相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求于2014年10月21日提交的標(biāo)題為“recombinantaavvariantsandusesthereof”的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)ussn62/066,856的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

在一些方面中，本公開內(nèi)容涉及可用于鑒定細(xì)胞中的腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus)的分離核酸、組合物和試劑盒。在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了新的aav和其使用方法以及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)：

腺相關(guān)病毒(aav)是小的輔助病毒依賴性病毒。其在20世紀(jì)60年代作為腺病毒(引起感冒的病毒)制備中的污染物被發(fā)現(xiàn)。其在細(xì)胞中的生長依賴于腺病毒的存在并因此被命名為腺相關(guān)病毒。aav載體已成為用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的有效平臺(tái)。然而，仍然需要用于基因遞送的新的aav載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些方面中，本公開內(nèi)容涉及用于基因治療應(yīng)用的新型aav。在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav包含一種或更多種衣殼蛋白中的氨基酸變化，其賦予新的或增強(qiáng)的組織嗜性特性。根據(jù)一些實(shí)施方案，本文中鑒定并公開了aav3b、aav4和aav5的變體，其具有有用的組織靶向特性。例如，提供了可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞如人肝細(xì)胞(例如，存在于肝組織中)等的aav3b的變體。提供了可用于靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，cns)、心肺組織、眼組織和其他組織的細(xì)胞的aav4和aav5的變體。在一些實(shí)施方案中，本文所述的變體aav靶向除了其相應(yīng)的野生型aav靶向的組織之外的組織。在一些實(shí)施方案中，aav3b變體靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)或心臟的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，aav4變體靶向肝或腎的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，aav5變體靶向cns、肝、脾或心臟的細(xì)胞。

在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了分離的核酸，其包含編碼aav衣殼蛋白的選自seqidno：1至47的序列。在一些實(shí)施方案中，提供了分離的核酸片段。在某些實(shí)施方案中，分離的核酸片段不編碼與seqidno：98至100中任一序列相同的肽。

在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了分離的aav衣殼蛋白，其包含選自seqidno：51至61的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，分離的aav衣殼蛋白包含選自seqidno：51至61的序列，其中所述序列中與seqidno：98所示序列的對(duì)應(yīng)氨基酸不同的氨基酸由保守替換所代替。在一些實(shí)施方案中，分離的aav衣殼蛋白包含選自seqidno：62至67的序列，其中所述序列中與seqidno：99所示序列的對(duì)應(yīng)氨基酸不同的氨基酸由保守替換所代替。在一些實(shí)施方案中，分離的aav衣殼蛋白包含選自seqidno：68至97的序列，其中所述序列中與seqidno：100所示序列的對(duì)應(yīng)氨基酸不同的氨基酸由保守替換所代替。

在本公開內(nèi)容的某些方面中，提供了包含任意前述分離aav衣殼蛋白的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包含可藥用載體。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的組合物，其包含一種或更多種本公開內(nèi)容的分離aav衣殼蛋白和生理相容性載體。

在本公開內(nèi)容的某些方面中，提供了包含任意前述分離aav衣殼蛋白的重組aav(raav)。在一些實(shí)施方案中，提供了包含raav的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述包含raav的組合物還包含可藥用載體。還提供了重組aav，其中所述重組aav包含一種或更多種本公開內(nèi)容的分離aav衣殼蛋白。

在本公開內(nèi)容的一些方面中，提供了宿主細(xì)胞，其含有包含與啟動(dòng)子有效連接的選自seqidno：1至47的編碼序列的核酸。在一些實(shí)施方案中，提供了包含宿主細(xì)胞和無菌細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物。在一些實(shí)施方案中，提供了包含宿主細(xì)胞和冷凍保存劑的組合物。

根據(jù)本公開內(nèi)容的一些方面，提供了向?qū)ο筮f送轉(zhuǎn)基因的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向?qū)ο笫┯萌我馇笆鰎aav，其中所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因，并且其中所述raav感染所述對(duì)象靶組織的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象選自小鼠、大鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬和非人靈長類。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象是人。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因是蛋白質(zhì)編碼基因。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因編碼小干擾核酸。在某些實(shí)施方案中，小干擾核酸是mirna。在某些實(shí)施方案中，小干擾核酸是抑制對(duì)象中至少一種mirna的活性的mirna海綿或tudrna。在某些實(shí)施方案中，mirna在靶組織的細(xì)胞中表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，靶組織是骨骼肌、心、肝、胰、腦或肺。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)包含至少一個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物，其中所述mirna通過與結(jié)合位點(diǎn)雜交而抑制除靶組織以外的組織中轉(zhuǎn)基因的活性。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)、透皮、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、腦內(nèi)、經(jīng)口、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或通過吸入向?qū)ο笫┯胷aav。

根據(jù)本公開內(nèi)容的一些方面，提供了用于產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括向非人動(dòng)物施用任一種前述raav，其中所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因，并且其中所述raav感染所述非人動(dòng)物靶組織的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因是蛋白質(zhì)編碼基因。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因編碼小干擾核酸。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種轉(zhuǎn)基因編碼報(bào)告分子。在某些實(shí)施方案中，小干擾核酸是mirna。在某些實(shí)施方案中，小干擾核酸是抑制動(dòng)物中至少一種mirna的活性的mirna海綿或tudrna。在某些實(shí)施方案中，mirna在靶組織的細(xì)胞中表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，靶組織是骨骼肌、心、肝、胰、腦或肺。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)包含至少一個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物，其中所述mirna通過與結(jié)合位點(diǎn)雜交而抑制除靶組織以外的組織中轉(zhuǎn)基因的活性。

根據(jù)本公開內(nèi)容的一些方面，提供了用于產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法，其包括向非人動(dòng)物施用任意前述raav，其中所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)包含至少一個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物，其中所述mirna通過與轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合位點(diǎn)雜交而抑制除靶組織以外的組織中轉(zhuǎn)基因的活性。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，組織特異性啟動(dòng)子是肝特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白(thyroxinbindingglobulin，tbg)啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子、生長抑素啟動(dòng)子、胰多肽(pancreaticpolypeptide，ppy)啟動(dòng)子、突觸蛋白-1(syn)啟動(dòng)子、肌酸激酶(mck)啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物結(jié)蛋白(des)啟動(dòng)子、α-肌球蛋白重鏈(a-mhc)啟動(dòng)子或心肌肌鈣蛋白t(cardiactroponint，ctnt)啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)、透皮、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或通過吸入向動(dòng)物施用raav。根據(jù)本公開內(nèi)容的一些方面，提供了通過任意前述方法產(chǎn)生的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。

在本公開內(nèi)容的另一些方面中，提供了用于產(chǎn)生raav的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含容納有具有seqidno：1至47中任一序列的分離核酸的容器。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于產(chǎn)生raav的說明書。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含至少一個(gè)容納有重組aav載體的容器，其中所述重組aav載體包含轉(zhuǎn)基因。

在本公開內(nèi)容的另一些方面中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有具有任意前述分離aav衣殼蛋白的重組aav的容器。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒的容器是注射器。

在另一些方面中，本公開內(nèi)容涉及將基于aav的載體作為載劑用于遞送基因、治療、預(yù)防和研究目的以及體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型開發(fā)的用途。在一些方面中，本公開內(nèi)容涉及這樣的aav血清型，其已經(jīng)顯示出獨(dú)特的組織/細(xì)胞型嗜性，并且可以在不存在載體相關(guān)毒理學(xué)的情況下以與腺病毒載體類似的水平在動(dòng)物組織中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移(例如，取決于靶組織和載體劑量的高達(dá)100％的體內(nèi)組織轉(zhuǎn)導(dǎo))。在另一些方面中，本公開內(nèi)容涉及具有肝、心、骨骼肌、腦和胰組織靶向能力的aav血清型。這些組織與廣泛的人類疾病(包括多種代謝、心血管和糖尿病)有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因可以是導(dǎo)致病理狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因編碼治療病理狀態(tài)的蛋白質(zhì)。

在另一個(gè)方面中，本公開內(nèi)容的新型aav可用于用于將轉(zhuǎn)基因遞送至對(duì)象的方法。所述方法通過將本公開內(nèi)容的raav施用于對(duì)象來進(jìn)行，其中所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，所述raav靶向?qū)ο蟮念A(yù)定組織。

在另一個(gè)方面中，本公開內(nèi)容的aav可用于用于產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法。所述方法通過將本公開內(nèi)容的raav施用于動(dòng)物來進(jìn)行，其中所述raav包含至少一種轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因?qū)е虏±頎顟B(tài)，并且其中所述raav靶向動(dòng)物的預(yù)定組織。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述raav含有具有選自seqidno：51至97的氨基酸序列的aav衣殼。

所述轉(zhuǎn)基因可表達(dá)許多基因，包括癌相關(guān)基因、促凋亡基因和凋亡相關(guān)基因。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)能夠抑制癌相關(guān)基因表達(dá)的小干擾核酸。在另一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)能夠抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)的小干擾核酸。在另一些實(shí)施方案中，所述小干擾核酸是mirna或shrna。根據(jù)另一些實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)毒素，任選地其中所述毒素是dta。在另一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)報(bào)告基因，所述報(bào)告基因任選地是報(bào)告酶(如β-半乳糖苷酶)或熒光蛋白(如gfp)。

所述轉(zhuǎn)基因可表達(dá)mirna。在另一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)mirna海綿，其中mirna海綿抑制動(dòng)物中一種或更多種mirna的活性。在一些實(shí)施方案中，mirna可以是內(nèi)源性mirna，或者其可以在心、肝、骨骼肌、腦或胰組織的細(xì)胞中表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，aav的靶組織是生殖腺、隔膜、心、胃、肝、脾、胰或腎。所述raav可轉(zhuǎn)導(dǎo)許多不同類型的組織，例如肌纖維、鱗狀上皮細(xì)胞、腎近曲或遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞、粘膜腺細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述raav以每個(gè)對(duì)象10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵個(gè)基因組拷貝的劑量施用。在一些實(shí)施方案中，所述raav以每千克10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴個(gè)基因組拷貝的劑量施用。所述raav可以通過任何途徑施用。例如、其在一些實(shí)施方案中可以靜脈內(nèi)施用(例如，通過門靜脈注射)。

在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因包括組織特異性啟動(dòng)子，例如肝特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白(tbg)啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子、生長抑素啟動(dòng)子、胰多肽(ppy)啟動(dòng)子、突觸蛋白-1(syn)啟動(dòng)子、肌酸激酶(mck)啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物結(jié)蛋白(des)啟動(dòng)子、α-肌球蛋白重鏈(a-mhc)啟動(dòng)子或心肌肌鈣蛋白t(ctnt)啟動(dòng)子。

所述體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可以是哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬、非人靈長類。

在一些實(shí)施方案中，可以向體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型施用推定的治療劑以確定所述推定的治療劑對(duì)動(dòng)物病理狀態(tài)的作用。

在另一個(gè)方面中，本公開內(nèi)容是通過本文所述方法產(chǎn)生的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

根據(jù)本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面，提供了用于產(chǎn)生raav的試劑盒，所述raav產(chǎn)生在預(yù)定組織中具有病理狀態(tài)的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述試劑盒包含至少一個(gè)容納有重組aav載體的容器，至少一個(gè)容納有raav包裝組件的容器，以及用于構(gòu)建和包裝重組aav的說明書。

raav包裝組件可包括表達(dá)至少一種rep基因和/或至少一種cap基因的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞表達(dá)影響含有重組aav載體的raav產(chǎn)生的至少一種輔助病毒基因產(chǎn)物。所述至少一種cap基因可編碼靶向預(yù)定組織的來自aav血清型的衣殼蛋白。

在另一些實(shí)施方案中，raav包裝組件包括輔助病毒，任選地其中所述輔助病毒是腺病毒或皰疹病毒。

raav載體及其中的組件可包括本文所述的任何元件。例如，在一些實(shí)施方案中，所述raav載體包含轉(zhuǎn)基因，例如本文所述的任意轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)mirna抑制劑(例如，mirna海綿或tudrna)，其中mirna抑制劑抑制體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中一種或更多種mirna的活性。

本公開內(nèi)容的每個(gè)限制可以涵蓋本公開內(nèi)容的多個(gè)實(shí)施方案。因此，預(yù)期本公開內(nèi)容中涉及任何一個(gè)元件或元件組合的每個(gè)限制都可以包括在本公開內(nèi)容的每個(gè)方面中。本公開內(nèi)容在其應(yīng)用中不限于在以下描述中闡述或在附圖中示出的構(gòu)造細(xì)節(jié)和組件布置。本公開內(nèi)容能夠具有其他實(shí)施方案并且能夠以多種方式實(shí)踐或執(zhí)行。

附圖說明

圖1描繪了aav3b變體衣殼序列的比對(duì)；

圖2描繪了aav4變體衣殼序列的比對(duì)；

圖3描繪了aav5變體衣殼序列的比對(duì)；并且

圖4描述了重組aav轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定的結(jié)果。

發(fā)明詳述

腺相關(guān)病毒(aav)是一種小(約26nm)的復(fù)制缺陷型非包膜病毒，其在細(xì)胞中的生長一般依賴于第二種病毒如腺病毒或皰疹病毒的存在。并不知道aav引起疾病并誘導(dǎo)非常輕微的免疫應(yīng)答。aav可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞二者，并且可以將其基因組并入到宿主細(xì)胞的基因組中。這些特征使得aav成為用于創(chuàng)建基因治療的病毒載體的非常有吸引力的候選物。基于血清型2的原型aav載體為鼠和大動(dòng)物模型中的無毒且穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移提供了概念證明，但是在許多主要靶組織中表現(xiàn)出不良的基因轉(zhuǎn)移效率。在一些方面中，本公開內(nèi)容試圖通過提供具有獨(dú)特組織靶向能力的新型aav來克服這個(gè)缺點(diǎn)，以用于基因治療和研究應(yīng)用。

在本公開內(nèi)容的一些方面中，提供了具有獨(dú)特組織靶向能力的新型aav衣殼蛋白。在一些實(shí)施方案中，aav衣殼蛋白分離自包含衣殼蛋白的aav所靶向的組織。在一些方面中，提供了用于將轉(zhuǎn)基因遞送至對(duì)象靶組織的方法。所述轉(zhuǎn)基因遞送方法可用于基因治療(例如，治療疾病)或研究(例如，產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型)應(yīng)用。

發(fā)現(xiàn)aav的方法

aav的許多生物學(xué)特征受其衣殼的影響。因此，發(fā)現(xiàn)新aav的方法主要集中于分離aav衣殼的dna序列。腺相關(guān)病毒(aav)潛伏生命周期的核心特征是在宿主細(xì)胞中以整合和/或附加基因組的形式持續(xù)存在。用于分離新aav的方法包括：基于pcr的潛伏aavdna基因組的分子拯救、體外的在腺病毒輔助功能存在下對(duì)來自組織dna中的潛伏前病毒基因組的感染性病毒拯救，以及由等溫噬菌體phi-29聚合酶介導(dǎo)的通過滾環(huán)線性擴(kuò)增進(jìn)行的對(duì)來自組織dna中的環(huán)狀前病毒基因組的拯救。所有的這些分離方法均利用aav前病毒dna基因組的潛伏期并且集中于拯救持續(xù)性病毒基因組dna。

內(nèi)源性潛伏aav基因組在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，非人類靈長類組織如肝、脾和淋巴結(jié)的細(xì)胞)中具有轉(zhuǎn)錄活性。不希望受理論束縛，假設(shè)為保持宿主中的aav持久性，可能需要aav基因的低水平轉(zhuǎn)錄，并且所得到的caprna可以用作更合適且豐富的底物以挽回用于載體開發(fā)的功能性cap序列。通過rna檢測(cè)方法(例如，rt-pcr)檢測(cè)rep和cap基因轉(zhuǎn)錄物的可變豐度。cap基因轉(zhuǎn)錄物的存在和通過逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription，rt)在體外產(chǎn)生caprna的cdna的能力顯著增加了用于基于pcr從組織中拯救新cap序列的模板的豐度，并增強(qiáng)了發(fā)現(xiàn)新aav的敏感性。

