本發(fā)明屬生物組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及小腦脫細(xì)胞再生生物支架及其制備方法和用途，尤其涉及一種去除細(xì)胞后含有多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的小腦細(xì)胞外基質(zhì)再生生物支架及其制備方法和在制備治療神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)制劑中的用途。

背景技術(shù)：

據(jù)報(bào)道，人體組織器官因?yàn)椴∽?、損傷和衰老導(dǎo)致的器官功能失用導(dǎo)致臨床上巨大的組織器官替代治療缺口。臨床實(shí)踐中，由于可替代的器官來源有限，如何在體外采用人工的方法產(chǎn)生有功能的人體器官成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)。生物人工器官的研究已成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，有著巨大的臨床應(yīng)用前景。據(jù)研究顯示，生物人工器官的生成需要三個(gè)最基本的條件，其包括：具有特異性的功能細(xì)胞，理想的含有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白的生物支架以及高度模擬體內(nèi)狀態(tài)的生物活性環(huán)境。所述ECM已被證明可以指導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的分化，也是在器官發(fā)生中可以影響細(xì)胞行為的因素；有研究顯示，通過生物工程的方法可以很好的對組織器官進(jìn)行去細(xì)胞化，如果ECM蛋白結(jié)構(gòu)能夠很好的模擬目標(biāo)組織ECM在體內(nèi)的情況則能更好地使前體細(xì)胞向目標(biāo)組織分化。最近有學(xué)者通過生物工程的方法將器官特異性的細(xì)胞選擇性地灌注到靶器官的ECM支架中，成功在體外生成有功能的生物人工心臟、肺臟和腎臟，有關(guān)論文均發(fā)表在《nature medicine》雜志上，這是國際上第一次通過生物工程的方法在不存在自體細(xì)胞的組織特異性全器官去細(xì)胞基質(zhì)中生成有功能的生物人工器官。到目前為止，國內(nèi)外尚未見有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)組織器官體外再生的報(bào)道，也未見有理想的CNS生物支架的報(bào)道。

業(yè)內(nèi)已知，小腦是腦組織中相對獨(dú)立和特殊的區(qū)域，在運(yùn)動(dòng)控制中發(fā)揮著重要的作用，在認(rèn)知功能領(lǐng)域，如注意、語言、調(diào)節(jié)恐懼及愉悅的應(yīng)答中發(fā)揮著一定的作用；小腦位于大腦半球后方，覆蓋在腦橋及延髓之上，橫跨在中腦和延髓之間，解剖位置相對獨(dú)立，易于顯微解剖分離，在小腦蚓部和半球表面存在有橫行的溝和裂，將小腦分成許多回、葉和小葉，這是其特異性的形態(tài)表現(xiàn)；相較于大腦皮層的6層結(jié)構(gòu)，小腦皮層分 為三層，包括：分子層，浦肯野細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層，而且對比于大腦所有的多種神經(jīng)元，小腦主要由兩種神經(jīng)元包括顆粒神經(jīng)元、浦肯野神經(jīng)元發(fā)揮作用，且最為重要的是，小腦半球的部分切除并不會(huì)造成機(jī)體嚴(yán)重的功能障礙；這些特殊性使得小腦成為研究CNS組織器官體外再生的突破點(diǎn)。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種小腦脫細(xì)胞再生生物支架及其制備方法，進(jìn)一步用于神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)治療干預(yù)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種小腦脫細(xì)胞再生生物支架及其制備方法和用途，尤其涉及一種去除細(xì)胞后含有多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的小腦細(xì)胞外基質(zhì)再生生物支架及其制備方法和在制備治療神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)制劑中的用途。

本發(fā)明提供了一種對神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的黏附、遷移、增殖、分化以及基因表達(dá)的調(diào)控有顯著作用和影響的新型小腦再生生物支架。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官脫細(xì)胞策略的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，制備出脫細(xì)胞徹底且ECM三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、功能更完整的小鼠小腦脫細(xì)胞支架；通對支架進(jìn)行組織學(xué)觀察、成分分析、免疫原性檢測以及體內(nèi)外相容性等研究評價(jià)其生物安全性，并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證制得的脫細(xì)胞支架對人NSCs生物學(xué)特性的影響以及體內(nèi)外生物相容性，為小腦再生的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為再生醫(yī)學(xué)研究提供了一種方法和工具。

