本專(zhuān)利申請(qǐng)要求2014年7月1日提交的韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10-2014-0081889號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。本發(fā)明涉及一種細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物。
背景技術(shù)：
：隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，很多人由于退行性疾病已被遭受了痛苦，且退行性疾病患者數(shù)有持續(xù)增加的趨勢(shì)。包括帕金森氏病、盧格里格病的無(wú)法治愈的多種退行性疾病的最理想的治療法就是將源自患者細(xì)胞的分化全能性干細(xì)胞或從其分化的功能細(xì)胞移植到患處。最近，世界各國(guó)為了基于細(xì)胞重編程(reprogranmming)或去分化技術(shù)主導(dǎo)細(xì)胞治療劑和新藥研發(fā)而正在進(jìn)行激烈的技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)，以便實(shí)現(xiàn)無(wú)法治愈的退行性疾病的根本治療。去分化技術(shù)是比較簡(jiǎn)單的方法，其幾乎沒(méi)有對(duì)患者帶來(lái)的身體損傷和不便。其確保自體細(xì)胞，由此能制備如人類(lèi)胚胎干細(xì)胞等特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了從患者體細(xì)胞確保定制自多能干細(xì)胞系的戰(zhàn)略劃時(shí)代的進(jìn)化。例如，為了誘導(dǎo)未分化干細(xì)胞而可以利用組合有特定基因的病毒，通過(guò)將所述病毒傳達(dá)到細(xì)胞中來(lái)以基因被插入到細(xì)胞基因組的形式表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)的方法被許多研究者提出。另外，雖然通過(guò)這種方法制備的重編程的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)具有與胚胎干細(xì)胞幾乎同等的細(xì)胞特性和分化潛能，但由于以病毒載體為媒介傳達(dá)基因而存在導(dǎo)致細(xì)胞的基因組上包括大量的病毒來(lái)源的遺傳物質(zhì)的問(wèn)題。并且，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成癌的副作用，這就意味著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的實(shí)際臨床應(yīng)用仍然是很危險(xiǎn)的。如上所述的去分化干細(xì)胞存在在重編程過(guò)程中利用癌基因(oncogene)的問(wèn)題，因此，最近對(duì)擺脫現(xiàn)有重編程方式而將體細(xì)胞直接分化成患者所需的細(xì)胞系的直接重編程(directreprogramming)的研究活躍地進(jìn)行。另外，由于在現(xiàn)有化合物中如逆轉(zhuǎn)素、Aurora激酶抑制劑等可用作細(xì)胞重編程用途的化合物具有細(xì)胞毒性，因而不適合用作細(xì)胞重編程組合物。為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明人合成出無(wú)細(xì)胞毒性并能使分化的細(xì)胞直接重編程成具有不同特性的細(xì)胞的化合物，且確定通過(guò)利用該化合物可以實(shí)現(xiàn)安全有效的細(xì)胞重編程。在本說(shuō)明書(shū)全文中，參照了多篇論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)，并表示了其引用。所引用的論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容全部插入于本說(shuō)明書(shū)作為參照，從而更加明確說(shuō)明本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明人努力研究開(kāi)發(fā)了與現(xiàn)有吲唑衍生物化合物相比在呈現(xiàn)改善的生物特征譜(biologicalprofile)的同時(shí)能夠進(jìn)行細(xì)胞重編程的化合物。其結(jié)果，本發(fā)明人通過(guò)分子設(shè)計(jì)合成出具有細(xì)胞重編程誘導(dǎo)能力的新穎的吲唑衍生物化合物，得知這些化合物與如激酶抑制劑等現(xiàn)有吲唑衍生物不同地，不呈現(xiàn)細(xì)胞毒性(cytotoxicity)并發(fā)揮優(yōu)異的細(xì)胞重編程能力，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種新穎的吲唑衍生物。本發(fā)明的其它目的及優(yōu)點(diǎn)將在下面的詳細(xì)說(shuō)明、權(quán)利要求書(shū)及附圖得到進(jìn)一步闡釋。用于解決問(wèn)題的方案根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物，其包括由下述化學(xué)式A表示的化合物:化學(xué)式A在化學(xué)式A中，R1為氫、硝基、硝基氧基或Y-羰基，所述Y為氫、羥基、鹵、C1-30烷氧基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-30雜環(huán)烷基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-20雜環(huán)烯基、C6-30芳基、C1-30烷基或C2-30烯基，R2為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，R3為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，X為胺基、酰氨基、磺酰氨基、羰基、肟或酰亞胺酰氨。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種從分化的細(xì)胞制備重編程的細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：(a)使本發(fā)明的細(xì)胞重編程組合物與分化的細(xì)胞接觸；及(b)培養(yǎng)所述步驟(a)的細(xì)胞。本發(fā)明人努力研究開(kāi)發(fā)了與現(xiàn)有吲唑衍生物化合物相比可以呈現(xiàn)改善的生物特征譜并進(jìn)行細(xì)胞重編程的化合物，其結(jié)果，通過(guò)分子設(shè)計(jì)合成具有細(xì)胞重編程誘導(dǎo)能力的新穎吲唑衍生物化合物，得知這些化合物與如激酶抑制劑等現(xiàn)有吲唑衍生物不同地，不呈現(xiàn)細(xì)胞毒性并發(fā)揮優(yōu)異的細(xì)胞重編程能力。由化學(xué)式A表示的本發(fā)明的化合物為將分化的細(xì)胞重編程成新特性的細(xì)胞的化合物，其以吲唑?yàn)槟负?，?jīng)化學(xué)合成得到?，F(xiàn)有吲唑衍生物化合物作為細(xì)胞重編程的用途完全未被知道，在本發(fā)明的化合物的情況下，與現(xiàn)有吲唑衍生物化合物相比，沒(méi)有細(xì)胞毒性或細(xì)胞毒性顯著低，且細(xì)胞重編程能力非常優(yōu)異?，F(xiàn)有直接重編程方法為利用病毒導(dǎo)入基因的方法，其具有如下缺點(diǎn)：難以直接適用于患者，誘導(dǎo)過(guò)程的效率性較低，在免疫方面有問(wèn)題。在本發(fā)明的利用低分子物質(zhì)的直接重編程的情況下，替代通過(guò)病毒的基因?qū)敕椒?，由于僅通過(guò)低分子物質(zhì)的處理誘導(dǎo)重編程，因而穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性及效率性非常優(yōu)越。本發(fā)明的組合物非常有效于從分化的細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物可以從源自哺乳動(dòng)物的分化細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的成骨(osteogeniclineage)細(xì)胞或成脂(adipogeniclineage)細(xì)胞等各種類(lèi)型的細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)成肌細(xì)胞(myoblast)分化成成骨細(xì)胞(osteoblast)或脂肪細(xì)胞(adipocyte)。分化的細(xì)胞沒(méi)有特別限制，例如，包括體細(xì)胞或體細(xì)胞干細(xì)胞。體細(xì)胞是指作為構(gòu)成成體的細(xì)胞，具有有限的分化能力和自我生產(chǎn)能力的細(xì)胞，所述體細(xì)胞可以是構(gòu)成人的皮膚、毛發(fā)、脂肪或骨的體細(xì)胞。所述分化的細(xì)胞可以是源自如人、猴、豬、馬、牛、羊、狗、貓、鼠及兔等不同哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，優(yōu)選源自人的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重編程(Reprogramming)”是指使以如無(wú)分化能力的細(xì)胞或有部分分化能力的細(xì)胞等具有不同特征的狀態(tài)存在的分化的細(xì)胞，最終恢復(fù)或轉(zhuǎn)化成新型細(xì)胞或具有新型分化能力的細(xì)胞的過(guò)程。根據(jù)本發(fā)明，分化的細(xì)胞通過(guò)與本發(fā)明的組合物接觸來(lái)可以被重編程為0％至100％的呈現(xiàn)不同特性的細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)中，為了定義化學(xué)式A的吲唑衍生物而使用的術(shù)語(yǔ)“硝基”是指鹵族元素，例如，包括氟、氯、溴和碘。術(shù)語(yǔ)“硝基氧基”是指-O-N＝O官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“羰基”是指-(C＝O)-官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“羥基”是指-OH官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“鹵”是指鹵族元素，例如，包括氟、氯、溴和碘。術(shù)語(yǔ)“烷基”是指包括直鏈或支鏈的、取代或未取代的飽和烴基，例如，包括甲基、乙基、丙基、異丁基、戊基、己基、庚基、半基、壬基、癸基、十一燒基、十二燒基、十五燒基及十七燒基。C1-30烷基是指包括具有1至30個(gè)碳原子數(shù)的烷基單元的烷基，當(dāng)C1-30烷基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，位于化學(xué)式A的Y位的C1-30烷基為C1-15烷基，而位于化學(xué)式A的R2位的C1-30烷基優(yōu)選為C1-15烷基。術(shù)語(yǔ)“烯基”是指具有預(yù)定碳原子數(shù)的直鏈或支鏈的、取代或未取代的不飽和烴基，例如，包括次乙基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、叔丁烯基、正戊烯基及正己烯基。