通過用從具有非常低豐度的前病毒aav基因組的組織中分離的總細(xì)胞dna來轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可以鑒定新的cap序列。還可以用提供輔助病毒功能(例如，腺病毒)以觸發(fā)和/或增強(qiáng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中aav基因轉(zhuǎn)錄的基因來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本公開內(nèi)容的新cap序列可以通過從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離capmrna，從mrna產(chǎn)生cdna(例如，通過rt-pcr)并對(duì)cdna進(jìn)行測(cè)序來鑒定。

分離的衣殼蛋白和編碼其的核酸

分離自哺乳動(dòng)物特別是非人靈長類的aav可用于創(chuàng)建用于臨床開發(fā)和人類基因治療應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移載體。在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了使用本文公開的方法在多種非人靈長類組織中發(fā)現(xiàn)的新aav。在分離自非人靈長類組織的病毒基因組dna和mrna中均發(fā)現(xiàn)了編碼這些新aav的衣殼蛋白的核酸。關(guān)于aav的核酸和蛋白質(zhì)序列以及其他信息列于表1和表2以及序列表中。

編碼aav衣殼蛋白的本公開內(nèi)容的分離核酸包括具有如seqidno1至47中任一所示序列的任何核酸以及具有與其基本上同源之序列的任何核酸。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了這樣的分離核酸，其與具有如seqidno1至47中任一所示序列的核酸基本上同源，但是不編碼具有如seqidno98至100中任一所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

此外，本公開內(nèi)容的分離aav衣殼蛋白包括具有如seqidno51至98中任一所示氨基酸序列的任何蛋白質(zhì)以及與其基本上同源的任何蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了這樣的分離衣殼蛋白，其與具有如seqidno98至100中任一所示序列的蛋白質(zhì)基本上同源，但是不具有如seqidno98至100中任一所示的氨基酸序列。

“同源”是指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分之間的百分比同一性。當(dāng)涉及核酸或其片段時(shí)，術(shù)語“基本上同源”表示當(dāng)與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行帶有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔У淖罴驯葘?duì)時(shí)，在約90至100％的比對(duì)序列中存在核苷酸序列同一性。當(dāng)涉及多肽或其片段時(shí)，術(shù)語“基本上同源”表示當(dāng)與另一多肽進(jìn)行帶有適當(dāng)?shù)目瘴?、插入或缺失的最佳比?duì)時(shí)，在約90至100％的比對(duì)序列中存在核苷酸序列同一性。術(shù)語“高度保守”意指至少80％的同一性，優(yōu)選至少90％的同一性，并且更優(yōu)選超過97％的同一性。在一些情況下，高度保守可指100％的同一性。同一性是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法和計(jì)算機(jī)程序容易確定的。

如本文所述，使用多種公共或商業(yè)可得的多序列比對(duì)程序(例如，可通過因特網(wǎng)上的web服務(wù)器訪問的“clustalw”)中的任一種來進(jìn)行核酸或多肽序列之間的比對(duì)?；蛘?，也可以使用vectornti實(shí)用程序。本領(lǐng)域中還已知有許多可用于測(cè)量核苷酸序列同一性的算法，包括上述程序中所包含的算法。作為另一個(gè)實(shí)例，可以使用blastn來比較多核苷酸序列，blastn提供了對(duì)查詢序列和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和百分比序列同一性。類似的程序可用于比較氨基酸序列，例如“clustalx”程序、blastp。通常，以默認(rèn)設(shè)置使用這些程序中的任一個(gè)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要改變這些設(shè)置?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用另一種算法或計(jì)算機(jī)程序，其提供至少如參照算法和程序所提供的同一性或比對(duì)水平。比對(duì)可用于識(shí)別兩種蛋白質(zhì)或肽之間的對(duì)應(yīng)氨基酸?！皩?duì)應(yīng)氨基酸”是蛋白質(zhì)或肽序列中已與另一蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸比對(duì)的氨基酸。對(duì)應(yīng)氨基酸可以相同或不同。作為不同氨基酸的對(duì)應(yīng)氨基酸可稱為變體氨基酸。多種aav變體中的對(duì)應(yīng)氨基酸的表列于表4至6中。

或者，對(duì)于核酸，可以通過以下過程來確定同源性：在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化并對(duì)經(jīng)消化的片段進(jìn)行大小測(cè)定?；旧贤吹膁na序列可以在例如嚴(yán)格條件(如針對(duì)該特定體系所確定的條件)下的southern雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定。確定適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。

“核酸”序列是指dna或rna序列。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語核酸涵蓋包括任何已知的dna和rna堿基類似物的序列，所述堿基類似物例如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、n6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。

在一些實(shí)施方案中，分離了本公開內(nèi)容的蛋白質(zhì)和核酸。如本文所使用的術(shù)語“分離的”是指人工獲得或產(chǎn)生的。如本文關(guān)于核酸所使用的術(shù)語“分離的”一般是指：(i)通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)在體外擴(kuò)增的；(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的；(iii)通過切割和凝膠分離純化的；或者(iv)通過例如化學(xué)合成法合成的。分離的核酸是可以容易地通過本領(lǐng)域公知的重組dna技術(shù)操作的核酸。因此，載體中所包含的其中5’和3’限制性位點(diǎn)已知或者已經(jīng)公開了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)引物序列的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的，但是在其天然宿主中以其天然狀態(tài)存在的核酸序列并不是。分離的核酸可以是基本上純化的，但不需要如此。例如，在克隆或表達(dá)載體中分離的核酸不是純的，因?yàn)槠淇蓛H包含微小百分比的其所存留的細(xì)胞中的物質(zhì)。然而，這樣的核酸也是分離的，如該術(shù)語在本文中所使用的那樣，因?yàn)槠淇赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地操作。如本文關(guān)于蛋白質(zhì)或肽所使用的術(shù)語“分離的”通常是指人工獲得或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽(例如，通過化學(xué)合成，通過重組dna技術(shù)等)。

應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行保守氨基酸替換以提供功能等同變體或衣殼蛋白的同源物。在一些方面，本公開內(nèi)容包括導(dǎo)致保守氨基酸替換的序列改變。如本文所使用的保守氨基酸替換是指不改變進(jìn)行氨基酸替換的蛋白質(zhì)的相對(duì)電荷或大小特征的氨基酸替換。變體可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于改變多肽序列的方法來制備，例如，如匯編這些方法的參考文獻(xiàn)中所找到的，例如，molecularcloning：alaboratorymanual，j.sambrook等編，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，1989；或者currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel等編，johnwiley&sons，inc.，newyork。氨基酸的保守替換包括在以下組中的氨基酸之間進(jìn)行的替換：(a)m、i、l、v；(b)f、y、w；(c)k、r、h；(d)a、g；(e)s、t；(f)q、n；以及(g)e、d。因此，可以對(duì)本文所公開的蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列進(jìn)行保守氨基酸替換。

編碼aav衣殼蛋白的分離核酸的實(shí)例是具有選自seqidno：1至47的序列的核酸。編碼aav衣殼序列的分離核酸的片段可用于構(gòu)建編碼期望衣殼序列的核酸。片段可以具有任意適當(dāng)?shù)拈L度。在一些實(shí)施方案中，編碼aav衣殼序列的分離核酸的片段(部分)可用于構(gòu)建編碼期望衣殼序列的核酸。片段可以具有任意適當(dāng)?shù)拈L度(例如，至少6個(gè)、至少9個(gè)、至少18個(gè)、至少36個(gè)、至少72個(gè)、至少144個(gè)、至少288個(gè)、至少576個(gè)、至少1152個(gè)或更多個(gè)核苷酸的長度)。例如，編碼第一aav衣殼蛋白之多肽的核酸序列的片段可以用于構(gòu)建編碼第二aav衣殼序列的核酸序列或者可以并入編碼第二aav衣殼序列的核酸序列中，以改變aav衣殼的特性。在一些實(shí)施方案中，包含來自多個(gè)aav血清型的衣殼序列片段的aav衣殼蛋白被稱為嵌合aav衣殼。所述片段可以是不編碼與seqidno：98至100中任一序列相同之肽的片段。例如，編碼變體氨基酸(與已知的aav血清型相比)的核酸序列的片段可以用于構(gòu)建編碼aav衣殼序列的核酸序列或者可以并入編碼aav衣殼序列的核酸序列中，以改變aav衣殼的特性。在一些實(shí)施方案中，與已知的aav血清型(例如，aav血清型3b、aav4或aav5)相比，編碼aav變體的核酸序列可以包含約1至約100個(gè)氨基酸變體。在一些實(shí)施方案中，與已知的aav血清型(例如，aav血清型3b、aav4或aav5)相比，編碼aav變體的核酸序列可以包含約5至約50個(gè)氨基酸變體。在一些實(shí)施方案中，與已知的aav血清型(例如，aav血清型3b、aav4或aav5)相比，編碼aav變體的核酸序列可以包含約10至約30個(gè)氨基酸變體。在一些實(shí)施方案中，與已知的aav血清型(例如，aav血清型3b、aav4或aav5)相比，編碼aav變體的核酸序列可以包含1個(gè)、或2個(gè)、或3個(gè)、或4個(gè)、5個(gè)、或6個(gè)、或7個(gè)、或8個(gè)、或9個(gè)、或10個(gè)、或11個(gè)、或12個(gè)、或13個(gè)、或14個(gè)、或15個(gè)、或16個(gè)、或17個(gè)、或18個(gè)、或19個(gè)、或20個(gè)氨基酸變體。例如，與已知的aav血清型(例如，aav5)相比，編碼aav變體(例如，seqidno：92)的核酸序列可以包含3個(gè)氨基酸變體。通過將包含編碼變體氨基酸之區(qū)域的核酸序列的片段并入編碼已知aav血清型的核酸序列中，重組cap序列可以被構(gòu)造成具有一個(gè)或更多個(gè)3氨基酸變體。所述片段可以通過任何合適的方法并入，包括使用定點(diǎn)誘變。因此，可以創(chuàng)建具有新特性的新aav變體。

重組aav

在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了分離的aav。如本文關(guān)于aav所使用的術(shù)語“分離的”是指人工獲得或產(chǎn)生的aav。分離的aav可以使用重組方法產(chǎn)生。這種aav在本文中稱為“重組aav”。重組aav(raav)優(yōu)選具有組織特異性靶向能力，以使得raav的轉(zhuǎn)基因?qū)⒈惶禺愋赃f送至一個(gè)或更多個(gè)預(yù)定組織。aav衣殼是確定這些組織特異性靶向能力的重要因素。因此，可以選擇具有適合于被靶向組織之衣殼的raav。在一些實(shí)施方案中，raav包含具有如seqidno51至97中任一所示氨基酸序列的衣殼蛋白或者具有與其基本上同源的蛋白質(zhì)。

獲得具有期望衣殼蛋白的重組aav的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如us2003/0138772)，其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。通常，所述方法包括培養(yǎng)含有以下的宿主細(xì)胞：編碼aav衣殼蛋白的核酸序列(例如，具有如seqidno：1至47中任一所示序列的核酸)或其片段；功能性rep基因；由aav反向末端重復(fù)(invertedterminalrepeat，itr)和轉(zhuǎn)基因構(gòu)成的重組aav載體；以及允許將重組aav載體包裝到aav衣殼蛋白中的足夠的輔助功能物。在一些實(shí)施方案中，衣殼蛋白是由aav的cap基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。在一些實(shí)施方案中，aav包含三種衣殼蛋白：病毒體蛋白1至3(命名為vp1、vp2和vp3)，所有的這些蛋白可以由單一cap基因表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方案中，vp1、vp2和vp3蛋白共享共同核心序列。在一些實(shí)施方案中，vp1、vp2和vp3的分子量分別為約87kda、約72kda和約62kda。在一些實(shí)施方案中，翻譯后，衣殼蛋白在病毒基因組周圍形成球形60聚體(mer)蛋白質(zhì)殼。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)殼主要包含vp3衣殼蛋白。在一些實(shí)施方案中，衣殼蛋白的功能是保護(hù)病毒基因組，遞送基因組和與宿主相互作用。在一些方面中，衣殼蛋白以組織特異性方式將病毒基因組遞送至宿主。在一些實(shí)施方案中，vp1和/或vp2衣殼蛋白可有助于經(jīng)包裝aav的組織嗜性。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)包裝aav的組織嗜性由vp3衣殼蛋白決定。在一些實(shí)施方案中，aav的組織嗜性通過衣殼蛋白中發(fā)生的突變而增強(qiáng)或改變。

在一些方面中，本公開內(nèi)容描述了野生型aav血清型的變體。在一些實(shí)施方案中，所述變體具有改變的組織嗜性。在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體包含在cap基因內(nèi)的氨基酸變化(例如，替換、缺失、插入)。如上所述，所有的三種衣殼蛋白都是由單一cap基因轉(zhuǎn)錄的。因此，在一些實(shí)施方案中，cap基因內(nèi)的氨基酸變化存在于由所述cap基因編碼的所有三種衣殼蛋白中?；蛘撸谝恍?shí)施方案中，氨基酸變化可能不存在于所有三種衣殼蛋白中。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化僅發(fā)生在vp1衣殼蛋白中。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化僅發(fā)生在vp2衣殼蛋白中。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化僅發(fā)生在vp3衣殼蛋白中。在一些實(shí)施方案中，aav變體包含在cap基因中的多于一個(gè)變化。在一些實(shí)施方案中，所述多于一個(gè)變化發(fā)生在相同衣殼蛋白內(nèi)(例如，在vp3內(nèi))。在一些實(shí)施方案中，所述多于一個(gè)變化發(fā)生在不同衣殼蛋白內(nèi)(例如，至少一個(gè)變化在vp2中而至少一個(gè)變化在vp3中)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體是aav3b、aav4或aav5的變體。已知aav3b有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)人肝細(xì)胞(例如，肝組織)。還已知aav3b有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)癌性人肝細(xì)胞。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav3b變體可用于將基因治療遞送至癌性和正常的人肝細(xì)胞。已知aav4和aav5靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)組織、心肺組織和眼睛。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav4和aav5變體可用于將基因治療遞送至cns、心肺組織或眼睛。

應(yīng)當(dāng)理解，與相應(yīng)的野生型aav相比，本文所述的aav3b、aav4和aav5變體可以包含在cap基因內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)變化。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav3b、aav4和aav5變體可具有可用于將基因治療遞送至不被野生型aav3b、aav4或aav5所靶向的其他組織類型的組織嗜性。在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav3b變體(例如，cbr-7.4、cbr-7.5、cbr-7.8)可用于將基因治療遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)。在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav4變體可用于靶向腎細(xì)胞或肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav5變體可用于使基因治療靶向肝、脾、心或腦。aav變體及其靶組織的非限制性實(shí)例可以在表1中找到。

