本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種戴氏蟲草菌絲體多糖的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病以高血糖為主要特征的糖脂代謝紊亂性疾病，是僅次于心腦血管疾病和癌癥，危害人類健康最嚴(yán)重的第三大疾病(Association AD.Diagnosis and classification of diabetes mellitus.Diabetes Care,2012,35,Suppl(1):S42–7；http://www.idf.org/diabetesatlas)。藥物治療是糖尿病的主要治療策略，但是，磺酰脲類、雙胍類、糖苷酶抑制劑類、胰島素增敏類等最常用臨床一線降血糖藥物，有較多的毒副作用，且易引起繼發(fā)性失效，對(duì)糖尿病及并發(fā)癥無效(Turner RC,Cull CA,Frighi V,et al.Glycemic control with diet,sulfonylurea,metformin,or insulin in patients with type 2diabetes mellitus:progressive requirement for multiple therapies(UKPDS 49).Journal of the American Medical Association,1999,281(6):2005-12)。所以，開發(fā)新型高效、低毒的降血糖藥物已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

多糖是天然藥物中主要有效組分，生物活性廣，并具有高效低毒特性，是比較理想的藥源。近些年發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有良好的降血糖功效。蟲草是一類在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景的真菌資源。研究表明，冬蟲夏草、蛹蟲草的菌絲體多糖均具明顯的降血糖、抗糖尿病作用(Kiho T,Ookubo K,Usui S,et al.Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharide(CS-F10)from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis.Biological&Pharmaceutical Bulletin,1999,22(9):966-70；Li SP,Zhang GH,Zeng Q,et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide,with antioxidation,isolated from cultured Cordyceps mycelia.Phytomedicine 2006；13(6):428-33；Zhang G,Huang Y,Bian Y,et al.Hypoglycemic activity of the fungi Cordyceps militaris,Cordyceps sinensis,Tricholoma mongolicum,and Omphalia lapidescens in streptozotocin-induced diabetic rats.Applied Microbiology and Biotechnology 2006；72(6):1152-6)，是制備抗糖尿病藥物和保健品的良好資源。戴氏蟲草(戴氏綠僵菌)Cordyceps taii是我國菌物學(xué)家梁宗琦教授在貴州省首次報(bào)道的一個(gè)新蟲草菌，貴州民間一直誤認(rèn)為冬蟲夏草用于滋補(bǔ)健體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：提供一種戴氏蟲草菌絲體多糖的制備方法。

本發(fā)明還提供了一種戴氏蟲草菌絲體多糖在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：戴氏蟲草菌絲體多糖的制備方法，包括如下步驟：

1)采用戴氏蟲草GYYA0601菌株制備戴氏蟲草菌絲體；

2)將戴氏蟲草菌絲體干燥后，粉碎至過60-100目分子篩，獲得戴氏蟲草菌絲體粉末；

3)將戴氏蟲草菌絲體粉末中按1:3-5的料液比加入石油醚脫脂，料液比的單位為g/ml；將脫脂后菌絲粉按1：5-15料液比加入蒸餾水，料液比的單位為g/ml，采用水提醇沉的方法提取粗多糖；將粗多糖經(jīng)去蛋白、脫色和透析后，濃縮醇沉，得到戴氏蟲草菌絲體多糖。

