本申請要求2014年8月2日提交的美國臨時(shí)申請序號62/032,567的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及均勻的納米復(fù)合物簇的合成。

發(fā)明背景

來自很多領(lǐng)域，包括磁流體、催化、生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)、磁共振成像、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和環(huán)境修復(fù)的研究人員對磁性納米粒子都是非常感興趣的。特別地，已經(jīng)證明超順磁性納米粒子對于生物技術(shù)/生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是非常有希望的，因?yàn)楫?dāng)不存在磁場時(shí)它們表現(xiàn)為非磁性材料且保持分散，而在外部磁場控制下它們能夠顯示出強(qiáng)的磁性相互作用。氧化鐵納米粒子受到了最多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈兙哂性谏項(xiàng)l件下的生物相容性和低毒性。

然而，控制納米粒子在所需溶劑中的尺寸、形狀、穩(wěn)定性和分散性存在技術(shù)挑戰(zhàn)。已開發(fā)出了幾種用于合成具有受控尺寸分布的磁性氧化鐵納米粒子的方法，其通常通過在高溫下在有機(jī)溶劑中進(jìn)行有機(jī)金屬過程完成。對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，通常進(jìn)行另外的表面改性步驟以便將疏水性納米粒子從有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)移至水中。而且，因?yàn)檫@些方法涉及在高溫下的有機(jī)溶劑反應(yīng)混合物，所以難以工業(yè)化并且生產(chǎn)成本較高。

因此，對于具有高均勻性的磁性納米粒子以及用于制備這種均勻磁性納米粒子的有效且環(huán)境友好的方法存在持續(xù)的需求。

發(fā)明概述

本公開提供了一種均勻的納米復(fù)合物簇、制備這種納米復(fù)合物的方法以及這種納米復(fù)合物的用途。這種納米復(fù)合物可以用于經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞的系統(tǒng)中。

在一個(gè)方面，本公開涉及一種組合物，所述組合物包含懸浮在液體介質(zhì)中的均勻的納米復(fù)合物簇。本文所述的納米復(fù)合物具有落入約1nm至約1000nm之間范圍內(nèi)的平均尺寸(優(yōu)選尺寸為約1-900nm、1-500nm、2-400nm、5-200nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm)。在某些實(shí)施方式中，簇中的納米復(fù)合物具有基本相同的尺寸。在某些實(shí)施方式中，納米復(fù)合物的尺寸分布(標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于納米復(fù)合物簇平均尺寸的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％。在某些實(shí)施方式中，納米復(fù)合物的70％具有落入納米復(fù)合物簇平均尺寸的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％內(nèi)的尺寸。在某些實(shí)施方式中，納米復(fù)合物簇具有小于0.15的通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測得的多分散性指數(shù)(PDI)。優(yōu)選地，納米復(fù)合物簇具有小于0.1的PDI。更優(yōu)選地，納米復(fù)合物簇具有小于0.08、0.07、0.06、0.05或0.04的PDI。

在某些實(shí)施方式中，本公開所述的納米復(fù)合物包含核心納米粒子和涂層。在某些實(shí)施方式中，核心納米粒子是磁性納米粒子或非磁性納米粒子。在某些實(shí)施方式中，磁性納米粒子是超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒子。在某些實(shí)施方式中，SPIO納米粒子摻雜有鎂、鋅、錳、鈷、金、銀或其組合。

在某些實(shí)施方式中，涂層是硅烷化涂層。在某些實(shí)施方式中，涂層是表面活性劑或聚合物。在某些實(shí)施方式中，涂層包含官能團(tuán)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，官能團(tuán)是單羧酸、二羧酸、三羧酸或四羧酸。在某些實(shí)施方式中，官能團(tuán)選自下組：鏈霉親和素、蛋白A、蛋白G、抗體、肽、適體、熒光團(tuán)、酶和藥物。在某些實(shí)施方式中，涂層是低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)。

在另一個(gè)方面，本公開提供了制備均勻的納米復(fù)合物簇的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備均勻的納米復(fù)合物簇的方法，所述方法包括(1)在水/醇溶劑中混合金屬鹽前體和表面活性劑，以形成反應(yīng)溶液；(2)向反應(yīng)溶液中加入沉淀劑；(3)獲得納米復(fù)合物簇；其中將反應(yīng)溶液控制在低于300C的溫度下。優(yōu)選地，將反應(yīng)溶液控制在低于200C的溫度下。更優(yōu)選地，將反應(yīng)溶液控制在低于100C的溫度下。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)溶液不含醇以外的有機(jī)溶劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開提供了一種由本文所述方法制備的復(fù)合物。