在一些方面中，本文所述的aav變體可用于治療cns相關(guān)疾病。如本文所使用的“cns相關(guān)疾病”是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥。cns相關(guān)疾病可影響脊髓(例如，脊髓病)、腦(例如，腦病)或者腦和脊髓周圍的組織。cns相關(guān)疾病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或體細(xì)胞突變獲得。cns相關(guān)疾病可以是心理病癥或疾病，例如注意缺陷多動(dòng)障礙、孤獨(dú)癥譜系障礙、心境障礙、精神分裂癥、抑郁癥、雷特綜合征等。cns相關(guān)疾病可以是自身免疫病。cns相關(guān)疾病也可以是cns的癌癥，例如腦癌。作為癌癥的cns相關(guān)疾病可以是cns的原發(fā)性癌癥，例如星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，或者可以是轉(zhuǎn)移到cns組織的癌癥，例如轉(zhuǎn)移到腦的肺癌。cns相關(guān)疾病的另一些非限制性實(shí)例包括帕金森病、溶酶體貯積病、缺血、神經(jīng)性疼痛、肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，als)、多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis，ms)和卡納萬病(canavandisease，cd)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于將基因治療遞送至心細(xì)胞(例如，心臟組織)。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于治療心血管疾病。如本文所使用的“心血管疾病”是心血管系統(tǒng)的疾病或病癥。心血管疾病可能會(huì)影響心臟、循環(huán)系統(tǒng)、動(dòng)脈、靜脈、血管和/或毛細(xì)血管。心血管疾病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或體細(xì)胞突變獲得。心血管疾病的非限制性實(shí)例包括風(fēng)濕性心臟病、瓣膜性心臟病、高血壓性心臟病、動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病(例如，高血壓)、外周動(dòng)脈疾病(peripheralarterialdisease，pad)、缺血性心臟病、心絞痛、冠心病、冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗塞、腦血管疾病、短暫性腦缺血發(fā)作、炎性心臟病、心肌病、心包疾病、先天性心臟病、心力衰竭、中風(fēng)和由美洲錐蟲病(chagasdisease)引起的心肌炎。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可靶向肺和/或肺部系統(tǒng)的組織。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于治療肺部疾病。如本文所使用的“肺部疾病”是肺部系統(tǒng)的疾病或病癥。肺部疾病可影響肺或呼吸所涉及的肌肉。肺部疾病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或過體細(xì)胞突變獲得。肺部疾病可以是肺的癌癥，包括但不限于非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌和肺類癌腫瘤。肺部疾病的另外的非限制性實(shí)例包括急性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)、石棉沉滯癥、哮喘、支氣管擴(kuò)張、細(xì)支氣管炎、閉塞性細(xì)支氣管炎組織性肺炎(bronchiolitisobliteransorganizingpneumonia，boop)、支氣管肺發(fā)育不良、棉屑沉著病、慢性支氣管炎、球孢子菌病(cocci)、慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisorder，copd)、隱源性機(jī)化性肺炎(cryptogenicorganizingpneumonia，cop)、囊性纖維化、肺氣腫、漢坦病毒肺綜合征、組織胞漿菌病、人偏肺病毒、過敏性肺炎、流感、淋巴管瘤病、間皮瘤、中東呼吸綜合征、非結(jié)核分枝桿菌、百日咳、肺塵埃沉著病(黑肺病)、肺炎、原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺動(dòng)脈高壓、肺纖維化、肺血管病、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)、結(jié)節(jié)病、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，sars)、矽肺、睡眠呼吸暫停、嬰兒猝死綜合征(suddeninfantdeathsyndrome，sids)和肺結(jié)核。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可靶向肝組織。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于治療肝病。如本文所使用的“肝病”是肝的疾病或病癥。肝病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或體細(xì)胞突變獲得。肝病可以是肝癌，包括但不限于肝細(xì)胞癌(hepatocelluarcarcinoma，hcc)、纖維板層癌、膽管癌、血管肉瘤和肝母細(xì)胞瘤。肺部疾病的其他非限制性實(shí)例包括alagille綜合征、α1抗胰蛋白酶缺乏癥、自身免疫性肝炎、膽道閉鎖、肝硬化、肝囊性疾病、脂肪肝疾病、半乳糖血癥、膽結(jié)石、吉爾伯特氏綜合征、血色沉著病、妊娠期肝病、新生兒肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、卟啉癥、瑞氏綜合征、結(jié)節(jié)病、中毒性肝炎、1型糖原貯積病、酪氨酸血癥、甲型、乙型、丙型病毒性肝炎、威爾遜病，和血吸蟲病。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可靶向腎組織。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于治療腎病。如本文所使用的“腎病”是肝的疾病或病癥。肝病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或體細(xì)胞突變獲得。肝病可以是腎的癌癥，包括但不限于腎細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、1型乳頭狀癌、2型乳頭狀癌、嫌色細(xì)胞癌、嗜酸性細(xì)胞癌、集合管癌、腎盂的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞癌，和威爾姆氏腫瘤。腎病的其他非限制性實(shí)例包括：abderhalden-kaufmann-lignac綜合征(腎病性胱氨酸貯積癥)、急性腎衰竭/急性腎損傷、急性葉性腎病、急性磷酸腎病、急性腎小管壞死、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏、腺病毒腎炎、家族性出血性腎炎(alportsyndrome)、淀粉樣變性、血管肌脂肪瘤、鎮(zhèn)痛劑腎病、血管緊張素抗體和局灶性節(jié)段性腎小球硬化、抗磷脂綜合征、抗tnf-α治療相關(guān)性腎小球腎炎、apol1突變、表觀性心肌皮質(zhì)激素過多綜合征、馬兜鈴酸腎病、巴爾干地方性腎病、巴特綜合征、甜菜尿(beeturia)、β-地中海貧血腎病、膽汁管型腎病、bk多瘤、c1q腎病、心腎綜合征、cfhr5腎病、膽固醇栓塞、churg-strauss綜合征、乳糜尿、塌陷性腎小球病、cmv相關(guān)的塌陷性腎小球病、先天性腎病綜合征、conorenal綜合征(mainzer-saldino綜合征或saldino-mainzer病)、對(duì)比劑腎病、硫酸銅中毒、皮質(zhì)壞死、冷沉球蛋白血癥、晶體誘發(fā)的急性腎損傷、獲得性囊性腎疾病、胱氨酸尿癥、致密物沉積病(mpgn2型)、登特病(x連鎖隱性腎結(jié)石)、透析不平衡綜合征、糖尿病腎病、尿崩癥、east綜合征、異位輸尿管、水腫、erdheim-chester病、法布里病、家族性低尿鈣性高血鈣癥、范科尼綜合征、弗雷澤綜合征、纖維連接蛋白腎小球病、原纖維性腎小球腎炎和免疫觸須樣腎小球病、弗雷利綜合征、局灶性節(jié)段性腎小球硬化、局灶性硬化、局灶性腎小球硬化、gallowaymowat綜合征、吉特曼綜合征、腎小球疾病、腎小球管反流、葡萄糖尿、肺出血腎炎綜合征、溶血性尿毒綜合征(hemolyticuremicsyndrome，hus)、非典型溶血性尿毒綜合征(atypicalhemolyticuremicsyndrome，ahus)、噬血細(xì)胞綜合征、出血性膀胱炎、與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥和溶血性貧血有關(guān)的血鐵黃素沉積癥、肝靜脈阻塞病、肝竇阻塞綜合征、丙型肝炎相關(guān)性腎病、肝腎綜合征、hiv相關(guān)性腎病(hivan)、馬蹄腎(腎融合)、亨納潰瘍、醛固酮增多癥、高鈣血癥、高鉀血癥、高鎂血癥、高鈉血癥、高草酸尿癥、高磷血癥、低鈣血癥、低鉀血癥、低鉀血癥誘發(fā)的腎功能障礙、低鎂血癥、低鈉血癥、低磷血癥、iga腎病、igg4腎病、間質(zhì)性膀胱炎、疼痛膀胱綜合征、間質(zhì)性腎炎、ivemark綜合征、腎結(jié)石、腎石病、鉤端螺旋體腎病、輕鏈沉積病、單克隆免疫球蛋白沉積病、利德爾綜合征、lightwood-albright綜合征、脂蛋白腎小球病、鋰腎中毒、lmx1b突變導(dǎo)致的遺傳性fsgs、腰痛性血尿癥、狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎病、狼瘡性腎炎、萊姆病相關(guān)的腎小球腎炎、瘧疾性腎病、惡性高血壓、軟化斑、尿道口狹窄、髓質(zhì)囊性腎病、髓質(zhì)海綿腎、巨輸尿管癥、三聚氰胺中毒和腎病、膜增生性腎小球腎炎、膜性腎病、中美洲腎病、代謝性酸中毒、代謝性堿中毒、顯微鏡下多發(fā)性血管炎、乳-堿綜合征、微小病變性腎病、多囊性發(fā)育不良腎、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生性腫瘤和腎小球病、指甲髕骨綜合征、鈣質(zhì)沉著癥、腎源性系統(tǒng)性纖維化、腎下垂(游走腎、腎下垂)、腎病綜合征、神經(jīng)源性膀胱、結(jié)節(jié)性腎小球硬化、非淋病性胡桃夾綜合征、口面指綜合征、直立性低血壓、直立性蛋白尿、滲透性利尿、page腎、乳頭壞死、乳頭腎綜合征(腎缺損綜合征、孤立性腎發(fā)育不良)、腹膜-腎綜合征、后尿道瓣膜、感染后腎小球性腎炎、鏈球菌感染后腎小球性腎炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多囊腎病、后尿道瓣膜、子癇前期、伴有單克隆igg沉積的增生性腎小球腎炎(納斯病)、蛋白尿(尿蛋白)、假性醛固酮增多癥、假性甲狀旁腺功能減退癥、肺-腎綜合征、腎盂腎炎(腎感染)、腎盂積膿、放射性腎病、復(fù)食綜合征、反流性腎病、急進(jìn)性腎小球腎炎、腎膿腫、腎周膿腫、腎缺如、腎動(dòng)脈瘤、腎動(dòng)脈狹窄、腎細(xì)胞癌、腎囊腫、伴有運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的急性腎衰竭的腎低尿酸血癥、腎梗死、腎性骨營養(yǎng)不良、腎小管性酸中毒、滲透調(diào)定點(diǎn)重設(shè)(resetosmostat)、腔靜脈后輸尿管、腹膜后纖維化、橫紋肌溶解癥、與減肥手術(shù)有關(guān)的橫紋肌溶解癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性腎病、結(jié)節(jié)性腎病、腎和腦的耗鹽癥、schimke免疫性骨質(zhì)發(fā)育不良、硬皮病腎危象、蛇形腓骨多囊腎綜合征、exner綜合征、鐮狀細(xì)胞腎病、二氧化硅暴露和慢性腎疾病、造血細(xì)胞移植后的腎病、干細(xì)胞移植相關(guān)的腎病、薄基底膜病、良性家族性血尿、膀胱三角區(qū)炎、結(jié)節(jié)性硬化癥、腎小管發(fā)育不全、腫瘤溶解綜合征、尿毒癥、尿毒癥性視神經(jīng)病變、輸尿管疝、尿道肉阜、尿道狹窄、尿失禁、尿道感染、尿道梗阻、膀胱直腸瘺、膀胱輸尿管反流、腦視網(wǎng)膜血管瘤病(vonhippel-lindaudisease)、華法林相關(guān)腎病、韋氏肉芽腫病、伴有多血管炎的肉芽腫，和wunderlich綜合征。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于將基因治療遞送至眼組織。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的aav變體可用于治療眼部疾病。如本文所使用的“眼部疾病”是眼睛的疾病或病癥。心血管疾病可能會(huì)影響眼睛、鞏膜、角膜、前房、后房、虹膜、瞳孔、晶狀體、玻璃體液、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)。眼部疾病可以是遺傳起源的，其通過遺傳或體細(xì)胞突變獲得。眼部疾病和病癥的非限制性實(shí)例包括但不限于：年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、青光眼、色素性視網(wǎng)膜炎和眼癌。

要在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)以將raav載體包裝在aav衣殼中的組件可以反式地提供給宿主細(xì)胞?；蛘?，任何一種或更多種所需組件(例如，重組aav載體、rep序列、cap序列和/或輔助功能物)可以通過穩(wěn)定的宿主細(xì)胞提供，所述穩(wěn)定的宿主細(xì)胞使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而被改造成包含一種或更多種所需組件。最適當(dāng)?shù)?，這種穩(wěn)定的宿主細(xì)胞將包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的所需組件。然而，所需組件也可以在組成型啟動(dòng)子的控制之下。在適用于轉(zhuǎn)基因的調(diào)控元件的討論中，本文提供了合適的誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子的實(shí)例。在另一個(gè)替代方案中，所選擇的穩(wěn)定的宿主細(xì)胞可以包含在組成型啟動(dòng)子控制下的選定組件和在一種或更多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的其他選定組件。例如，可以產(chǎn)生這樣的穩(wěn)定宿主細(xì)胞，其來源于293細(xì)胞(其包含在組成型啟動(dòng)子控制下的e1輔助功能物)，但是包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的rep和/或cap蛋白。另外的穩(wěn)定宿主細(xì)胞也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生。

可以用任何合適的遺傳元件(載體)將產(chǎn)生本公開內(nèi)容的raav所需的重組aav載體、rep序列、cap序列和輔助功能物遞送至包裝性宿主細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，將編碼所有三種衣殼蛋白(例如vp1、vp2和vp3)的單個(gè)核酸以單個(gè)載體遞送到包裝性宿主細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，編碼衣殼蛋白的核酸通過兩個(gè)載體遞送到包裝性宿主細(xì)胞中；第一載體包含編碼兩種衣殼蛋白(例如vp1和vp2)的第一核酸，第二載體包含編碼單一衣殼蛋白(例如vp3)的第二核酸。在一些實(shí)施方案中，將各自包含編碼不同衣殼蛋白的核酸的三種載體遞送至包裝性宿主細(xì)胞中。所選擇的遺傳元件可以通過任何合適的方法遞送，包括本文所述的那些。用于構(gòu)建本公開內(nèi)容的任意實(shí)施方案的方法對(duì)于核酸操作技術(shù)人員是已知的，并且包括遺傳工程、重組工程和合成技術(shù)。參見例如sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y.。類似地，產(chǎn)生raav病毒體的方法是公知的，并且合適方法的選擇不是對(duì)本公開內(nèi)容的限制。參見例如k.fisher等，j.virol.，70：520-532(1993)和美國專利no.5,478,745。

在一些實(shí)施方案中，重組aav可以使用三重轉(zhuǎn)染方法(詳細(xì)描述于美國專利no.6,001,650中)來產(chǎn)生。通常，重組aav通過用待包裝到aav顆粒中的重組aav載體(包含轉(zhuǎn)基因)、aav輔助功能載體和附屬功能載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而產(chǎn)生。aav輔助功能載體編碼“aav輔助功能”序列(例如rep和cap)，其反式地起作用以進(jìn)行高效的aav復(fù)制和包封。優(yōu)選地，aav輔助功能載體支持有效的aav載體產(chǎn)生而不產(chǎn)生任何可檢測(cè)的野生型aav病毒體(例如，含有功能性rep和cap基因的aav病毒體)。適用于本公開內(nèi)容的載體的非限制性實(shí)例包括美國專利no.6,001,650中描述的phlp19和美國專利no.6,156,303中描述的prep6cap6載體，二者的全部內(nèi)容通過引用并入本文。附屬功能載體編碼aav復(fù)制所依賴的非aav源的病毒和/或細(xì)胞功能的核苷酸序列(例如“附屬功能”)。附屬功能包括aav復(fù)制所需的那些功能，包括但不限于參與aav基因轉(zhuǎn)錄激活、階段特異性aavmrna剪接、aavdna復(fù)制、cap表達(dá)產(chǎn)物合成和aav衣殼組裝的部分。基于病毒的附屬功能可以從已知的任意輔助病毒(如腺病毒、皰疹病毒(除1型單純皰疹病毒之外)和痘苗病毒)中得到。

在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用于指細(xì)胞攝入外來dna，當(dāng)外源dna被引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，則細(xì)胞已被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見例如graham等(1973)virology，52：456；sambrook等(1989)molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratories，newyork；davis等(1986)basicmethodsinmolecularbiology，elsevier；以及chu等(1981)gene13：197。這樣的技術(shù)可以用于將一種或更多種外源核酸(如核苷酸整合載體和其他核酸分子)引入合適的宿主細(xì)胞中。

“宿主細(xì)胞”是指任何容納有或能夠容納目的物質(zhì)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以用作aav輔助構(gòu)建體、aav小基因質(zhì)粒、附屬功能載體或與重組aav產(chǎn)生相關(guān)的其他轉(zhuǎn)移dna的接受者。該術(shù)語包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的后代。因此，本文所使用的“宿主細(xì)胞”可以指已經(jīng)用外源dna序列轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，由于自然、偶然或故意突變，單個(gè)親代細(xì)胞的后代在形態(tài)方面或者在基因組或總dna互補(bǔ)物方面可能不一定與原始親本完全相同。

如本文所使用的術(shù)語“細(xì)胞系”是指在體外能夠持續(xù)或延長生長和分裂的細(xì)胞群。通常，細(xì)胞系是來源于單個(gè)祖細(xì)胞的克隆群體。在本領(lǐng)域中還已知，在這種克隆群體的儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)移期間，核型可以發(fā)生自發(fā)或誘導(dǎo)的變化。因此，來源于所提及的細(xì)胞系的細(xì)胞可能與祖先細(xì)胞或培養(yǎng)物不完全相同，并且所提及的細(xì)胞系包括這些變體。

如本文所使用的術(shù)語“重組細(xì)胞”是指已引入導(dǎo)致生物活性多肽轉(zhuǎn)錄或生物活性核酸(如rna)產(chǎn)生的外源dna片段(例如dna片段)的細(xì)胞。

