本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及聚肌胞苷酸對(duì)介導(dǎo)肺部組織對(duì)肺炎鏈球菌清除的I型干擾素通路有激活作用。

背景技術(shù)：
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呼吸道的病毒感染是常見呼吸道疾病，且常表現(xiàn)良性的臨床病程。然而，相當(dāng)多一部分的病人發(fā)展成伴隨性或繼發(fā)性細(xì)菌感染^[1][2][3]，這種并發(fā)癥可導(dǎo)致呼吸衰竭或死亡。盡管兒童，老人和免疫力低下的人群常面臨暴發(fā)此類并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)，但是病毒細(xì)菌性肺炎也可能出現(xiàn)于健康成年人，并導(dǎo)致沉重的疾病負(fù)擔(dān)。隨著流感感染流行，病毒-細(xì)菌性肺炎屢次被報(bào)道。它是導(dǎo)致20世紀(jì)的流感流行期和2009年甲型H1N1流感大流行期的患者死亡主要原因^[4][5][6]。

對(duì)于病毒感染是如何促進(jìn)細(xì)菌感染的機(jī)制仍然知之甚少，但有可能極其復(fù)雜。流感研究案例已提出的機(jī)制包括流感引起一般具有保護(hù)性的呼吸道上皮細(xì)胞層的損傷機(jī)制，細(xì)菌介導(dǎo)受體的結(jié)合增強(qiáng)機(jī)制，抗炎因子如IL-10誘導(dǎo)機(jī)制，以及識(shí)別模式分子的表達(dá)如Toll樣受體的減弱機(jī)制^[7][8][9]。此外，近期，我們和其他人發(fā)現(xiàn)，宿主針對(duì)流感的免疫反應(yīng)，如I型和II型干擾素誘導(dǎo)，可能與抑制先天性抗菌免疫應(yīng)答關(guān)鍵環(huán)節(jié)^[10][11][12]。原因包括巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答受損先前文獻(xiàn)顯示：這兩種類型的先天性免疫細(xì)胞在肺部病原菌清除方面具有至關(guān)重要的作用。然而，鑒于流感感染導(dǎo)致肺部的多樣的變化，由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制尚不明確。

此外，流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。在臨床上，許多病毒與細(xì)菌會(huì)形成聯(lián)合感染，包括呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻腔病毒(這兩者都是RNA病毒)^[3][13][14]。因此，我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究，假設(shè)僅僅活化宿主呼吸道疾病的病毒RNA識(shí)別受體將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌清除力的下降。我們?cè)诓捎煤铣苫衔?特別是聚肌胞甘酸，咪喹莫特和嘎德莫特)給藥，接下來，進(jìn)行細(xì)菌感染。此類藥物是眾所周知的可模擬病毒核酸對(duì)免疫系統(tǒng)的影響的藥物。聚肌苷酸是可激活TLR3的合成化合物^[15]，TLR3受體可識(shí)別核內(nèi)dsRNA；還有RIG類似受體(RLRs)維甲酸誘導(dǎo)性基因(RIG-I)和可識(shí)別RNA病毒核酸的黑色素瘤分化-相關(guān)蛋白5(MDA5)細(xì)胞質(zhì)受體^[16]。咪喹莫特和嘎德莫特(R848)激活可識(shí)別單鏈RNA的TLR7^[17][18]。聚肌苷酸和TLR7激動(dòng)劑作為治療或預(yù)防劑，抵御 流感或潛在生物病原體的多種呼吸道病原菌，包括流感，H5N1禽流感病毒，和土拉弗朗西斯菌。它們被認(rèn)為是一種有效且安全的抗病毒免疫反應(yīng)的“助推器” ^{[19][20][21][22]}。以肺部感染小鼠作為動(dòng)物模型，我們以滴鼻給藥的方式，注入聚肌苷酸和TLR7激動(dòng)劑，繼而，以常見的呼吸道病原菌(可導(dǎo)致繼發(fā)性肺炎的病原菌)感染實(shí)驗(yàn)小鼠，最終確定的抗病毒免疫通絡(luò)的激活是否增加宿主繼發(fā)性細(xì)菌感染的敏感性。我們發(fā)現(xiàn)，聚肌苷酸給藥，類似流感感染，損害宿主對(duì)肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的清除力。此外，聚肌苷酸的有害作用可能是由I型干擾素介導(dǎo)的。我們的研究結(jié)果表明，聚肌胞苷酸可能不是一個(gè)良性免疫刺激分子，其作為病毒流行時(shí)的預(yù)防或治療劑的存在疑慮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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由于呼吸道病毒感染較為常見，且相當(dāng)多一部分的病人發(fā)展成伴隨性或繼發(fā)性細(xì)菌感染^[1][2][3]，故其研究備受大眾關(guān)注。迄今為止，對(duì)于病毒感染是如何促進(jìn)細(xì)菌感染的機(jī)制仍然知之甚少。研究證實(shí)宿主針對(duì)流感的免疫反應(yīng)，如I型和II型干擾素誘導(dǎo)，可能與抑制先天性抗菌免疫應(yīng)答關(guān)鍵環(huán)節(jié)^[10][11][12]。但由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制尚不明確。流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。關(guān)于聚肌胞苷酸對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌引起的繼發(fā)性肺炎敏感性的作用報(bào)道較少。