戴氏蟲草菌絲體多糖在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果提示，戴氏蟲草菌絲體粗多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變等多種活性(梁宗琦.中國真菌志.第32卷,蟲草屬.北京：科學(xué)出版社,2007)。申請(qǐng)人在貴陽一個(gè)茶場(chǎng)采集并分離到戴氏蟲草GYYA0601菌株(戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株)，保藏編號(hào)是CGMCC No.2880。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，其菌絲體多糖經(jīng)由抗氧化應(yīng)激及免疫調(diào)節(jié)來延緩衰老，該多 糖是一種半乳葡萄甘露聚糖(Xiao JH,Xiao DM,Chen DX,et al.Polysaccharides from the medicinal mushroom Cordyceps taii show antioxidant and immunoenhancing activities in a D-galactose-induced aging mouse model.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume,2012(2012),Article ID 273435,15pages)。值得提出的是，氧化應(yīng)激是糖尿病的病理機(jī)制之一。機(jī)體抗氧化防御體系難以平抑高糖狀態(tài)所致大量自由基引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成胰島細(xì)胞受損，同時(shí)也降低外周組織對(duì)胰島素的敏感性而產(chǎn)生胰島素抵抗，這些因素促進(jìn)了糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展(Forbes JM,Coughlan MT,Cooper ME(2008)Oxidative stress as a major culprit in kidney disease in diabetes.Diabetes 57:1446–54；Stadler K.Oxidative stress in diabetes.Advances in Experimental Medicine and Biology.2012；771:272-87)。而且，氧化應(yīng)激和胰島素抵抗是相輔相成，胰島素抵抗又促進(jìn)氧化應(yīng)激(Dong F,Fang CX,Yang X,et al.Cardiac overexpression of catalase rescues cardiac contractile dysfunction induced by insulin resistance:Role of oxidative stress,protein carbonyl formation and insulin sensitivity.Diabetologia.2006；49(6):1421-33)。因此，降低機(jī)體的氧化應(yīng)激可能是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效方法，利用抗氧化天然產(chǎn)物開發(fā)新型抗糖尿病及其并發(fā)癥藥物的新方向。因此，申請(qǐng)人以具明顯抗氧化應(yīng)激能力的戴氏蟲草菌絲體多糖為研究對(duì)象，首次系統(tǒng)地研究了其制備方法及對(duì)α-葡萄糖苷酶、糖尿病動(dòng)物模型的作用。本發(fā)明提供的戴氏蟲草菌絲體多糖制備方法及在抗糖尿病藥物或輔助降糖保健品中的應(yīng)用，至今未見報(bào)道。

本發(fā)明通過戴氏蟲草GYYA0601菌株來制備戴氏蟲草菌絲體多糖，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)該菌絲體多糖在作為治療糖尿病的藥物上具有良好效用，它能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，能顯著降低糖尿病人的血糖值、改善胰島β細(xì)胞受損程度，增加胰島素分泌，還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)預(yù)防和治療糖尿病，具有療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

附圖1為戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠模型胰島組織細(xì)胞影響(200×)；

A-正常組NG；B-模型組MCG；C-陽性對(duì)照組PG；D-高劑量組HG；E-中劑量組MG；F-低劑量組LG。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例1：戴氏蟲草發(fā)酵品的生產(chǎn)

1、多糖是從蟲草真菌戴氏蟲草(戴氏綠僵菌)GYYA0601菌株發(fā)酵菌絲體中分離得到。戴氏蟲草菌種保藏編號(hào)為CGMCC NO.2880，申請(qǐng)人在先申請(qǐng)的已授權(quán)專利(ZL 200910301440)已經(jīng)公開。

2、戴氏蟲草斜面種子培養(yǎng)基配方包括蔗糖25g、黃豆3g、酵母膏5g、蛋白胨2g、麥麩3g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、瓊脂18g、蒸餾水1L、初始pH 7.0；戴氏蟲草液體種子或/發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括蔗糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蒸餾水1L，初始pH 7.0。

3、戴氏蟲草斜面種子23-28℃培養(yǎng)7-15天，置于4℃保藏備用。移植斜面菌種到盛有120mL液體種子培養(yǎng)基的500mL規(guī)格的搖瓶中，然后置于旋轉(zhuǎn)搖床，120-180r/min，25-30℃培養(yǎng)4d，制備發(fā)酵液體種子。50L發(fā)酵罐裝33L發(fā)酵培養(yǎng)基，按體積系數(shù)4％(v/v)的比例接種發(fā)酵液體種子，150-250r/min，28℃條件下發(fā)酵60-80h。發(fā)酵終止后，減壓抽濾發(fā)酵產(chǎn)物，用蒸餾水清洗3次，將其置于烘箱，45-60℃干燥至恒重，稱量發(fā)酵品干重。干燥后的發(fā)酵品搗成粉末，過60-100目分子篩，密封-20℃冷藏備用。