C2-30烯基是指包括具有2至30個(gè)碳原子數(shù)的烯基單元的烯基，當(dāng)C2-30烯基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，位于化學(xué)式A的Y位的C2-30烯基為C2-15烯基，而位于化學(xué)式A的R2位的C2-30烯基優(yōu)選為C2-15烯基。術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指與1個(gè)氧原子結(jié)合的烷基或芳基。例如，其包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、芳基氧基等。C1-30烷氧基是指包括具有1至30個(gè)碳原子數(shù)的烷氧基單元的烷氧基，當(dāng)C1-30烷氧基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基。C2-5烷氧基烷基是指包括具有2至5個(gè)碳原子數(shù)的烷氧基烷基單元的烷氧基烷基，當(dāng)C2-5烷氧基烷基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。術(shù)語(yǔ)“烷氧基羰基”是指被烷氧基取代的羰基。C2-5烷氧基羰基是指包括具有2至5個(gè)碳原子數(shù)的烷氧基羰基單元的烷氧基羰基，當(dāng)C2-5烷氧基羰基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。術(shù)語(yǔ)“作為雜原子包含氮、氧或硫的雜環(huán)烷基”是指包括碳、氫及至少1個(gè)雜原子(氮、氧或硫)的非芳族環(huán)狀碳化氫。所述雜原子優(yōu)選為氮或氧，最優(yōu)選為氮。根據(jù)本發(fā)明，雜原子的個(gè)數(shù)為1-4、1-3或1-2個(gè)。C2-30雜環(huán)烷基是指形成環(huán)結(jié)構(gòu)的碳的個(gè)數(shù)為2-30個(gè)的雜環(huán)烷基。另外，所述雜環(huán)烷基是被全部或部分取代或未被取代的碳環(huán)，所述雜環(huán)烷基可以被羥基、鹵、取代或未取代的、直鏈或支鏈的C1-5烷基、直鏈或支鏈的C1-5烷氧基、直鏈或支鏈的C1-5烯基、C2-8烷氧基烷基、C2-8烷氧基羰基、作為雜原子包含氮的C2-8雜環(huán)烯基烷基、或其組合取代。術(shù)語(yǔ)“作為雜原子包含氮、氧或硫的雜環(huán)烯基”是指包括碳、氫、至少1個(gè)雜原子(氮、氧或硫)及至少1個(gè)雙鍵的非芳族環(huán)狀碳化氫。所述雜原子優(yōu)選為氮或氧，最優(yōu)選為氮。根據(jù)本發(fā)明，雜原子的個(gè)數(shù)為1-4、1-3或1-2個(gè)。C2-30雜環(huán)烯基是指形成環(huán)結(jié)構(gòu)的碳的個(gè)數(shù)為2-30個(gè)的雜環(huán)烯基。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烯基烷基”是指被雜環(huán)烯基取代的烷基。C2-8雜環(huán)烯基是指包括具有2至5個(gè)碳原子數(shù)的雜環(huán)烯基烷基單元的雜環(huán)烯基烷基，當(dāng)C2-5雜環(huán)烯基烷基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。術(shù)語(yǔ)“芳基”是指全部或部分不飽和的取代或未取代的單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)。C6-30芳基是指具有6至30個(gè)碳原子數(shù)的碳環(huán)原子的芳基，當(dāng)C6-30芳基被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。優(yōu)選地，芳基為單芳基或非芳基。單芳基優(yōu)選具有5-6個(gè)碳原子數(shù)，而非芳基優(yōu)選具有9-10個(gè)碳原子數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，所述芳基為取代或未取代的苯基。當(dāng)單芳基被取代時(shí)，例如，當(dāng)苯基被取代時(shí)，可以在不同位置被不同取代基取代，例如，可以被鹵、羥基、硝基、氰基、取代或未取代的直鏈或支鏈C1-5烷基、直鏈或支鏈C1-5烷氧基、直鏈或支鏈C1-5烯基或其組合取代。特別優(yōu)選的芳基部位包括苯基、芐基、萘基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、惡唑基、噻唑基、吡唑基及噻吩基，但不限于此。術(shù)語(yǔ)“胺(amine)”是指包括具有未共用電子對(duì)(lonepair)的堿性氮原子的官能團(tuán)。C1-10胺是指包括具有-NH2或1至10個(gè)碳原子數(shù)的胺單元的胺，當(dāng)C1-10胺被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，位于化學(xué)式A的X位的C1-10胺為C1-5胺或-NH2。術(shù)語(yǔ)“酰胺”是指由結(jié)合到氮原子的?；鶚?gòu)成的官能團(tuán)。C1-10酰胺是指包括具有1至10個(gè)碳原子數(shù)的酰胺單元的酰胺，當(dāng)C1-10酰胺被取代時(shí)，其不包括取代產(chǎn)物的碳原子數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，所述酰胺為R-CO-NH-R'、磺胺或磷酰胺。術(shù)語(yǔ)“肟(oxime)”是指包括RR'C＝N-OH的亞胺(imines)的官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“酰亞胺酰胺”是指包括N-CR＝N'H2的官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明，在化學(xué)式A中，所述Y為氫、羥基、鹵、C1-15烷氧基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-15雜環(huán)烷基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-15雜環(huán)烯基、C6-15芳基、C1-15烷基或C2-15烯基。根據(jù)本發(fā)明，在所述Y中，雜環(huán)烷基可以被羥基、鹵、C1-5烷基、C2-5烯基、C1-5烷氧基、C2-8烷氧基烷基、C2-8烷氧基羰基、作為雜原子包含氮的C2-8雜環(huán)烯基烷基、或其組合取代。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，所述Y的雜環(huán)烯基烷基為(1H-咪唑-1-ly)烷基。根據(jù)本發(fā)明，所述R2為氫、鹵、C1-15芳基、C1-15烷氧基或C1-15烷基或C2-15烯基，并且，在所述R2中，芳基可以被羥基、鹵、C1-5烷氧基、C1-5烯基、C2-5烯基或其組合取代。另外，在化學(xué)式A中，當(dāng)所述X為酰亞胺酰氨時(shí)，所述R2可以與所述酰亞胺酰氨的C或N'結(jié)合。本發(fā)明的化合物可以具有1個(gè)或多個(gè)手性中心及/或幾何異構(gòu)中心，且本發(fā)明包括由化學(xué)式A表示的所有立體異構(gòu)體，即，光學(xué)異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體及幾何異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物為由選自由下述化學(xué)式1至化學(xué)式45組成的組中的化學(xué)式表示的化合物：化學(xué)式1化學(xué)式2化學(xué)式3化學(xué)式4化學(xué)式5化學(xué)式6化學(xué)式7化學(xué)式8化學(xué)式9化學(xué)式10化學(xué)式11化學(xué)式12化學(xué)式13化學(xué)式14化學(xué)式15化學(xué)式16化學(xué)式17化學(xué)式18化學(xué)式19化學(xué)式20化學(xué)式21化學(xué)式22化學(xué)式23化學(xué)式24化學(xué)式25化學(xué)式26化學(xué)式27化學(xué)式28化學(xué)式29化學(xué)式30化學(xué)式31化學(xué)式32化學(xué)式33化學(xué)式34化學(xué)式35化學(xué)式36化學(xué)式37化學(xué)式38化學(xué)式39化學(xué)式40化學(xué)式41化學(xué)式42化學(xué)式43化學(xué)式44化學(xué)式45根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物為由選自由下述化學(xué)式1、化學(xué)式25、化學(xué)式30、化學(xué)式31、化學(xué)式33、化學(xué)式34、化學(xué)式35及化學(xué)式45組成的組中的化學(xué)式表示的化合物：化學(xué)式1化學(xué)式25化學(xué)式30化學(xué)式31化學(xué)式33化學(xué)式34化學(xué)式35化學(xué)式45根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)時(shí)方式，本發(fā)明提供一種化合物，作為吲唑衍生物，由下述化學(xué)式A表示：化學(xué)式A在化學(xué)式A中，R1為氫、硝基、硝基氧基或Y-羰基，所述Y為氫、羥基、鹵、C1-30烷氧基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-30雜環(huán)烷基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-20雜環(huán)烯基、C6-30芳基、C1-30烷基或C2-30烯基，R2為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，R3為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，X為胺基、酰氨基、磺酰氨基、羰基、肟或酰亞胺酰氨，但，在所述R1為硝基且所述X為酰氨基時(shí)，R2不為苯基，在所述R1和R3為氫，所述X為N-羥基-酰亞胺酰氨，所述R2為苯基時(shí)，R2與酰亞胺酰氨的碳原子不結(jié)合(或R2與酰亞胺酰氨的N'原子結(jié)合)。根據(jù)本發(fā)明，所述Y為氫、羥基、鹵、C1-15烷氧基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-15雜環(huán)烷基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-15雜環(huán)烯基、C6-15芳基、C1-15烷基或C2-15烯基。根據(jù)本發(fā)明，在化學(xué)式A的所述Y中，雜環(huán)烷基可以被羥基、鹵、C1-5烷基、C2-5烯基、C1-5烷氧基、C2-8烷氧基烷基、C2-8烷氧基羰基、作為雜原子包含氮的C2-8雜環(huán)烯基烷基、或其組合取代。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，雜環(huán)烯基烷基為(1H-咪唑-l-ly)烷基。根據(jù)本發(fā)明，在化學(xué)式A中，所述R2為氫、鹵、C1-15芳基、C1-15烷氧基或C1-15烷基或C2-15烯基，而且，在所述R2中，芳基可以被羥基、鹵、C1-5烷氧基、C1-5烷基、C2-5烯基或其組合取代。