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明第一方面提供肺炎鏈球菌感染后聚肌胞甘酸給藥對(duì)細(xì)菌清除率的影響。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，與咪喹莫特鼻腔給藥組相比，聚肌胞甘酸鼻腔給藥的動(dòng)物肺部肺炎鏈球菌量明顯增加。與生理鹽水對(duì)照組相比，咪喹莫特或者嘎德莫特(TLR配體)給藥組在細(xì)菌清除方面并沒有明顯的差異。因此TLR7配體的單獨(dú)給藥不足以降低細(xì)菌的清除率。

本發(fā)明第二方面提供聚肌胞甘酸增強(qiáng)了肺組織對(duì)細(xì)菌的易感性。

與肺炎鏈球菌相似，在金黃色葡萄球菌感染24h后，聚肌胞甘酸給藥減低其清除率。所以聚肌胞甘酸似乎損害了宿主肺組織對(duì)兩種臨床上引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎病原菌(肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)的防御機(jī)制。

本發(fā)明第三方面提供細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸給藥持續(xù)時(shí)間的正 比關(guān)系。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在經(jīng)1次或3次劑量聚肌胞甘酸或生理鹽水鼻腔給藥24h后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌。在48h時(shí)，記錄機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌量。相關(guān)數(shù)據(jù)一次性聚肌胞甘酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌清除率將呈降低的趨勢(shì)(比生理鹽水對(duì)照組平均的CFU值高8倍，p＝0.05)，同時(shí)經(jīng)3次聚肌胞甘酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺部細(xì)菌的CFU較高(如圖2，比生理鹽水組平均的CFU值高13倍，p＝0.01)。因此，細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸持續(xù)時(shí)間成正比。

本發(fā)明第四方面提供TLR3和Cardif通路有助于聚肌胞甘酸誘導(dǎo)宿主對(duì)細(xì)菌的易感性。

在抗病毒反應(yīng)的初期，Cardif充當(dāng)RIG-I及MDA5信號(hào)的銜接分子^{[25][26][27][28]}。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，TLR3(Tlr3-/-)缺失或Cardif(Cardif－/-)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在聚肌胞甘酸給藥后，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率經(jīng)有所提高。相比于生理鹽水組，雙敲除(Cardif-/-/Tlr3-/-)組在繼發(fā)性細(xì)菌感染環(huán)境下，進(jìn)行聚肌胞甘酸給藥，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率顯著提高。然而，既無Tlr3-/-或Cardif-/-缺陷的動(dòng)物在無聚肌胞甘酸給藥條件下，其肺部肺炎鏈球菌清除率與野生株組相比存在明顯的差異。因此，動(dòng)物模型研究性試驗(yàn)顯示，聚肌胞甘酸對(duì)細(xì)菌清除率的不利影響與TLR3和Cardif依賴性抗病毒通路活化有關(guān)。

本發(fā)明第五方面提供聚肌胞甘酸對(duì)于細(xì)菌清除力的長期不利影響。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在肺炎球菌感染48小時(shí)后，聚肌胞苷酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)含有較高的細(xì)菌量。而在進(jìn)行每3日聚肌胞苷酸給藥，其次進(jìn)行肺炎鏈球菌的感染，并評(píng)估在感染后的第1,3和5天肺部細(xì)菌菌落數(shù)(CFU)后，數(shù)據(jù)顯示直至第5天，生理鹽水對(duì)照組的肺部細(xì)菌量低于檢測(cè)最小值，趨于健康；而聚肌胞甘酸給藥的動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌量增加，趨向于發(fā)病。因此，聚肌胞甘酸對(duì)肺部抗菌防御機(jī)制呈長期不利影響。

