)?？咕癫∷巹┛梢允潜蕉⊥?butyrophenone)、硫代二苯胺(phenothiazine)、氟非那嗪(fluphenazine)、羥哌氯丙嗪(perphenazine)、普氯苯噻肼(prochlorperazine)、甲硫噠嗪(thioridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、美索達(dá)嗪(mesoridazine)、普馬嗪(promazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)、左美丙嗪(levomepromazine)、異丙嗪(promethazine)、硫雜蒽(thioxanthene)、泰爾登(chlorprothixene)、氟哌噻噸(flupenthixol)、替沃噻噸(thiothixene)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)、氯氮平(clozapine)、奧氮平(olanzapine)、理思培酮(risperidone)、喹硫平(quetiapine)、齊拉西酮(ziprasidone)、氨磺必利(amisulpride)、阿塞那平(asenapine)、帕利哌酮(paliperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)、拉莫三嗪(lamotrigine)、美金剛(memantine)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、大麻二酚(cannabidiol)、ly2140023、氟哌利多(droperidol)、匹莫齊特(pimozide)、布他哌嗪(butaperazine)、丙酰奮乃靜(carphenazine)、瑞莫必(remoxipride)、哌西他嗪(piperacetazine)、斯而比來(lái)特(sulpiride)、阿坎酸(acamprosate)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、苯甲酸(benzoicacid)、苯甲酸鈉(sodiumbenzoate)、苯甲酸鉀(potassiumbenzoate)、苯甲酸鈣(calciumbenzoate)、苯甲酸鋰(lithiumbenzoate)、2-氨基苯甲酸酯(2-aminobenzoate)、3-氨基苯甲酸酯(3-aminobenzoate)或4-氨基苯甲酸酯(4-aminobenzoate)。所述干細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞(meschymalstemcell,msc)。所述抗癡呆的藥劑是美金剛(memantine)或乙酰膽素酯脢抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitor,achei)，其可以是加蘭他敏(galantamine)、他克林(tacrine)、多奈哌齊(donepezil)、雷司替明(rivastigmine)、石杉?jí)A甲(huperzinea)、扎那哌齊(zanapezil)、更斯的明(ganstigmine)、苯絲氨酸(phenserine)、苯乙基去甲希姆絲氨酸(phenethylnorcymserine)、希姆絲氨酸(cymserine)、硫雜希姆絲氨酸(thiacymserine)、sph1371、er127528、rs1259或其混合物。所述神經(jīng)退行性疾病可以是阿爾茲海默癥(alzhemer’sdisease，ad)、嗜銀顆粒癡呆(argyrophilicgraindisease)、肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)、關(guān)島型帕金森癡呆肌萎縮側(cè)索硬化綜合癥(als-parkinsonismdementiacomplexofguam)、血管性癡呆(vasculardementia)、額顳葉癡呆(frontotemporaldementia)、語(yǔ)義性癡呆(semanticdementia)、路易體癡呆(dementiawithlewybodies)、亨丁頓舞蹈癥(huntington’sdisease)、包涵體肌病(inclusionbodymyopathy)、包涵體肌炎(inclusionbodymyositis)或帕金森氏癥(parkinson’sdiseasepd)。所述神經(jīng)精神疾病可以是精神分裂癥、精神錯(cuò)亂(delirium)、阿爾茲海默癥、憂(yōu)郁癥、躁狂癥、注意力缺乏癥(attentiondeficitdisorders，add)、注意力不足過(guò)動(dòng)障礙(attentiondeficithyperactivitydisorder，adhd)、藥物成癮、輕度認(rèn)知障礙、癡呆(dementia)、情緒激動(dòng)(agitation)、無(wú)情感(apathy)、焦慮、精神病、創(chuàng)傷后壓力癥候群(post-traumaticstressdisorders)、易怒、和雙相情感障礙。一種受試者腦部區(qū)域成像的方法，包含：(i)以連續(xù)或同時(shí)施用的方式施用有效量的生長(zhǎng)因子和足量的造影劑至受試者，所述生長(zhǎng)因子選自下組：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子i(igf-1)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子ii(igf-ii)、其一部分或其組合；所述造影劑用于計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)或核磁共振成像(mri)；以及(ii)監(jiān)測(cè)所述造影劑在腦區(qū)域移動(dòng)時(shí)的分布情況。所述生長(zhǎng)因子的施用量為5-200ng/kg。其他實(shí)施方式本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的所有特征可以任一組合方式組合。本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的每個(gè)特征可以由服務(wù)于相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明確指明，所公開(kāi)的每個(gè)特征僅是等同或相似特征的通用系列的示例。從上面的描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，其他實(shí)施例也在權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)。序列表<110>中央研究院等<120>增強(qiáng)血腦屏障通透性的方法及其用途<130>b2079pc00<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>165<212>prt<213>智人<400>1alaprometalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallys151015phemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleu202530valaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelys354045prosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspglu505560glyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnile65707580metargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserphe859095leuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaarg100105110glngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphe115120125valglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspser130135140argcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcys145150155160asplysproargarg165當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12