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，在化學(xué)式A中，雜原子為氮。本發(fā)明的吲唑衍生物化合物由選自由下述化學(xué)式1、化學(xué)式2及化學(xué)式4至化學(xué)式45組成的組中的化學(xué)式表示：化學(xué)式1化學(xué)式2化學(xué)式4化學(xué)式5化學(xué)式6化學(xué)式7化學(xué)式8化學(xué)式9化學(xué)式10化學(xué)式11化學(xué)式12化學(xué)式13化學(xué)式14化學(xué)式15化學(xué)式16化學(xué)式17化學(xué)式18化學(xué)式19化學(xué)式20化學(xué)式21化學(xué)式22化學(xué)式23化學(xué)式24化學(xué)式25化學(xué)式26化學(xué)式27化學(xué)式28化學(xué)式29化學(xué)式30化學(xué)式31化學(xué)式32化學(xué)式33化學(xué)式34化學(xué)式35化學(xué)式36化學(xué)式37化學(xué)式38化學(xué)式39化學(xué)式40化學(xué)式41化學(xué)式42化學(xué)式43化學(xué)式44化學(xué)式45根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的吲唑衍生物化合物由選自由下述化學(xué)式1、化學(xué)式25、化學(xué)式30、化學(xué)式31、化學(xué)式33、化學(xué)式34、化學(xué)式35及化學(xué)式45組成的組中的化學(xué)式表示：化學(xué)式1化學(xué)式25化學(xué)式30化學(xué)式31化學(xué)式33化學(xué)式34化學(xué)式35化學(xué)式45根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種通過(guò)使包括由下述化學(xué)式A表示的化合物的組合物與細(xì)胞接觸來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的方法：化學(xué)式A在化學(xué)式A中，R1為氫、硝基、硝基氧基或Y-羰基，所述Y為氫、羥基、鹵、C1-30烷氧基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-30雜環(huán)烷基、作為雜原子包含氮、氧或硫的C2-20雜環(huán)烯基、C6-30芳基、C1-30烷基或C2-30烯基，R2為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，R3為氫、羥基、鹵、C1-30芳基、C1-30烷氧基、C1-30烷基或C2-30烯基，X為胺基、酰氨基、磺酰氨基、羰基、肟或酰亞胺酰氨。由于本發(fā)明的細(xì)胞重編程(re-programming)誘導(dǎo)方法利用上述本發(fā)明的細(xì)胞重編程誘導(dǎo)用組合物，因而為了避免反復(fù)記載使說(shuō)明書(shū)過(guò)于復(fù)雜，省略?xún)烧咧g共同的內(nèi)容的記載。發(fā)明的效果本發(fā)明特征及優(yōu)點(diǎn)的摘要如下：(a)本發(fā)明涉及細(xì)胞重編程誘導(dǎo)組合物。(b)本發(fā)明的吲唑衍生物化合物呈現(xiàn)改善的生物特征譜并能夠進(jìn)行有效的細(xì)胞重編程。(c)本發(fā)明的吲唑衍生物化合物與如逆轉(zhuǎn)素或BIO等現(xiàn)有低分子細(xì)胞重編程誘導(dǎo)化合物不同地，不呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，因此，當(dāng)臨床應(yīng)用時(shí)，能夠期待在細(xì)胞治療劑或細(xì)胞重編程誘導(dǎo)劑市場(chǎng)高速增長(zhǎng)。(d)另外，現(xiàn)有吲唑衍生物化合物作為細(xì)胞重編程的用途完全未被知道，且由于非特異性細(xì)胞毒性而無(wú)法進(jìn)行高濃度處理。(e)在本發(fā)明的化合物的情況下，與現(xiàn)有吲唑衍生物化合物相比，沒(méi)有細(xì)胞毒性或細(xì)胞毒性顯著低，并且細(xì)胞重編程能力非常優(yōu)異，具有新穎的作用機(jī)理。附圖說(shuō)明圖1及圖2示出在使C2C12小鼠成肌細(xì)胞(myoblast)和本發(fā)明的化合物相接觸后，重編程為成骨細(xì)胞的結(jié)果。在與本發(fā)明的化合物即LDD-1821、LDD-1664、LDD-1945、LDD-2199或LDD-2200接觸后，染成茜素紅色，進(jìn)行觀察(ATDC5:軟骨祖細(xì)胞)。圖3示出在使C2C12小鼠成肌細(xì)胞和本發(fā)明的化合物相接觸后，進(jìn)行茜素紅試驗(yàn)的結(jié)果。圖表示出當(dāng)對(duì)各個(gè)化合物進(jìn)行處理時(shí)的吸光度。圖4示出C2C12小鼠成肌細(xì)胞的MTT比色試驗(yàn)的結(jié)果。具體實(shí)施方式下面，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例只用于更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。合成例合成示意圖1下面，在合成例所記載的反應(yīng)過(guò)程和取代基指代所述合成示意圖中的反應(yīng)過(guò)程和取代基。一般合成過(guò)程步驟(a)的一般過(guò)程在正丁醇(20mL)中溶解起始材料(1.0g，6.02mmol)。然后，向溶液添加水合肼(420uL，7.22mmol)。在110℃下攪拌所述混合物2小時(shí)，放涼，然后向反應(yīng)物添加亞甲基氯(MC)，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例1：5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(化合物1)在正丁醇(20mL)中溶解2-氟-5-硝基芐腈(1.0g，6.02mmol)。然后，向溶液添加水合肼(420uL，7.22mmol)。在110℃下攪拌所述混合物2小時(shí)，放涼，然后向反應(yīng)物添加亞甲基氯，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：84％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.89(d，1H)，8.05(dd，1H)，7.34(d，2H)，5.98(s，2H).MASS＝178.15合成例2：3-氨基-1H-吲唑-5-羧酸(化合物2)在正丁醇(20mL)中溶解3-氰基-4-氟苯甲酸(1.0g，6.02mmol)。然后，向溶液添加水合肼(420uL，7.22mmol)。在110℃下攪拌所述混合物2小時(shí)，放涼，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾，用MeOH進(jìn)行清洗，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：55％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.35(s，1H)，8.45(s，1H)，7.80(d，2H)，7.22(d，1H)，5.59(s，2H).MASS＝177.16步驟(b-2)的一般過(guò)程合成示意圖1，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的化合物(50mg，0.28mmol)溶解于吡啶(0.3mL)中。然后，向反應(yīng)混合物添加R2-苯甲酰氯(16.5uL，0.28mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水(brine)清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空濃縮后，通過(guò)柱層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(化合物3至化合物6)。合成例3(LDD-1664)：N-(5-硝基-1(2)H-吲唑-3-基)-苯甲酰胺(化合物3)將5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(50mg，0.28mmol)溶解于吡啶(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加苯甲酰氯(16.5uL，0.28mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空濃縮后，通過(guò)柱層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：42％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.95(d，1H)，8.22(dd，1H)，8.12(m，2H)，8.12(m，2H)，7.69(m，4H).MASS＝282.26合成例4(LDD-1663)：3-溴-N-(5-硝基-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物4)將5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(0.14mmol)溶解于吡啶(0.4mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加3-溴苯甲酰氯(19uL，0.14mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。向所述提取物添加二氯甲烷(DCM)和核酸，以便形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：37％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.32(s，1H)，8.93(d，1H)，8.26(s，1H)，8.19(dd，1H).MASS＝361.16合成例5(LDD-2348)：4-甲氧基-N-(5-硝基-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物5)將5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(25mg，0.14mmol)溶解于吡啶(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加4-甲氧基苯甲酰氯(24mg，0.14mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空濃縮。通過(guò)柱層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：40％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.93(d，1H)，8.20(dd，1H)，8.12(d，2H)，7.67(d，1H)，7.11(d，2H)，3.86(s，3H).MASS＝312.28合成例6(LDD-1665)：3-苯甲酰氨基-IH-吲唑-5-羧酸(化合物6)將3-氨基-1H-吲唑-5-羧酸(25mg，0.14mmol)溶解于吡啶(0.5mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加苯甲酰氯(16.5uL，0.14mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。