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一種發(fā)酵蟲草菌絲體粉及其制備方法與流程

文檔序號:11392095閱讀:469來源:國知局

本發(fā)明涉及一種發(fā)酵蟲草菌絲體粉、其制備方法及其在制備增強(qiáng)免疫功能制劑中的應(yīng)用。



背景技術(shù):

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)名貴的強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥材,由于天然蟲草有其嚴(yán)格的寄生性及特殊的生長環(huán)境,加之近年來生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞,天然蟲草資源銳減,價格猛漲。隨著人民生活水平的不斷提高,對蟲草的需求量正日益增大,因此,人工培養(yǎng)蟲草菌絲體替代天然蟲草成為當(dāng)務(wù)之急。現(xiàn)代科學(xué)研究表明,蟲草菌絲體中富含蟲草酸、蟲草素、sod酶、蟲草多糖等功效成分,其含量基本與天然冬蟲夏草相同,蟲草菌絲體同樣具有提高人體免疫力、抗疲勞、預(yù)防心腦血管疾病及抗腫瘤等多種促進(jìn)人體健康的功能,產(chǎn)品保健功效顯著,是天然冬蟲夏草理想的替代品,有廣闊的發(fā)展前景。

鈣元素是人體中含量最多的無機(jī)鹽,占人體體重的2%,具有多種重要的生理功能,享有“生命元素”之稱。鎂是人體必需的重要元素之一,體內(nèi)鎂的總量約為21-28g。鎂元素在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面起重要作用:參與免疫球蛋白的合成、參與激活補(bǔ)體、調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的吞噬功能、調(diào)節(jié)t淋巴細(xì)胞的成熟和功能,低鎂可致血免疫球蛋白降低。鐵是人體含量最多的必需微量元素,人體總含量為3-5克。在人體所必需的十多種微量元素中,鐵無論在重要性上還是在數(shù)量上都居首位,堪稱“微量元素中的老大”。鋅是人體不可缺少的微量元素之一,人體內(nèi)含鋅量約為2-3g。鋅元素參與體內(nèi)多種生理活動,具有重要的生理功能:其能直接作用于脾臟、扁桃體及胸腺等免疫器官,并作用于多種免疫物質(zhì)與免疫細(xì)胞,促進(jìn)生長,提高機(jī)體免疫力;維持機(jī)體的正常生長發(fā)育;維持正常的味覺功能及食欲;促進(jìn)正常的性發(fā)育等。

蟲草酸、蟲草素、sod酶是蟲草菌絲體本身含有的特征性功效成分。國內(nèi)外目前關(guān)于富含鈣、鎂、鐵、鋅的蟲草菌絲體產(chǎn)品及其制備方法幾乎沒有。本發(fā)明在專利申請?zhí)枮?01310124056.3的“一種蟲草菌絲體及制備方法”的基礎(chǔ)上進(jìn)行了研究、改進(jìn),在未增加工藝復(fù)雜性、投入成本更低的情況下,得到了鈣、鎂、鐵、鋅、蟲草酸、蟲草素、sod酶含量更高的蟲草菌絲體粉,產(chǎn)品的保健功能更強(qiáng)。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的發(fā)酵蟲草菌絲體粉及其制備方法,所述產(chǎn)品較現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)出的蟲草菌絲體粉含有更高的鈣、鎂、鐵、鋅等元素,并且蟲草酸、蟲草素、sod酶等特征性功效成分含量更高,且不增加工藝的復(fù)雜性,投入成本更低;

本發(fā)明的另一目的在于提供一種在制備增強(qiáng)免疫功能制劑中具有更好的增強(qiáng)機(jī)體免疫效果的蟲草菌絲體粉。

為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用下列技術(shù)方案實現(xiàn)。

菌種接種恒溫培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方組成及重量比為:麥芽糖1%-3%,雞蛋蛋白粉2%-8%,kh2po40.1%-0.5%,硫酸鎂0.1%-3%,水余量。

為進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的,其配方組成及重量比為:麥芽糖1.5%-2.5%,雞蛋蛋白粉4%-6%,kh2po40.2%-0.4%,硫酸鎂0.5%-2.5%,水余量;更優(yōu)選的配方組成及重量比為:麥芽糖2%,雞蛋蛋白粉5%,kh2po40.3%,硫酸鎂0.2%,水余量。