更具體的，本發(fā)明的一種小腦脫細(xì)胞再生生物支架，其由脫去細(xì)胞的小腦組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)構(gòu)成，呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其空間構(gòu)型符合小腦生理結(jié)構(gòu)空間構(gòu)型。

本發(fā)明制得的小腦脫細(xì)胞再生生物支架，采用天然的小腦脫細(xì)胞支架作為小腦再生的支架材料，具有最接近小腦組織的三維結(jié)構(gòu)，其生物力學(xué)性能與正常小腦相似，能為神經(jīng)通路的重建提供生理相似的通道從而正確引導(dǎo)其生長；所述支架表面具備細(xì)胞膜受體識別位點(diǎn)、部分活性因子，有利于細(xì)胞的黏附生長并發(fā)揮生理功能；工程化的種子細(xì)胞(如重編程的類小腦顆粒樣細(xì)胞等)既能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)/生長因子，又能促進(jìn)新的細(xì)胞外基質(zhì)形成，提供再生引導(dǎo)信號；具有良好的生物相容性。

本發(fā)明通過下述方法制備索所述的小腦脫細(xì)胞再生生物支架：其包括下述步驟：

1，小腦再生支架的制備及鑒定，其中包括：

1)小腦取材

將獲得的健康成年C57BL/6小鼠小腦組織，分離并去除所有的非中樞神經(jīng)組織；

2)小鼠小腦脫細(xì)胞，

按下述順序攪拌水浴過程脫細(xì)胞：1.0％SDS，去離子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去離子水，1.0％Triton X-100，1.0M蔗糖，去離子水；脫去細(xì)胞的小腦組織浸沒在青霉素G，鏈霉素以及兩性霉素B的PBS中保存72h，制得小腦脫細(xì)胞再生生物支架，4℃PBS中保存?zhèn)溆茫?/p>

3)支架的大體形態(tài)觀察

以正常小鼠小腦為對照，觀察小鼠小腦脫細(xì)胞支架的外形、顏色等變化情況；

4)小腦支架的組織學(xué)觀察與評價(jià)

以正常小腦組織為對照，光鏡下觀察小腦脫細(xì)胞支架基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性、脫細(xì)胞程度及蛋白殘留量；

5)再生生物支架殘留DNA定量和片段長度分析

對殘余DNA的含量和堿基對長度進(jìn)行定量測定，其中，采用美國Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒檢測提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA檢測試劑盒說明書操作，1％瓊脂糖凝膠電泳對殘余DNA的堿基對長度進(jìn)行測定；采用以下標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)脫細(xì)胞的效果：(1)在DAPI和H&E切片上沒有可見的細(xì)胞核；(2)DNA片段長度不超過200bp；(3)雙鏈DNA的含量小于50ng/mg干燥ECM，為符合再生生物支架要求；

6)BDNF和NGF含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)的含量進(jìn)行測定；

2，體外生物相容性試驗(yàn)，包括：

1)小腦再生支架ECM對NSCs的細(xì)胞毒性作用試驗(yàn)；

2)小腦再生支架ECM對NSCs的增殖作用試驗(yàn)；

3)小腦再生支架ECM對NSCs的遷移作用試驗(yàn)：

4)小腦再生支架ECM對NSCs的分化作用試驗(yàn)；

3，小腦脫細(xì)胞支架的掃描電鏡觀察，采用掃描電鏡觀察支架的結(jié)構(gòu)；

4，體內(nèi)生物相容性試驗(yàn)，包括：

1)動(dòng)物分組：

SD大鼠隨機(jī)分為皮下組及顱內(nèi)組，各組平均分為三個(gè)亞組：假手術(shù)組，明膠海綿組及小腦再生支架組；

2)標(biāo)本組織學(xué)觀察

移植后標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；免疫組化染色，檢測CD4⁺和CD8⁺T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)目用于評價(jià)支架的免疫原性；

所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理；實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以x±s表示。各組均數(shù)運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，p<0.05為差異有顯著性，p<0.01為差異有非常顯著性。