還可以用向aav提供輔助功能物的載體(例如，輔助載體)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。提供輔助功能物的載體可以提供腺病毒功能物，包括例如e1a、e1b、e2a、e4orf6。提供這些功能物的腺病毒基因的序列可以從任何已知的腺病毒血清型獲得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且還包括本領(lǐng)域已知的任何目前已鑒定的人類型。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用表達(dá)aav復(fù)制、aav基因轉(zhuǎn)錄和/或aav包裝所需的一個(gè)或更多個(gè)基因的載體來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

如本文所使用的術(shù)語“載體”包括當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂圃嚓P(guān)聯(lián)時(shí)能夠復(fù)制并且可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移基因序列的任何遺傳元件，例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、人造染色體、病毒、病毒體等。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)載劑以及病毒載體。在一些實(shí)施方案中，預(yù)期有用的載體是其中待轉(zhuǎn)錄核酸片段位于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的那些載體?！皢?dòng)子”是指被細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器所識(shí)別的引發(fā)基因特異性轉(zhuǎn)錄所需的dna序列。術(shù)語“有效定位”，“控制下”或“轉(zhuǎn)錄控制下”是指啟動(dòng)子位于與核酸相關(guān)的正確位置和取向上以控制rna聚合酶起始和基因的表達(dá)。術(shù)語“表達(dá)載體或構(gòu)建體”是指含有其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄的核酸的任何類型的遺傳構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)包括核酸的轉(zhuǎn)錄，例如，由經(jīng)轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)生生物活性多肽產(chǎn)物或抑制性rna(例如，shrna、mirna、mirna抑制物)。

在一些情況下，使用本領(lǐng)域公知的方法，分離的衣殼基因可以用于構(gòu)建和包裝重組aav，以確定與由該基因編碼的衣殼蛋白相關(guān)的功能特征。例如，分離的衣殼基因可以用于構(gòu)建和包裝包含報(bào)告基因(例如，b-半乳糖苷酶、gfp、螢光素酶等)的重組aav(raav)。然后可以將raav遞送至動(dòng)物(例如，小鼠)，并且新的分離衣殼基因的組織靶向特性可以通過檢查報(bào)告基因在動(dòng)物的多個(gè)組織(例如心臟、肝、腎)中的表達(dá)來確定。本文中公開了用于表征新的分離衣殼基因的另一些方法，并且還有一些方法是本領(lǐng)域公知的。

用于將重組載體包裝在期望aav衣殼中以產(chǎn)生本公開內(nèi)容的raav的上述方法并不意在限制，并且其他合適的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。

重組aav載體

本公開內(nèi)容的“重組aav(raav)載體”通常至少由轉(zhuǎn)基因及其調(diào)控序列以及5’和3’aav反向末端重復(fù)(itr)構(gòu)成。將這種重組aav載體包裝入衣殼蛋白并遞送至所選擇的靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因是與載體序列異源的核酸序列，其編碼目的多肽、蛋白質(zhì)、功能性rna分子(例如，mirna、mirna抑制物)或其他基因產(chǎn)物。核酸編碼序列以允許在靶組織的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)的方式與調(diào)控組件有效連接。

載體的aav序列通常包含順式作用的5’和3’反向末端重復(fù)序列(參見例如b.j.carter在″handbookofparvoviruses″中，編，p.tijsser，crcpress，第155168頁(1990))。itr序列的長度為約145bp。優(yōu)選地，在分子中使用基本上整個(gè)編碼itr的序列，但是對(duì)這些序列的某種程度的微小修飾是允許的。修飾這些itr序列的能力在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)(參見例如，如sambrook等″molecularcloning.alaboratorymanual″，第2版，coldspringharborlaboratory，newyork(1989)；以及k.fisher等，jvirol.，70：520532(1996)的文本)。本公開內(nèi)容中使用的這種分子的實(shí)例是含有轉(zhuǎn)基因的“順式作用”質(zhì)粒，其中所選擇的轉(zhuǎn)基因序列和相關(guān)調(diào)控元件的側(cè)翼是5’和3’aavitr序列。aavitr序列可以由任何已知的aav獲得，包括目前已鑒定的哺乳動(dòng)物aav類型。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的raav是假型raav。假型化是與外來病毒包膜蛋白組合來產(chǎn)生病毒或病毒載體的過程。其結(jié)果是假型病毒顆粒。利用這種方法，外來病毒包膜蛋白可以用于改變病毒顆粒的宿主嗜性或者提高/降低病毒顆粒的穩(wěn)定性。在一些方面中，假型raav包含來自兩種或更多種不同aav的核酸，其中來自一種aav的核酸編碼衣殼蛋白，并且至少一種其他aav的核酸編碼其他病毒蛋白和/或病毒基因組。在一些實(shí)施方案中，假型raav是指包含一種aav血清型的反向末端重復(fù)序列(itr)和不同aav血清型的衣殼蛋白的aav。例如，包含血清型x的itr并以y蛋白殼體化的假型aav載體將被稱為aavx/y(例如，aav2/1具有aav2的itr和aav1的衣殼)。在一些實(shí)施方案中，假型raav可用于將來自一種aav血清型的衣殼蛋白的組織特異性靶向能力與來自另一種aav血清型的病毒dna相組合，從而允許將轉(zhuǎn)基因靶向遞送至靶組織。

除了以上確定的關(guān)于重組aav載體的主要元件之外，所述載體還包含必需的常規(guī)控制元件，其與轉(zhuǎn)基因以允許其在經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或經(jīng)本公開內(nèi)容產(chǎn)生的病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達(dá)的方式有效連接。如本文所使用的“有效連接”序列包括與目的基因鄰接的表達(dá)控制序列和以反式方式或在一定距離處作用以控制目的基因的表達(dá)控制序列二者。

表達(dá)控制序列包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的rna加工信號(hào)，例如剪接和聚腺苷酸化(polya)信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mrna的序列；提高翻譯效率的序列(例如，kozak共有序列)；提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及在需要時(shí)提高編碼產(chǎn)物分泌的序列。許多表達(dá)控制序列(包括天然的、組成型的、誘導(dǎo)型的和/或組織特異性的啟動(dòng)子)是本領(lǐng)域已知的并且可以使用。

如本文所使用的，當(dāng)核酸序列(例如，編碼序列)和調(diào)控序列以這樣的方式共價(jià)連接，以使得將核酸序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄置于調(diào)控序列的影響或控制下時(shí)，則認(rèn)為它們被“有效”連接。如果期望將核酸序列翻譯成功能性蛋白質(zhì)，則如果誘導(dǎo)5’調(diào)控序列中的啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼序列轉(zhuǎn)錄，并且如果兩個(gè)dna序列之間的接頭性質(zhì)(1)不導(dǎo)致移碼突變引入，(2)不干擾啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，并且(3)不干擾相應(yīng)rna轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)的能力，則兩個(gè)dna序列被認(rèn)為是有效連接。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)能夠影響該dna序列的轉(zhuǎn)錄，以使得所得轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成期望蛋白質(zhì)或多肽，則啟動(dòng)子區(qū)與核酸序列有效連接。類似地，當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)以這樣的方式連接，以使得其來自共同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致兩個(gè)或更多個(gè)已在框內(nèi)翻譯的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，則它們被有效連接。在一些實(shí)施方案中，有效連接的編碼序列產(chǎn)生融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，有效連接的編碼序列產(chǎn)生功能性rna(例如，shrna、mirna、mirna抑制物)。

對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的核酸，一般在轉(zhuǎn)基因序列之后和在3’aavitr序列之前插入聚腺苷酸化序列?？捎糜诒竟_內(nèi)容的raav構(gòu)建體還可以包含內(nèi)含子，期望其位于啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列和轉(zhuǎn)基因之間。一種可能的內(nèi)含子序列來自sv-40，并且被稱為sv-40t內(nèi)含子序列。另一種可以使用的載體元件是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，ires)。ires序列用于從單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄物中產(chǎn)生多于一種的多肽。ires序列用于產(chǎn)生包含多于一條多肽鏈的蛋白質(zhì)。這些和其他常見載體元件的選擇是常規(guī)的，并且許多這樣的序列是可用的[參見例如sambrook等和其中所引用的參考文獻(xiàn)，例如在3.18、3.26和16.1716.27頁中；以及ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1989]。在一些實(shí)施方案中，口蹄疫病毒2a序列包括在多蛋白中；這是一種顯示出介導(dǎo)多蛋白切割的小肽(長度約18個(gè)氨基酸)(ryan，md等，embo，1994；4：928-933；mattion，nm等，jvirology，1996年11月，第8124-8127頁；furler，s等，genetherapy，2001；8：864-873；以及halpin，c等，theplantjournal，1999；4：453-459)。先前已經(jīng)在包含質(zhì)粒和基因治療載體(aav和逆轉(zhuǎn)錄病毒)的人造系統(tǒng)中證明了2a序列的切割活性(ryan，md等，embo，1994；4：928-933；mattion，nm等，jvirology，1996年11月，第8124-8127頁；furler，s等，genetherapy，2001；8：864-873；以及halpin，c等，theplantjournal，1999；4：453-459；defelipe，p等，genetherapy，1999；6：198-208；defelipe，p等，humangenetherapy，2000；11：1921-1931.；以及klump，h等，genetherapy，2001；8：811-817)。

在宿主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)所需的調(diào)控序列的確切性質(zhì)可以在物種、組織或細(xì)胞類型之間變化，但是一般應(yīng)包含(在必要時(shí))分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄序列和5’非翻譯序列，例如tata盒、加帽序列、caat序列、增強(qiáng)子元件等。特別地，這種5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包含啟動(dòng)子區(qū)，其包含用于有效連接的基因的轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。根據(jù)需要，調(diào)控序列還可以包含增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。本公開內(nèi)容的載體可以任選地包含5’前導(dǎo)或信號(hào)序列。適當(dāng)載體的選擇和設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判斷之內(nèi)。

組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒勞氏肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)ltr啟動(dòng)子(任選地帶有rsv增強(qiáng)子)、巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子(任選地帶有cmv增強(qiáng)子)[參見例如boshart等，cell，41：521-530(1985)]、sv40啟動(dòng)子、二氫葉酸還原酶啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、磷酸甘油激酶(pgk)啟動(dòng)子和ef1α啟動(dòng)子[invitrogen]。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子允許調(diào)控基因表達(dá)并且可以通過外源供應(yīng)的化合物、環(huán)境因素(如溫度)或特定生理狀態(tài)(例如，急性期、細(xì)胞的特定分化狀態(tài))的存在或僅在復(fù)制細(xì)胞中存在來調(diào)控。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型系統(tǒng)可從多種商業(yè)來源獲得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已經(jīng)描述了許多其他系統(tǒng)，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。由外源供應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括鋅誘導(dǎo)型綿羊金屬硫蛋白(mt)啟動(dòng)子、地塞米松(dex)誘導(dǎo)型小鼠乳腺腫瘤病毒(mousemammarytumorvirus，mmtv)啟動(dòng)子、t7聚合酶啟動(dòng)子系統(tǒng)(wo98/10088)、蛻皮激素昆蟲啟動(dòng)子(no等，proc.natl.acad.sci.usa，93：3346-3351(1996))、四環(huán)素阻遏型系統(tǒng)(gossen等，proc.natl.acad.sci.usa，89：5547-5551(1992))、四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)(gossen等，science，268：1766-1769(1995)，還參見harvey等，curr.opin.chem.biol.，2：512-518(1998))、ru486誘導(dǎo)型系統(tǒng)(wang等，nat.biotech.，15：239-243(1997)和wang等，genether.，4：432-441(1997))以及雷帕霉素誘導(dǎo)型系統(tǒng)(magari等，j.clin.invest.，100：2865-2872(1997))。在本文中可用的另一些類型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是受特定生理狀態(tài)(例如，溫度、急性期、細(xì)胞的特定分化狀態(tài)或僅在復(fù)制細(xì)胞中)調(diào)控的啟動(dòng)子。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，將使用轉(zhuǎn)基因的天然啟動(dòng)子。當(dāng)期望轉(zhuǎn)基因的表達(dá)應(yīng)當(dāng)模擬天然表達(dá)時(shí)，天然的啟動(dòng)子可以是優(yōu)選的。當(dāng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)必須在時(shí)間上或發(fā)育上、或者以組織特異性方式、或者響應(yīng)特定的轉(zhuǎn)錄刺激來進(jìn)行調(diào)控時(shí)，可以使用天然啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可以使用其他天然表達(dá)控制元件來模擬天然表達(dá)，例如增強(qiáng)子元件、聚腺苷酸化位點(diǎn)或kozak共有序列。

在一些實(shí)施方案中，調(diào)控序列賦予組織特異性基因表達(dá)能力。在一些情況下，組織特異性調(diào)控序列結(jié)合組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，后者以組織特異性方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。這樣的組織特異性調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)是本領(lǐng)域公知的。示例性組織特異性調(diào)控序列包括但不限于以下的組織特異性啟動(dòng)子：肝特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白(tbg)啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子、生長抑素啟動(dòng)子、胰多肽(ppy)啟動(dòng)子、突觸蛋白-1(syn)啟動(dòng)子、肌酸激酶(mck)啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物結(jié)蛋白(des)啟動(dòng)子、α-肌球蛋白重鏈(a-mhc)啟動(dòng)子或心肌肌鈣蛋白t(ctnt)啟動(dòng)子。其他示例性啟動(dòng)子包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子(sandig等，genether.，3：1002-9(1996))、甲胎蛋白(afp)啟動(dòng)子(arbuthnot等，hum.genether.，7：1503-14(1996))、骨骨鈣素啟動(dòng)子(stein等，mol.biol.rep.，24：185-96(1997))、骨涎蛋白啟動(dòng)子(chen等，j.boneminer.res.，11：654-64(1996))、cd2啟動(dòng)子(hansal等，j.immunol.，161：1063-8(1998))、免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子、t細(xì)胞受體α鏈啟動(dòng)子、神經(jīng)元如神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，nse)啟動(dòng)子(andersen等，cell.mol.neurobiol.，13：503-15(1993))、神經(jīng)絲輕鏈基因啟動(dòng)子(piccioli等，proc.natl.acad.sci.usa，88：5611-5(1991))和神經(jīng)元特異性vgf基因啟動(dòng)子(piccioli等，neuron，15：373-84(1995))等，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的。

在一些實(shí)施方案中，將一種或更多種mirna的一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并入raav載體的轉(zhuǎn)基因中，以抑制在具有轉(zhuǎn)基因的對(duì)象的一個(gè)或更多個(gè)組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以選擇結(jié)合位點(diǎn)從而以組織特異性方式控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。例如，可以將肝特異性mir-122的結(jié)合位點(diǎn)并入轉(zhuǎn)基因中以抑制該轉(zhuǎn)基因在肝中的表達(dá)。mrna中的靶位點(diǎn)可以在5’utr、3’utr或編碼區(qū)中。通常，靶位點(diǎn)在mrna的3’utr中。此外，轉(zhuǎn)基因可以被設(shè)計(jì)為使得多個(gè)mirna通過識(shí)別相同或多個(gè)位點(diǎn)來調(diào)控mrna。多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)的存在可導(dǎo)致多個(gè)risc的共同作用并提供高效的表達(dá)抑制。靶位點(diǎn)序列可以包含總共5至100、10至60或更多個(gè)核苷酸。靶位點(diǎn)序列可以包含靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列的至少5個(gè)核苷酸。

重組aav載體：轉(zhuǎn)基因編碼序列

raav載體的轉(zhuǎn)基因序列的組成將取決于所得載體所用的用途。例如，一種類型的轉(zhuǎn)基因序列包括報(bào)告序列，其在表達(dá)后產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼治療性蛋白質(zhì)或治療性功能性rna。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼旨在用于研究目的(例如，用于產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，例如，用于研究轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的功能)的蛋白質(zhì)或功能性rna。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼旨在用于產(chǎn)生疾病的動(dòng)物模型的蛋白質(zhì)或功能性rna。合適的轉(zhuǎn)基因編碼序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的。