種子罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方組成及重量比為:馬鈴薯粉15%-30%,葡萄糖1%-4%,乳清濃縮蛋白2%-5%,kh2po40.1%-0.5%,硫酸鎂0.1%-3%,水余量。

為進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的,其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉20%-25%,葡萄糖2%-3%,乳清濃縮蛋白3%-4%,kh2po40.2%-0.4%,硫酸鎂0.5%-2.5%,水余量;更優(yōu)選的配方組成及重量比為:馬鈴薯粉20%,葡萄糖3%,乳清濃縮蛋白4%,kh2po40.2%,硫酸鎂0.1%,水余量。

發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方組成及重量比為:大豆分離蛋白4%-10%,脫脂奶粉4%-10%,酶解骨粉8%-12%,葡萄糖1%-3%,水余量;所述酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

為進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的,其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白5%-8%,脫脂奶粉5%-8%,酶解骨粉9%-11%,葡萄糖2%-3%,水余量;更優(yōu)選的配方組成及重量比為:大豆分離蛋白5%,脫脂奶粉5%,酶解骨粉10%,葡萄糖3%,水余量。

本發(fā)明采用蝙蝠蛾擬青霉為菌種,通過菌種接種恒溫培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、超低溫真空濃縮、冷凍干燥、粉碎等工藝制備而成。

具體步驟為:

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖1%-3%,雞蛋蛋白粉2%-8%,kh2po40.1%-0.5%,硫酸鎂0.1%-3%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在120-130℃條件下滅菌18-30分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至20-30℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,15-30℃恒溫培養(yǎng)5-10天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉15%-30%,葡萄糖1%-4%,乳清濃縮蛋白2%-5%,kh2po40.1%-0.5%,硫酸鎂0.1%-3%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量6.5%-8.0%,溫度15-30℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白4%-10%,脫脂奶粉4%-10%,酶解骨粉8%-12%,葡萄糖1%-3%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.0%-3.5%,溫度15-30℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.2-1.3g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

本發(fā)明所述的菌種接種恒溫培養(yǎng)的培養(yǎng)基,其氮源采用雞蛋蛋白粉,雞蛋蛋白粉屬動物源蛋白質(zhì),含有90%以上的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸種類齊全且含量豐富,營養(yǎng)價值高。經(jīng)過篩選對比試驗后發(fā)現(xiàn),以雞蛋蛋白粉做為氮源,可明顯的促進(jìn)接種恒溫培養(yǎng)階段的蟲草菌絲體的生長,是此階段的最佳氮源。礦物質(zhì)鉀、磷、鎂對蟲草發(fā)酵具有重要影響,因此在培養(yǎng)基中加入適量的kh2po4和硫酸鎂,以促進(jìn)蟲草菌絲體的生長。

本發(fā)明所述的種子罐培養(yǎng)基,其氮源采用乳清濃縮蛋白,乳清濃縮蛋白來源于牛乳,含有80%以上的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸種類齊全且含量豐富,營養(yǎng)價值高。經(jīng)過篩選對比試驗后發(fā)現(xiàn),以乳清濃縮蛋白做為氮源,可明顯的促進(jìn)種子罐培養(yǎng)階段的蟲草菌絲體的生長,是此階段的最佳氮源。礦物質(zhì)鉀、磷、鎂對蟲草發(fā)酵具有重要影響,因此在培養(yǎng)基中加入適量的kh2po4和硫酸鎂,以促進(jìn)蟲草菌絲體的生長。

本發(fā)明所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基,以大豆分離蛋白、脫脂奶粉為氮源,大豆分離蛋白含有90%以上的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),屬于植物性蛋白,脫脂奶粉含有34%的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),屬于動物性蛋白,兩者復(fù)配使用,可實現(xiàn)氨基酸的互補(bǔ),彌補(bǔ)兩種蛋白質(zhì)中限制性氨基酸的不足,顯著提高營養(yǎng)價值。經(jīng)過篩選對比試驗后發(fā)現(xiàn),以大豆分離蛋白和脫脂奶粉做為氮源,可明顯的促進(jìn)發(fā)酵罐培養(yǎng)階段的蟲草菌絲體的生長,是此階段的最佳氮源。酶解骨粉來源于天然牛骨,富含鈣、鎂、鐵、鋅等多種礦物元素,是純天然的礦物質(zhì)集合體,與無機(jī)礦物質(zhì)相比,安全性高,生物利用率高,營養(yǎng)價值高,并可以明顯促進(jìn)蟲草菌絲體的生長。