利用二氯甲烷形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：31％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.11(d，2H)，7.94(dd，1H)，7.66(t，1H)，7.58(t，3H).MASS＝281.27步驟(c-3)的一般過(guò)程合成示意圖1，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式3的化合物(25mg，0.14mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中。然后，向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(DMAP，0.03mmol)，哌啶(0.17mmol)及二氯化乙烯(EDC，0.28mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例7(LDD-1820)：N-(5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物7)將3-苯甲酰氨基-1H-吲唑-5-羧酸(25mg，0.14mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1mL)中。然后，向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(0.03mmol)，哌啶(0.17mmol)及二氯化乙烯(0.28mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，CDC13)δ11.02(s，1H)，9.26(s，1H)，8.15(s，1H)，8.04(d，2H)，7.59(m，3H)，7.37(d，1H)，7.21(d，1H)，3.59(m，4H)，1.75(m，6H).MASS＝348.41步驟(d-4)的一般過(guò)程合成示意圖1，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式3的化合物(25mg，0.14mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1mL)中。然后，向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(0.03mmol)，叔丁基4-氨基哌啶-1-羧酸(0.17mmol)及二氯化乙烯(0.28mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例8(LDD-1690)：叔丁基4-(3-苯甲酰氨基1H-吲唑-5-羰基)哌嗪-1-羧酸鹽(化合物8)將3-苯甲酰氨基-1H-吲唑-5-羧酸(25mg，0.14mmol)溶解于二甲基甲酰胺(1mL)中。然后，向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(0.03mmol)，叔丁基4-氨基哌啶-1-羧酸(0.17mmol)及二氯化乙烯(0.28mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.82(s，1H)，8.23(s，2H)，8.07(d，2H)，7.85(d，1H)，7.60(m，4H)，3.96(m，3H)，2.79(m，2H)，1.74(m，2H)，1.41(m，11H).MASS＝449.51步驟(e-5)的一般過(guò)程合成示意圖1，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式5的化合物(30mg，0.065mmol)溶解于二氯甲烷(0.7mL)中。然后，在0℃下添加三氟乙酸(TFA，0.2mL)，在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例9(LDD-1691)：N-(5-(哌嗪-1-羰基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物9)將叔丁基4-(3-苯甲酰氨基1H-吲唑-5-羰基)哌嗪-1-羧酸鹽(30mg，0.065mmol)溶解于二氯甲烷(0.7mL)中。接著，在0℃下添加三氟乙酸(0.2mL)，在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和MeOH的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：20％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.86(s，1H)，8.40(d，1H)，8.24(s，1H)，8.07(d，2H)，7.85(d，1H)，7.63(m，4H).MASS＝349.39合成示意圖2下面，在合成例所記載的反應(yīng)過(guò)程和取代基指代所述合成示意圖中的反應(yīng)過(guò)程和取代基。一般合成過(guò)程步驟(a)的一般過(guò)程合成示意圖2，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的化合物(50mg，0.28mmol)溶解于吡啶(0.9mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加R2-苯磺酰氯(36uL，0.28mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。利用二氯甲烷形成沉淀物，然后進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例10(LDD-1667)：N-(5-硝基-1H-吲唑-3-基)苯磺酰胺(化合物10)將5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(50mg，0.28mmol)溶解于吡啶(0.9mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加苯磺酰氯(36uL，0.28mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用醋酸鹽和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。利用亞甲基氯形成沉淀物，然后進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：43％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.14(s，1H)，8.70(d，1H)，8.12(dd，1H)，7.78(d，2H)，7.55(m，4H).MASS＝318.31合成例11(LDD-1666)：3-溴-N-(5-硝基-1H-吲唑-3-基)苯磺酰胺(化合物11)將5-硝基-1H-吲唑-3-基胺(0.28mmol)溶解于吡啶(0.9mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加3-溴苯磺酰氯(40uL，0.28mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。向所述提取物添加二氯甲烷和核酸，以便形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：50％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.99(s，1H)，8.72(d，1H)，8.19(m，1H)，7.99(t，1H)，7.87(d，1H)，7.81(d，1H)，7.63(d，1H)，7.54(t，1H).MASS＝397.20合成例12(LDD-1668)：3-(苯基磺酰氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物12)將3-氨基-1H-吲唑-5-羧酸(25mg，0.14mmol)溶解于吡啶(0.7mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加苯磺酰氯(20uL，0.14mmol)，攪拌1小時(shí)，然后用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。利用甲醇形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：20％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.88(s，1H)，8.42(s，1H)，7.89(dd，3H)，7.63(m，4H).MASS＝317.32步驟(b-2)的一般過(guò)程合成示意圖2，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式7的化合物(25mg，0.08mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.8mL)中。向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(0.02mmol)，叔丁基4-氨基哌啶-1-羧酸(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.16mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例13(LDD-1692)：叔丁基4-(3-(苯基磺酰氨基)-1H-吲唑-5-羰基)哌嗪-1-羧酸(化合物13)將3-(苯基磺酰氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(25mg，0.08mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.8mL)中。向反應(yīng)混合物添加二甲氨基吡啶(0.015mmol)，叔丁基4-氨基哌啶-1-羧酸(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.16mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：50％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.77(s，1H)，8.31(d，2H)，7.83(m，3H)，7.62(m，1H)，7.57(t，2H)，7.44(d，1H).MASS＝485.56步驟(c-3)的一般過(guò)程合成示意圖2，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式8的化合物(20mg，0.038mmol)溶解于二氯甲烷(0.8mL)中。在0℃下添加三氟乙酸(0.15mL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和MeOH的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例14(LDD-1693)：N-(5-(哌嗪-1-羰基)-1H-吲唑-3-基)苯磺酰胺(化合物14)將叔丁基4-(3-(苯基磺酰氨基)-1H-吲唑-5-羰基)哌嗪-1-羧酸(20mg，0.038mmol)溶解于二氯甲烷(0.4mL)中。