本發(fā)明第六方面提供I型干擾素在介導(dǎo)聚肌胞甘酸作用中的角色。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，聚肌胞甘酸鼻腔給藥組的肺部IFN-α水平呈現(xiàn)明顯變化。(Ifnar-/-)動(dòng)物能抵抗聚肌胞甘酸的負(fù)面作用，其細(xì)菌清除率有所增加。在聚肌胞甘酸給藥后，IFNAR阻斷抗體免疫組與IgG處理組相比可更好的控制肺炎球菌 感染。因此，基因缺失還是抗體引起IFNAR阻斷導(dǎo)致I型IFN干擾素信號(hào)的消除，此過程可維護(hù)在聚肌胞甘酸給藥下機(jī)體對(duì)于細(xì)菌清除作用。野生型和Ifnar-/-動(dòng)物在無聚肌胞甘酸給藥條件下，機(jī)體細(xì)菌量沒有明顯變化。此暗示：在無病毒配體條件下，I型干擾素通路并不會(huì)介導(dǎo)肺部組織對(duì)肺炎鏈球菌的清除。

本發(fā)明第七方面提供聚肌胞甘酸給藥引起Ifnar-/-動(dòng)物組中性粒細(xì)胞聚集量增加

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在聚肌胞甘酸給藥3天，接著將野生型和Ifnar-/-的動(dòng)物進(jìn)行鞘內(nèi)肺炎鏈球菌感染后，兩組支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)相似，即總細(xì)胞數(shù)(野生組1.7*10⁶細(xì)胞，Ifnar-/-組2.0*10⁶細(xì)胞)，巨噬細(xì)胞(野生組1.2*10⁶細(xì)胞，Ifnar-/-組21.3*10⁶細(xì)胞)。盡管相比于野生組，Ifnar-/-動(dòng)物機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞量呈兩倍以上的趨勢(shì)(野生組為4.1*10⁵，Ifnar-/-組中性粒細(xì)胞為8.0*10⁵細(xì)胞)，但無顯著性差異。因此，在此動(dòng)物模型中，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物組在感染6h后的清除能力有所提高。與聚肌胞甘酸給藥野生組相比，聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物組的中性粒細(xì)胞聚集量增加，引起機(jī)體對(duì)細(xì)菌清除力增強(qiáng)。

本發(fā)明第八方面提供聚肌胞甘酸引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的野生組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在肺炎球菌感染后7天內(nèi)死亡率為100％。與之相反，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物在細(xì)菌感染(p＝0.01，聚肌胞甘酸給藥野生組相比Ifnar-/-動(dòng)物組)14天后，存活率超過60％。肺炎鏈球菌感染下的生理鹽水對(duì)照組和Ifnar-/-動(dòng)物組無明顯差異。所以聚肌胞甘酸誘導(dǎo)了I型干擾素，而I型干擾素在抗病毒免疫機(jī)制活化條件下可增加動(dòng)物機(jī)體對(duì)肺炎鏈球菌的易感性，進(jìn)而引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實(shí)了聚肌胞甘酸對(duì)肺部抗菌防御機(jī)制呈長期不利影響。發(fā)現(xiàn)咪喹莫特或者嘎德莫特(TLR配體)單獨(dú)給藥不足以降低細(xì)菌清除率，聚肌胞甘酸提高了肺組織對(duì)細(xì)菌的易感性，細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸給藥持續(xù)時(shí)間成正比，TLR3和Cardif通路增加了聚肌胞甘酸誘導(dǎo)宿主對(duì)細(xì)菌易感性，聚肌胞甘酸對(duì)于后細(xì)菌清除力的長期不利影響，I型干擾素在介導(dǎo)聚 肌胞甘酸作用中的角色以及聚肌胞甘酸可引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加。表明聚肌胞苷酸對(duì)介導(dǎo)肺部組織對(duì)肺炎鏈球菌清除的I型干擾素通路有激活作用。

附圖說明：

圖1：聚肌胞甘酸增強(qiáng)了肺組織對(duì)細(xì)菌的易感性。A.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天分別進(jìn)行聚肌胞甘酸，或TLR7激動(dòng)劑(50μg咪喹莫特或50μg嘎德莫特)，或生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)2天。在最后一次劑量后的24小時(shí)，動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌(30μl，共900CFU)。在第3天，取肺組織用于CFU值的計(jì)算。*表示，與生理鹽水和TLR7激動(dòng)劑給藥組相比，通過單因素方差分析得出p＜0.05。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)。B.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸(50μg)或生理鹽水給藥，持續(xù)3天。緊接著24小時(shí)后注射耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)(6×10⁶CFU)。在細(xì)菌注射后的24小時(shí)，取肺組織用于細(xì)菌CFU值的計(jì)算。

圖2：聚肌胞甘酸濃度對(duì)肺部細(xì)菌清除率的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天分別進(jìn)行聚肌胞甘酸(50μg)，或生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)1或3天。在最后一次劑量后的24小時(shí)，動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌(30μl，共1×10⁵CFU)。48小時(shí)后，取肺組 織用于CFU值的計(jì)算。*表示，聚肌胞苷酸給藥組(3種劑量)與生理鹽水組相比，通過單因素方差分析得出p＜0.05。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)(n＝7–8/group)。