可以在轉(zhuǎn)基因中提供的報(bào)告序列包括但不限于編碼以下的dna序列：β-內(nèi)酰胺酶、β-半乳糖苷酶(lacz)、堿性磷酸酶、胸苷激酶、綠色熒光蛋白(gfp)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、螢光素酶和本領(lǐng)域公知的其他酶。當(dāng)與驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的調(diào)控元件關(guān)聯(lián)時(shí)，報(bào)告序列提供可通過常規(guī)方法檢測(cè)的信號(hào)，包括酶、放射照相、比色、熒光或其他光譜測(cè)定、熒光活化細(xì)胞分選測(cè)定和免疫測(cè)定(包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、放射免疫測(cè)定(radioimmunoassay，ria)和免疫組織化學(xué))。例如，當(dāng)標(biāo)記序列是lacz基因時(shí)，攜帶該信號(hào)的載體的存在通過β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定來檢測(cè)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因是綠色熒光蛋白或螢光素酶時(shí)，攜帶該信號(hào)的載體可以通過發(fā)光計(jì)中的顏色或光產(chǎn)生來經(jīng)視覺測(cè)量。這樣的報(bào)告因子可例如用于驗(yàn)證raav的組織特異性靶向能力和組織特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)活性。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中一種或更多種遺傳缺陷或功能障礙的方法的raav載體，所述遺傳缺陷或功能障礙例如，哺乳動(dòng)物中的多肽缺乏或多肽過量，并且特別是用于治療或減輕人(其表現(xiàn)出與細(xì)胞和組織中的這樣的多肽缺陷相關(guān)的一種或更多種病癥)中的缺陷的嚴(yán)重性或程度。該方法包括將可藥用載體中編碼一種或更多種治療性肽、多肽、sirna、microrna、反義核苷酸等的raav載體以足以治療患有這樣的病癥的對(duì)象中之缺陷或病癥的量和時(shí)間段來施用于對(duì)象。

因此，本公開內(nèi)容包括遞送編碼一種或更多種肽、多肽或蛋白質(zhì)的raav載體，其可用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物對(duì)象中的疾病狀態(tài)。示例性治療性蛋白質(zhì)包括選自以下的一種或更多種多肽：生長因子、白細(xì)胞介素、干擾素、抗凋亡因子、細(xì)胞因子、抗糖尿病因子、抗凋亡劑、凝血因子、抗腫瘤因子。治療性蛋白質(zhì)的其他非限制性實(shí)例包括bdnf、cntf、csf、egf、fgf、g-scf、gm-csf、促性腺激素、ifn、ifg-1、m-csf、ngf、pdgf、pedf、tgf、vegf、tgf-b2、tnf、催乳素、促生長素、xiap1、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-10(187a)、病毒性il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17和il-18。

raav載體可以包含待轉(zhuǎn)移到對(duì)象以治療與基因表達(dá)減少、缺乏基因表達(dá)或基因功能障礙有關(guān)的疾病的基因。示例性基因和相關(guān)疾病狀態(tài)包括但不限于：與1a型糖原貯積缺陷有關(guān)的葡萄糖-6-磷酸酶；與pepck缺陷有關(guān)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；與半乳糖血癥有關(guān)的半乳糖-1磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶；與苯丙酮尿癥有關(guān)的苯丙氨酸羥化酶；與楓糖尿癥有關(guān)的支鏈α-酮酸脫氫酶；與1型酪氨酸血癥有關(guān)的延胡索酰乙酰乙酸水解酶；與甲基丙二酸血癥有關(guān)的甲基丙二酰輔酶a變位酶；與中鏈乙酰輔酶a缺陷有關(guān)的中鏈?；o酶a脫氫酶；與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺陷有關(guān)的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶；與瓜氨酸血癥有關(guān)的精氨琥珀酸合成酶；與家族性高膽固醇血癥有關(guān)的低密度脂蛋白受體蛋白；與克里格勒-納賈爾病有關(guān)的udp-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶；與嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病有關(guān)的腺苷脫氨酶；與痛風(fēng)和萊施-奈恩綜合征有關(guān)的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；與生物素酶缺陷有關(guān)的生物素酶；與戈謝病有關(guān)的β-葡糖腦苷脂酶；與sly綜合征有關(guān)的β-葡糖苷酸酶；與腦肝腎綜合征(zellwegersyndrome)有關(guān)的過氧化物酶體膜蛋白70kda；與急性間歇性卟啉癥有關(guān)的膽色素原脫氨酶；用于治療α-1抗胰蛋白酶缺陷(肺氣腫)的α-1抗胰蛋白酶；用于治療由于地中海貧血或由于腎衰竭引起的貧血的紅細(xì)胞生成素；用于治療缺血性疾病的血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1和成纖維細(xì)胞生長因子；用于治療如例如動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成或栓塞中可見的閉塞血管的血栓調(diào)節(jié)蛋白和組織因子途徑抑制劑；用于治療帕金森病的芳香族氨基酸脫羧酶(aromaticaminoaciddecarboxylase，aadc)和酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，th)；用于治療充血性心力衰竭的β腎上腺素能受體、受磷蛋白的反義或突變形式、肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)腺苷三磷酸酶-2(serca2)和心臟腺苷酸環(huán)化酶；用于治療多種癌癥的腫瘤抑制基因如p53；例如用于治療炎性和免疫疾病和癌癥的多種白細(xì)胞介素之一的細(xì)胞因子；用于治療肌肉萎縮癥的肌養(yǎng)蛋白或小肌養(yǎng)蛋白和肌營養(yǎng)相關(guān)蛋白或小肌營養(yǎng)相關(guān)蛋白；以及用于治療糖尿病的胰島素。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼可用于治療與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸的aav。以下是與cns疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：與阿爾茨海默病有關(guān)的drd2、gria1、gria2、grin1、slc1a1、syp、syt1、chrna7、3rtau/4rtus、app、bax、bcl-2、grik1、gfap、il-1、ager；與帕金森病有關(guān)的uch-l1、skp1、egln1、nurr-1、bdnf、trkb、gstm1、s106β；與亨廷頓病有關(guān)的it15、prnp、jph3、tbp、atxn1、atxn2、atxn3、atrophin1、ftl、titf-1；與弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)有關(guān)的fxn；與卡納萬病有關(guān)的aspa；與肌營養(yǎng)不良有關(guān)的dmd；以及與脊髓性肌萎縮有關(guān)的smn1、ube1、dync1h1。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及編碼可用于治療與心血管系統(tǒng)有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸。以下是與心血管疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：vegf、fgf、sdf-1、連接蛋白40、連接蛋白43、scn4a、hif1α、serca2a、adcy1和adcy6。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼可用于治療與肺系統(tǒng)有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna之核酸的aav。以下是與肺部疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：tnfα、tgfβ1、sftpa1、sftpa2、sftpb、sftpc、hps1、hps3、hps4、adtb3a、il1a、il1b、lta、il6、cxcr1和cxcr2。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼可用于治療與肝有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸的aav。以下是與肝疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：α1-at、hfe、atp7b、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fah)、葡萄糖-6-磷酸酶、ncan、gckr、lyplal1和pnpla3。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼可用于治療與腎有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸的aav。以下是與腎疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：

pkd1，pkd2，pkhd1，nphs1，nphs2，plce1，cd2ap，lamb2，trpc6，wt1，lmx1b，smarcal1，coq2，pdss2，scarb3，fn1，col4a5，col4a6，col4a3，col4a4，fox1c，ret，upk3a，bmp4，six2，cdc5l，usf2，robo2，slit2，eya1，myog，six1，six5，fras1，frem2，gata3，kal1，pax2，tcf2，和sall1。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼可用于治療與眼有關(guān)的病癥、疾病或病患之蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸的aav。以下是與眼部疾病有關(guān)的基因的非限制性列表：cfh、c3、mt-nd2、arms2、timp3、camk4、fmn1、rho、ush2a、rpgr、rp2、tmco、six1、six6、lrp12、zfpm2、tbk1、galc、肌纖蛋白、cyp1b1、cav1、cav2、optineurin和cdkn2b。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種前述基因或其片段的核酸的重組aav。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含表達(dá)一種或更多種功能性rna的核酸的重組aav，所述功能性rna抑制一種或更多種前述基因的表達(dá)。

本公開內(nèi)容的raav可用于恢復(fù)在對(duì)象中表達(dá)減少、沉默或其他功能障礙的基因(例如，在患有癌癥的對(duì)象中沉默的腫瘤抑制基因)的表達(dá)。本公開內(nèi)容的raav也可以用于敲低在對(duì)象中異常表達(dá)的基因(例如，在患有癌癥的對(duì)象中表達(dá)的致癌基因)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，包含編碼與癌癥有關(guān)基因產(chǎn)物(例如，腫瘤抑制基因)的核酸的raav載體可用于通過將所述具有raav載體的raav施用于患有癌癥的對(duì)象來治療癌癥。在一些實(shí)施方案中，包含編碼抑制與癌癥有關(guān)的基因產(chǎn)物(例如，致癌基因)表達(dá)的小干擾核酸(例如，shrna、mirna)的核酸的raav載體可用于通過將所述具有raav載體的raav施用于患有癌癥的對(duì)象來治療癌癥。在一些實(shí)施方案中，包含編碼與癌癥有關(guān)的基因產(chǎn)物的核酸(或者抑制與癌癥有關(guān)的基因表達(dá)的功能性rna)的raav載體可用于研究目的，例如，用于研究癌癥或用于鑒定治療癌癥的療法。以下是已知與癌癥發(fā)生有關(guān)的示例性基因(例如，致癌基因和腫瘤抑制基因)的非限制性列表：

aars，abcb1，abcc4，abi2，abl1，abl2，ack1，acp2，acy1，adsl，ak1，akr1c2，akt1，alb，anpep，anxa5，anxa7，ap2m1，apc，arhgap5，arhgef5，arid4a，asns，atf4，atm，atp5b，atp5o，axl，bard1，bax，bcl2，bhlhb2，blmh，braf，brca1，brca2，btk，canx，cap1，capn1，capns1，cav1，cbfb，cblb，ccl2，ccnd1，ccnd2，ccnd3，ccne1，cct5，ccyr61，cd24，cd44，cd59，cdc20，cdc25，cdc25a，cdc25b，cdc2l5，cdk10，cdk4，cdk5，cdk9，cdkl1，cdkn1a，cdkn1b，cdkn1c，cdkn2a，cdkn2b，cdkn2d，cebpg，cenpc1，cgrrf1，chaf1a，cib1，ckmt1，clk1，clk2，clk3，clns1a，cltc，col1a1，col6a3，cox6c，cox7a2，crat，crhr1，csf1r，csk，csnk1g2，ctnna1，ctnnb1，ctps，ctsc，ctsd，cul1，cyr61，dcc，dcn，ddx10，dek，dhcr7，dhrs2，dhx8，dlg3，dvl1，dvl3，e2f1，e2f3，e2f5，egfr，egr1，eif5，epha2，erbb2，erbb3，erbb4，ercc3，etv1，etv3，etv6，f2r，fastk，fbn1，fbn2，fes，fgfr1，fgr，fkbp8，fn1，fos，fosl1，fosl2，foxg1a，foxo1a，frap1，frzb，ftl，fzd2，fzd5，fzd9，g22p1，gas6，gcn5l2，gdf15，gna13，gnas，gnb2，gnb2l1，gpr39，grb2，gsk3a，gspt1，gtf2i，hdac1，hdgf，hmmr，hprt1，hrb，hspa4，hspa5，hspa8，hspb1，hsph1，hyal1，hyou1，icam1，id1，id2，idua，ier3，ifitm1，igf1r，igf2r，igfbp3，igfbp4，igfbp5，il1b，ilk，ing1，irf3，itga3，itga6，itgb4，jak1，jarid1a，jun，junb，jund，k-alpha-1，kit，kitlg，klk10，kpna2，kras2，krt18，krt2a，krt9，lamb1，lamp2，lck，lcn2，lep，litaf，lrpap1，ltf，lyn，lztr1，madh1，map2k2，map3k8，mapk12，mapk13，mapkapk3，mapre1，mars，mas1，mcc，mcm2，mcm4，mdm2，mdm4，met，mgst1，micb，mllt3，mme，mmp1，mmp14，mmp17，mmp2，mnda，msh2，msh6，mt3，myb，mybl1，mybl2，myc，mycl1，mycn，myd88，myl9，mylk，neo1，nf1，nf2，nfkb1，nfkb2，nfsf7，nid，ninj1，nmbr，nme1，nme2，nme3，notch1，notch2，notch4，npm1，nqo1，nr1d1，nr2f1，nr2f6，nras，nrg1，nsep1，osm，pa2g4，pabpc1，pcna，pctk1，pctk2，pctk3，pdgfa，pdgfb，pdgfra，pdpk1，pea15，pfdn4，pfdn5，pgam1，phb，pik3ca，pik3cb，pik3cg，pim1，pkm2，pkmyt1，plk2，ppard，pparg，ppih，ppp1ca，ppp2r5a，prdx2，prdx4，prkar1a，prkcbp1，prnp，prss15，psma1，ptch，pten，ptgs1，ptma，ptn，ptprn，rab5a，rac1，rad50，raf1，ralbp1，rap1a，rara，rarb，rasgrf1，rb1，rbbp4，rbl2，rea，rel，rela，relb，ret，rfc2，rgs19，rhoa，rhob，rhoc，rhod，ripk1，rpn2，rps6kb1，rrm1，sars，selenbp1，sema3c，sema4d，sepp1，serpinh1，sfn，sfpq，sfrs7，shb，shh，siah2，siva，sivatp53，ski，skil，slc16a1，slc1a4，slc20a1，smo，smpd1，snai2，snd1，snrpb2，socs1，socs3，sod1，sort1，spint2，spry2，src，srpx，stat1，stat2，stat3，stat5b，stc1，taf1，tbl3，tbrg4，tcf1，tcf7l2，tfap2c，tfdp1，tfdp2，tgfa，tgfb1，tgfbi，tgfbr2，tgfbr3，thbs1，tie，timp1，timp3，tjp1，tk1，tle1，tnf，tnfrsf10a，tnfrsf10b，tnfrsf1a，tnfrsf1b，tnfrsf6，tnfsf7，tnk1，tob1，tp53，tp53bp2，tp53i3，tp73，tpbg，tpt1，tradd，tram1，trrap，tsg101，tufm，txnrd1，tyro3，ubc，ube2l6，uchl1，usp7，vdac1，vegf，vhl，vil2，wee1，wnt1，wnt2，wnt2b，wnt3，wnt5a，wt1，xrcc1，yes1，ywhab，ywhaz，zap70，和znf9。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含編碼與cns相關(guān)病癥有關(guān)之基因產(chǎn)物的核酸的raav載體。以下是與cns相關(guān)病癥有關(guān)的基因的非限制性列表：與阿爾茨海默病有關(guān)的drd2、gria1、gria2、grin1、slc1a1、syp、syt1、chrna7、3rtau/4rtus、app、bax、bcl-2、grik1、gfap、il-1、ager；與帕金森病有關(guān)的uch-l1、skp1、egln1、nurr-1、bdnf、trkb、gstm1、s106β；與亨廷頓病有關(guān)的it15、prnp、jph3、tbp、atxn1、atxn2、atxn3、atrophin1、ftl、titf-1；與弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)有關(guān)的fxn；與卡納萬病有關(guān)的aspa；與肌營養(yǎng)不良有關(guān)的dmd；以及與脊髓性肌萎縮有關(guān)的smn1、ube1、dync1h1。

raav載體可以包含編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)或功能性rna的核酸作為轉(zhuǎn)基因。以下是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因的非限制性列表，編碼這些基因及其同源物產(chǎn)物的核酸和編碼抑制這些基因及其同源物表達(dá)的小干擾核酸(例如，shrna、mirna)的核酸在本公開內(nèi)容的某些實(shí)施方案中可用作轉(zhuǎn)基因：

rps27a，abl1，akt1，apaf1，bad，bag1，bag3，bag4，bak1，bax，bcl10，bcl2，bcl2a1，bcl2l1，bcl2l10，bcl2l11，bcl2l12，bcl2l13，bcl2l2，bclaf1，bfar，bid，bik，naip，birc2，birc3，xiap，birc5，birc6，birc7，birc8，bnip1，bnip2，bntp3，bnip3l，bok，braf，card10，card11，nlrc4，card14，nod2，nod1，card6，card8，card9，casp1，casp10，casp14，casp2，casp3，casp4，casp5，casp6，casp7，casp8，casp9，cflar，cidea，cideb，cradd，dapk1，dapk2，dffa，dffb，fadd，gadd45a，gdnf，hrk，igf1r，lta，ltbr，mcl1，nol3，pycard，ripk1，ripk2，tnf，tnfrsf10a，tnfrsf10b，tnfrsf10c，tnfrsf10d，tnfrsf11b，tnfrsf12a，tnfrsfl4，tnfrsf19，tnfrsf1a，tnfrsf1b，tnfrsf21，tnfrsf25，cd40，fas，tnfrsf6b，cd27，tnfrsf9，tnfsf10，tnfsf14，tnfsf18，cd40lg，faslg，cd70，tnfsf8，tnfsf9，tp53，tp53bp2，tp73，tp63，tradd，traf1，traf2，traf3，traf4，traf5drd2，gria1，gria2，grin1，slc1a1，syp，syt1，chrna7，3rtau/4rtus，app，bax，bcl-2，grik1，gfap，il-1，ager，uch-l1，skp1，egln1，nurr-1，bdnf，trkb，gstm1，s106β，it15，prnp，jph3，tbp，atxn1，atxn2，atxn3，atrophin1，ftl，titf-1，fxn，aspa，dmd，和smn1，ube1，dync1h1。