接著，在0℃下添加三氟乙酸(0.15mL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：20％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.92(s，1H)，8.28(d，1H)，8.22(s，1H)，7.80(m，2H)，7.68(d，1H)，7.38(d，3H)，7.20(d，1H)，3.95(m，1H)，3.16(d，3H)，2.78(t，2H)，1.85(m，2H)，1.57(m，2H).MASS＝385.44合成示意圖3下面，在實(shí)施例所記載的反應(yīng)過(guò)程和取代基指代所述合成示意圖中的反應(yīng)過(guò)程和取代基。一般合成過(guò)程步驟(a)的一般過(guò)程向起始材料(1.0g，6.2mmol)添加水(40mL)，然后對(duì)此添加溶解于水中的亞硝酸鈉(4.3g，62mmol)。接著，向反應(yīng)混合物逐漸滴加3NHCl20分鐘。在常溫下攪拌8小時(shí)，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾。在完全干燥后，獲得目標(biāo)化合物。合成例15：5-硝基-1H-吲唑-3-碳醛(化合物15)向5-硝基-1H-吲哚(1.0g，6.2mmol)添加水(40mL)，然后對(duì)此添加溶解于水中的亞硝酸鈉(4.3g，62mmol)。接著，向反應(yīng)混合物逐漸滴加3NHCl(21mL)20分鐘。在常溫下攪拌8小時(shí)，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾。在真空狀態(tài)下完全干燥后，獲得目標(biāo)化合物(收率：40％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.98(s，1H)，9.75(s，1H)，8.87(s，1H)，8.56(m，2H).MASS＝191.15合成例16：3-甲酰基-1H-吲唑-5-羧酸(化合物16)向1H-吲哚-5-羧酸(1.0g，6.02mmol)添加水(40mL)，然后對(duì)此添加溶解于水中的亞硝酸鈉(4.3g，62mmol)。向反應(yīng)混合物逐漸滴加3NHCl(21mL)20分鐘。在常溫下攪拌8小時(shí)，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾。在真空狀態(tài)下完全干燥后，獲得目標(biāo)化合物(收率：84％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.20(s，1H)，8.74(s，1H)，8.02(d，1H)，7.75(d，2H).MASS＝190.16步驟(b-2)的一般過(guò)程合成示意圖3，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式11的化合物(500mg，2.63mmol)溶解于二甲基甲酰胺(13mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加鹽酸羥胺(550mg，7.89mmol)和三乙胺(110uL，7.89mmol)，在80℃下攪拌12小時(shí)后，利用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，獲得用于進(jìn)行下述反應(yīng)的目標(biāo)化合物。合成例17：5-硝基-1H-吲唑-3-羧醛肟(化合物17)將5-硝基-1H-吲唑-3-碳醛(500mg，2.63mmol)溶解于二甲基甲酰胺(13mL)中。向反應(yīng)混合物添加鹽酸羥胺(550mg，7.89mmol)和三乙胺(110uL，7.89mmol)，在80℃下攪拌12小時(shí)后，利用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，獲得用于進(jìn)行下述反應(yīng)的目標(biāo)化合物(收率：93％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.98(s，1H)，11.12(s，1H)，8.87(s，1H)，8.56(m，2H)，7.95(s，1H).MASS＝206.16合成例18：3-((肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物18)將3-甲?；?1H-吲唑-5-羧酸(500mg，2.63mmol)溶解于二甲基甲酰胺(13mL)中。向反應(yīng)混合物添加鹽酸羥胺(550mg，7.89mmol)和三乙胺(110uL，7.89mmol)，在80℃下攪拌12小時(shí)后，利用乙酸乙酯和1NHCl進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，獲得用于進(jìn)行下述反應(yīng)的目標(biāo)化合物(收率：93％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.61(s，1H)，8.75(s，1H)，8.38(s，1H)，7.96(d，2H)，7.62(d，1H).MASS＝205.17步驟(c-3)的一般過(guò)程合成示意圖3，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式12的化合物(500mg，2.44mmol)溶解于二甲基甲酰胺(12mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加N-氯琥珀酰亞胺(320mg，2.44mmol)，然后在40℃下攪拌混合物1小時(shí)。利用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，利用所獲得的目標(biāo)化合物進(jìn)行下述反應(yīng)。合成例19：N-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-carimidoyl氯化物(化合物19)將5-硝基-1H-吲唑-3-羧基醛(500mg，2.44mmol)溶解于二甲基甲酰胺(12mL)中。向反應(yīng)混合物添加N-氯琥珀酰亞胺(320mg，2.44mmol)，然后在40℃下攪拌混合物1小時(shí)。利用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，獲得目標(biāo)化合物(收率：80％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.98(s，1H)，11.12(s，1H)，8.87(s，1H)，8.56(m，2H).MASS＝240.60合成例20：3-(氯(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物20)將3-(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(500mg，2.44mmol)溶解于二甲基甲酰胺(12mL)中。向反應(yīng)混合物添加N-氯琥珀酰亞胺(320mg，2.44mmol)，然后在40℃下攪拌混合物1小時(shí)。利用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。不經(jīng)過(guò)另外的精制過(guò)程，獲得目標(biāo)化合物(收率：86％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.78(s，1H)，7.99(d，1H)，7.68(d，1H).MASS＝239.62步驟(d-4)的一般過(guò)程合成示意圖3，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式13的化合物(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加R2-苯胺(35μL，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例21(LDD-2369)：Ν'-羥基-5-硝基-N-苯基-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物21)將N-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-carimidoyl氯化物(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。添加苯胺(35μL，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.97(s，1H)，8.90(d，1H)，8.47(s，1H)，8.23(dd，1H)，7.75(dd，1H).MASS＝297.27合成例22(LDD-2370)：N-(4-氟苯基)-Ν'-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物22)將N-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-carimidoyl氯化物(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-氟苯胺(37μL，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.95(s，1H)，8.92(d，1H)，8.49(s，1H)，8.23(dd，1H)，7.75(dd，1H)，6.94(m，2H)，6.75(m，2H).MASS＝315.26合成例23(LDD-2371)：Ν'-羥基-N-(4-羥基苯基)-5-硝基-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物23)將N-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-carimidoyl氯化物(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-羥基苯胺(41mg，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.65(s，1H)，8.92(s，1H)，8.84(d，1H)，8.21(dd，1H)，8.09(s，1H)，7.72(d，1H)，6.60(m，2H)，6.50(m，2H).MASS＝313.27合成例24(LDD-2372)：Ν'-羥基-N-(4-甲氧基苯基)-5-硝基-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物24)將N-羥基-5-硝基-1H-吲唑-3-carimidoyl氯化物(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-甲氧基苯胺(41mg，47mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：33％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.74(s，1H)，8.87(d，H)，8.23(s，1H)，8.21(dd，1H)，7.72(d，1H)，6.68(m，4H).MASS＝327.30合成例25(LDD-1986)：3-(Ν'-羥基-N-苯基碳亞氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物25)將3-(氯(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加苯胺(35μL，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