結(jié)果顯示：本發(fā)明的經(jīng)過脫細(xì)胞處理的小腦經(jīng)組織學(xué)證實(shí)細(xì)胞基本完全脫落，支架內(nèi)未見細(xì)胞殘留物，支架結(jié)構(gòu)保存完好，電鏡下三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整存在，小鼠小腦脫細(xì)胞支架在HE染色及DAPI染色下未見細(xì)胞核殘留，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，支架內(nèi)未見長度超過200bp的DNA，DNA定量分析結(jié)果顯示，支架內(nèi)雙鏈DNA的含量小于50ng/mg干重ECM，上述量化指標(biāo)檢測表明，本發(fā)明的脫細(xì)胞方法能完全脫去小腦內(nèi)細(xì)胞；制得的ECM支架中保留了較多的膠原蛋白和葡聚糖，其中葡聚糖能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的黏附和增殖，髓磷脂對神經(jīng)細(xì)胞的再生及突觸的形成有抑制作用，脫細(xì)胞的過程使得神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量明顯減少，但仍保留了一定量的營養(yǎng)因子。

本發(fā)明采用天然的小鼠小腦脫細(xì)胞支架作為小腦再生的支架材料具有獨(dú)特的優(yōu)勢：具有最接近小腦組織的三維結(jié)構(gòu)，生物力學(xué)性能與正常小腦相似；能為神經(jīng)通路的重建提供生理相似的通道從而正確引導(dǎo)其生長；支架表面具備細(xì)胞膜受體識別位點(diǎn)、部分活性因子，有利于細(xì)胞的黏附生長并發(fā)揮生理功能；工程化的種子細(xì)胞(如重編程的類小腦顆粒樣細(xì)胞等)既能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)/生長因子，又能促進(jìn)新的細(xì)胞外基質(zhì)形成，提供再生引導(dǎo)信號；具有良好的生物相容性。

本發(fā)明的去除細(xì)胞后含有多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的小腦細(xì)胞外基質(zhì)再生生物支架進(jìn)一步用于在制備治療神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)制劑中的用途。

附圖說明：

圖1，再生生物支架的制備流程圖。

圖2：A：小鼠小腦；B：小腦再生支架。

圖3：A：正常小腦H&E染色；B：小腦支架H&E染色；C：正常小腦DAPI染色；D：小腦支架DAPI染色；E：DNA片段長度不超過200bp，紅色箭頭指示200bp；F：雙鏈DNA 的含量小于50ng/mg干燥ECM，紅色指示50ng/mg。

圖4：A：正常小腦膠原染色；B：小腦支架膠原染色；C：正常小腦GAGs染色；D：小腦支架GAGs染色；E：正常小腦髓磷脂染色；F：小腦支架髓磷脂染色。

圖5：A：BDNF的含量；B：NGF的含量。

圖6(A)小腦支架ECM對NSCs的細(xì)胞毒性，未顯示差異(p>0.05)；(B)不同濃度小腦支架和膀胱ECM對細(xì)胞增殖存在差異(p<0.05)；(C)不同濃度小腦支架和膀胱ECM對細(xì)胞趨化存在差異(p<0.05)。

圖7：NSCs分化的免疫熒光βIII-tubulin，A：陰性對照；B：小腦支架ECM；C：膀胱支架ECM和GFAP D：陰性對照；E：小腦支架ECM；F：膀胱支架ECM，G：NSCs在含小腦支架ECM培養(yǎng)基中向神經(jīng)元分化比率較陰性對照及膀胱ECM高(p<0.05)。

圖8：空白(A)及再種植后(B)小腦再生支架的掃描電鏡圖像。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 制備小腦再生支架

1，小腦再生支架的制備及鑒定

1)小腦取材

將健康成年C57BL/6小鼠(體重20～25g，雌雄不限)采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，1.0％SDS(十二烷基磺酸鈉,Sodium Dodecyl Sulfonate)心臟灌注5min(20ml/min)。俯臥位固定，常規(guī)備皮，沿中線切開頭皮，暴露顱骨。切開顱骨，完整取出小腦，注意動(dòng)作輕柔，，為保證無菌，后續(xù)操作都在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行，經(jīng)PBS清洗干凈后，PBS中仔細(xì)分離并去除所有的非小腦組織。