技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，在編碼蛋白質(zhì)或多肽的轉(zhuǎn)基因的情況下，可以在轉(zhuǎn)基因中進(jìn)行導(dǎo)致保守氨基酸替換的突變以提供蛋白質(zhì)或多肽的功能上等同的變體或同源物。在一些方面，本公開內(nèi)容包括導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的保守氨基酸替換的序列改變。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含具有顯性負(fù)效突變的基因。例如，轉(zhuǎn)基因可以表達(dá)突變蛋白質(zhì)，其與和野生型蛋白質(zhì)相互作用的相同元件相互作用，從而阻斷野生型蛋白質(zhì)的一些方面的功能。

有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物還包括mirna。mirna和其他小干擾核酸通過靶rna轉(zhuǎn)錄物切割/降解或靶信使rna(mrna)的翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。mirna是天然表達(dá)的，通常作為最終的19至25個(gè)非翻譯的rna產(chǎn)物。mirna通過與靶mrna的3’非翻譯區(qū)(utr)的序列特異性相互作用表現(xiàn)出其活性。這些內(nèi)源性表達(dá)的mirna形成發(fā)夾前體，其隨后被加工成mirna雙鏈體，并進(jìn)一步被加工成“成熟”單鏈mirna分子。這種成熟mirna引導(dǎo)多蛋白復(fù)合物mirisc，所述mirisc根據(jù)它們與成熟mirna的互補(bǔ)性來確定靶mrna的例如在3’utr區(qū)中的靶位點(diǎn)。

在所述方法的某些實(shí)施方案中，mirna基因及其同源物的以下非限制性列表可用作轉(zhuǎn)基因或用作由轉(zhuǎn)基因編碼的小干擾核酸(例如，mirna海綿、反義寡核苷酸、tudrna)的靶標(biāo)：

hsa-let-7a，hsa-let-7a*，hsa-let-7b，hsa-let-7b*，hsa-let-7c，hsa-let-7c*，hsa-let-7d，hsa-let-7d*，hsa-let-7e，hsa-let-7e*，hsa-let-7f，hsa-let-7f-1*，hsa-let-7f-2*，hsa-let-7g，hsa-let-7g*，hsa-let-7i，hsa-let-7i*，hsa-mir-1，hsa-mir-100，hsa-mir-100*，hsa-mir-101，hsa-mir-101*，hsa-mir-103，hsa-mir-105，hsa-mir-105*，hsa-mir-106a，hsa-mir-106a*，hsa-mir-106b，hsa-mir-106b*，hsa-mir-107，hsa-mir-10a，hsa-mir-10a*，hsa-mir-10b，hsa-mir-10b*，hsa-mir-1178，hsa-mir-1179，hsa-mir-1180，hsa-mir-1181，hsa-mir-1182，hsa-mir-1183，hsa-mir-1184，hsa-mir-1185，hsa-mir-1197，hsa-mir-1200，hsa-mir-1201，hsa-mir-1202，hsa-mir-1203，hsa-mir-1204，hsa-mir-1205，hsa-mir-1206，hsa-mir-1207-3p，hsa-mir-1207-5p，hsa-mir-1208，hsa-mir-122，hsa-mir-122*，hsa-mir-1224-3p，hsa-mir-1224-5p，hsa-mir-1225-3p，hsa-mir-1225-5p，hsa-mir-1226，hsa-mir-1226*，hsa-mir-1227，hsa-mir-1228，hsa-mir-1228*，hsa-mir-1229，hsa-mir-1231，hsa-mir-1233，hsa-mir-1234，hsa-mir-1236，hsa-mir-1237，hsa-mir-1238，hsa-mir-124，hsa-mir-124*，hsa-mir-1243，hsa-mir-1244，hsa-mir-1245，hsa-mir-1246，hsa-mir-1247，hsa-mir-1248，hsa-mir-1249，hsa-mir-1250，hsa-mir-1251，hsa-mir-1252，hsa-mir-l253，hsa-mir-1254，hsa-mir-1255a，hsa-mir-1255b，hsa-mir-1256，hsa-mir-1257，hsa-mir-1258，hsa-mir-1259，hsa-mir-125a-3p，hsa-mir-125a-5p，hsa-mir-125b，hsa-mir-125b-1*，hsa-mir-125b-2*，hsa-mir-126，hsa-mir-126*，hsa-mir-1260，hsa-mir-1261，hsa-mir-1262，hsa-mir-1263，hsa-mir-1264，hsa-mir-1265，hsa-mir-1266，hsa-mir-1267，hsa-mir-1268，hsa-mir-1269，hsa-mir-1270，hsa-mir-1271，hsa-mir-1272，hsa-mir-1273，hsa-mir-127-3p，hsa-mir-1274a，hsa-mir-1274b，hsa-mir-1275，hsa-mir-127-5p，hsa-mir-1276，hsa-mir-1277，hsa-mir-1278，hsa-mir-1279，hsa-mir-128，hsa-mir-1280，hsa-mir-1281，hsa-mir-1282，hsa-mir-1283，hsa-mir-1284，hsa-mir-1285，hsa-mir-1286，hsa-mir-1287，hsa-mir-1288，hsa-mir-1289，hsa-mir-129*，hsa-mir-1290，hsa-mir-1291，hsa-mir-1292，hsa-mir-1293，hsa-mir-129-3p，hsa-mir-1294，hsa-mir-1295，hsa-mir-129-5p，hsa-mir-1296，hsa-mir-1297，hsa-mir-1298，hsa-mir-1299，hsa-mir-1300，hsa-mir-1301，hsa-mir-1302，hsa-mir-1303，hsa-mir-1304，hsa-mir-1305，hsa-mir-1306，hsa-mir-1307，hsa-mir-1308，hsa-mir-130a，hsa-mir-130a*，hsa-mir-130b，hsa-mir-130b*，hsa-mir-132，hsa-mir-132*，hsa-mir-1321，hsa-mir-1322，hsa-mir-1323，hsa-mir-1324，hsa-mir-133a，hsa-mir-133b，hsa-mir-134，hsa-mir-135a，hsa-mir-135a*，hsa-mir-135b，hsa-mir-135b*，hsa-mir-136，hsa-mir-136*，hsa-mir-137，hsa-mir-138，hsa-mir-138-1*，hsa-mir-138-2*，hsa-mir-139-3p，hsa-mir-139-5p，hsa-mir-140-3p，hsa-mir-140-5p，hsa-mir-141，hsa-mir-141*，hsa-mir-142-3p，hsa-mir-142-5p，hsa-mir-143，hsa-mir-143*，hsa-mir-144，hsa-mir-144*，hsa-mir-145，hsa-mir-145*，hsa-mir-146a，hsa-mir-146a*，hsa-mir-146b-3p，hsa-mir-146b-5p，hsa-mir-147，hsa-mir-147b，hsa-mir-148a，hsa-mir-148a*，hsa-mir-148b，hsa-mir-148b*，hsa-mir-149，hsa-mir-149*，hsa-mir-150，hsa-mir-150*，hsa-mir-151-3p，hsa-mir-151-5p，hsa-mir-152，hsa-mir-153，hsa-mir-154，hsa-mir-154*，hsa-mir-155，hsa-mir-155*，hsa-mir-15a，hsa-mir-15a*，hsa-mir-15b，hsa-mir-15b*，hsa-mir-16，hsa-mir-16-1*，hsa-mir-16-2*，hsa-mir-17，hsa-mir-17*，hsa-mir-181a，hsa-mir-181a*，hsa-mir-181a-2*，hsa-mir-181b，hsa-mir-181c，hsa-mir-181c*，hsa-mir-181d，hsa-mir-182，hsa-mir-182*，hsa-mir-1825，hsa-mir-1826，hsa-mir-1827，hsa-mir-183，hsa-mir-183*，hsa-mir-184，hsa-mir-185，hsa-mir-185*，hsa-mir-186，hsa-mir-186*，hsa-mir-187，hsa-mir-187*，hsa-mir-188-3p，hsa-mir-188-5p，hsa-mir-18a，hsa-mir-18a*，hsa-mir-18b，hsa-mir-18b*，hsa-mir-190，hsa-mir-190b，hsa-mir-191，hsa-mir-191*，hsa-mir-192，hsa-mir-192*，hsa-mir-193a-3p，hsa-mir-193a-5p，hsa-mir-193b，hsa-mir-193b*，hsa-mir-194，hsa-mir-194*，hsa-mir-195，hsa-mir-195*，hsa-mir-196a，hsa-mir-196a*，hsa-mir-196b，hsa-mir-197，hsa-mir-198，hsa-mir-199a-3p，hsa-mir-199a-5p，hsa-mir-199b-5p，hsa-mir-19a，hsa-mir-19a*，hsa-mir-19b，hsa-mir-19b-1*，hsa-mir-19b-2*，hsa-mir-200a，hsa-mir-200a*，hsa-mir-200b，hsa-mir-200b*，hsa-mir-200c，hsa-mir-200c*，hsa-mir-202，hsa-mir-202*，hsa-mir-203，hsa-mir-204，hsa-mir-205，hsa-mir-206，hsa-mir-208a，hsa-mir-208b，hsa-mir-20a，hsa-mir-20a*，hsa-mir-20b，hsa-mir-20b*，hsa-mir-21，hsa-mir-21*，hsa-mir-210，hsa-mir-211，hsa-mir-212，hsa-mir-214，hsa-mir-214*，hsa-mir-215，hsa-mir-216a，hsa-mir-216b，hsa-mir-217，hsa-mir-218，hsa-mir-218-1*，hsa-mir-218-2*，hsa-mir-219-1-3p，hsa-mir-219-2-3p，hsa-mir-219-5p，hsa-mir-22，hsa-mir-22*，hsa-mir-220a，hsa-mir-220b，hsa-mir-220c，hsa-mir-221，hsa-mir-221*，hsa-mir-222，hsa-mir-222*，hsa-mir-223，hsa-mir-223*，hsa-mir-224，hsa-mir-23a，hsa-mir-23a*，hsa-mir-23b，hsa-mir-23b*，hsa-mir-24，hsa-mir-24-1*，hsa-mir-24-2*，hsa-mir-25，hsa-mir-25*，hsa-mir-26a，hsa-mir-26a-1*，hsa-mir-26a-2*，hsa-mir-26b，hsa-mir-26b*，hsa-mir-27a，hsa-mir-27a*，hsa-mir-27b，hsa-mir-27b*，hsa-mir-28-3p，hsa-mir-28-5p，hsa-mir-296-3p，hsa-mir-296-5p，hsa-mir-297，hsa-mir-298，hsa-mir-299-3p，hsa-mir-299-5p，hsa-mir-29a，hsa-mir-29a*，hsa-mir-29b，hsa-mir-29b-1*，hsa-mir-29b-2*，hsa-mir-29c，hsa-mir-29c*，hsa-mir-300，hsa-mir-301a，hsa-mir-301b，hsa-mir-302a，hsa-mir-302a*，hsa-mir-302b，hsa-mir-302b*，hsa-mir-302c，hsa-mir-302c*，hsa-mir-302d，hsa-mir-302d*，hsa-mir-302e，hsa-mir-302f，hsa-mir-30a，hsa-mir-30a*，hsa-mir-30b，hsa-mir-30b*，hsa-mir-30c，hsa-mir-30c-1*，hsa-mir-30c-2*，hsa-mir-30d，hsa-mir-30d*，hsa-mir-30e，hsa-mir-30e*，hsa-mir-31，hsa-mir-31*，hsa-mir-32，hsa-mir-32*，hsa-mir-320a，hsa-mir-320b，hsa-mir-320c，hsa-mir-320d，hsa-mir-323-3p，hsa-mir-323-5p，hsa-mir-324-3p，hsa-mir-324-5p，hsa-mir-325，hsa-mir-326，hsa-mir-328，hsa-mir-329，hsa-mir-330-3p，hsa-mir-330-5p，hsa-mir-331-3p，hsa-mir-331-5p，hsa-mir-335，hsa-mir-335*，hsa-mir-337-3p，hsa-mir-337-5p，hsa-mir-338-3p，hsa-mir-338-5p，hsa-mir-339-3p，hsa-mir-339-5p，hsa-mir-33a，hsa-mir-33a*，hsa-mir-33b，hsa-mir-33b*，hsa-mir-340，hsa-mir-340*，hsa-mir-342-3p，hsa-mir-342-5p，hsa-mir-345，hsa-mir-346，hsa-mir-34a，hsa-mir-34a*，hsa-mir-34b，hsa-mir-34b*，hsa-mir-34c-3p，hsa-mir-34c-5p，hsa-mir-361-3p，hsa-mir-361-5p，hsa-mir-362-3p，hsa-mir-362-5p，hsa-mir-363，hsa-mir-363*，hsa-mir-365，hsa-mir-367，hsa-mir-367*，hsa-mir-369-3p，hsa-mir-369-5p，hsa-mir-370，hsa-mir-371-3p，hsa-mir-371-5p，hsa-mir-372，hsa-mir-373，hsa-mir-373*，hsa-mir-374a，hsa-mir-374a*，hsa-mir-374b，hsa-mir-374b*，hsa-mir-375，hsa-mir-376a，hsa-mir-376a*，hsa-mir-376b，hsa-mir-376c，hsa-mir-377，hsa-mir-377*，hsa-mir-378，hsa-mir-378*，hsa-mir-379，hsa-mir-379*，hsa-mir-380，hsa-mir-380*，hsa-mir-381，hsa-mir-382，hsa-mir-383，hsa-mir-384，hsa-mir-409-3p，hsa-mir-409-5p，hsa-mir-410，hsa-mir-411，hsa-mir-411*，hsa-mir-412，hsa-mir-421，hsa-mir-422a，hsa-mir-423-3p，hsa-mir-423-5p，hsa-mir-424，hsa-mir-424*，hsa-mir-425，hsa-mir-425*，hsa-mir-429，hsa-mir-431，hsa-mir-431*，hsa-mir-432，hsa-mir-432*，hsa-mir-433，hsa-mir-448，hsa-mir-449a，hsa-mir-449b，hsa-mir-450a，hsa-mir-450b-3p，hsa-mir-450b-5p，hsa-mir-451，hsa-mir-452，hsa-mir-452*，hsa-mir-453，hsa-mir-454，hsa-mir-454*，hsa-mir-455-3p，hsa-mir-455-5p，hsa-mir-483-3p，hsa-mir-483-5p，hsa-mir-484，hsa-mir-485-3p，hsa-mir-485-5p，hsa-mir-486-3p，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-487a，hsa-mir-487b，hsa-mir-488，hsa-mir-488*，hsa-mir-489，hsa-mir-490-3p，hsa-mir-490-5p，hsa-mir-491-3p，hsa-mir-491-5p，hsa-mir-492，hsa-mir-493，hsa-mir-493*，hsa-mir-494，hsa-mir-495，hsa-mir-496，hsa-mir-497，hsa-mir-497*，hsa-mir-498，hsa-mir-499-3p，hsa-mir-499-5p，hsa-mir-500，hsa-mir-500*，hsa-mir-501-3p，hsa-mir-501-5p，hsa-mir-502-3p，hsa-mir-502-5p，hsa-mir-503，hsa-mir-504，hsa-mir-505，hsa-mir-505*，hsa-mir-506，hsa-mir-507，hsa-mir-508-3p，hsa-mir-508-5p，hsa-mir-509-3-5p，hsa-mir-509-3p，hsa-mir-509-5p，hsa-mir-510，hsa-mir-511，hsa-mir-512-3p，hsa-mir-512-5p，hsa-mir-513a-3p，hsa-mir-513a-5p，hsa-mir-513b，hsa-mir-513c，hsa-mir-514，hsa-mir-515-3p，hsa-mir-515-5p，hsa-mir-516a-3p，hsa-mir-516a-5p，hsa-mir-516b，hsa-mir-517*，hsa-mir-517a，hsa-mir-517b，hsa-mir-517c，hsa-mir-518a-3p，hsa-mir-518a-5p，hsa-mir-518b，hsa-mir-518c，hsa-mir-518c*，hsa-mir-518d-3p，hsa-mir-518d-5p，hsa-mir-518e，hsa-mir-518e*，hsa-mir-518f，hsa-mir-518f*，hsa-mir-519a，hsa-mir-519b-3p，hsa-mir-519c-3p，hsa-mir-519d，hsa-mir-519e，hsa-mir-519e*，hsa-mir-520a-3p，hsa-mir-520a-5p，hsa-mir-520b，hsa-mir-520c-3p，hsa-mir-520d-3p，hsa-mir-520d-5p，hsa-mir-520e，hsa-mir-520f，hsa-mir-520g，hsa-mir-520h，hsa-mir-521，hsa-mir-522，hsa-mir-523，hsa-mir-524-3p，hsa-mir-524-5p，hsa-mir-525-3p，hsa-mir-525-5p，hsa-mir-526b，hsa-mir-526b*，hsa-mir-532-3p，hsa-mir-532-5p，hsa-mir-539，hsa-mir-541，hsa-mir-541*，hsa-mir-542-3p，hsa-mir-542-5p，hsa-mir-543，bsa-mir-544，hsa-mir-545，hsa-mir-545*，hsa-mir-548a-3p，hsa-mir-548a-5p，hsa-mir-548b-3p，hsa-mir-548b-5p，hsa-mir-548c-3p，hsa-mir-548c-5p，hsa-mir-548d-3p，hsa-mir-548d-5p，hsa-mir-548e，hsa-mir-548f，hsa-mir-548g，hsa-mir-548h，hsa-mir-548i，hsa-mir-548j，hsa-mir-548k，hsa-mir-5481，hsa-mir-548m，hsa-mir-548n，hsa-mir-548o，hsa-mir-548p，hsa-mir-549，hsa-mir-550，hsa-mir-550*，hsa-mir-551a，hsa-mir-551b，hsa-mir-551b*，hsa-mir-552，hsa-mir-553，hsa-mir-554，hsa-mir-555，hsa-mir-556-3p，hsa-mir-556-5p，hsa-mir-557，hsa-mir-558，hsa-mir-559，hsa-mir-561，hsa-mir-562，hsa-mir-563，hsa-mir-564，hsa-mir-566，hsa-mir-567，hsa-mir-568，hsa-mir-569，hsa-mir-570，hsa-mir-571，hsa-mir-572，hsa-mir-573，hsa-mir-574-3p，hsa-mir-574-5p，hsa-mir-575，hsa-mir-576-3p，hsa-mir-576-5p，hsa-mir-577，hsa-mir-578，hsa-mir-579，hsa-mir-580，hsa-mir-581，hsa-mir-582-3p，hsa-mir-582-5p，hsa-mir-583，hsa-mir-584，hsa-mir-585，hsa-mir-586，hsa-mir-587，hsa-mir-588，hsa-mir-589，hsa-mir-589*，hsa-mir-590-3p，hsa-mir-590-5p，hsa-mir-591，hsa-mir-592，hsa-mir-593，hsa-mir-593*，hsa-mir-595，hsa-mir-596，hsa-mir-597，hsa-mir-598，hsa-mir-599，hsa-mir-600，hsa-mir-601，hsa-mir-602，hsa-mir-603，hsa-mir-604，hsa-mir-605，hsa-mir-606，hsa-mir-607，hsa-mir-608，hsa-mir-609，hsa-mir-610，hsa-mir-611，hsa-mir-612，hsa-mir-613，hsa-mir-614，hsa-mir-615-3p，hsa-mir-615-5p，hsa-mir-616，hsa-mir-616*，hsa-mir-617，hsa-mir-618，hsa-mir-619，hsa-mir-620，hsa-mir-621，hsa-mir-622，hsa-mir-623，hsa-mir-624，hsa-mir-624*，hsa-mir-625，hsa-mir-625*，hsa-mir-626，hsa-mir-627，hsa-mir-628-3p，hsa-mir-628-5p，hsa-mir-629，hsa-mir-629*，hsa-mir-630，hsa-mir-631，hsa-mir-632，hsa-mir-633，hsa-mir-634，hsa-mir-635，hsa-mir-636，hsa-mir-637，hsa-mir-638，hsa-mir-639，hsa-mir-640，hsa-mir-641，hsa-mir-642，hsa-mir-643，hsa-mir-644，hsa-mir-645，hsa-mir-646，hsa-mir-647，hsa-mir-648，hsa-mir-649，hsa-mir-650，hsa-mir-651，hsa-mir-652，hsa-mir-653，hsa-mir-654-3p，hsa-mir-654-5p，hsa-mir-655，hsa-mir-656，hsa-mir-657，hsa-mir-658，hsa-mir-659，hsa-mir-660，hsa-mir-661，hsa-mir-662，hsa-mir-663，hsa-mir-663b，hsa-mir-664，hsa-mir-664*，hsa-mir-665，hsa-mir-668，hsa-mir-671-3p，hsa-mir-671-5p，hsa-mir-675，hsa-mir-7，hsa-mir-708，hsa-mir-708*，hsa-mir-7-1*，hsa-mir-7-2*，hsa-mir-720，hsa-mir-744，hsa-mir-744*，hsa-mir-758，hsa-mir-760，hsa-mir-765，hsa-mir-766，hsa-mir-767-3p，hsa-mir-767-5p，hsa-mir-768-3p，hsa-mir-768-5p，hsa-mir-769-3p，hsa-mir-769-5p，hsa-mir-770-5p，hsa-mir-802，hsa-mir-873，hsa-mir-874，hsa-mir-875-3p，hsa-mir-875-5p，hsa-mir-876-3p，hsa-mir-876-5p，hsa-mir-877，hsa-mir-877*，hsa-mir-885-3p，hsa-mir-885-5p，hsa-mir-886-3p，hsa-mir-886-5p，hsa-mir-887，hsa-mir-888，hsa-mir-888*，hsa-mir-889，hsa-mir-890，hsa-mir-891a，hsa-mir-891b，hsa-mir-892a，hsa-mir-892b，hsa-mir-9，hsa-mir-9*，hsa-mir-920，hsa-mir-921，hsa-mir-922，hsa-mir-923，hsa-mir-924，hsa-mir-92a，hsa-mir-92a-1*，hsa-mir-92a-2*，hsa-mir-92b，hsa-mir-92b*，hsa-mir-93，hsa-mir-93*，hsa-mir-933，hsa-mir-934，hsa-mir-935，hsa-mir-936，hsa-mir-937，hsa-mir-938，hsa-mir-939，hsa-mir-940，hsa-mir-941，hsa-mir-942，hsa-mir-943，hsa-mir-944，hsa-mir-95，hsa-mir-96，hsa-mir-96*，hsa-mir-98，hsa-mir-99a，hsa-mir-99a*，hsa-mir-99b，和hsa-mir-99b*。