蟲草酸是蟲草菌絲體的主要活性成分之一,其屬于弱酸,對溫度敏感,遇熱易揮發(fā);蟲草素是蟲草菌絲體的主要活性成分之一,屬于腺苷類似物,其熱穩(wěn)定性也較差;sod酶是蟲草菌絲體的主要活性成分之一,屬于生物酶類,遇高溫容易變性從而失去生物活性。本發(fā)明所述的超低溫真空濃縮和冷凍干燥工藝,是在較低的加工溫度條件下,實現(xiàn)了蟲草菌絲體的濃縮和干燥過程,與現(xiàn)有技術(shù)相比,更好的保留了蟲草菌絲體中的對熱敏感的活性物質(zhì)。

發(fā)明人通過大量的實驗研究,發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲體對礦物質(zhì)元素富集能力高。本發(fā)明采用特定的培養(yǎng)基及制備方法,生產(chǎn)出富含鈣、鎂、鐵、鋅的蟲草菌絲體,同時明顯提高了蟲草菌絲體中蟲草酸、蟲草素、sod酶等活性成分的含量。藥理實驗和臨床實驗數(shù)據(jù)表明,蟲草菌絲體具有顯著的免疫調(diào)節(jié)的功能;鈣、鎂、鋅、鐵元素均是人體必需的礦物元素,與人體免疫系統(tǒng)關(guān)系密切,具有提高機(jī)體免疫力的功效。兩者相輔相成,協(xié)同增效,可以明顯增加產(chǎn)品此方面的保健功效。

發(fā)明人在研究蟲草菌絲體粉的制備工藝時,意外發(fā)現(xiàn)選擇步驟二種子罐培養(yǎng)過程中接入步驟一培養(yǎng)好的菌種的接種量為6.5%-8.0%,步驟三發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中選擇本發(fā)明特定工藝制備的酶解骨粉配制培養(yǎng)基,而僅接入步驟二培養(yǎng)好的菌種3.0%-3.5%,不改變其他步驟工藝參數(shù)的情況下,所制得的蟲草菌絲體粉的產(chǎn)量幾乎沒有變化,但產(chǎn)品中鈣含量、鎂含量、鐵、鋅、蟲草酸、蟲草素、sod酶活力均有不同程度的提升。經(jīng)檢測,本發(fā)明所述的蟲草菌絲體粉,較申請?zhí)枮?01310124056.3生產(chǎn)的蟲草菌絲體粉,產(chǎn)品中鈣含量提高15~20%;鎂含量提高5~8%;鐵含量提高5~7%;鋅含量提高6~9%;蟲草酸含量提高5~8%;蟲草素含量提高6~10%;sod酶活力提高4~7%。

經(jīng)功能試驗證明,本發(fā)明所述的蟲草菌絲體粉,較現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的蟲草菌絲體粉具有更加顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫的效果。

本發(fā)明所述的蟲草菌絲體粉可與任何一種或一種以上藥劑學(xué)上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、葡萄糖、甘露醇等混合制成的各種劑型,例如,可制成片劑、緩釋片、粉劑、滴丸、顆粒劑、膠囊劑、微粒劑。優(yōu)選劑型為膠囊劑或粉劑。

試驗例:

下面通過臨床試驗數(shù)據(jù),進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果:

1材料和方法:參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中增強(qiáng)免疫力功能檢驗方法與操作規(guī)程進(jìn)行。

1.1試驗動物與造模

昆明種spf級小鼠,雌性,由重慶市實驗動物中心提供,體質(zhì)量為16~18g,放入動物房適應(yīng)3d后,體質(zhì)量為18~22g開始造模,腹腔內(nèi)注射100mg/kg環(huán)磷酰胺,1次/d,連續(xù)3天。

1.2分組與給藥劑量

每個實驗分為四組,即實驗a組、實驗b組、實驗c組、空白對照組,每組10只。實驗a組為服用本發(fā)明實施例1制得的蟲草菌絲體粉,實驗b組為服用專利申請?zhí)枮?01310124056.3中的實施例1制得的蟲草菌絲體粉(其步驟三中酶解骨粉采用以下方法制備:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉),實驗c組為服用從江西中科生物有限公司購得的蟲草菌絲體粉,按照成人一天推薦量2g/60kg計算,相當(dāng)于0.03g/日/kg體重,實驗量設(shè)人體推薦量的10倍,即每日0.3g/kgbw。受試物以無菌水配制,每日一次經(jīng)口給予,連續(xù)灌胃30天后測各項指標(biāo)??瞻讓φ战M給予同劑量的生理鹽水。