：75％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.82(s，1H)，8.66(s，1H)，8.38(s，1H)，7.95(dd，1H)，7.60(d，1H)，7.07(t，2H)，6.78(t，1H)，6.69(d，2H).MASS＝296.29合成例26(LDD-2197)：3-N-(4-氟苯基)-Ν'-羥基碳亞氨基-1H-吲唑-5-羧酸(化合物26)將3-(氯(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-氟苯胺(37μL，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：29％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.79(s，1H)，8.67(s，1H)，8.40(s，1H)，7.95(dd，1H)，7.60(dd，1H)，6.93(m，2H)，6.714(m，2H).MASS＝314.28合成例27(LDD-2349)：3-(Ν'-羥基-N-(4-羥基苯基)碳亞氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物27)將3-(氯(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-羥基苯胺(41mg，0.38mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：31％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.23(s，1H)，10.45(s，1H)，8.93(s，1H)，8.90(s，1H)，7.92(m，2H)，7.47(d，1H)，6.64(d，2H)，6.40(d，2H).MASS＝312.28合成例28(LDD-2198)：3-(Ν'-羥基-N-(4-甲氧基苯基)碳亞氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物28)將3-(氯(肟基)甲基)-1H-吲唑-5-羧酸(30mg，0.13mmol)溶解于乙醇(1.5mL)中。接著，添加4-甲氧基苯胺(41mg，47mmol)，然后在80℃下攪拌混合物2小時(shí)。利用乙醇將所獲得的殘余物濃縮而除去，然后通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：31％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(s，1H)，8.59(s，1H)，8.11(s，1H)，7.89(dd，1H)，7.54(dd，1H)，6.61(s，4H)，3.58(s，3H).MASS＝326.31步驟(e-5)的一般過(guò)程將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.02mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，在0℃下逐漸滴加四甲基硅烷(TMS)-重氮甲烷(100μL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例29(LDD-2196)：甲基-3-(Ν'-羥基-N-苯基碳亞氨基)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物29)將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.02mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，在0℃下逐漸滴加四甲基硅烷-重氮甲烷(100μL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：83％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.27(s，1H)，9.56(dd，1H)，9.20(s，1H)，8.65(dd，1H)，8.25(dd，1H)，7.54(m，2H)，7.19(t，1H)，7.06(dd，2H)，3.55(s，3H).MASS＝310.31步驟(f-6)的一般過(guò)程合成示意圖3，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式14的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(HOBt，0.04mmol)、哌啶(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例30(LDD-1821)：Ν'-羥基-N-苯基-5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物30)將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、哌啶(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：65％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.67(s，1H)，8.36(s，1H)，7.83(s，1H)，7.55(d，1H)，7.34(d，1H)，7.02(t，2H)，6.73(t，1H)，6.64(d，2H)，3.56(m，4H)，1.58(m，6H).MASS＝363.42合成例31(LDD-2199)：N-(4-氟苯基)-Ν'-羥基-5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物31)將在合成例26獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、哌啶(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：72％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.67(s，1H)，8.41(s，1H)，7.88(s，1H)，7.58(dd，1H)，7.38(dd，1H)，6.915(m，2H)，6.71(m，2H)，3.33(m，4H)，1.62(m，6H).MASS＝381.41合成例32(LDD-2350)：Ν'-羥基-N-(4-羥基苯基)-5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物32)將在合成例27獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、哌啶(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：65％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.25(s，1H)，10.34(s，1H)，8.84(s，1H)，7.96(s，1H)，7.74(s，1H)，7.51(d，1H)，7.31(dd，1H)，6.53(m，2H)，6.44(m，2H)，3.39(m，4H)，1.60(m，6H).MASS＝379.42合成例33(LDD-2200)：Ν'-羥基-N-(4-甲氧基苯基)-5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物33)將在合成例28獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、哌啶(0.09mmol)、TEA(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：41％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.48(s，1H)，8.16(s，1H)，7.82(s，1H)，7.56(dd，1H)，7.36(dd，1H)，3.55(s，3H)，3.46(m，4H)，1.62(m，6H).MASS＝393.45合成例34(LDD-1987)：Ν'-羥基-N-苯基-5-(4-丙基哌嗪-1-羰基)-1H-吲唑-3-羧基酰亞胺酰胺(化合物34)將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、1-丙基哌嗪(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：41％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.69(s，1H)，8.37(s，1H)，7.87(s，1H)，7.59(d，1H)，7.39(dd，1H)，7.06(t，2H)，6.77(t，1H)，6.69(d，2H)，3.45(m'4H)，2.37(m，4H)，2.29(t，2H)，1.47(q，2H)，0.88(m，3H).MASS＝406.49合成例35(LDD-1988)：Ν'-羥基-5-(4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-羰基)-N-苯基-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物35)將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.04mmol)、1-(2-甲氧基乙基)哌嗪(0.09mmol)及二氯化乙烯(0.09mmol)，在常溫下攪拌混合物3小時(shí)。然后用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：36％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.70(s，1H)，8.39(s，1H)，7.87(s，1H)，7.59(d，1H)，7.39(dd，1H)，7.06(t，2H)，6.77(t，1H)，6.69(d，2H)，3.46(m，6H)，3.24(s，1H)，2.52(m，2H)，2.40(m，4H).MASS＝422.49合成例36(LDD-2351)：5-(4-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪-1-羰基)-N'-羥基-N-苯基-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物36)將在合成例25獲得的化合物(20mg，0.06mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.6mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.08mmol)、1-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪(0.19mmol)及二氯化乙烯(0.19mmol)，在常溫下攪拌混合物1小時(shí)。