圖3：病毒模式識(shí)別通路在介導(dǎo)聚肌胞甘酸引起的免疫機(jī)制中的作用。年齡與性別相匹配的TLR3(Tlr3-/-)缺失、Cardif(Cardif-/-)缺失以及兩者同時(shí)缺失(Cardif-/-/Tlr3-/-，雙敲除)，以及野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行持續(xù)3天的聚肌胞苷酸給藥，緊接著注射肺炎鏈球菌(1×10⁴CFU)。48小時(shí)后，取肺組織用于CFU值的計(jì)算。**表示，野生型給藥組與Cardif-/-/Tlr3-/-組相比，通過單因素方差分析得出p＜0.05。其他比較無顯著性差異。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)。

圖4：在聚肌胞甘酸給藥后期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)菌清除力已有所損害。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天分別進(jìn)行聚肌胞甘酸(50μg)，或生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)3天。在最后一次劑量后的24小時(shí)，動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌(30μl，共1×10⁴CFU)。1,3，或5天后，取肺組織用于CFU值的計(jì)算，接著繪制每組的數(shù)據(jù)(n＝4/group)。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。*表示，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)聚肌胞苷酸給藥組與生理鹽水組相比，通過單因素方差分析得出p＜0.05。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)。

圖5：聚肌胞甘酸給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的I型干擾素的檢測(cè)。A.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天分別進(jìn)行聚肌胞甘酸(50μg)，嘎德莫特(100μg)，或生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)3天。緊接著注射肺炎鏈球菌(7×10⁴CFU)。48小時(shí)后，取肺組織用于ELISA實(shí)驗(yàn)分析IFN-α4。均值和標(biāo)準(zhǔn)差如圖表所示，n＝4/group。*表示，聚肌胞苷酸給藥組與生理鹽水組相比，通過單因素方差分析得出p＜0.05。B.野生型動(dòng)物和I型干擾素受體(Ifnar1-/-)缺陷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸鼻腔給藥，持續(xù)3天。隨后進(jìn)行肺炎鏈球菌感染(7×10⁴CFU)。n＝4/group。*表示p＜0.05。C.野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸鼻腔給藥，持續(xù)3天，接著在第4天注射肺炎鏈球菌(2×10⁴CFU)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)注射IFNAR阻斷抗體與IgG(第1天1.5mg，第3天0.75mg，第5天0.75mg)。在細(xì)菌注射48小時(shí)后取肺組織。*表示p＜0.05。

圖6：在持續(xù)聚肌胞甘酸給藥及肺炎鏈球菌感染下，Ifnar-/-和野生組在后期的存活率及細(xì)菌的清除率。A.年齡與性別相匹配的野生型與Ifnar-/-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn) 行聚肌胞苷酸給藥，持續(xù)3天，緊接著注射肺炎鏈球菌(1×10⁴CFU)，接著進(jìn)行14天的跟蹤，對(duì)瀕死動(dòng)物進(jìn)行安樂死，記錄致死率。**表示，聚肌胞苷酸給藥野生組與Ifnar-/-組相比，通過時(shí)序檢驗(yàn)得到p＝0.001。n＝7-8/group。其他比較無顯著性差異。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)。B、C.在分開的實(shí)驗(yàn)中，年齡與性別相匹配的野生型與Ifnar-/-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥，持續(xù)3天，緊接著注射肺炎鏈球菌(1.5×10⁴CFU)。在細(xì)菌注射后的第3天和第4天，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行安樂死，去肺組織和血液用于細(xì)菌CFU值的計(jì)算。*表示p＜0.05；n＝4/group。數(shù)據(jù)通過兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)耦聯(lián)。

圖7：肺炎鏈球菌感染后Cardif-/-和Ifnar-/-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液及肺組織負(fù)荷。年齡與性別相匹配的Cardif-/-和Ifnar-/-，以及野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射肺炎鏈球菌(1×10⁴CFU)。48小時(shí)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行安樂死，取肺組織及血液用于細(xì)菌CFU值計(jì)算。ns表示無意義比較；直線表示檢測(cè)最小值。數(shù)據(jù)由兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)得到。n＝8/group。

圖8：肺炎鏈球菌感染后Tlr3-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液及肺組織負(fù)荷。年齡與性別相匹配的Tlr3-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射肺炎鏈球菌(1×10⁴CFU)。48小時(shí)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行安樂死，取肺組織及血液用于細(xì)菌CFU值計(jì)算。ns表示無意義比較；直線表示檢測(cè)最小值。數(shù)據(jù)由兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)得到。n＝8-9/group。