在又一個(gè)方面，本公開提供了通過使用均勻的納米復(fù)合物簇向腫瘤組織遞送功能性分子的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，遞送是通過經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開提供了通過經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞遞送均勻的納米復(fù)合物簇的系統(tǒng)。

在另一個(gè)方面，本公開涉及用于活化在某一應(yīng)用中使用的納米粒子的溶液，所述溶液包含酸、堿或鹽。在某些實(shí)施方式中，酸選自下組：鹽酸、硫酸、亞硫酸、膦酸、亞磷酸、羧酸和氨基酸及其組合。在某些實(shí)施方式中，堿選自下組：氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、四甲基氫氧化銨及其組合。在某些實(shí)施方式中，鹽選自下組：Tris鹽酸鹽、羧酸鈉、羧酸銨、硫酸鈉、烷基硫酸鈉及其組合。在某些實(shí)施方式中，溶液還包含聚乙二醇、吐溫、CHAPS、丙二醇、丁二醇、鹽、甘油、蔗糖，脫氧核糖核苷酸、小肽或蛋白。

在另一個(gè)方面，本公開涉及一種在某一應(yīng)用中使用納米復(fù)合物的方法，所述方法包括提供懸浮在液體介質(zhì)中的納米復(fù)合物簇；以及向該簇中加入溶液以活化用于所述應(yīng)用的納米復(fù)合物。

附圖簡述

圖1：由實(shí)施例1中所述工序制備的納米復(fù)合物。

圖2：使用本公開所公開的方法制備的摻雜金屬的磁性納米復(fù)合物。

圖3：單分散納米復(fù)合物是水溶性的，因此其完全分散在水相中。在由己烷組成的頂相中未觀察到納米復(fù)合物。

圖4：由本公開所公開方法制備的納米復(fù)合物簇的透射電鏡圖。其顯示了由動(dòng)態(tài)光散射法測定的單分散性。

圖5：均勻的磁性納米復(fù)合物可以以更清楚的截止分子量用于DNA尺寸片段的選擇。

圖6：均勻的磁性納米復(fù)合物能夠與抗體結(jié)合并用于抗體的純化和免疫測定。納米復(fù)合物的單分散性產(chǎn)生更一致的檢測數(shù)據(jù)。

圖7：利用納米復(fù)合物遞送化療藥物和收集過量化學(xué)藥物的裝置的示意圖。該裝置包含兩條導(dǎo)管。一條導(dǎo)管插入向器官內(nèi)的腫瘤輸送的動(dòng)脈中，例如通過肝動(dòng)脈分支。從導(dǎo)管或與導(dǎo)管連接的容器注射納米復(fù)合物，并將其導(dǎo)向腫瘤。另一條導(dǎo)管插入肝靜脈，其具有引入后能夠延伸至導(dǎo)管外部的磁性結(jié)構(gòu)。磁性結(jié)構(gòu)能夠通過磁性吸引收集攜帶藥物的過量納米復(fù)合物。磁性結(jié)構(gòu)還可以是沉積在過濾材料上的磁性結(jié)構(gòu)，以改善單獨(dú)使用過濾材料對攜帶化學(xué)藥物的過量納米復(fù)合物的收集。

圖8A：在顯微鏡下觀察到的含有全氟化碳和均勻的磁性納米復(fù)合物的乳液。

圖8B：在顯微鏡下觀察到的納米泡乳液。由于對乳液進(jìn)行物理振搖，產(chǎn)生了各種尺寸的氣泡。

發(fā)明詳述

在對本公開更加詳細(xì)的描述之前，應(yīng)理解本公開不限于所描述的特定實(shí)施方式，并且其當(dāng)然是可以改變的。還應(yīng)理解本申請中使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方式的目的，并不旨在限制，因?yàn)楸竟_的范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。在提供數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間每個(gè)居中值和任何其他表述或該表述范圍內(nèi)的居中值，到下限的單位的十分之一，都被包括在本公開的范圍內(nèi)，除非上下文另有明示。這些更小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在更小的范圍中，并且也被包括在本公開的范圍內(nèi)，服從所述范圍中任何特定排除的極限值。在所述的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)極限值時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)在內(nèi)的極限值的范圍也被包括在本公開的范圍內(nèi)。

除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有的含義與本公開所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本申請中使用的多數(shù)術(shù)語的一般性指導(dǎo)。雖然與本文所述的方法和材料類似或等價(jià)的任何方法和材料也可用于本公開的實(shí)踐或試驗(yàn)，但是以下描述優(yōu)選的方法和材料。