通過(guò)MC:MeOH＝10:1混合溶劑和飽和的NaHCO3水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：16％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.74(s，1H)，8.37(s，1H)，7.870(s，1H)，7.65(s，1H)，7.58(dd，1H)，7.38(dd，1H)，7.20(m，1H)，7.05(t，2H)，6.87(m，1H)，6.77(t，1H)，6.68(d，2H)，4.10(t，2H)，3.46(m，4H)，2.68(t，2H)，2.42(m，4H).MASS＝458.53合成例37(LDD-2352)：5-(4-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪-1-羰基)-N-(4-氟苯基)-N'-羥基-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物37)將在合成例25獲得的化合物(20mg，0.06mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.6mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.08mmol)、1-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪(0.19mmol)及二氯化乙烯(0.19mmol)，在常溫下攪拌混合物1小時(shí)。通過(guò)MC:MeOH＝10:1混合溶劑和飽和的NaHCO3水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：29％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.74(s，1H)，8.42(s，1H)，7.90(s，1H)，7.65(s，1H)，7.58(d，1H)，7.39(dd，1H)，7.20(t，1H)，6.92(m，3H)，6.70(m，2H)，4.10(t，2H)，3.50(m，4H)，2.68(t，2H)，2.40(m，4H).MASS＝476.52合成例38(LDD-2354)：5-(4-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪-1-羰基)-N'-羥基-N-(4-羥基苯基)-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物38)將在合成例25獲得的化合物(20mg，0.06mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.6mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.08mmol)、1-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪(0.19mmol)及二氯化乙烯(0.19mmol)，在常溫下攪拌混合物1小時(shí)。通過(guò)MC:MeOH＝10:1混合溶劑和飽和的NaHCO3水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：14％)。1HNMR(400MHz，DMSC-d6)δ13.29(s，1H)，10.41(s，1H)，8.88(s，1H)，7.99(s，1H)，7.79(s，1H)，7.71(s，1H)，7.55(d，1H)，7.36(dd，1H)，7.22(m.1H)，6.90(m.1H)，6.55(m，2H)，6.49(m，2H)，4.10(t，2H)，3.50(m，4H)，2.67(t，2H)，2.42(m，4H).MASS＝474.52合成例39(LDD-2353)：5-(4-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪-1-羰基)-N'-羥基-N-(4-甲氧基苯基)-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物39)將在合成例25獲得的化合物(20mg，0.06mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.6mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.08mmol)、1-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)哌嗪(0.19mmol)及二氯化乙烯(0.19mmol)，在常溫下攪拌混合物1小時(shí)。通過(guò)MC:MeOH＝10:1混合溶劑和飽和的NaHCO3水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和MeOH的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：31％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.29(s，1H)，10.41(s，1H)，8.88(s，1H)，7.99(s，1H)，7.79(s，1H)，7.71(s，1H)，7.55(d，1H)，7.36(dd，1H)，7.22(m.1H)，6.90(m.1H)，6.55(m，2H)，6.49(m，2H)，4.10(t，2H)，3.50(m，4H)，2.67(t，2H)，2.42(m，4H).MASS＝488.55合成例40(LDD-2319)：叔丁基(2-(2-(2-(4-(3-(Ν'-羥基-N-苯基碳亞氨基)-1H-吲唑-5-羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(化合物40)將在合成例25獲得的化合物(20mg，0.07mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.6mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.11mmol)、叔丁基(2-(2-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(0.14mmol)及二氯化乙烯(0.14mmol)，在常溫下攪拌混合物2小時(shí)。用乙酸乙酯和水對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：90％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.68(s，1H)，8.36(s，1H)，7.82(s，1H)，7.53(d，1H)，7.33(dd，1H)，6.99(t，2H)，6.71(m，2H)，6.63(d，2H)，3.49(m，8H)，3.29(m，4H)，3.01(m，2H)，2.49(m，2H)，2.37(m，4H)，1.32(s，9H).MASS＝595.7合成例41(LDEH2320)：5-(4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-羰基)-N'-羥基-N-苯基-1H-吲唑-3-碳酰亞胺酰胺(化合物41)將在合成例25獲得的化合物(10mg，0.02mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，在0℃下添加三氟乙酸(0.15mL)，在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)利用以氨飽和的氯仿和甲醇的硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：85％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.75(s，1H)，8.40(s，1H)，7.86(s，1H)，7.57(d，1H)，7.38(dd，1H)，7.03(t，2H)，6.75(t，1H)，6.68(d，2H)，3.54(m，12H)，2.86(m，2H)，2.49(m，2H)，2.42(m，4H).MASS＝495.58合成示意圖4下面，在合成例所記載的反應(yīng)過(guò)程和取代基指代所述合成示意圖中的反應(yīng)過(guò)程和取代基。一般合成過(guò)程步驟(a)的一般過(guò)程合成示意圖4，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的化合物(20mg，0.11mmol)溶解于1，4-二惡烷(1mL)中。接著，向溶液添加R2-N-羥基苯亞胺基氯化物(0.17mmol)和TEA(0.22mmol)。在常溫下攪拌所述混合物18小時(shí)后，用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例42(LDD-2194)：3-(Ν'-羥基苯酰亞胺酰胺)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物42)將在合成例2獲得的化合物(20mg，0.11mmol)溶解于1，4-二惡烷(1mL)中。接著，向溶液添加N-羥基苯亞胺基氯化物(0.17mmol)和TEA(0.22mmol)。在常溫下攪拌所述混合物18小時(shí)后，用乙酸乙酯和飽和的NH4Cl水溶液對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。然后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：23％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.31(s，1H)，8.62(m，1H)，7.63(dd，1H)，7.43(m，3H)，7.33(m，2H)，7.16(dd，1H)，6.81(s，2H).MASS＝296.29合成例45(LDD-1945)：N'-羥基-N-(5-(哌啶-1-羰基)-1H-吲唑-3-基)苯酰亞胺酰氨(化合物45)將在合成例44獲得的化合物(10mg，0.04mmol)溶解于1，4-二惡烷(0.4mL)中。接著，向溶液添加N-羥基苯亞胺基氯化物(0.04mL)和TEA(0.08mmol)。在常溫下攪拌所述混合物18小時(shí)，對(duì)所產(chǎn)生的沉淀物進(jìn)行過(guò)濾，然后用亞甲基氯清洗，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：31％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.28(s，1H)，7.91(s，1H)，7.43(m，3H)，7.32(d，2H)，7.18(m，2H)，6.48(s，2H)，3.57(m，4H)，1.54(m，6H).MASS＝363.42步驟(b-2)的一般過(guò)程合成示意圖4，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式17的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，在0℃下逐漸滴加四甲基硅烷-重氮甲烷(100μL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例43(LDD-2195)：甲基-3-(Ν'-羥苯酰亞胺酰氨)-1H-吲唑-5-羧酸(化合物43)將在合成例42獲得的化合物(10mg，0.03mmol)溶解于二甲基甲酰胺(0.3mL)中。接著，在0℃下逐漸滴加四甲基硅烷-重氮甲烷(100μL)，然后在0℃下攪拌30分鐘。在真空下進(jìn)行濃縮后，通過(guò)硅膠層析進(jìn)行精制，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：85％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.31(s，1H)，8.66(m，1H)，7.640(dd，1H)，7.43(m，3H)，7.33(m，2H)，7.19(dd，1H)，6.87(s，2H)，3.84(s，3H).MASS＝310.31步驟(c-3)的一般過(guò)程合成示意圖4，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的化合物(100mg，0.56mmol)溶解于二甲基甲酰胺(2mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.85mmol)、各種胺(0.68mmol)、TEA(1.7mmol)及二氯化乙烯(1.13mmol)，在常溫下攪拌混合物12小時(shí)。