1.3試驗方法

1.3.1體重、臟器/體質(zhì)量比值各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后稱量,頸椎脫臼處死,解剖動物,取出胸腺和脾臟,用濾紙吸干血跡后稱量,計算臟器和體質(zhì)量之間的比值。

1.3.2脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗采用同位素?fù)饺敕?。各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后制作各組小鼠脾細(xì)胞,做為反應(yīng)細(xì)胞。刺激細(xì)胞的制作:無菌制作c57bl/6小鼠脾細(xì)胞懸液,用濃度為25mg/l的絲裂霉素c在37攝氏度下處理30min后,離心去上清,再洗2遍后,用含10%小牛血清的rpmi1640恢復(fù)到5*109/l,并加入到96孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)6d后,每孔加3h-tdr使終濃度為18.5*104bq/孔繼續(xù)培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上,液閃儀計數(shù)每分鐘脈沖數(shù)。

1.3.3遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗采用耳腫脹法。各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后,于第1、第5天每只小鼠后肢皮內(nèi)注射7%dnfb丙酮溶液0.02ml進(jìn)行致敏,于第1次致敏的第8天,用1%dnfb丙酮溶液0.02ml涂布于右耳進(jìn)行攻擊,左耳涂布生理鹽水作為對照。次日處死動物,用直徑8mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片,稱重并計算左右耳重量的差值進(jìn)行單因素方差分析。

1.3.4抗體生產(chǎn)細(xì)胞檢測采用jerne改良玻片法。各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后用srbc致敏,5d后頸椎脫臼處死,取出肝臟制成細(xì)胞懸液,在5mlrpmi1640培養(yǎng)液中技術(shù)細(xì)胞,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5*106個/ml。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后,放50℃水浴保溫,與等量ph7.2-7.4、2倍濃度的hank's液視合,分裝小試管,每管0.5ml,再向管內(nèi)加50μl10%srbc,20μl脾細(xì)胞懸液,迅速混勻,傾倒于己刷瓊脂糖薄層的玻片上,做平行片,待瓊脂凝固后,將玻片水平扣放在片架上.放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1-1.5h然后用sa緩沖液稀釋的補(bǔ)體加入到玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1-1.5h后,計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.3.5血清溶血素測定采用測定半數(shù)溶血值法。各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后用srbc致敏,5天后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h使血清充分析出,2000r/min離心10min,收集血清。用sa緩沖液稀釋。將稀釋后的血清1ml置試管內(nèi).依次加入10%srbc0.5ml,補(bǔ)體1ml。另設(shè)不加血清的對照管(以sa緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫巧20min后.冰浴終止反應(yīng),2000r/min離心10min,取上情液1ml加都氏試劑3ml,同時取10%srbc0.25ml加都氏試劑至4ml,充分混勻,放置10min后,于540nm處以對照管作空白,分別測定各管光密度值,即為血清半數(shù)溶血值(血清hc50)。

1.3.6碳廓清實驗各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后后小鼠的尾靜脈按每10g體質(zhì)量0.1ml注入濃度為25%墨汁,注射墨汁間隔2、10min,分別從小鼠內(nèi)毗靜脈叢取血20μl,加入到2ml的na2co3(w=0.1%)溶液中。以na2co3溶液作空白對照,用722可見分光光度計在600nm下測定吸光度。然后將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,稱量,算出吞噬指數(shù)α。

1.3.7巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗各組小鼠按規(guī)定給藥劑量給藥,連續(xù)灌胃30d后,向每只小鼠腹腔注射20%的雞紅細(xì)胞懸液lml,30min后,頸椎脫臼處死動物,解剖小鼠腹腔,注入2ml生理鹽水,吸取腹腔液制作涂片,用吉姆薩工作液染色15~30min,再用蒸餾水漂洗、晾干,顯微鏡下計數(shù),計算吞噬指數(shù)和吞噬百分率。

1.3.8nk細(xì)胞活性測定用mtt法:取處于對數(shù)生長期的yac-1細(xì)胞為靶細(xì)胞。各組小鼠脾淋巴細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中貼壁2h去除貼壁的巨噬細(xì)胞后為效應(yīng)細(xì)胞,按下式計算殺傷率:

殺傷率(%)=1-(od(e+t)-ode)/odt

od(e+t):指nk+靶細(xì)胞孔o(hù)d值。ode:指同一組效應(yīng)細(xì)胞對照孔o(hù)d值。odt:指相應(yīng)靶細(xì)胞對照孔o(hù)d值。

2實驗結(jié)果

2.1對小鼠體質(zhì)量,脾臟、胸腺指數(shù)影響:與空白對照組比較,各實驗組小鼠體重增加差異不顯著(p>0.05);脾臟/體質(zhì)量與胸腺/體質(zhì)量中,實驗b組、實驗c組可顯著提高小鼠脾臟或胸腺指數(shù)(p<0.05),實驗a組即本發(fā)明組可極其顯著提高小鼠脾臟或胸腺指數(shù)(p<0.01)。具體實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1對小鼠體質(zhì)量及脾臟、胸腺質(zhì)量的影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.2對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響:與空白對照組比較,實驗b組、實驗c組可顯著抑制cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(p<0.05),實驗a組,即本發(fā)明組,可極其顯著抑制cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(p<0.01)。具體實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.3對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)影響:與空白對照組比較,各實驗組小鼠右耳經(jīng)1%dnfb丙酮溶液攻擊后明顯腫脹,重量高于左耳,其中實驗b組、實驗c組左右耳重量的差值明顯高于對照組(p<0.05),實驗a組左右耳重量的差值極其顯著高于對照組。具體實驗數(shù)據(jù)見表3。

表3對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.4對小鼠抗體生成細(xì)胞影響:與空白對照組比較,實驗b組、實驗c組小鼠脾抗體形成細(xì)胞明顯增強(qiáng)(p<0.05),實驗a組脾抗體形成細(xì)胞增強(qiáng)極其顯著(p<0.01)。具體實驗數(shù)據(jù)見表4。

表4對小鼠抗體生成細(xì)胞影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.5對小鼠血清溶血素影響:與空白對照組比較,各實驗均能升高血清hc50,實驗a組、實驗b組、實驗c組均具有顯著性(p<0.05)。具體實驗數(shù)據(jù)見表5。

表5對小鼠血清溶血素影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.6對小鼠碳廓清及巨噬細(xì)胞吞噬功能影響:與空白對照組比較,實驗b組、實驗c組可以明顯提高小鼠的碳廓清能力(p<0.05)、能明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力(p<0.05);實驗a組可以極其明顯提高小鼠的碳廓清能力(p<0.01)、能極其明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力(p<0.01)。具體實驗數(shù)據(jù)見表6。

表6對小鼠碳廓清及巨噬細(xì)胞吞噬功能影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

2.7對小鼠nk細(xì)胞活性影響:與空白對照組比較,實驗b組、實驗c組能顯著提高小鼠nk細(xì)胞活性(p<0.05),實驗a組能極其顯著提高小鼠nk細(xì)胞活性(p<0.01)。具體實驗數(shù)據(jù)見表7。

表7對小鼠nk細(xì)胞活性影響

注:*與空白對照組比較,p<0.05;**與空白對照組比較,p<0.01

3結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,本發(fā)明技術(shù)方案制得的蟲草菌絲體粉對細(xì)胞免疫、體液免疫、巨噬細(xì)胞吞噬功能和nk細(xì)胞活性均有極強(qiáng)的促進(jìn)作用,提示本發(fā)明蟲草菌絲體粉具有較現(xiàn)有技術(shù)更加顯著的增強(qiáng)免疫力的功能。發(fā)明人對本發(fā)明其他的幾個實施例也分別進(jìn)行了上述功效試驗,均得到了相似的實驗結(jié)果,證明本發(fā)明技術(shù)方案制得的蟲草菌絲體粉較現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的蟲草菌絲體粉具有更加顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的效果。

具體實施方式

實施例1

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖2%,雞蛋蛋白粉5%,kh2po40.3%,硫酸鎂0.2%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在120℃條件下滅菌20分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至25℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,27℃恒溫培養(yǎng)8天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉20%,葡萄糖3%,乳清濃縮蛋白4%,kh2po40.2%,硫酸鎂0.1%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量8.0%,溫度18℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白5%,脫脂奶粉5%,酶解骨粉10%,葡萄糖3%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.5%,溫度25℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