2)小鼠小腦脫細(xì)胞流程

后續(xù)為室溫下一系列的攪拌水浴過程，順序進(jìn)行下列過程：1.0％SDS(100rpm，60min)，去離子水(60rpm，10min)，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA(60rpm，30min)，去離子水(60rpm，10min)，1.0％Triton X-100(100rpm，60min)，1.0M蔗糖(60rpm，15min)，去離子水(60rpm，30min)。脫去細(xì)胞的小腦組織浸沒在含10,000U/ml的青霉素G，10mg/ml的鏈霉素以及25ug/ml的兩性霉素B的PBS中保存72h。將該生物支架4℃PBS中保存?zhèn)溆谩?/p>

3)支架的大體形態(tài)觀察

以正常小鼠小腦為對照，觀察小鼠小腦脫細(xì)胞支架的外形、顏色等變化情況。

4)小腦支架的組織學(xué)觀察與評價(jià)

將小腦脫細(xì)胞支架經(jīng)4％多聚甲醛固定液固定，脫水，石蠟包埋，6μm厚連續(xù)切片，分別行HE染色，用Masson’s三色法對膠原進(jìn)行染色，Alcian blue對葡糖氨基葡聚糖(GAGs)進(jìn)行染色，luxol fast blue法對髓磷脂進(jìn)行染色。染色步驟按試劑盒說明書操作，以正常小腦組織為對照，光鏡下觀察小腦脫細(xì)胞支架基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性、脫細(xì)胞程度及蛋白殘留量。

HE染色方法簡述如下：石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色液染色5～10min，自來水洗3～5min，1％鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，自來水洗3～5min，伊紅復(fù)染30s～2min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

Masson’s三色法簡述如下：切片常規(guī)脫蠟至水，用配制好的試劑(A)染色5～10min，用酸性乙醇分化液分化、水洗，用氨水溶液返藍(lán)、水洗，蒸餾水水洗1min，麗春紅品紅染色液染色5～10min，用乙酸溶液洗1min，磷鉬酸溶液洗1～2min，用乙酸溶液洗1min，直接放入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2min，乙酸溶液洗1min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明5min，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

Alcian blue染色方法簡述如下：石蠟切片脫蠟至水，阿新藍(lán)(PH＝2.5)染30min，自來水洗5～10min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明5min，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

luxol fast blue染色方法簡述如下：95％乙醇溶液中浸泡3min，置于0.1％Luxol固藍(lán)溶液中，在57℃溫度下，孵育過夜(16-24h)，95％乙醇溶液中浸洗30秒。去離子水中浸洗3min。切片于0.05％碳酸鋰溶液中快速浸洗15s，去離子水沖洗。0.1％甲苯粉紫溶液，37℃浸染10min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明5min。中性樹膠封固。

冰凍切片觀察：標(biāo)本獲取方法見第二部分。30％的蔗糖溶液脫水，整形OTC包埋，做冰凍切片用4％多聚甲醛室溫固定，PBS清洗3次。用0.25％Triton X-100/10％山羊血清破膜封閉2h，用PBS清洗3次，加入核染色劑DAPI，室溫避光孵育5min，用防熒光淬滅的封片劑封固在載玻片上，壓片。熒光顯微鏡下觀察。

5)殘留DNA定量和片段長度分析

DNA提取

采用美國Roche公司的DNA提取試劑盒提取支架和正常小鼠小腦組織內(nèi)的DNA，按DNA提取試劑盒說明書操作，步驟如下：

(1)分別稱取凍干的支架和正常小鼠小腦，約10mg，記錄干重；

(2)將樣品剪碎后加入到含1ml裂解液的離心管，勻漿；

(3)加入0.7μL蛋白水解酶K，65℃，孵育2h；

(4)加入30μL 10mg/ml RNA酶，充分混勻，37℃，孵育15min；

(5)加入0.4ml蛋白沉淀液，渦旋振蕩20s，充分混勻，冰水浴5min，離心(26900g，20min，15℃)；

(6)將上清液轉(zhuǎn)移至含有1ml異丙醇的離心管中，輕柔顛倒離心管，可見DNA析出，離心(1370×g，10min，室溫)；

(7)去上清液，加入1ml 70％乙醇，輕柔顛倒離心管，漂洗DNA，離心(137×g，5min，室溫)；

(8)去上清液，待DNA自然風(fēng)干，加入1ml TE溶液(1×，pH8.0)，輕拍離心管，使DNA重懸，4℃孵育過夜，使DNA再水化，4℃保存?zhèn)溆谩?