在本說明書中引用的所有出版物和專利都通過引用并入本申請，相當(dāng)于每篇出版物或?qū)＠继貏e地和單獨(dú)地被指出通過引用并入，并且其通過引用并入本申請以披露和描述與所引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。所引用的任何出版物均在本申請?zhí)峤蝗罩肮_，不應(yīng)將所述公開中的任何事項(xiàng)看作是承認(rèn)本申請由于在先公開而沒有資格早于這些公開。而且，所提供的公開日可能不同于實(shí)際的公開日，其可能需要單獨(dú)確認(rèn)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開后將理解，本申請中所描述和解釋的各個(gè)實(shí)施方式均具有離散的組成和特性，在不脫離本公開范圍或主旨的前提下，可以容易地將其分離或者與任意其他若干實(shí)施方式的特性組合。任何所述的方法均可以所敘述的事件順序或者邏輯上可能的任何順序進(jìn)行。

除非另有明示，本公開的實(shí)施方式將采用化學(xué)、固態(tài)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)、分析化學(xué)、材料化學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、藥理學(xué)、成像等技術(shù)，其均在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。在文獻(xiàn)中對這種技術(shù)進(jìn)行了充分闡述，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二版，(Sambrook等，1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait編著，1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney編著，1987)；"Methods in Enzymology"叢書(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等編著，1987，并且定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction"(Mullis等編著，1994)。可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備本申請中使用的引物、多核苷酸和多肽。

在對本公開的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述前，除非另有明示，應(yīng)理解本公開不僅限于特定材料、試劑、反應(yīng)原料、生產(chǎn)工藝等，其是可以改變的。還應(yīng)理解在本申請中使用的術(shù)語僅用于說明特定實(shí)施方式的目的，并不旨在限制?？梢砸赃壿嬌峡赡艿牟煌樞驁?zhí)行本公開中的步驟也是可能的。

給出下述實(shí)施方式以便向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完整的披露和描述本申請所公開和主張的方法是如何進(jìn)行的以及納米結(jié)構(gòu)是如何使用的。要努力確保數(shù)字的準(zhǔn)確度(例如量、溫度等)，但是應(yīng)考慮一些誤差和偏差。

需要指出的是，如用于本說明書和所附權(quán)利要求中的，單數(shù)形式“一(a)”、“一個(gè)(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明示。因此，例如“化合物”包括多個(gè)化合物。在本說明書和下文中的權(quán)利要求中，將給出多個(gè)術(shù)語以供參考，將對其進(jìn)行定義以使其具有下述含義，除非具有明顯相反的意圖。

本公開提供了一種均勻的納米復(fù)合物簇、制備此類納米復(fù)合物的方法和此類納米復(fù)合物的用途。

均勻的納米復(fù)合物簇

在一個(gè)方面，本公開涉及一種組合物，所述組合物包含懸浮于液體介質(zhì)中的均勻的納米復(fù)合物簇。

在本文使用的術(shù)語“均勻的納米復(fù)合物”或“均勻的納米復(fù)合物簇”指具有基本上相同的尺寸、形狀或質(zhì)量的多個(gè)納米復(fù)合物。

在某些實(shí)施方式中，本文所述的納米復(fù)合物簇具有落入約1nm至約1000nm之間范圍內(nèi)的平均尺寸或直徑(優(yōu)選尺寸為約1-900nm、1-500nm、2-400nm、5-200nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm)。在本申請中公開了合成具有受控尺寸的均勻的納米復(fù)合物簇的方法。

在某些實(shí)施方式中，當(dāng)簇中的任意兩個(gè)納米復(fù)合物具有基本上相同的尺寸時(shí)，納米復(fù)合物簇是均勻的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)納米復(fù)合物的尺寸分布(即納米復(fù)合物尺寸的標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于簇平均尺寸的20％，優(yōu)選15％、10％，更優(yōu)選9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％時(shí)，納米復(fù)合物簇是均勻的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)納米復(fù)合物的70％具有落入納米復(fù)合物簇平均尺寸的20％，優(yōu)選15％、10％，更優(yōu)選9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％內(nèi)的尺寸時(shí)，納米復(fù)合物簇是均勻的。在某些實(shí)施方式中，納米復(fù)合物簇具有小于0.15的通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測得的多分散性指數(shù)(PDI)。優(yōu)選地，納米復(fù)合物簇具有小于0.1的PDI。更優(yōu)選地，納米復(fù)合物簇具有小于0.08、0.07、0.06、0.05或0.04的PDI。

如本文使用的，多分散性指數(shù)(PDI)是混合物中納米復(fù)合物的尺寸分布的度量。如果納米復(fù)合物具有基本上相同的尺寸、形狀或質(zhì)量，則納米復(fù)合物的集合是均勻的。測定納米粒子尺寸和尺寸分布的一種常規(guī)方法是使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)，這是一種確定小顆粒在懸液中的尺寸分布的技術(shù)。動(dòng)態(tài)光散射的詳細(xì)機(jī)理和應(yīng)用可以參見Berne,B.J.和Pecora,R.，Dynamic Light Scattering.Courier Dover Publications(2000)，其通過引用并入本申請。在本專利申請中，相關(guān)的DLS檢測在Brookhaven Nanosizer上進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，本文所述的納米復(fù)合物包含核心納米粒子和涂層。