圖9：肺炎鏈球菌感染后聚肌胞苷酸給藥動(dòng)物的早期細(xì)菌負(fù)荷和炎癥細(xì)胞的應(yīng)答。年齡與性別相匹配的Ifnar-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥(50μg)，持續(xù)3天，緊接著注射肺炎鏈球菌(7×10³CFU)。6小時(shí)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)。A.第一次1ml的支氣管肺泡灌洗液稀釋5倍，用于細(xì)菌CFU值計(jì)算。B.此時(shí)間點(diǎn)對(duì)于總支氣管肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(多形核白細(xì)胞)總量計(jì)算的描述。C.野生組和Ifnar-/-動(dòng)物機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞量。

圖10：肺炎鏈球菌感染后聚肌胞苷酸給藥動(dòng)物肺部組織學(xué)切片。年齡與性別相匹配的Ifnar-/-和野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天進(jìn)行聚肌胞苷酸給藥(50μg)，持續(xù)3天，緊接著在第3天注射肺炎鏈球菌(1×10⁴CFU)。取肺組織制成切片。組織切片顯示，野生組肺組織呈現(xiàn)大面積的固結(jié)和炎性細(xì)胞浸潤(左)。而Ifnar-/-組 肺組織表現(xiàn)較小面積的炎癥，肺組織大部分正常(右)。肺組織切片的描述代表每一組；n＝3-4/group。

具體實(shí)施方式：

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的相關(guān)配體和抗體的腹腔注射接種法，革蘭氏陽性細(xì)菌的培養(yǎng)法，細(xì)菌注射法，組織及血液取樣方法，CFU值測(cè)定法，細(xì)胞計(jì)算法(雙盲法)，細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法，蘇木精-伊紅石蠟切片制作法，統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

呼吸道的病毒感染是常見呼吸道疾病，且常表現(xiàn)良性的臨床病程。然而，相當(dāng)多一部分的病人發(fā)展成伴隨性或繼發(fā)性細(xì)菌感染^[1][2][3]病毒-細(xì)菌性肺炎屢次被報(bào)道。它是導(dǎo)致20世紀(jì)的流感流行期和2009年甲型H1N1流感大流行期的患者死亡主要原因^[4][5][6]。但由流感誘導(dǎo)的非損傷性的抗病毒免疫通路的活化是否有助于細(xì)菌繼發(fā)性感染的機(jī)制尚不明確，流感導(dǎo)致宿主防御障礙的現(xiàn)象是否與其他病毒病原體相關(guān)尚不清楚。

聚肌胞甘酸，咪喹莫特和嘎德莫特是眾所周知的可模擬病毒核酸對(duì)免疫系統(tǒng)的影響的藥物。以肺部感染小鼠作為動(dòng)物模型，我們以滴鼻給藥的方式，注入聚肌苷酸和咪喹莫特和嘎德莫特，繼而，以常見的呼吸道病原菌(可導(dǎo)致繼發(fā)性肺炎的病原菌)感染實(shí)驗(yàn)小鼠，最終確定聚肌胞甘酸給藥降低細(xì)菌清除率的以及聚肌胞苷酸給藥組動(dòng)物動(dòng)物肺部細(xì)菌量明顯增加，且咪喹莫特或者嘎德莫特單獨(dú)給藥不足以降低細(xì)菌清除率，聚肌胞甘酸增強(qiáng)了肺組織對(duì)細(xì)菌的易感性，細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸給藥持續(xù)時(shí)間成正比，TLR3和Cardif通路增強(qiáng)由聚肌胞甘酸誘導(dǎo)的宿主對(duì)細(xì)菌易感性，聚肌胞甘酸對(duì)于后期細(xì)菌清除力產(chǎn)生不利影響，聚肌胞甘酸可引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加。表明聚肌胞苷酸對(duì)介導(dǎo)肺部組織對(duì)肺炎鏈球菌清除的I型干擾素通路有激活作用。

相關(guān)配體和抗體的腹腔注射接種法

聚肌胞苷酸、咪喹莫特和嘎德莫特是由Invivogen公司提供的。小鼠腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物，使其麻醉，然后使用聚肌胞苷酸(50μg)、咪喹莫特(50μg)和嘎德莫特(100μg)混合于50μl無菌生理鹽水或生理鹽水，鼻內(nèi)給藥。在聚肌胞苷酸給藥第一天注射1.5mg MAR1-5A3抗體(Leinco Technologies,I-401)，小鼠體內(nèi)將產(chǎn)生IFNAR1中和體。緊接著，在第3天及第5天(伴隨肺炎鏈球菌感染)再次注射1.5mg MAR1-5A3抗體，劑量0.75mg。以正常小鼠的IgG表達(dá)水平為對(duì)照。