DNA定量

采用美國Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒檢測提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA檢測試劑盒說明書操作，步驟如下：

(1)取100μL Quant-iT PicoGreen原液加入到19.9ml TE溶液中稀釋200倍，制得Quant-iT PicoGreen工作液，避光保存；

(2)將Lambda DNA標(biāo)準(zhǔn)品(100μg/ml)用TE溶液按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml梯度濃度稀釋，取各濃度Lambda DNA標(biāo)準(zhǔn)品溶液各100μL至96孔板，分別加入100μL Quant-iT PicoGreen工作液，避光，混勻，室溫孵育2～5min后，用酶標(biāo)儀檢測熒光信號值(激發(fā)波長480μm，發(fā)射波長520μm)，結(jié)果采用線性回歸分析，建立熒光信號值和DNA濃度的回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)將制備的樣品DNA溶液重懸混勻后，分別取100μL至96孔板，各加入100μL Quant-iT PicoGreen工作液，避光，混勻，室溫孵育2～5min后，用酶標(biāo)儀檢測熒光信號值(激發(fā)波長480μm，發(fā)射波長520μm)，根據(jù)回歸方程計(jì)算DNA濃度，當(dāng)樣品DNA濃度超過1000ng/ml時(shí)，需按比例稀釋，使樣品濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍內(nèi)，重新測量。根據(jù)所測樣品DNA濃度計(jì)算標(biāo)本DNA含量，以ng/mg干重表示。

DNA片段尺寸分析

采用瓊脂糖凝膠電泳分析A、B組支架和正常大鼠脊髓內(nèi)DNA片段尺寸，步驟如下：

(1)將制膠槽兩端用粘膠帶封好，在一端安插上樣品梳，確保梳齒下緣與膠槽底面保持1mm左右間隙，且制膠槽處于水平位置。

(2)將制備的1.5％瓊脂糖凝膠小心倒入制膠槽內(nèi)，凝膠緩慢展開，去除氣泡，形成均勻膠層，厚約3～5mm。室溫下靜置，待凝膠冷卻固定后，小心取出樣品梳，撤除兩端固定膠帶，將凝膠置于電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液至超過凝膠表面約1mm。

(3)DNA樣品與6×加樣緩沖液按5:1混勻后加入到樣品孔內(nèi)，DNA marker加到兩側(cè)的樣品孔內(nèi)。

(4)接通電源，電壓設(shè)為60V，觀察指示劑位置，判斷電泳終止時(shí)間，約60min。

(5)凝膠呈像儀上觀察電泳結(jié)果并拍照。

6)BDNF和NGF含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)的含量進(jìn)行測定。樣本在含1mM PMSF及1mM EGTA的PBS溶液中勻漿，取上清。

(1)從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

(2)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

(3)待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

(4)隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

(5)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

(7)每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

(8)使用胎牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，通過Lowry’s method進(jìn)行定量。

2，體外生物相容性試驗(yàn)

NSCs培養(yǎng)在層粘連蛋白(10mg/L)包被的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)液為添加重組小鼠EGF(10ng/ml)及重組人FGF-2(10ng/ml)的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，隔天換液。膀胱ECM作為參考材料來評估小腦再生支架是否有組織特異性的優(yōu)勢。樣本凍干后剪碎至<1.0mm大小，在含1.0mg/ml胃蛋白酶的0.01N HCl中進(jìn)行溶解。使用二喹啉甲酸法測定的胎牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，對多個(gè)稀釋的溶解ECM進(jìn)行蛋白濃度測定。使用0.1N的NaOH調(diào)節(jié)溶液Ph至7.4。使用10×PBS調(diào)節(jié)到液體張力平衡，1×PBS調(diào)整至需要濃度。不同濃度的 ECM(10，50，100ug/ml)用來評價(jià)對NSCs的增殖和趨化效果，不含ECM的中性胃蛋白酶PBS溶液用來作為陰性對照，所有體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1)小腦再生支架ECM對NSCs的細(xì)胞毒性作用試驗(yàn)