本發(fā)明的實(shí)施例2：戴氏蟲草菌絲體多糖的制備

將戴氏蟲草菌絲體粉末中按1:3-5的料液比加入石油醚脫脂，料液比的單位為g/ml；將脫脂后菌絲粉按1：5-15料液比加入蒸餾水，料液比的單位為g/ml，并在沸水浴中浸提1-3小時(shí)，重復(fù)2-4次，抽濾，合并濾液，然后減壓濃縮至1/3-1/4體積，將濃縮濾液置于燒杯 中，加入質(zhì)量百分比為80-90％的乙醇，4℃冰箱靜置過夜，離心取得沉淀物；再按1：1-3的料液比(單位g/ml)加入蒸餾水溶解沉淀物，然后加入質(zhì)量百分比為80-90％的乙醇，4℃冰箱靜置過夜，重復(fù)此操作直至乙醇液無明顯顏色；將分離得到的總沉淀物干燥，即獲得粗多糖；采用水提醇沉的方法提取粗多糖；采取Sevag去游離蛋白，然后采用活性炭或雙氧水脫色，再用3500kD分子量的對(duì)流水法透析24小時(shí)，濃縮醇沉后得到戴氏蟲草菌絲體多糖。

本發(fā)明的實(shí)施例3：戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

1、陽性藥阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性：構(gòu)建酶反應(yīng)體系，微量篩選標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系共140μL，每孔先分別加磷酸鹽緩沖液20μL，再分別取0.001、0.01、0.1、1mg/mL阿卡波糖溶液各20μL于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，最后依次加入60μL 20U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液和10μL10mmol/L的PNPG溶液，混合均勻后，于37℃保溫30min，然后每孔加入30μL 1mol/L Na₂CO₃終止反應(yīng)，此時(shí)呈現(xiàn)黃色，酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的OD值，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和背景對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算出阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性(見表1)：

2、戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性：用以上構(gòu)建的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型對(duì)戴氏蟲草菌絲體多糖進(jìn)行篩選和最佳劑量的研究，并求出IC₅₀。每孔分別加20μL磷酸鹽緩沖液，再分別取5、10、20、40、80、200、300mg/ml濃度多糖溶液20μL加入酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系里，與60μL 20U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和10μL 10mmol/L的PNPG溶液混合均勻后，于37℃共同孵育30min，終止液 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的OD值，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和背景對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。同樣，根據(jù)上述公式計(jì)算出戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結(jié)果見表1，計(jì)算其IC₅₀值為105.95mg/mL。

表1戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

本發(fā)明的實(shí)施例4：戴氏蟲草菌絲體多糖的抗糖尿病作用

1、糖尿病模型的構(gòu)建與給藥：雄性昆明小鼠(20-30g)，于清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(溫度：25±2℃濕度：60±5％，光照：12h/d，通風(fēng)良好)飼養(yǎng)7d適應(yīng)環(huán)境后，小鼠被隨機(jī)分為2組，其中正常對(duì)照組(normal control group,NC)8只，其余小鼠被用來造模，造模組小鼠隔夜禁食12h(自由飲水)后，100mg/kg一次性腹腔注射STZ(檸檬酸鹽緩沖液，pH＝4.44)，在STZ注射4h后，喂小鼠5％的葡萄糖溶液，避免小鼠因低血糖死亡，5d后，尾靜脈取血后用血糖儀檢測(cè)空腹血糖，連續(xù)3次，血糖值>11.1mmol/L為造模成功。正常組小鼠1次性注射檸檬酸鹽緩沖液，藥物對(duì)照組采用0.5ml 0.9％的生理鹽水。將造模成功小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組(NG，0.9％生理鹽水)、模型對(duì)照組(MCG,0.9％生理鹽水)、陽性對(duì)照組(PG,300mg/kg/d的二甲雙胍)、低劑量多糖組(LG,100mg/kg/d)、中劑量多糖組(MG,200mg/kg/d)、高劑量多糖組(HG,400mg/kg/d)，每組12只。

2、戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響:如表2所示，在造模組小鼠100mg/kg STZ單次腹腔注射5d后，與正常組相比，小鼠空腹血糖顯著升高(P＜0.01)，說明糖尿病模型構(gòu)建成功；與模型組相比，CTP灌胃治療組血糖值在給藥周期內(nèi)明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，戴氏蟲草菌絲體多糖能明顯降低糖尿病小鼠的血糖水平。