革蘭氏陽性細(xì)菌的培養(yǎng)法

在肺炎鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)中，甘油凍存的肺炎鏈球菌(ATCC 6303)在Todd-Hewitt液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％的CO2,37℃。在培養(yǎng)6小時(shí)，細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。將細(xì)菌進(jìn)行離心，用無菌PBS將沉淀重懸。通過測(cè)定600nm吸光度預(yù)估細(xì)菌的濃度。

在金黃色葡萄球菌感染實(shí)驗(yàn)中，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株(USA300/LAC)置于胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中，并存儲(chǔ)于37℃的振蕩培養(yǎng)箱(200rpm)中，進(jìn)行過夜培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)的細(xì)菌在經(jīng)1:200稀釋，4個(gè)小時(shí)傳代培養(yǎng)后，處于中期對(duì)數(shù)生長期?？赏ㄟ^測(cè)量600nm的吸光度值預(yù)估細(xì)菌濃度

細(xì)菌注射法

采用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物，經(jīng)腹腔注射實(shí)驗(yàn)小鼠，使其處于麻醉狀態(tài)；其次將小鼠的氣管暴露，采用無菌27號(hào)針頭注射30μl的細(xì)菌培養(yǎng)液；最后將其皮 膚切口縫合。

CFU值測(cè)定法

在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)，在小鼠體內(nèi)注射二氧化碳使其安樂死。結(jié)合肝素抗凝劑，收集小鼠右心室的血液，并用PBS進(jìn)行1:2稀釋，并將10μl血液接種于血瓊脂(用于肺炎鏈球菌培養(yǎng))和胰蛋白酶大豆肉湯瓊脂平板上(用于金黃色葡萄球菌培養(yǎng))，以此來確定血液中細(xì)菌的CFU值。在小鼠肺切除前，將含有5mM EDTA的1mL PBS注入右心室，灌注至肺血管。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)，將整個(gè)肺切除且在含有蛋白酶抑制劑混合物(羅氏公司)的1mL PBS中進(jìn)行勻漿。用PBS將勻漿液進(jìn)行1:5稀釋。每種稀釋液中10μl溶液接種于血瓊脂或TSB瓊脂平板，以確定肺部細(xì)菌的CFU值。

組織取樣方法

在指定的時(shí)間點(diǎn)，收集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織。1ml 4％的多聚甲醛灌注右心室，灌流至肺血管，加以固定。聚乙烯管插入氣管，將約1ml 4％的多聚甲醛灌入，使肺部膨脹，使其固定；其次將氣管的結(jié)扎。切除整個(gè)胸腔，并將其固定，浸泡于多聚甲醛6小時(shí)-過夜，然后將其送至美國加州大學(xué)洛杉磯分校轉(zhuǎn)化病理核心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行石蠟包埋、切片和通過蘇木精-伊紅染色法方法染色。

細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法

Verikine TM鼠干擾素α酶聯(lián)免疫試劑盒從PBL InterferonSource公司(皮斯卡塔韋，新澤西州)購買。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，利用該試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子水平。

細(xì)胞計(jì)算法(雙盲法)

蘇木精-伊紅石蠟切片制作法

統(tǒng)計(jì)分析

通過對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，我們比較了動(dòng)物在輻射劑量大小或時(shí)間長短下的存活曲線。而對(duì)于其他數(shù)據(jù)，通過多重適當(dāng)?shù)谋容^法(雙尾曼-惠特尼U檢驗(yàn)(對(duì)于CFU)或單因素方差分析校正法)顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的重要性。P＝0.05或更低的AP值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有計(jì)算均使用了Windows操作系統(tǒng)中的Prism軟件程序進(jìn)行(格拉夫派得軟件公司)。在所有圖表中誤差線表示SEM和重復(fù)數(shù)。

實(shí)施例1

聚肌胞甘酸提高了肺組織對(duì)細(xì)菌的易感性

我們首先檢測(cè)在細(xì)菌感染后，聚肌胞甘酸給藥對(duì)細(xì)菌清除率的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行持續(xù)兩天(如,2倍劑量)的聚肌胞甘酸或咪喹莫特鼻腔給藥。在第三天(如,最后一次聚肌胞甘酸劑量后的24小時(shí))，動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌。我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)行鼻腔聚肌胞甘酸給藥的動(dòng)物肺部細(xì)菌量明顯增加。有趣的是，與生理鹽水對(duì)照組相比，咪喹莫特或者嘎德莫特(TLR7激動(dòng)劑，如圖1A)給藥組在細(xì)菌清除方面并沒有明顯的差異。但兩組在初始攻毒階段表現(xiàn)強(qiáng)大的清除率。因此TLR7配體的單獨(dú)給藥不足以降低細(xì)菌的清除率。