本公開所述的核心納米粒子可以是磁性納米粒子或非磁性納米粒子。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁性納米粒子是超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒子。在某些實(shí)施方式中，SPIO納米粒子摻雜有鎂、鋅、錳、鈷、金、銀或其組合。

SPIO納米粒子是氧化鐵納米粒子，磁赤鐵礦(γ-Fe₂O₃)或磁鐵礦(Fe₃O₄)，或者由這兩相組成的納米粒子。據(jù)稱納米粒子處于超順磁狀態(tài)，因?yàn)樵诓淮嬖谕獠看艌龅那闆r下其磁化強(qiáng)度似乎平均為零，但納米粒子可以被外部磁場磁化。本申請中公開了合成均勻的SPIO納米粒子簇的方法。

非SPIO納米粒子包括例如金屬納米粒子(例如金納米粒子或銀納米粒子(參見例如Hiroki Hiramatsu,F.E.O.,Chemistry of Materials 16,2509-11(2004)))、半導(dǎo)體納米粒子(例如具有單個(gè)或多個(gè)組分的量子點(diǎn)，如CdSe/ZnS(參見例如M.Bruchez等，Science 281,2013-16(1998)))、無摻雜的重金屬的量子點(diǎn)(參見例如Narayan Pradhan等，J.Am,Chem.Soc 129,3339-47(2007))或其他半導(dǎo)體量子點(diǎn))；聚合物納米粒子(例如由PLGA(乳酸-羥基乙酸共聚物)(參見例如Minsoung Rhee等，Adv.Mater.23,H79-83(2011))、PCL(聚己內(nèi)酯)(參見例如Marianne Labet等，Chem.Soc.Rev.38,3484-3504(2009))、PEG(聚乙二醇)或其他聚合物中的一種或組合制備的粒子)；含硅納米粒子，和非SPIO磁性納米粒子(例如MnFe₂O₄(參見例如Jae-Hyun Lee等，Nature Medicine 13,95-99(2006))、合成的反鐵磁性納米粒子(SAF)(參見例如A.Fu等，Angew.Chem.Int.Ed.48,1620-24(2009))和其他類型的磁性納米粒子)。核心納米粒子的尺寸為約1nm至約900nm(優(yōu)選1-500nm、2-400nm、5-200nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、50nm、75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm)。

在某些實(shí)施方式中，核心納米粒子具有球形、棒狀、四腳形、金字塔形、多臂、納米管、納米線、納米纖維或納米板的形狀。

在本申請中公開了合成具有非SPIO核心納米粒子的均勻的納米復(fù)合物簇的方法。

如本文使用的，術(shù)語“涂層”指至少一個(gè)核心納米粒子可嵌入其中的任意物質(zhì)。可以使用本領(lǐng)域公知的任意適宜涂層，例如表面活性劑、聚合物涂層和非聚合物涂層。涂層與核心納米粒子通過如下相互作用：1)分子間相互作用，如共價(jià)鍵(例如σ鍵、π鍵、δ鍵、雙鍵、三鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、3c-2e鍵、3c-4e鍵、4c-2e鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數(shù)和反鍵)、金屬鍵(例如與核心納米粒子中的金屬原子的螯合相互作用)或離子鍵(陽離子π-鍵和鹽鍵)，和2)分子間相互作用，如氫鍵(例如二氫鍵、二氫復(fù)合物、低勢壘氫鍵、對稱氫鍵)和非共價(jià)鍵(例如疏水性、親水性、電荷-電荷或π堆疊相互作用、范德華力、倫敦分散力、機(jī)械鍵、鹵素鍵、親金作用、嵌入、堆疊、熵力和化學(xué)極性)。

在某些實(shí)施方式中，涂層是硅烷化涂層。在一個(gè)實(shí)施方式中，硅烷化涂層是在SPIO納米粒子表面上的包含硅烷和/或硅烷樣分子(或那些分子與表面的反應(yīng)產(chǎn)物)的涂層。

涂層可以是無定形的?？梢詫ν繉拥暮穸冗M(jìn)行控制以便能夠產(chǎn)生用于特定應(yīng)用的涂覆的納米粒子。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過將三甲氧基硅烷與適宜的官能團(tuán)(如巰基基團(tuán)、氨基基團(tuán)、巰基/氨基基團(tuán)、羧基基團(tuán)、膦酸酯基基團(tuán)、烷基基團(tuán)、聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)(PEG)及其組合)交聯(lián)來制備硅烷化涂層。