mirna抑制其靶向的mrna的功能，其結(jié)果是抑制由mrna編碼的多肽的表達(dá)。因此，(部分或全部)阻斷mirna的活性(例如，使mirna沉默)可以有效誘導(dǎo)或恢復(fù)表達(dá)受到抑制的多肽的表達(dá)(使多肽去阻抑)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由多種方法中的任一種通過抑制細(xì)胞中的mirna活性來實(shí)現(xiàn)mirna對(duì)mrna靶標(biāo)編碼的多肽的去阻抑。例如，可以通過與和mirna互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的小干擾核酸(例如，反義寡核苷酸、mirna海綿、tudrna)雜交來實(shí)現(xiàn)阻斷mirna的活性，從而阻斷mirna與其靶mrna的相互作用。如本文使用的與mirna基本上互補(bǔ)的小干擾核酸是能夠與mirna雜交并阻斷mirna活性的核酸。在一些實(shí)施方案中，與mirna基本上互補(bǔ)的小干擾核酸是在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)堿基處與mirna互補(bǔ)的小干擾核酸。在一些實(shí)施方案中，與mirna基本上互補(bǔ)的小干擾核酸序列是在至少一個(gè)堿基處與mirna互補(bǔ)的小干擾核酸序列。

“mirna抑制劑”是阻斷mirna功能、表達(dá)和/或加工的試劑。例如，這些分子包括但不限于抑制mirna與drosha復(fù)合物相互作用的microrna特異性反義、microrna海綿、toughdecoyrna(tudrna)和microrna寡核苷酸(雙鏈、發(fā)夾、短寡核苷酸)。如上所述，microrna抑制劑可以由raav載體的轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中表達(dá)。microrna海綿通過互補(bǔ)的七聚體種子序列特異性抑制mirna(ebert，m.s.naturemethods，epub，2007年8月12日；)。在一些實(shí)施方案中，可以使用單個(gè)海綿序列使整個(gè)mirna家族沉默。tudrna在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)特定mirna的有效和長期抑制(參見例如takeshiharaguchi等，nucleicacidsresearch，2009，第37卷，第6期，e43，其涉及tudrna的內(nèi)容通過引用并入本文)。用于使細(xì)胞中mirna功能沉默(mirna靶標(biāo)的去阻抑)的其他方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯然的。

在一些實(shí)施方案中，重組rna載體的克隆能力可能受到限制，并且所期望的編碼序列可能需要完全替換病毒的4.8千堿基基因組。因此，在某些情況下，大基因可能不適合用于標(biāo)準(zhǔn)重組aav載體。技術(shù)人員將理解，在本領(lǐng)域中一些選擇可用于克服有限的編碼能力。例如，兩個(gè)基因組的aavitr可以退火以形成頭尾多聯(lián)體，幾乎使載體的能力加倍。插入剪接位點(diǎn)允許從轉(zhuǎn)錄物中移除itr。用于克服有限的克隆能力的其他選擇對(duì)于技術(shù)人員將是顯然的。

使用基于raav的基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

本公開內(nèi)容還涉及使用基于重組腺相關(guān)病毒(raav)的方法產(chǎn)生疾病的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。該方法至少部分地基于如下觀察：aav血清型及其變體在成年動(dòng)物中以組織特異性方式介導(dǎo)有效且穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移。將raav元件(衣殼、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物)組合從而實(shí)現(xiàn)以時(shí)間和組織特異性方式表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。通過本公開內(nèi)容的方法產(chǎn)生的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作人疾病、病理狀態(tài)的有用模型和/或用于表征功能(例如，組織特異性、疾病作用)未知或未完全理解的基因的作用。例如，可用包含具有特定組織靶向能力(例如，肝、心、胰)的衣殼和具有驅(qū)動(dòng)疾病涉及的基因表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因的raav，使動(dòng)物(例如，小鼠)在不同發(fā)育階段(例如，年齡)感染。感染后，raav感染靶組織的不同細(xì)胞并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)的序列進(jìn)行修飾。該修飾可以改變由轉(zhuǎn)基因編碼的產(chǎn)物的功能。然后可使用本文公開的方法通過產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在體內(nèi)研究修飾的作用。在一些實(shí)施方案中，編碼區(qū)序列的修飾是得到片段(例如，截短形式)的無義突變。在另一些情況下，修飾是導(dǎo)致氨基酸替換的錯(cuò)義突變。其他修飾是可能的并且對(duì)于技術(shù)人員將是顯然的。

在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因?qū)е虏±頎顟B(tài)。導(dǎo)致病理狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因是其產(chǎn)物在疾病或病癥中發(fā)揮作用(例如，引起疾病或病癥、使動(dòng)物易患疾病或病癥)和/或可在動(dòng)物中誘導(dǎo)疾病或病癥的基因。然后可以觀察動(dòng)物以評(píng)估疾病的許多方面(例如，進(jìn)展、對(duì)治療的應(yīng)答等)。這些實(shí)例并不意在限制，本文公開了其他一些方面和實(shí)例并且在以下對(duì)其進(jìn)行更詳細(xì)地描述。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了用于通過靶向破壞特定細(xì)胞類型來產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法。例如，1型糖尿病模型可通過靶向破壞胰β島來產(chǎn)生。在另一些實(shí)例中，靶向破壞特定細(xì)胞類型可用于評(píng)估特定細(xì)胞類型對(duì)人疾病的作用。在這方面，編碼細(xì)胞毒素(例如，白喉毒素a(diphtheriatoxina，dta))的轉(zhuǎn)基因或促凋亡基因(ntr、box等)可用作特定細(xì)胞類型的功能性消融的轉(zhuǎn)基因。其他示例性轉(zhuǎn)基因(其產(chǎn)物殺傷細(xì)胞)包括在本文公開的方法中并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法，以研究基因過表達(dá)或敲低的長期影響。特定靶組織中基因的長期過表達(dá)或敲低(例如，通過shrna、mirna、mirna抑制劑等)可干擾正常的代謝平衡并建立病理狀態(tài)，從而產(chǎn)生疾病(如癌癥)的動(dòng)物模型。在一些方面，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法，以研究潛在致癌基因和其他基因的基因過表達(dá)或敲低的長期影響，從而研究靶組織中的腫瘤發(fā)生和基因功能。有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括已知與癌癥有關(guān)的蛋白質(zhì)和抑制這樣的蛋白質(zhì)的表達(dá)小干擾核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇其他合適的轉(zhuǎn)基因，只要它們可用于產(chǎn)生組織特異性病理狀態(tài)和/或疾病的動(dòng)物模型。

重組aav施用方法

可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法將raav以組合物遞送至對(duì)象?？梢詫aav(優(yōu)選懸浮于生理相容的載體中(例如，以組合物))施用于對(duì)象，例如，宿主動(dòng)物，例如人、小鼠、大鼠、貓、狗、綿羊、兔、馬、牛、山羊、豬、豚鼠、倉鼠、雞、火雞或非人靈長類(例如，獼猴)。在一些實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物不包括人。

將raav遞送至哺乳動(dòng)物對(duì)象的操作可以通過例如肌內(nèi)注射或通過施用到哺乳動(dòng)物對(duì)象的血流中來進(jìn)行?？梢酝ㄟ^注射到靜脈、動(dòng)脈或任何其他血管導(dǎo)管中來施用到血流中。在一些實(shí)施方案中，將raav通過分離肢體灌注(外科手術(shù)領(lǐng)域中公知的一種技術(shù))施用到血流中，該方法基本上使得技術(shù)人員能夠在施用raav病毒體之前將肢體與體循環(huán)分離。技術(shù)人員也可以使用分離肢體灌注技術(shù)的變體(描述于美國專利no.6,177,403中)將病毒體施用到分離肢體的脈管系統(tǒng)中以潛在地增強(qiáng)向肌肉細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，在某些情況下，可能期望將病毒體遞送至對(duì)象的cns。“cns”意指脊椎動(dòng)物的腦和脊髓的所有細(xì)胞和組織。因此，該術(shù)語包括但不限于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦脊液(csf)、胞間隙、骨、軟骨等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的神經(jīng)外科技術(shù)(例如，通過立體定向注射)通過用針、導(dǎo)管或相關(guān)裝置注射到例如心室區(qū)域以及注射到紋狀體(例如，紋狀體的尾狀核或殼核)、脊髓和神經(jīng)肌肉接頭或小腦小葉中，從而將重組aav直接遞送至cns或腦(參見例如stein等，jvirol73：3424-3429，1999；davidson等，pnas97：3428-3432，2000；davidson等，nat.genet.3：219-223，1993；以及alisky和davidson，hum.genether.11：2315-2329，2000)。

本公開內(nèi)容的組合物可以僅包含raav或者與一種或更多種其他病毒組合(例如，編碼具有一種或更多種不同轉(zhuǎn)基因的第二raav)。在一些實(shí)施方案中，組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的raav，其各自具有一種或更多種不同的轉(zhuǎn)基因。

考慮到raav所針對(duì)的目標(biāo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇合適的載體。例如，一種合適的載體包括鹽水，其可以用多種緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)進(jìn)行配制。其他示例性載體包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。載體的選擇不是本公開內(nèi)容的限制。