其次，我們檢測(cè)聚肌胞甘酸是否也降低另一個(gè)重要的引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎的臨床病原菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))的清除率。與上文類相似，在金黃色葡萄球菌感染24h后，聚肌胞甘酸給藥將減低其清除率(圖1B)。因此，聚肌胞甘酸似乎損害了宿主肺組織對(duì)兩種臨床上引起病毒繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎病原菌(肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)的防御機(jī)制。

實(shí)施例2

細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸給藥持續(xù)時(shí)間成正比

我們觀察到，在聚肌胞甘酸給藥后，動(dòng)物機(jī)體體內(nèi)的細(xì)菌清除率下降的時(shí)間點(diǎn)。由于病毒感染，例如流感，通常需要持續(xù)幾天甚至更久的時(shí)間，隨即我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，以1劑量或3次劑量服用聚肌胞甘酸來模擬病毒感染的作用。經(jīng)一次或3次聚肌胞甘酸或生理鹽水鼻腔給藥24h后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鞘內(nèi)注射肺炎鏈球菌。在48h時(shí)，記錄機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌量。我們發(fā)現(xiàn)，聚肌胞甘酸的劑量與細(xì)菌的清除率相關(guān)。一次性聚肌胞甘酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌清除率將呈降低的趨勢(shì)(比生理鹽水對(duì)照組平均的CFU值高8倍，p＝0.05)，同時(shí)經(jīng)3次聚肌胞甘酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺部細(xì)菌的CFU較高(如圖2，比生理鹽水組平均的CFU值高13倍，p＝0.01)。因此，細(xì)菌清除力的損害程度與聚肌胞甘酸持續(xù)時(shí)間成正比。

實(shí)施例3

TLR3和Cardif通路增強(qiáng)由聚肌胞甘酸誘導(dǎo)的宿主對(duì)細(xì)菌易感性

由于聚肌胞甘酸同時(shí)激活了TLR3和Cardif依賴性解旋酶RIG-I和MDA5，我們?cè)噲D確定是否其中一個(gè)或者兩個(gè)通路都與聚肌胞甘酸損害宿主細(xì)菌清除力相關(guān)。對(duì)于此類研究，我們將聚肌胞甘酸用于TLR3(Tlr3-/-)缺失、Cardif(Cardif-/-)缺失以及兩者同時(shí)缺失(雙敲除)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在抗病毒反應(yīng)的初期，Cardif 充當(dāng)RIG-I及MDA5信號(hào)的銜接分子^{[25][26][27][28]}。我們發(fā)現(xiàn)TLR3(Tlr3-/-)缺失或Cardif(Cardif－/-)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在聚肌胞甘酸給藥后，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率經(jīng)有所提高。相比于生理鹽水組，雙敲除(Cardif-/-/Tlr3-/-)組在繼發(fā)性細(xì)菌感染環(huán)境下，進(jìn)行聚肌胞甘酸給藥，機(jī)體內(nèi)細(xì)菌清除率顯著提高(圖3)。然而，既無Tlr3-/-或Cardif-/-缺陷的動(dòng)物在無聚肌胞甘酸給藥條件下，其肺部肺炎鏈球菌清除率與野生株組相比存在明顯的差異。因此，動(dòng)物模型研究性試驗(yàn)顯示，聚肌胞甘酸對(duì)細(xì)菌清除率的不利影響與TLR3和Cardif依賴性抗病毒通路活化有關(guān)。

實(shí)施例4

聚肌胞甘酸對(duì)于后期細(xì)菌清除力產(chǎn)生不利影響

鑒于在肺炎球菌感染48小時(shí)后，聚肌胞苷酸給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)含有較高的細(xì)菌量，我們希望確定，聚肌胞甘酸是否在后期對(duì)細(xì)菌的清除率帶來不利的影響，或聚肌胞甘酸是否只是簡單的延緩了細(xì)菌清除過程。因此我們進(jìn)行每3日聚肌胞苷酸給藥，其次進(jìn)行肺炎鏈球菌的感染，并評(píng)估在感染后的第1,3和5天肺部細(xì)菌菌落數(shù)(CFU)。我們發(fā)現(xiàn)直至第5天，生理鹽水對(duì)照組的肺部細(xì)菌量低于檢測(cè)最小值，趨于健康；而聚肌胞甘酸給藥的動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌量增加(圖4)，趨向于發(fā)病。因此，聚肌胞甘酸對(duì)肺部抗菌防御機(jī)制呈長期不利影響。