在某些實(shí)施方式中，涂層是表面活性劑。在某些實(shí)施方式中，表面活性劑是含有羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、氫、胺、銨、甜菜堿和磺基甜菜堿基團(tuán)的化合物。

在某些實(shí)施方式中，涂層是含有羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、氫、胺、銨、甜菜堿和磺基甜菜堿基團(tuán)的化合物。

在某些實(shí)施方式中，涂層是聚合物。聚合物的示例包括但不限于可以任選地用各種側(cè)基官能化的多肽。聚合物涂層可以選自下組：殼聚糖、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚醛、葡聚糖、蔗糖、多糖、瓊脂糖。

在某些實(shí)施方式中，涂層含有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。官能團(tuán)的示例包括但不限于氨基、巰基、單羧酸、二羧酸、三羧酸或四羧酸、鏈霉親和素、親和素、蛋白A、蛋白G、抗體、肽、適體、熒光團(tuán)、酶和藥物。

可以在涂層形成過程中引入官能團(tuán)，例如通過在交聯(lián)過程中加入含有此類官能團(tuán)的含硅化合物。還可以在涂層形成之后引入官能團(tuán)，例如通過化學(xué)改性將官能團(tuán)引入涂層表面。在某些實(shí)施方式中，官能團(tuán)是涂層中固有的。

在某些實(shí)施方式中，涂層是如在以整體并入本申請的WO2013112643中所公開的低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)。低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指密度比現(xiàn)有介孔材料(例如孔徑為2至50nm的介孔材料)低至少10倍的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)具有<1.0g/cc(例如0.01mg/cc至1000mg/cc)的密度。

當(dāng)懸浮于液體介質(zhì)中時(shí)，本文所述的納米復(fù)合物簇保持均勻性和穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方式中，納米復(fù)合物可溶于液體介質(zhì)中，即納米復(fù)合物在液體介質(zhì)中是穩(wěn)定的和可分配的。懸浮在液體介質(zhì)中的納米復(fù)合物不聚集或沉淀。用于懸浮納米復(fù)合物的液體介質(zhì)包括但不限于水、生物緩沖液(例如PBS、TBS)、醇及其組合。

制備方法

在另一個(gè)方面，本公開提供了用于制備均勻的納米復(fù)合物簇的方法。在所需溶劑中控制納米復(fù)合物的尺寸、形狀、穩(wěn)定性和分散性是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。已開發(fā)出了幾種用于合成具有受控尺寸分布的磁性氧化鐵納米粒子的方法，其通常通過在高溫下在有機(jī)溶劑中進(jìn)行有機(jī)金屬過程完成(參見例如US20080032132)。對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，通常進(jìn)行另外的表面改性步驟以便將疏水性納米粒子從有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)移至水中。然而，因?yàn)檫@些方法涉及有機(jī)溶劑在高溫下的反應(yīng)混合物，所以難以工業(yè)化并且生產(chǎn)成本較高。本發(fā)明令人吃驚的發(fā)現(xiàn)之一是一種在溫和制備條件下(水/醇溶劑和相對低的溫度)制備均勻的納米復(fù)合物簇的方法，所述均勻的納米復(fù)合物簇為可分配的或水溶性的。

在一個(gè)實(shí)施方式中，制備均勻的納米復(fù)合物簇的方法包括(1)在水/醇溶劑中混合金屬鹽前體和表面活性劑，以形成反應(yīng)溶液；(2)向反應(yīng)溶液中加入沉淀劑；(3)獲得納米復(fù)合物簇；其中將反應(yīng)溶液控制在低于300℃的溫度下。優(yōu)選地，將反應(yīng)溶液控制在低于200℃的溫度下。更優(yōu)選地，將反應(yīng)溶液控制在低于100℃的溫度下。

金屬鹽前體包括但不限于氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽、氟化物、溴化物、碘化物、硫化物、硒化物、碲化物、乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽形式的鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、鎘鹽、錳鹽、鎳鹽、鈷鹽、金鹽、銀鹽。

在某些實(shí)施方式中，金屬鹽前體是亞鐵鹽和鐵鹽的混合物。亞鐵鹽包括氯化亞鐵、硫酸亞鐵、硝酸亞鐵、氟化亞鐵、溴化亞鐵、碘化亞鐵、硫化亞鐵、硒化亞鐵、碲化亞鐵、乙酸亞鐵、草酸亞鐵、檸檬酸亞鐵和磷酸亞鐵。鐵鹽包括氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氟化鐵、溴化鐵、碘化鐵、硫化鐵、硒化鐵、碲化鐵、乙酸鐵、草酸鐵、檸檬酸鐵和磷酸鐵。