任選地，本公開內(nèi)容的組合物除raav和載體之外還可以包含其他常規(guī)藥物成分，例如防腐劑或化學(xué)穩(wěn)定劑。合適的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和對(duì)氯苯酚。合適的化學(xué)穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。

以足夠的量施用raav以轉(zhuǎn)染期望組織的細(xì)胞，并提供足夠的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)水平而沒有過度的不良作用。常規(guī)和藥學(xué)上可接受的施用途徑包括但不限于直接遞送至選定器官(例如，經(jīng)門靜脈遞送至肝)、經(jīng)口、吸入(包括鼻內(nèi)和氣管內(nèi)遞送)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)和其他親本施用途徑。如果需要的話，則可以組合施用途徑。

實(shí)現(xiàn)特定“治療效果”所需的raav病毒體的劑量(例如，基因組拷貝/每千克體重(gc/kg)的劑量單位)將根據(jù)多個(gè)因素而變化，包括但不限于：raav病毒體施用途徑、達(dá)到治療效果所需的基因或rna表達(dá)水平、被治療的特定疾病或病癥以及基因或rna產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述因素以及本領(lǐng)域公知的其他因素容易地確定用于治療患有特定疾病或病癥的患者的raav病毒體劑量范圍。

raav的有效量是足以靶向感染動(dòng)物、靶向期望組織的量。在一些實(shí)施方案中，raav的有效量是足以產(chǎn)生穩(wěn)定的體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的量。有效量將主要取決于例如對(duì)象的物種、年齡、重量、健康和待靶向的組織的因素，因此可以在動(dòng)物和組織之間變化。例如，raav的有效量一般是包含約10⁹至10¹⁶個(gè)基因組拷貝的約1ml至約100ml的溶液。在一些實(shí)施方案中，以每個(gè)對(duì)象10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵個(gè)基因組拷貝的劑量施用raav。在一些實(shí)施方案中，以每kg10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴個(gè)基因組拷貝的劑量施用raav。在一些情況下，約10¹¹至10¹²個(gè)raav基因組拷貝的劑量是合適的。在某些實(shí)施方案中，10¹²個(gè)raav基因組拷貝對(duì)靶向心臟、肝和胰組織是有效的。在一些情況下，通過多劑量的raav產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

在一些實(shí)施方案中，特別是在存在高raav濃度(例如，約10¹³gc/ml或更高)的情況下，將raav組合物配制成減少組合物中aav顆粒的聚集。用于減少raav聚集的方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括例如添加表面活性劑、調(diào)節(jié)ph、調(diào)節(jié)鹽濃度等(參見例如wrightfr等，moleculartherapy(2005)12，171-178，其內(nèi)容通過引用并入本文)。

可藥用賦形劑和載體溶液的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，用于在多種治療方案中使用本文所述的特定組合物的合適給藥和治療方案的開發(fā)也是如此。

通常，這些制劑可以包含至少約0.1％或更多的活性化合物，盡管活性成分的百分比當(dāng)然可以變化并且可以方便地為總制劑的重量或體積的約1％或2％至約70％或80％或更高。自然地，每種治療上有用的組合物中的活性化合物的量可以以這樣的方式準(zhǔn)備，以使得在任何給定單位劑量的化合物中將獲得合適的劑量。制備這樣的藥物制劑的技術(shù)人員將考慮例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途徑、產(chǎn)品保質(zhì)期以及其他藥理學(xué)考慮因素，因此，多種劑量和治療方案可能是期望的。

在某些情況下，期望經(jīng)皮下、胰內(nèi)、鼻內(nèi)、腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或經(jīng)口、腹膜內(nèi)或通過吸入遞送本文公開的經(jīng)適當(dāng)配制的藥物組合物中的基于raav的治療性構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，如美國專利no.5,543,158、5,641,515和5,399,363(各自明確地通過引用整體并入本文)中所述的施用形式可用于遞送raav。在一些實(shí)施方案中，一種優(yōu)選的施用方式是通過門靜脈注射。

適用于可注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散體和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。分散體也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物中以及在油中制備。在普通儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。在許多情況下，所述形式為無菌的并且流動(dòng)性達(dá)到容易注射的程度。其在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須被保藏以免受微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。預(yù)防微生物的作用可通過多種抗菌劑和抗真菌劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實(shí)現(xiàn)。在許多情況下，優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來實(shí)現(xiàn)。

對(duì)于施用可注射水溶液，例如，如果需要的話，溶液可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行緩沖，并且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。在這一點(diǎn)上，可使用的無菌水性介質(zhì)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，一個(gè)劑量可以溶解在1ml等滲nacl溶液中，并且被添加到1000ml的皮下灌注流體中或者在建議的輸注部位處注射(參見例如，“remington′spharmaceuticalsciences”第15版，第1035至1038頁和第1570至1580頁)。一些劑量變化必然會(huì)根據(jù)宿主的情況而發(fā)生。無論如何，負(fù)責(zé)施用的人將確定單個(gè)宿主的合適劑量。

無菌可注射溶液通過如下制備：將所需量的活性raav與本文列舉的多種其他成分(根據(jù)需要)并入合適的溶劑中，隨后過濾滅菌。通常，通過將多種無菌活性成分并入無菌載劑中來制備分散體，所述無菌載劑包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上述列舉的那些的所需其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)由其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分與任何另外的所期望成分的粉末。

本文公開的raav組合物也可以被配制成中性或鹽形式?？伤幱名}包括與無機(jī)酸(例如，鹽酸或磷酸)或者如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等這樣的有機(jī)酸形成的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿，例如，鈉、鉀、銨、鈣或鐵氫氧化物，以及例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等的有機(jī)堿。配制后，將以與劑量制劑相容的方式并且以治療有效的量施用溶液。所述制劑易于以多種劑型(例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等)施用。

如本文使用的“載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、載劑、包衣、稀釋劑、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。這樣的介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。也可以將補(bǔ)充的活性成分并入組合物中。術(shù)語“可藥用”是指當(dāng)施用于宿主時(shí)不產(chǎn)生變應(yīng)或類似不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。

遞送載劑(例如脂質(zhì)體、納米膠囊、微粒、微球、脂質(zhì)顆粒、囊泡等)可用于將本公開內(nèi)容的組合物引入合適的宿主細(xì)胞中。特別地，raav載體遞送的轉(zhuǎn)基因可以被配制成用于包封在脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球或納米顆粒等中遞送。

這樣的制劑對(duì)于引入本文公開的核酸或raav構(gòu)建體的可藥用制劑可以是優(yōu)選的。脂質(zhì)體的形成和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。近來，開發(fā)了具有改善的血清穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期的脂質(zhì)體(美國專利no.5,741,516)。此外，已經(jīng)描述了將脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制劑作為潛在藥物載體的多種方法(美國專利no.5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

已成功地將脂質(zhì)體用于許多細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型通常對(duì)通過其他方法的轉(zhuǎn)染具有抵抗力。此外，脂質(zhì)體不受dna長度限制(其是基于病毒的遞送系統(tǒng)的特征)。已將脂質(zhì)體有效地用于將基因、藥物、放射治療劑、病毒、轉(zhuǎn)錄因子和變構(gòu)效應(yīng)物引入多種經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞系和動(dòng)物中。此外，已經(jīng)完成了檢查脂質(zhì)體介導(dǎo)藥物遞送的有效性的若干次成功的臨床試驗(yàn)。

脂質(zhì)體由分散在水性介質(zhì)中并自發(fā)形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡(mlv))的磷脂形成。mlv的直徑一般為25nm至4μm。mlv的超聲處理導(dǎo)致形成直徑為200至500.ang.的在核心中包含水溶液的小單層囊泡(smallunilamellarvesicle，suv)。

或者，可以使用raav的納米膠囊制劑。納米膠囊通常可以以穩(wěn)定和可重復(fù)的方式捕獲物質(zhì)。為了避免由于細(xì)胞內(nèi)聚合物過載引起的副作用，應(yīng)使用能夠在體內(nèi)降解的聚合物來設(shè)計(jì)這樣的超微顆粒(尺寸約0.1μm)。預(yù)期使用滿足這些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒。

除了上述遞送方法之外，還預(yù)期將以下技術(shù)作為將raav組合物遞送至宿主的替代方法。在美國專利no.5,656,016中已使用和描述了將超聲促滲(sonophoresis)(即，超聲)作為用于提高藥物滲入并通過循環(huán)系統(tǒng)的速率和功效的裝置。預(yù)期其他藥物遞送替代方案是骨內(nèi)注射(美國專利no.5,779,708)、微芯片裝置(美國專利no.5,797,898)、眼用制劑(bourlais等，1998)、透皮基質(zhì)(美國專利no.5,770,219和5,783,208)和反饋控制遞送(美國專利no.5,697,899)。

試劑盒和相關(guān)組合物

在一些實(shí)施方案中，本文所述的藥劑可被組裝成藥物或診斷或研究試劑盒以促進(jìn)其在治療、診斷或研究應(yīng)用中的使用。試劑盒可以包含容納有本公開內(nèi)容的組分的一個(gè)或更多個(gè)容器和使用說明書。具體地，這樣的試劑盒可以包含本文所述的一種或更多種藥劑以及描述這些藥劑的預(yù)期應(yīng)用和適當(dāng)用途的說明書。在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的藥劑可以是適用于特定應(yīng)用和適用于藥劑施用方法的藥物制劑和劑量。用于研究目的的試劑盒可以包含適當(dāng)濃度或量的組分以用于進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)。

試劑盒可以被設(shè)計(jì)成輔助研究人員使用本文所述的方法并且可以采取許多形式。在適用的情況下，試劑盒的每種組合物可以以液體形式(例如，以溶液)或固體形式(例如，干粉末)提供。在某些情況下，一些組合物可以是可組成的或以其他方式可加工的(例如，加工為活性形式)，例如通過添加合適的溶劑或其他物質(zhì)(例如，水或細(xì)胞培養(yǎng)基)，其可以與或可以不與試劑盒一起提供。如本文使用的“說明書”可以確定說明和/或推廣的組分，并且通常包括在本公開內(nèi)容的包裝上或與其有關(guān)的書面說明書。說明書還可以包括以任何方式提供的任何口頭或電子說明書，以使得使用者將清楚地認(rèn)識(shí)到說明書與該試劑盒有關(guān)，例如音像(例如，錄像帶、dvd等)、因特網(wǎng)和/或基于網(wǎng)絡(luò)的通信等。書面說明書可以是由管理藥品或生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式，該說明書還可反映所述機(jī)構(gòu)對(duì)用于動(dòng)物施用的制造、使用或銷售的許可。

試劑盒可以包含一個(gè)或更多個(gè)容器中的本文所述的任一種或更多種組分。作為一個(gè)實(shí)例，在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以包含用于混合試劑盒中的一種或更多種組分和/或分離和混合樣品并施用于對(duì)象的說明書。試劑盒可以包含容納有本文所述的藥劑的容器。所述藥劑可以是液體、凝膠或固體(粉末)形式。所述藥劑可以無菌制備，包裝在注射器中并冷藏運(yùn)送?；蛘?，其可以被放置在小瓶或其他容器中用于儲(chǔ)存。第二容器可以具有無菌制備的其他藥劑?；蛘撸噭┖锌梢园A(yù)先混合并在注射器、小瓶、管或其他容器中運(yùn)送的活性劑。試劑盒可以具有將藥劑施用于動(dòng)物所需的一種或更多種或全部組件，例如注射器、局部施用裝置或iv針管和包，特別是在用于產(chǎn)生特定體細(xì)胞動(dòng)物模型的試劑盒的情況下。

試劑盒可以具有多種形式，例如泡罩袋、收縮包裝袋、真空可密封袋、可密封的熱成型盤或類似的袋或盤形式，其中附件松散地包裝在袋、一個(gè)或更多個(gè)管、容器、箱或包中。在增加附件后，可以對(duì)試劑盒進(jìn)行滅菌，從而使容器中的各個(gè)附件不會(huì)散開?？梢允褂萌魏魏线m的滅菌技術(shù)(例如輻射滅菌、熱滅菌或本領(lǐng)域已知的其他滅菌方法)將試劑盒滅菌。根據(jù)具體應(yīng)用，試劑盒還可以包含其他組件，例如，容器、細(xì)胞培養(yǎng)基、鹽、緩沖劑、試劑、注射器、針、用于施用或去除消毒劑的織物如紗布、一次性手套、施用前的藥劑支架等。

試劑盒中包含的說明書可以包括用于檢測(cè)細(xì)胞中的潛在aav的方法。此外，本公開內(nèi)容的試劑盒可以包含說明書、陰性和/或陽性對(duì)照、容器、用于樣品的稀釋劑和緩沖劑、樣品制備管和用于序列比較的參照aav序列的印刷或電子表。

實(shí)施例

實(shí)施例1：從黑猩猩組織中分離轉(zhuǎn)錄活性新型aav衣殼序列以用于載體開發(fā)

為了尋找傾向于感染靈長類的新型aav，分析了多個(gè)黑猩猩組織中aav前病毒基因組和caprna的存在，其中首先使用一組引物和探針通過qpcr和qrt-pcr來靶向短保守cap序列段。評(píng)估了來自兩只黑猩猩的六個(gè)組織(腦、心臟、腎、肝、肺和脾)的aavcap序列。數(shù)據(jù)表明，所有組織均具有可變豐度的aav，其中肝中的拷貝數(shù)最高。隨后，進(jìn)行pcr和rt-pcr克隆來挽救來自黑猩猩dna和rna兩者的全長衣殼序列。通過測(cè)序分析cdna克隆(例如，vp1的克隆)。通過rt-pcr和pcr分離vp1的總計(jì)24個(gè)dna和23個(gè)rna克隆并進(jìn)行完全測(cè)序。有趣的是，這47個(gè)克隆中有30個(gè)是aav5樣的，其中14個(gè)克隆是rt-pcr的產(chǎn)物。

系統(tǒng)進(jìn)化分析將衣殼克隆分為與aav3b、aav4和aav5密切相關(guān)的三個(gè)主要組，其可用于基因遞送至多種組織(例如，cns、腎、脾、肝和心臟靶標(biāo))。表1列出了所鑒定的aav衣殼變體。表2提供了與鑒定的變體序列有關(guān)的野生型aav血清型的ncbi登錄號(hào)。

通過blast分析和多重序列比對(duì)選擇具有與aav3b、aav4或aav5及其自身內(nèi)部的氨基酸差異的變體capcdna克隆，以用于進(jìn)行進(jìn)一步表征(表3)。變體衣殼蛋白與野生型aav血清型之間的氨基酸替換總結(jié)在表4-6中。

構(gòu)建包含示例衣殼(即，cbr-7.4、cbr-7.5和cbr-7.8衣殼)的重組aav并包裝成包含螢光素酶表達(dá)載體基因組。對(duì)于cbr-7.4、cbr-7.5和cbr-7.8，產(chǎn)生的raav的滴度分別為1.3×10¹⁰、1.2×10¹⁰和1.2×10¹⁰個(gè)基因組拷貝/ml。用重組aav轉(zhuǎn)導(dǎo)huh-7.5肝瘤細(xì)胞并檢查螢光素酶表達(dá)以確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)(圖4)。檢查作為對(duì)照的aav9和aav3b。

表1：新型aav的序列

表2：aavcapsid序列變體

表3：aav3b變體之間的氨基酸變化

表4：aav4變體之間的氨基酸變化

表5：aav5變體之間的氨基酸變化

本公開內(nèi)容并不將其應(yīng)用限于本說明書中闡述或附圖中所示的構(gòu)造細(xì)節(jié)和組件布置。本公開內(nèi)容能夠具有其他實(shí)施方案并且能夠以多種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。另外，本文使用的措辭和術(shù)語是為了描述的目的并且不應(yīng)被認(rèn)為是限制。本文使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其變體意指涵蓋此后列出的項(xiàng)目及其等同物以及另外的項(xiàng)目。

至此已描述了本公開內(nèi)容的至少一個(gè)實(shí)施方案的若干方面，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易想到各種改變、修改和改進(jìn)。這樣的改變、修改和改進(jìn)旨在成為本公開內(nèi)容的一部分并且旨在包含在本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)。因此，上述說明書和附圖僅作為示例。