本發(fā)明屬于牙種植體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著牙種植體技術(shù)的不斷發(fā)展，和被醫(yī)患者廣泛的認(rèn)可，也是近年口腔醫(yī)學(xué)里發(fā)展最快的一個(gè)專業(yè)，不斷取得突破性進(jìn)展，正在為更多的牙疾患者提供專業(yè)幫助。然而，不得不承認(rèn)的另一現(xiàn)狀是，現(xiàn)有的介入裝置植入體內(nèi)后很容易發(fā)生感染。主要的感染機(jī)制是進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌首先粘附在材料表面，由于體內(nèi)豐富的營養(yǎng)環(huán)境，細(xì)菌發(fā)生繁殖，形成了一層保護(hù)性的生物膜。生物膜的存在使得醫(yī)用裝置引發(fā)的感染尤為難治。
Roos.Jansaker等對(duì)種植術(shù)后患者進(jìn)行多年的隨訪，以存在探診出血同時(shí)未出現(xiàn)骨質(zhì)喪失為診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床病例統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，種植體周黏膜炎的發(fā)病率約為79％；甚至有研究表明，約有超過90％的種植體出現(xiàn)過探診出血。而種植體周圍炎可導(dǎo)致種植體周骨組織的缺損、喪失，如不及時(shí)治療可導(dǎo)致種植體的松動(dòng)脫落。
由于牙種植體表面的主要成分通常處理為帶負(fù)電狀態(tài)。并將含有電正性基團(tuán)的聚合物如殼聚糖與牙種植體表面有較好的黏附作用。另外含有與羥基互為氫鍵給體/受體的基團(tuán)的聚合物，如海藻酸鈉、羥丙基纖維素等也可能與牙種植體表面有一定的黏附作用。
生物活性肽是蛋白質(zhì)中20個(gè)天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物?；钚噪木哂卸喾N人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用。
RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)中，可與11種整合素特異性結(jié)合，能有效地促進(jìn)細(xì)胞對(duì)生物材料的粘附。將RGD序列固定于鈦或鈦合金種植體表面，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞對(duì)鈦或鈦合金表面的粘附，進(jìn)一步促進(jìn)種植體骨整合，提高種植義齒的成功率。RGD序列的空間結(jié)構(gòu)、修飾密度、周圍序列對(duì)其活性都有一定影響。
總之，牙種植體對(duì)材料的表面性質(zhì)要求非常高。因此，探索新型的牙種植體表面改性方法逐漸成為了種植領(lǐng)域的科研方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：公開具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，所述牙種植體表面順次涂覆有二氧化鈦層、正電荷殼聚糖層與負(fù)電荷RGD肽層或AMP復(fù)合物層交替組裝的緩釋層，外層負(fù)載硫酸軟骨素層-抗菌肽層。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的抗菌肽層的制備方法包括以下操作步驟：
(1)先秤取100mg RGD肽加至10ml的濃度為1％的醋酸-醋酸鈉緩沖液中；緩慢攪拌至溶解后，加入EDC·HCl 500mg，再加入NHS 250mg，經(jīng)過磁力攪拌器活化12h；放入ddH2O中透析，在磁力攪拌器攪拌狀態(tài)下隔夜；獲得RGD肽溶液；
(2)將種植體表面打磨，清洗，烘干；用50～100μmTiO2微粒對(duì)種植體表面進(jìn)行噴砂處理；再置于氫氟酸與鹽酸組成的混合酸蝕劑中進(jìn)行表面刻蝕處理，取出種植體超聲清洗，干燥；再將種植體置于60℃、5mol/L NaOH溶液孵育24-48h，用水超聲清洗備用；
(3)將步驟(2)所述的牙種植體浸沒于0.5～5mg/ml的殼聚糖溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上正電荷；再用去離子水充分清洗；
(4)將步驟(3)所述的牙種植體浸沒于步驟(1)所述的RGD肽溶液中3h以上；或浸沒于濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液中5～10min，以使牙種植體表面帶上負(fù)電荷；再用去離子水充分清洗；
根據(jù)需要組裝的層數(shù)，重復(fù)步驟(3)、(4)和(3)即可得到帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體；
(5)將步驟(4)所述的牙種植體在濃度為2mg/mL的硫酸軟骨素硫酸鈉鹽溶液中浸泡5～15min，溶液體系控制pH值為6，再用去離子水充分清洗后自然干燥；再將涂覆有硫酸軟骨素的牙種植體浸泡于pH值為7，濃度為0.5mg/mL的抗菌肽溶液中5～15min，再用去離子水充分清洗后自然干燥，獲得涂覆有硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層的材料。
上述技術(shù)方案中，所述RGD是Arg-Gly-Asp的短肽序列，由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成；
所述EDC·HCl為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，英文名稱：1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride；
所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，英文名稱:N-Hydroxysuccinimide；