在某些實(shí)施方式中，金屬鹽前體的混合物還包括非鐵金屬，如相應(yīng)的鹽形式的鈷、鎳、鎂、錳、鋅、金和銀。在這種情況下，可以將這些非鐵金屬引入合成中以使得終產(chǎn)物是基于鐵的復(fù)合氧化物。

用于本公開方法的適宜表面活性劑可以選自廣泛的聚合電解質(zhì)，所述聚合電解質(zhì)例如但不限于含有羧酸酯基團(tuán)的那些，包括聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、乙酸、草酸、丙酸、丁酸、油酸、戊酸、己酸、庚酸、鞣酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸，十三烷酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸，以及含有磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、胺、銨、甜菜堿或磺基甜菜堿基團(tuán)的那些。

用于本公開方法的適宜醇可以選自具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)或更多個(gè)碳原子的醇。在某些實(shí)施方式中，醇可以是一元醇或多元醇。一元醇的說明性示例包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。多元醇的說明性示例包括丙二醇、甘油、蘇糖醇、木糖醇等。

在某些實(shí)施方式中，醇可以具有飽和碳鏈或不飽和碳鏈。具有飽和碳鏈的醇可以用化學(xué)式C_nH_(2n+2)O表示。在某些實(shí)施方式中，n不小于3，或不小于4，或不小于5(例如n＝3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或以上)。具有不飽和碳鏈的醇在兩個(gè)碳原子之間具有雙鍵或三鍵。在某些實(shí)施方式中，醇可以是環(huán)醇，例如環(huán)己醇、肌醇或薄荷醇。

在某些實(shí)施方式中，醇可以具有直鏈碳鏈(例如正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇等)或支鏈碳鏈(例如異丙醇、異丁醇、叔丁醇等)。在某些實(shí)施方式中，醇以約30％至約70％的體積分?jǐn)?shù)存在(例如約30％至約70％、約30％至約60％、約30％至約55％、約40％至約70％、約45％至約70％、約40％至約60％)。在某些實(shí)施方式中，醇以50％左右的體積分?jǐn)?shù)存在(例如45％左右、46％左右、47％左右、48％左右、49％左右、50％左右、51％左右、52％左右、53％左右、54％左右、55％左右、56％左右、57％左右、58％左右、59％左右或60％左右)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)溶液不含有醇以外的有機(jī)溶劑。醇以外的有機(jī)溶劑包括但不限于甲苯、氯仿、己烷。

在本公開的方法中，納米復(fù)合物簇的沉淀可以通過加入沉淀劑引發(fā)。沉淀劑包括但不限于第1族和第2族金屬、銨的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽(例如NaOH、KOH、NH₄OH、Na₂CO₃、K₂CO₃)，四甲基氫氧化銨，氨以及負(fù)碳離子、酰胺和氫化物的第1族的鹽。

方法限定的產(chǎn)品

本公開的另一個(gè)方面涉及通過本文提供的任意方法制備的納米復(fù)合物簇。可以任選地使用本文所述的方法和/或本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法分離、純化或干燥本文制備的納米復(fù)合物。

使用方法

在又一個(gè)方面，本公開提供了本文所述的均勻的納米復(fù)合物簇的用途。均勻的納米復(fù)合物簇的用途包括但不限于制備治療或診斷組合物，制備用于定性或定量檢測的試劑，制備用于分子成像的試劑，和制備用于分離、純化或富集的試劑。本公開的均勻的納米復(fù)合物簇還可以用于包封或保護(hù)功能性分子(如藥物)，或用作功能性分子的載體。本公開的均勻的納米復(fù)合物簇還可以用于靶向遞送或控制釋放功能性分子。

在某些實(shí)施方式中，均勻的納米復(fù)合物簇用于與核酸相互作用以用于提取、尺寸選擇、診斷檢測，并且由于納米復(fù)合物的單分散性而獲得更好的結(jié)果。

在某些實(shí)施方式中，均勻的納米復(fù)合物簇用于免疫檢測，并且由于納米復(fù)合物的單分散性而獲得更好的結(jié)果(如一致性)和更好的定量。

在某些實(shí)施方式中，均勻的納米復(fù)合物簇用于細(xì)胞分離、鑒定和調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，并且由于納米復(fù)合物的單分散性而獲得更好的結(jié)果(如基于細(xì)胞表面標(biāo)記物與均勻的納米復(fù)合物之間的相互作用定量鑒定不同細(xì)胞類型)，更好的細(xì)胞分選和區(qū)分(其通過細(xì)胞表面上標(biāo)記的均勻粒子的熒光信號或磁性性質(zhì))，或者均勻的納米復(fù)合物對細(xì)胞行為的更一致的刺激。