其中酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.21g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%,實測值為3.5%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

實施例2

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖1.5%,雞蛋蛋白粉4%,kh2po40.2%,硫酸鎂0.5%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在128℃條件下滅菌25分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至27℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,30℃恒溫培養(yǎng)6天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉25%,葡萄糖2%,乳清濃縮蛋白3%,kh2po40.4%,硫酸鎂0.6%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量7.0%,溫度20℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白6%,脫脂奶粉8%,酶解骨粉9%,葡萄糖2%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.50%,溫度22℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

其中酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.28g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%,實測值為3.8%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

實施例3

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖3%,雞蛋蛋白粉7%,kh2po40.4%,硫酸鎂1%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在120℃條件下滅菌18分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至21℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,19℃恒溫培養(yǎng)10天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉15%,葡萄糖4%,乳清濃縮蛋白2%,kh2po40.5%,硫酸鎂0.9%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量6.8%,溫度22℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白8%,脫脂奶粉4%,酶解骨粉8%,葡萄糖1%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.0%,溫度26℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

其中酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.25g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%,實測值為4.0%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

實施例4

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖1.8%,雞蛋蛋白粉4.5%,kh2po40.4%,硫酸鎂1.1%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在129℃條件下滅菌26分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至23℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,17℃恒溫培養(yǎng)9天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉24%,葡萄糖2.2%,乳清濃縮蛋白4.8%,kh2po40.2%,硫酸鎂1.6%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量6.5%,溫度29℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白9%,脫脂奶粉4%,酶解骨粉8%,葡萄糖2.6%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.5%,溫度23℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

其中酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.28g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%,實測值為2.9%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

實施例5

步驟一:菌種接種恒溫培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:麥芽糖2.5%,雞蛋蛋白粉2%,kh2po40.1%,硫酸鎂1.2%,水余量。將配制好的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶中,封口后在130℃條件下滅菌19分鐘,取出培養(yǎng)基,自然冷卻至21℃,在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種,30℃恒溫培養(yǎng)5天。

步驟二:種子罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:馬鈴薯粉15%,葡萄糖3.4%,乳清濃縮蛋白4.1%,kh2po40.4%,硫酸鎂0.7%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養(yǎng)好的菌種,接種量8.0%,溫度19℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)時間72小時。

步驟三:發(fā)酵罐培養(yǎng):

配制培養(yǎng)基:其配方組成及重量比為:大豆分離蛋白10%,脫脂奶粉4%,酶解骨粉12%,葡萄糖1.5%,水余量。配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌,滅菌條件為:滅菌壓力0.1mpa;滅菌溫度121℃;滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養(yǎng)好的菌種,接種量3.2%,溫度16℃,通氣1∶0.5,攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)至培養(yǎng)基還原糖小于0.1%時,放罐收獲。

其中酶解骨粉的制備方法為:①蒸煮:將動物鮮骨經(jīng)挑選、清洗等工序,裝入蒸煮罐內(nèi),蒸煮3次,每次2小時;②研磨:將蒸煮后的凈骨,經(jīng)粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下,骨料與添加的水的重量比為1∶1;③生化酶解:將研磨后的骨漿打入生化缸,加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復(fù)合蛋白酶,復(fù)合蛋白酶占骨料重量比0.10%,加檸檬酸調(diào)ph值至5.5,45℃攪拌1h;酶解液加堿中和,滅活,供下道工序使用,噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時;④干燥噴粉:當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到180℃時,打開蓄水罐閥門,當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到225℃、出口溫度達(dá)到105℃時,穩(wěn)定10分鐘后關(guān)閉水閥門,打開滅菌缸排液閥門,開始噴粉,得酶解骨粉。

步驟四:超低溫真空濃縮

將培養(yǎng)好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設(shè)備,設(shè)定工作真空度為-0.08mpa,蒸發(fā)溫度為30℃,濃縮至產(chǎn)品比重達(dá)到1.23g/cm3,結(jié)束濃縮。

步驟五:冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃,維持2小時后,放入干燥室進(jìn)行干燥。加熱板升溫至45℃后,保持9小時,再降溫至35℃,保持5小時,全過程保持最高真空度。所得產(chǎn)物水分≤5%,實測值為3.0%。

冷凍干燥后產(chǎn)品,用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,得到粉末狀蟲草菌絲體。

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