實(shí)施例5

聚肌胞甘酸給藥引起Ifnar-/-動(dòng)物組中性粒細(xì)胞聚集量增加

鑒于檢測(cè)炎性細(xì)胞反應(yīng)，我們將聚肌胞甘酸給藥3天；其次，將野生型和Ifnar-/-的動(dòng)物進(jìn)行鞘內(nèi)肺炎鏈球菌感染。在細(xì)菌感染后6h，我們實(shí)行支氣管肺泡灌洗，以檢查炎癥細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，野生和Ifnar-/-組在6h時(shí)的細(xì)菌量存在顯著差異(圖9A)。野生組顯示對(duì)數(shù)倍的細(xì)菌量CFU(野生型組平均CFU為51000，Ifnar-/-為740)。引人注意的是，盡管野生組細(xì)菌量較高，但其炎癥反應(yīng)相比Ifnar-/-缺失組處于緩和狀態(tài)。平均來看，兩組細(xì)胞數(shù)相似，即總細(xì)胞數(shù)(野生組1.7*10⁶細(xì)胞，Ifnar-/-組2.0*10⁶細(xì)胞)，巨噬細(xì)胞(野生組1.2*10⁶細(xì)胞，Ifnar-/-組21.3*10⁶細(xì)胞)(圖9B及數(shù)據(jù)未顯示)。盡管相比于野生組，Ifnar-/-動(dòng)物機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞量呈兩倍以上的趨勢(shì)(野生組為4.1*10⁵，Ifnar-/-組中性粒細(xì)胞為8.0*10⁵細(xì)胞)，但無顯著性差異(圖9C)。因此，在此動(dòng)物模型中，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物組在感染6h后的清除能力有所提高。與聚肌胞甘酸給藥野生組 相比，聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物組的中性粒細(xì)胞聚集量增加，引起機(jī)體對(duì)細(xì)菌清除力增強(qiáng)。

實(shí)施例6

聚肌胞甘酸可引起依賴于I型干擾素的繼發(fā)性細(xì)菌感染宿主的死亡率增加

鑒于聚肌胞甘酸可導(dǎo)致細(xì)菌清除率降低，我們希望檢測(cè)，I型干擾素的消除是否可提高細(xì)菌感染后宿主生存率。我們將聚肌胞甘酸和生理鹽水鼻腔給藥，持續(xù)給藥3天；其次，將野生型和Ifnar-－/-動(dòng)物組進(jìn)行肺炎鏈球菌感染(大約為LD50量)。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至它們滿足標(biāo)準(zhǔn)安樂死或其經(jīng)肺炎鏈球菌感染后14天。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的野生組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在肺炎球菌感染后7天內(nèi)死亡率為100％(圖6A)。與之相反，經(jīng)聚肌胞甘酸給藥的Ifnar-/-動(dòng)物在細(xì)菌感染(p＝0.01，聚肌胞甘酸給藥野生組相比Ifnar-/-動(dòng)物組)14天后，存活率超過60％。肺炎鏈球菌感染下的生理鹽水對(duì)照組和Ifnar-/-動(dòng)物組無明顯差異?？傮w而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚肌胞甘酸誘導(dǎo)了I型干擾素。I型干擾素在抗病毒免疫機(jī)制活化條件下可增加動(dòng)物機(jī)體對(duì)肺炎鏈球菌的易感性。

為了確定宿主死亡機(jī)制，我們?cè)趧?dòng)物進(jìn)行安樂死前檢測(cè)肺部及血液的細(xì)菌量。相比于聚肌胞甘酸給藥Ifnar-－/-組，聚肌胞甘酸給藥野生組的血液及肺部組織內(nèi)的細(xì)菌量較高。以上結(jié)論暗示，在聚肌胞甘酸的給藥和肺炎鏈球菌感染的條件下，I型干擾素的缺失導(dǎo)致細(xì)菌清除力大不相同(圖6B和6C)。其次，我們檢測(cè)聚肌胞甘酸給藥Ifnar-/-組和野生組的肺組織切片。野生組肺組織呈現(xiàn)大面積的固結(jié)和炎性細(xì)胞浸潤，與組織內(nèi)細(xì)菌的增加量一致。而Ifnar-/-組肺組織表現(xiàn)較小面積的炎癥，肺組織大部分正常(圖10)。因此，I型干擾素至少介導(dǎo)聚肌胞甘酸導(dǎo)致機(jī)體在繼發(fā)性細(xì)菌感染后存活率下降的部分機(jī)制，而其主要是通過降低前期和后期機(jī)體細(xì)菌的清除率達(dá)到這一效果。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修 飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。