在某些實(shí)施方式中，由于納米復(fù)合物的均勻性，均勻的納米復(fù)合物簇更好地用于診斷檢測或處理臨床樣品。均勻的納米復(fù)合物簇能夠提供更一致和可靠的數(shù)據(jù)，例如在治療方法開發(fā)的靶點(diǎn)驗(yàn)證方面，或者用于檢測最早期癌癥或治療后的預(yù)測性評估的伴隨診斷方面。

在某些實(shí)施方式中，本公開的均勻的納米復(fù)合物簇能夠用于功能性分子的系統(tǒng)或局部遞送，如化療。

在一個(gè)實(shí)施方式中，功能性分子的局部遞送是通過經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)栓塞(TACE)。在一個(gè)示例中，通過TACE向腫瘤組織施用攜帶化療劑的均勻的磁性納米復(fù)合物簇。納米復(fù)合物防止化療劑在栓塞后從腫瘤組織洗去。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用磁性支架收集過量的帶有化療劑的納米復(fù)合物并將其從體內(nèi)移除以減少毒副作用。

在另一個(gè)方面，本公開提供了用于通過TACE遞送均勻的納米復(fù)合物簇的裝置。在某些實(shí)施方式中，該裝置包含兩條導(dǎo)管：一條導(dǎo)管包含可注射容器，所述可注射容器將納米復(fù)合物-化學(xué)藥物溶液保持在導(dǎo)管中，用于將納米復(fù)合物-化學(xué)藥物栓塞注射至靶組織或器官部位；另一條導(dǎo)管保持有磁性結(jié)構(gòu)，所述磁性結(jié)構(gòu)一旦就位就能夠伸出導(dǎo)管以收集過量的納米復(fù)合物-化學(xué)藥物栓塞。磁性結(jié)構(gòu)可以是永久磁性支架、可磁化的磁性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或能夠接通或斷開以產(chǎn)生所需磁力的電磁體，以便從機(jī)體外部位置吸引過量的納米復(fù)合物-化學(xué)藥物栓塞(對于該設(shè)置的圖示參見圖7)。

提供下述實(shí)施例以說明本發(fā)明。其并非旨在以任何方式進(jìn)行限制。

實(shí)施例1

下述是均勻的SPIO納米復(fù)合物簇的制備和表征的示例。

將含0.5g FeCl₂的5ml diH₂O與含1.0g FeCl₃的5ml H₂O在250ml的具有3個(gè)入口的反應(yīng)瓶中混合。將燒瓶在填充有65至70℃水的超聲器中超聲并使用N₂吹洗約10分鐘。通過將80mg月桂酸溶解在異丙醇中，隨后加入80mg油酸而制備基質(zhì)混合物。在將基質(zhì)混合物加入燒瓶前，將15ml 30％NH₄OH加入酸和油酸的混合物中。加入基質(zhì)混合物后，在加熱和N₂吹洗下將燒瓶再超聲10分鐘，隨后停止N₂吹洗。然后在無N₂的條件下將燒瓶超聲20分鐘。將燒瓶從超聲器中取出并冷卻5至15分鐘。

轉(zhuǎn)移燒瓶中的粗產(chǎn)物并在rotarack上旋轉(zhuǎn)至少2小時(shí)。將粗產(chǎn)物洗滌5次，前三次使用約30ml異丙醇洗滌，后兩次使用diH₂O。在轉(zhuǎn)移至潔凈容器前，在顯微鏡下檢查洗滌后的小珠(見圖1)。當(dāng)必要時(shí)進(jìn)行尺寸選擇。

通過控制納米復(fù)合物反應(yīng)中不同成分的量來控制納米復(fù)合物的尺寸，或者可以通過控制涂層材料的量來調(diào)節(jié)涂層的厚度。

如圖2中所示，可以使用類似方法制備摻雜有其他金屬元素的納米復(fù)合物。

制備了具有從100納米至1μm的不同尺寸并且具有不同表面涂層/分子/功能的納米復(fù)合物。

如圖3所示，制得的納米復(fù)合物能夠分散于水溶液中。

使用BrookHaven NanoSizer測定了納米復(fù)合物的尺寸分布。如表1中所示，納米復(fù)合物的多分散性指數(shù)低至<0.05，這在動(dòng)態(tài)散射儀的極限附近。

表1：納米復(fù)合物簇的平均尺寸和尺寸分布

圖5是使用透射電子顯微鏡顯示的納米復(fù)合物簇。所形成的這些納米復(fù)合物能夠進(jìn)行硅烷化涂布，并且證實(shí)了如表1中使用動(dòng)態(tài)光散色實(shí)驗(yàn)顯示的單分散性。