12孔板每孔1x10⁴NSCs鋪在PLL包被的玻璃蓋玻片上。包被后2h，100μg/ml ECM及PBS加入每孔，再培養(yǎng)24h。使用Live/Dead Viability Kit(Invitrogen)對細(xì)胞相容性進(jìn)行判斷。NSCs的生存率使用ImageJ對熒光圖像進(jìn)行讀取來定量判定。隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察、拍照并計(jì)數(shù)，不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2)小腦再生支架ECM對NSCs的增殖作用試驗(yàn)

在96孔板中加入100μl的各組細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)(37℃，5％CO₂)。向每孔加入10μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)。用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

3)小腦再生支架ECM對NSCs的遷移作用試驗(yàn)

采用transwell小室遷徙實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞遷徙功能進(jìn)行測試(孔徑8um，直徑6.5mm)。使用30mg/ml層粘連蛋白包被濾器30min后待其完全干燥。細(xì)胞分離后重懸在未行添加的培養(yǎng)液中，再以每孔1x10⁴的密度再接種到transwell平板的上室。分別添加有多種濃度ECM的培養(yǎng)基添加到下層小室中，平板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。擦凈小室膜上側(cè)未遷移的細(xì)胞，甲醛固定，DAPI染色，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察細(xì)胞穿膜情況并拍照，ImageJ分析軟件計(jì)數(shù)，不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

4)小腦再生支架ECM對NSCs的分化作用試驗(yàn)

1x10⁴NSCs每孔接種于PLL包被的48孔板中，每孔培養(yǎng)基預(yù)沖洗兩次，培養(yǎng)基為含100μg/ml小腦ECM或100μg/ml膀胱ECM的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，以及不含ECM的中性胃蛋白酶PBS溶液用來作為陰性對照，培養(yǎng)48h。細(xì)胞用4％甲醛固定，PBS沖洗三次，5％山羊血清及0.2％Triton X-100室溫下破膜封閉2h。PBS沖洗三次，4℃一抗孵育過夜，一抗為βtubulinⅢ和GFAP。PBS沖洗后，熒光二抗37℃孵育2h，PBS(1μg/ml)沖洗后，DAPI復(fù)染。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察細(xì)胞并拍照，ImageJ分析軟件計(jì)數(shù)，不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

3，小腦脫細(xì)胞支架的掃描電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察支架的結(jié)構(gòu)。將4×10⁶NSCs懸于500μl培養(yǎng)基中，無菌條件下通過微量注射器注射到支架中(深2.5mm，5min)，再種植后的支架培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d?？?白及再種植的支架切片，并用掃描電鏡(SEM)進(jìn)行觀察。樣本4℃電鏡液(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室提供)中固定24h，超純水漂洗3次，每次5min，冷凍干燥后，觀察面朝上粘貼于樣品臺(tái)，用真空噴涂儀在材料表面噴金，采用日本Hitachi公司SU8000掃描電子顯微鏡觀察拍照

4，體內(nèi)生物相容性試驗(yàn)

1)動(dòng)物分組：

SD大鼠共24只，雌雄不限，體重約200-250g。隨機(jī)分為皮下組及顱內(nèi)組各12只SD大鼠，各組平均分為三個(gè)亞組：假手術(shù)組，明膠海綿組及小腦再生支架組。

皮下組：將SD大鼠采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，在背部棘突一側(cè)旁約1cm處作縱行切口，長約1cm，切開皮膚、皮下組織及深筋膜，用血管鉗在深筋膜下鈍性分離，形成一個(gè)囊袋樣空腔，明膠海綿組及小腦再生支架組分別移植入明膠海綿和小腦脫細(xì)胞支架，縫合傷口。假手術(shù)組在深筋膜下鈍性分離，形成囊袋樣空腔后，不作移植，直接縫合傷口。