用飽和的NaHCO3水溶液和乙酸乙酯對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。利用二氯甲烷和核酸形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物。合成例44：(3-氨基-1H-吲唑-5-基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物44)合成示意圖4，將化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的化合物(100mg，0.56mmol)溶解于二甲基甲酰胺(2mL)中。接著，向反應(yīng)混合物添加羥基苯并三唑(0.85mmol)、各種胺(0.68mmol)、TEA(1.7mmol)及二氯化乙烯(1.13mmol)，在常溫下攪拌混合物12小時(shí)。用飽和的NaHCO3水溶液和乙酸乙酯對(duì)所獲得的殘余物進(jìn)行提取。通過(guò)鹽水清洗結(jié)合的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)行干燥，在真空下濃縮。利用二氯甲烷和核酸形成沉淀物，對(duì)此進(jìn)行過(guò)濾，從而獲得目標(biāo)化合物(收率：41％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.58(s，1H)，7.81(m，1H)，7.24(s，2H)，5.50(s，2H)，3.40(m，4H)，1.61(m，6H).MASS＝244.30試驗(yàn)例試驗(yàn)例1：利用茜素紅染色(Alizarinredstaining)的細(xì)胞篩選誘導(dǎo)直接細(xì)胞重編程(Directcellreprogramming)的低分子化合物的篩選用于尋找誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的化合物的方法基于以往的誘導(dǎo)骨形成的肌肉細(xì)胞的骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換研究PMID:23044010及18974773和逆轉(zhuǎn)素論文(ChenS2004)。將C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞以每孔1×104的密度分注于24-孔形式的細(xì)胞培養(yǎng)皿。在分注后經(jīng)過(guò)24小時(shí)，向3個(gè)孔以1濃度添加感興趣的化合物。作為陽(yáng)性對(duì)照組(Positivecontrol)，對(duì)細(xì)胞用100nM逆轉(zhuǎn)素或2uMBIO進(jìn)行處理。這兩個(gè)化合物是被認(rèn)為誘導(dǎo)肌細(xì)胞的骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換的化合物(ChenS2004andKimWHrecapitulatepapers)。作為陰性對(duì)照組(Negativecontrol)，對(duì)細(xì)胞用DMSO進(jìn)行處理，或沒(méi)有進(jìn)行處理。對(duì)細(xì)胞用化合物進(jìn)行處理總共72小時(shí)，在48小時(shí)后，為了補(bǔ)充化合物而進(jìn)一步進(jìn)行處理。化合物的細(xì)胞毒性由細(xì)胞中消失的部分和當(dāng)培養(yǎng)時(shí)浮漂的細(xì)胞碎片可以確定，而對(duì)引發(fā)毒性的化合物以250nM濃度重新進(jìn)行篩選。72小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)換成骨形成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(用添加有10％FBS，50μg/mL抗壞血酸-2-磷酸鹽，0.1μΜ地塞米松，10mMβ-甘油磷酸酯，50unitsmL-1青霉素，50-1鏈霉素的DMEM進(jìn)行處理14天)。骨形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基基于在以往的直接細(xì)胞重編程(reversinepapaers，ChenS2004andChenS2007)中的描述。對(duì)從肌肉細(xì)胞直接細(xì)胞重編程成的骨細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)在骨系細(xì)胞的鈣沉積(GregoryCA2004：PMID:15136169)是否存在的茜素紅染色(alizarinredstaining)進(jìn)行檢測(cè)。茜素紅染色(Alizarinredstaining)在通過(guò)PBS清洗細(xì)胞一次后，利用磷酸鹽緩沖甲醛水進(jìn)行固定20分鐘。通過(guò)蒸餾水清洗所固定的細(xì)胞，然后將該細(xì)胞浸漬于溶解于水中的1％茜素紅-S(Sigma-Aldrich)5分鐘。利用蒸餾水清洗剩下的染色液。在干燥細(xì)胞后，利用光學(xué)顯微鏡(CKX41Olympus)拍攝染色的細(xì)胞照片。染色的細(xì)胞被視為紅色部分，并將其選擇為“命中(hit)”化合物來(lái)進(jìn)行了更多分析。利用如上所述的試驗(yàn)方法對(duì)所合成的吲唑化合物的細(xì)胞重編程能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)分化成成骨細(xì)胞的過(guò)程中，LDD-1664、LDD-1821、LDD-1945、LDD-2199、LDD-2200呈現(xiàn)與作為陽(yáng)性對(duì)照組的逆轉(zhuǎn)素的重編程能力相當(dāng)?shù)膹?qiáng)大的重編程能力，且LDD-1986、LDD-1987、LDD-1988也呈現(xiàn)重編程能力。在可以確認(rèn)分化成脂肪細(xì)胞的過(guò)程的油紅0染色中，LDD-1821、LDD-1986、LDD-1987、LDD-1988物質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)大的重編程能力。尤其，在LDD-1821的情況下，分化成成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的過(guò)程中都呈現(xiàn)強(qiáng)大的重編程能力(參見(jiàn)圖1、圖2及圖3)?！颈?】細(xì)胞染色結(jié)果++(強(qiáng)陽(yáng)性)，+(弱陽(yáng)性)，-(陰性)試驗(yàn)例2：激酶(Kinase)試驗(yàn)吲唑衍生物的對(duì)于GSK-3β和AuroraA的抑制活性通過(guò)HTRF(homogeneoustime-sesolvedfluorescence)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。HTRF試驗(yàn)是在ATP的存在下確認(rèn)肽物質(zhì)的磷酸化的試驗(yàn)方法。磷酸化的物質(zhì)由TR-FRET(TimeResolved-FluorescenceResonance)信號(hào)探測(cè)。重組的GSK-3β和AuroraA激酶由Millipore(Billerica，MA)購(gòu)買(mǎi)。使用HTRFKinEASE試劑盒(Cisbio)進(jìn)行試驗(yàn)，用1μΜ的吲唑物質(zhì)對(duì)GSK-3β和AuroraA分別進(jìn)行處理，然后確認(rèn)抑制的磷酸化程度。試驗(yàn)由溶解于激酶反應(yīng)緩沖液(250mMHEPES(pH7.0)、0.5mM原釩酸鹽(orthovanadate)、0.05％BSA、0.1％NaN3)中的物質(zhì)-酶混合物和肽物質(zhì)構(gòu)成。在添加檢測(cè)緩沖液后，TR-FRET信號(hào)由EnVisionmulti-labelreader檢測(cè)。用1μΜ的LDD-1664、LDD-1667、LDD-1820及LDD-1821對(duì)GSK-3β和AuroraA分別進(jìn)行處理，酶活性的抑制程度如下表所示。如表2的結(jié)果所示，4種衍生物都在1μΜ濃度下針對(duì)GSK-3β和AuroraA呈現(xiàn)小于50％的抑制活性。并且，呈現(xiàn)卓越的細(xì)胞重編程能力的LDD-1821在1μΜ濃度下針對(duì)兩個(gè)酶完全未呈現(xiàn)抑制活性。由此可知，通過(guò)與作為GSK-3β或AuroraA的抑制劑的BIO和逆轉(zhuǎn)素不同的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞重編程。[表2]激酶試驗(yàn)試驗(yàn)例3：MTT比色試驗(yàn)將C2C12成肌細(xì)胞(myoblast)以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度分注于96-孔板。在培養(yǎng)細(xì)胞一天后，用物質(zhì)進(jìn)行處理。然后，培養(yǎng)細(xì)胞兩天，對(duì)細(xì)胞用包含3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium，DMEM)進(jìn)行處理3小時(shí)。在除去培養(yǎng)基后，在二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中，在搖動(dòng)的同時(shí)培養(yǎng)10分鐘。在570nm用微讀數(shù)器(VersaMax，MolecularDevices公司制)測(cè)量吸光度(參見(jiàn)圖4)。通過(guò)MTT試驗(yàn)對(duì)整理在下表中的化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果，被評(píng)價(jià)的所有吲唑衍生物都呈現(xiàn)10μΜ以上的IC50。在這一點(diǎn)上，吲唑衍生物與呈現(xiàn)高細(xì)胞毒性的現(xiàn)有BIO和逆轉(zhuǎn)素相比，具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。[表3]MTT比色分析的結(jié)果化合物IC50(μΜ)LDD-1821>10LDD-1986>10LDD-1987>10LDD-1988>10LDD-1945>10LDD-2194>10LDD-2195>10LDD-2196>10LDD-2197>10LDD-2198>10LDD-2199>10LDD-2200>10以上對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)闡述，對(duì)具有相關(guān)行業(yè)普遍知識(shí)的人員來(lái)說(shuō)，上述具體技術(shù)只是一種優(yōu)選實(shí)施例，并非用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍可以根據(jù)權(quán)利要求及其等同物進(jìn)行定義。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3