實(shí)施例2

下述是使用均勻的納米復(fù)合物簇分離DNA的示例。

將1,000ng 100～1,000bp的DNA梯(Fisher Scientific)與20μl納米復(fù)合物在室溫下混合30分鐘。將納米復(fù)合物在磁性支架上丸?；?，并使用100μl新鮮的70％乙醇洗滌兩次。洗脫所捕獲的梯并在3％瓊脂糖凝膠上分析。如圖4中所示，磁性納米復(fù)合物在DNA尺寸片段選擇中顯示了清楚的截止分子量。與市場上的其他產(chǎn)品比較，使用均勻的磁性納米復(fù)合物一致產(chǎn)生了具有更清晰結(jié)果的DNA文庫。

實(shí)施例3

下述是使用均勻的納米復(fù)合物簇結(jié)合抗體的示例。

如圖6中所示，將僅由磁性納米粒子組成或具有磁性和熒光性質(zhì)的均勻的納米復(fù)合物用于蛋白捕獲檢測。納米復(fù)合物與蛋白A或蛋白偶聯(lián)。將偶聯(lián)的納米復(fù)合物用于從溶液中捕獲抗體。如實(shí)施例6中所示，使用10μg的與蛋白A偶聯(lián)的納米復(fù)合物進(jìn)行兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以捕獲1μg的在溶液中的抗體。在磁性分離后，均勻的納米復(fù)合物顯示出更一致和可重復(fù)的結(jié)果。這種特征對于臨床免疫診斷檢測是非常重要的。

實(shí)施例4

可以將均勻的納米復(fù)合物簇用于功能性分子(如蛋白、核酸、信號產(chǎn)生分子、藥物)的控制和釋放。下述示例使用均勻的納米復(fù)合物簇用于DNA的控制和釋放。

將經(jīng)測定含有80ng小珠的兩個(gè)磁性納米復(fù)合物樣品(樣品1和樣品2)溶液與在pH 8緩沖液(tris，PEG 8000，NaCl)中的濃度為50μg/ml的10ul DNA混合30分鐘。使用100μl70％的乙醇洗滌2次所得到的物質(zhì)，然后空氣干燥5分鐘。向試管中的干燥物質(zhì)中加入20μl洗脫溶液：含有10mM NaCl的Tris緩沖液。在磁珠吸附后溶液的原始上清液反映了未吸附于磁性納米復(fù)合物上的DNA的量，利用使用Pico綠染料的熒光酶標(biāo)儀測定5min和10天后所得到的洗脫DNA和標(biāo)準(zhǔn)DNA。使用DNA對照樣品的線性擬合曲線計(jì)算釋放百分率。如表2中所示，吸附30min后均勻的納米復(fù)合物吸附90％以上的DNA。

在20μl溶液中20％、60％和100％的量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對照樣品的熒光讀數(shù)為：569、1488和1606。

表2：不同時(shí)間點(diǎn)的未吸附DNA的量和釋放結(jié)果

實(shí)施例5

下述是使用本文所述的均勻的納米復(fù)合物制備全氟化碳乳劑的示例。

通過組合下述成分來制備穩(wěn)定的乳劑：

(A)全氟化碳液體，其具有高的氧溶解度并且可以用于在體內(nèi)攜帶氧；

(B)pH 8的含有6種成分的組合的水溶液；

(C)植物油，如葵花油、橄欖油、鱷梨油和菜籽油；

(D)均勻的納米復(fù)合物。

所形成的乳劑是淺棕色均勻的微粘稠液體，其在室溫和4℃下穩(wěn)定。如圖8A和圖8B所示，磁性粒子很好地分散在乳液中，并且在振搖乳劑后觀察到一些氣泡。

使用水或0.02％SDS溶液將納米泡的兩個(gè)配方分別稀釋6倍或20倍。使用動(dòng)態(tài)散射(DLS)技術(shù)測定這兩個(gè)經(jīng)稀釋的含有PFC和磁性納米復(fù)合物的納米泡配方的尺寸和分布。如表3中所示，該乳劑具有較小的粒子尺寸和粒子尺寸分布。

乳劑將全氟化碳從25％穩(wěn)定至達(dá)40％，并且其作為含有達(dá)15mg/ml的納米復(fù)合物的均勻溶液是穩(wěn)定的。

表3：納米泡乳劑的尺寸和分布

盡管已參照特定實(shí)施方式(其中的一些是優(yōu)選實(shí)施方式)特別地示出和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在不脫離如本文所公開的本發(fā)明的主旨和范圍的前提下可以對其形式和細(xì)節(jié)做出各種改變。