顱內(nèi)組：將SD大鼠采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，取俯臥位固定于立體定位儀平臺(tái)上，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，沿中線切開頭皮，暴露顱骨。在bregma及l(fā)amda之間，矢狀竇旁開5mm鉆孔。切除部分額葉，明膠海綿組及小腦再生支架組分別將明膠海綿和小腦脫細(xì)胞支架移植物填入空腔，封閉切口。假手術(shù)組在切除部分額葉后不作移植，封閉切口。

2)標(biāo)本組織學(xué)觀察

移植4周后標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、6μm厚連續(xù)切片。

HE染色

石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色液染色5～10min，自來水洗3～5min，1％鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，自來水洗3～5min，伊紅復(fù)染30s～2min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

免疫組化染色

檢測CD4⁺和CD8⁺T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)目用于評價(jià)支架的免疫原性。

(1)石蠟切片置于58～60℃烤箱60min。

(2)石臘切片常規(guī)脫蠟至水。

(3)將30％過氧化氫溶液稀釋10倍后，將切片用3％的過氧化氫溶液室溫孵育10min，滅 活內(nèi)源性酶，雙蒸水洗3遍。

(4)抗原熱修復(fù)：切片轉(zhuǎn)至0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，微波加熱至沸騰后斷電，間隔10min，反復(fù)2次，冷卻后0.01M PBS漂洗2min×2遍。

(5)滴加5％血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體，不洗。

(6)滴加適量一抗，覆蓋標(biāo)本即可，濕盒中4℃孵育過夜，0.01M PBS漂洗2min×3遍。

(7)滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育20min，0.01M PBS漂洗2min×3遍。

(8)滴加SABC，37℃孵育20min，0.01M PBS漂洗5min×4遍。

(9)使用DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(5～15min)，蒸餾水充分沖洗，終止顯色。

(10)蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水充分沖洗，1％鹽酸-酒精分化。

(11)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

(12)光鏡下觀察。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以x±s表示。各組均數(shù)運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，p<0.05為差異有顯著性，p<0.01為差異有非常顯著性。

結(jié)果顯示：

1.支架的大體形態(tài)觀察

肉眼觀，在脫細(xì)胞處理過程中可見大量白色絮狀物自小腦內(nèi)析出，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，小鼠脫細(xì)胞小腦支架仍維持與正常小腦形態(tài)相似的形狀，呈乳白色，略有皺縮，長度約8mm；

2.支架的脫細(xì)胞程度鑒定

HE染色結(jié)果顯示，正常小鼠小腦組織結(jié)構(gòu)較致密，皮層有明顯的典型三層結(jié)構(gòu)，分子層、浦肯野細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層，而經(jīng)脫細(xì)胞方法處理后，脫細(xì)胞適度，可見支架極少量細(xì)胞碎片殘留，ECM網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整，熒光顯微鏡下正常小鼠小腦組織冰凍切片可見DAPI染核的正常分布，而經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，僅可見及少量細(xì)胞核，可見小腦ECM支架輪廓完整；

正常小鼠小腦各個(gè)長度的DNA片段皆可查見，有大量長度超過1000bp以上的DNA片段，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，幾乎檢測不到DNA片段殘留；

采用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒進(jìn)行小鼠小腦脫細(xì)胞支架內(nèi)殘留DNA的 定量分析，殘留DNA定量分析結(jié)果如正常小鼠小腦內(nèi)的DNA含量為1010.2±352.3ng/mg干重，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，小鼠小腦脫細(xì)胞支架內(nèi)殘留的DNA含量為32.3±11.5ng/mg干重，明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3F)。

3.支架的組織學(xué)分析

Masson’s三色法顯示，正常小鼠小腦膠原組織染色呈紅色陽性反應(yīng)，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，脫細(xì)胞方法處理后，脫細(xì)胞徹底，仍可見多量膠原存留，輪廓及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整；

Alcian blue染色顯示，正常小鼠小腦葡聚糖染色呈藍(lán)棕色陽性反應(yīng)，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，脫細(xì)胞方法處理后，脫細(xì)胞徹底，仍可見較多量葡聚糖存留，輪廓及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整；

luxol fast blue染色顯示，正常小鼠小腦髓磷脂染色呈藍(lán)色陽性反應(yīng)，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，脫細(xì)胞方法處理后，脫細(xì)胞徹底，僅可見少量髓磷脂存留，呈弱陽性，輪廓及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尚完整；