表2戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖的影響(n＝12)

注:與MCG比較,^aP<0.05,^bP<0.01；與NG比較：^cP<0.01

3、戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素的影響：如表3所示，正常組相比，模型組血清胰島素含量明顯下降(^aP＜0.05)；與模型組相比，所有給藥組血清胰島素含量顯著升高，且在^bP<0.01水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，戴氏蟲草菌絲體多糖能夠促進(jìn)糖尿病小鼠胰島素的分泌。另外，病理分析結(jié)果提示(見圖1)，NG組小鼠胰島細(xì)胞成團(tuán)分布于胰腺外分泌腺內(nèi)，胰島邊緣形狀規(guī)則，并且與外分泌腺之間周界清楚，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多，胰島細(xì)胞核呈圓形藍(lán)色著染，胞質(zhì)豐富淺粉色著染；MCG組小鼠胰島邊緣形狀不規(guī)則，胰島萎縮，中央部空泡變性，胰島β細(xì)胞數(shù)減少，胰島細(xì)胞分布雜亂，部分增生排列成腺管樣結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞代償性肥大；包括PG在內(nèi)四個(gè)給藥組 小鼠胰腺較完整，胰島β細(xì)胞數(shù)量較模型組多且分布均勻，說明戴氏蟲草菌絲體多糖有保護(hù)胰島細(xì)胞的功能，且高劑量組效果優(yōu)于中、低劑量組。

表3戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素的影響(n＝12)

注:與NG比較：^aP<0.01；與MCG比較^bP<0.01；

模型組MCG；C-陽性對(duì)照組PG；D-高劑量組HG；E-中劑量組MG；F-低劑量組LG.4、戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠外周血白細(xì)胞的影響：由表4可知，糖尿病模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)量低于正常組，但沒有顯著性差異；與模型組相比，戴氏蟲草菌絲體多糖灌胃治療組白細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(P＜0.01)；白細(xì)胞數(shù)量增加與戴氏蟲草菌絲體多糖呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系；當(dāng)灌胃劑量為400mg/kg/d時(shí)，效果優(yōu)于陽性藥二甲雙胍的療效，說明戴氏蟲草菌絲體多糖能夠提升機(jī)體的免疫保護(hù)作用。

表4戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響(n＝12)

注:與MCG比較^aP<0.01；

5、戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響：與正常組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，高劑量給藥組能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)，因此，戴氏蟲草菌絲體多糖能夠提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

表8戴氏蟲草菌絲體多糖對(duì)糖尿病小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響

(n＝8-12)

注:與NG比較,^aP<0.05；與MCG比較,^bP<0.05

本發(fā)明的實(shí)施例5：戴氏蟲草菌絲體多糖單獨(dú)或組合藥物(包括藥用載體或賦形劑或抗糖尿病藥)按處方量加入適量輔料混勻壓制成圓片狀或異性片狀的片劑(包括素片、糖衣片、薄膜衣片等)；或按處方量加入適宜輔料填充于空心膠囊或密封于軟質(zhì)囊材中的膠囊制劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊等)；或按處方量加入適量的輔料制定一定粒度的顆粒制劑；或按處方量加入適量的黏合劑或其它輔料制成丸形或類丸形的丸劑；或按處方量加入適量濃蔗糖水溶液制成的糖漿劑；或按處方量與適宜的基質(zhì)加熱熔融混勻后，滴入不相混溶的冷凝液中，收縮冷凝而制成的球形或類球形的滴丸劑；或按處方量加入茶水或其他輔料混合制成的其它內(nèi)服水劑。

本發(fā)明的給藥劑量取決于多種因素，包括預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán) 重程度，動(dòng)物或患者的性別、年齡、體重、個(gè)體反應(yīng)、給藥途徑、給藥次數(shù)等。因此，給藥劑量有大范圍變化?？筛鶕?jù)本發(fā)明復(fù)合物生產(chǎn)的制劑中所含實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到其治療目的。