4.BDNF和NGF含量測定

小腦脫細(xì)胞支架的BDNF含量(21.4+5.2pg/mg)較之正常小腦BDNF的含量(60.2+12.1pg/mg)明顯減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)；小腦脫細(xì)胞支架的NGF含量(33.6+8.3pg/mg)較之正常小腦NGF的含量(104.3+21.5pg/mg)明顯減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05；

5.體外生物相容性試驗(yàn)

小腦再生支架ECM(100μg/ml)對NSCs未顯示明顯的細(xì)胞毒性作用，存活率與對照組及膀胱ECM組進(jìn)行比較，未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；

不同濃度小腦再生支架ECM(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)對NSCs的增殖作用存在差異，較低濃度的小腦支架ECM(10μg/ml)對NSCs的影響較小，而高濃度的影響較大(100μg/ml)，差異存統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；膀胱ECM沒有明顯的作用趨勢，小腦支架及膀胱ECM在較低濃度上(10μg/ml)對NSCs的增殖有明顯差異(p<0.05)，而在較高濃度則沒有明顯差異(p>0.05)(圖3-5B)；

不同濃度小腦再生支架ECM(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)對NSCs的遷移作用存在差異，較低濃度(10μg/ml)小腦支架ECM對NSCs的遷移有明顯的促進(jìn)作用，增加約50％，而在較高濃度時(shí)，促進(jìn)作用明顯減少，差異存統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，對應(yīng)濃 度的膀胱ECM則顯示為減少遷移的作用(p<0.05)，最多達(dá)約50％；

小腦再生支架ECM(100μg/ml)對NSCs有誘導(dǎo)分化作用。小腦ECM支架誘導(dǎo)NSCs較高的Tuj1陽性神經(jīng)元分化效率(5％)，陰性對照只有約0.5％，膀胱ECM較陰性對照高(1.5％)，但是仍遠(yuǎn)低于小腦ECM(p<0.05)，陰性對照細(xì)胞的形態(tài)主要為未分化狀，在小腦ECM組，許多細(xì)胞沒有Tuj陽性的表達(dá)，但是細(xì)胞形態(tài)上有長的細(xì)胞突起，可能是向膠質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞，GFAP染色證實(shí)陽性；

6.支架的掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果顯示支架脫細(xì)胞適度，標(biāo)本的細(xì)胞成分被完全除去，細(xì)胞外基質(zhì)存在，ECM保存完好，相互交織成網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有縱向平行或不規(guī)則排列的孔道系統(tǒng)，各通道之間互相溝通形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NSCs種植入支架14天后，在支架內(nèi)可見細(xì)胞的攀附，有長的軸突長出，部分可見軸突在支架孔道中如蔓藤穿行；

7.體內(nèi)生物相容性試驗(yàn)

術(shù)后各組動(dòng)物的進(jìn)食及活動(dòng)正常，傷口周圍未見紅腫和感染，也沒有出現(xiàn)滲液、膿腫等炎癥反應(yīng)，傷口為一期愈合；

組織學(xué)觀察

皮下組：

植入術(shù)后4周，小腦脫細(xì)胞支架周邊中性粒細(xì)胞基本消失，有少量淋巴細(xì)胞浸潤，無毛細(xì)血管擴(kuò)張，偶見異物巨細(xì)胞，較陰性對照及明膠海綿對照組無明顯區(qū)別；

術(shù)后4周小腦脫細(xì)胞支架植入組CD4⁺和CD8⁺T淋巴細(xì)胞群的浸潤無明顯增加，較陰性對照及明膠海綿對照組無明顯區(qū)別；

顱內(nèi)組：

植入術(shù)后4周，小腦脫細(xì)胞支架周邊無明顯中性粒細(xì)胞機(jī)淋巴細(xì)胞浸潤。較陰性對照及明膠海綿對照組無明顯區(qū)別。部分標(biāo)本可見明膠海綿及小腦支架殘留，并與受體腦組織結(jié)合；

術(shù)后4周小腦脫細(xì)胞支架組未見明顯CD4⁺和CD8⁺T淋巴細(xì)胞表達(dá)，較陰性對照及明膠海綿對照組無明顯區(qū)別。