所述AMP為陽離子抗菌短肽，英文名稱:cationic antimicrobial peptides。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，其中，所述的清洗是指去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮?dú)獯蹈珊?，放于真空干燥箱中，?0℃的條件下干燥24小時(shí)。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，其中，所述的殼聚糖的脫乙酰度為50～98％，Mw為100～1500kDa。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，其中，所述的殼聚糖溶液為將殼聚糖溶解在0.3～3％的乙酸溶液中，配成0.5～5mg/ml的殼聚糖溶液，將所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.1～0.4，并加入體積濃度為0.5～1％的司盤80，同時(shí)加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為2～4∶1，攪拌所得油包水乳液，向其中加入5～10mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，40℃～60℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)4～6小時(shí)后；靜置取上清液；再將所得的殼聚糖微粒以水懸浮，添加少量的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，其中，所述靜置取上清液是指，靜置12小時(shí)以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8～9，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液。
對(duì)于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的具有殼聚糖-RGD復(fù)合涂層的種植體活性表面的制備方法，其中，所述濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液的配置方法為：所述濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液的配置方法為：秤取50mg AMP復(fù)合物粉末加至50ml的滅菌后去離子水中，攪拌充分至完全溶解，加冰醋酸調(diào)pH為5.0，此溶液帶有正電荷。
本發(fā)明的創(chuàng)新特征是：
本發(fā)明所制備的帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體。其涂層主要依靠陽離子與陰離子相互之間的靜電引力，在種植體固體表面形成有序排列的分子涂層，因?yàn)闅ぞ厶呛蚏GD層或AMP復(fù)合物層是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。由于表層硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層結(jié)構(gòu)的存在，具有持久、高效的殺菌、抗感染能力，其抗菌、抗凋亡活性，能夠支持多種細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的粘附、存活、生長與分化，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。
配置濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液；
秤取50mg AMP復(fù)合物粉末加至50ml的滅菌后去離子水中，攪拌充分至完全溶解，加冰醋酸調(diào)pH為5.0，此溶液帶有正電荷。
配置濃度為0.5mg/mL抗菌肽溶液
稱取5mg抗菌肽，將其溶解于10mL去離子水中，制備成pH值為7，濃度為0.5mg/mL抗菌肽溶液。
配置RGD肽溶液
秤取100mg RGD肽加至10ml的濃度為1％的醋酸-醋酸鈉緩沖液中；緩慢攪拌至溶解后，加入EDC·HCl 500mg，再加入NHS 250mg，經(jīng)過磁力攪拌器活化12h；放入ddH2O中透析，在磁力攪拌器攪拌狀態(tài)下隔夜獲得RGD肽溶液；
實(shí)施例1
(1)將表面為二氧化鈦層的牙種植體，依次用去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮?dú)獯蹈珊?，放于真空干燥箱中，?0℃的條件下干燥24小時(shí)，放置備用；
(2)將殼聚糖溶解在0.3％的乙酸溶液中，配成0.5mg/ml的殼聚糖溶液，所述的殼聚糖的脫乙酰度為50％，Mw為1000kDa。
(3)將步驟(2)所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.1，并加入體積濃度為0.5％的司盤80，同時(shí)加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為2∶1，室溫下攪拌1小時(shí)以上，形成均勻的油包水乳液；
(4)在將步驟(3)所得油包水乳液中加入5mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，40℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)4小時(shí)，得到殼聚糖微粒；
(5)將步驟(4)所得產(chǎn)物靜置12小時(shí)以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液
(6)向去離子水中加入步驟(5)所得的殼聚糖微粒懸浮液，添加lml的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷；
實(shí)施例2
(1)將表面為二氧化鈦層的牙種植體，依次用去離子水，乙醇和丙酮超聲清洗，用氮?dú)獯蹈珊螅庞谡婵崭稍锵渲?，?0℃的條件下干燥24小時(shí)，放置備用；
(2)將殼聚糖溶解在3％的乙酸溶液中，配成5mg/ml的殼聚糖溶液，所述的殼聚糖的脫乙酰度為98％，Mw為1500kDa。
(3)將步驟(2)所得溶液與液體石蠟混合，體積比為0.4，并加入體積濃度為1％的司盤80，同時(shí)加入分散劑硬脂酸鎂，司盤80與硬脂酸鎂的質(zhì)量比為4∶1，室溫下攪拌1小時(shí)以上，形成均勻的油包水乳液；
(4)在將步驟(3)所得油包水乳液中加入10mg/ml的交聯(lián)劑香草醛1ml，60℃攪拌狀態(tài)下反應(yīng)6小時(shí)，得到殼聚糖微粒；
(5)將步驟(4)所得產(chǎn)物靜置12小時(shí)以上分離油水相，取下層水溶液，調(diào)節(jié)pH值為9，離心除去沉淀物，取上清液得到殼聚糖微粒懸浮液
(6)向去離子水中加入步驟(5)所得的殼聚糖微粒懸浮液，添加lml的冰醋酸溶液，磁力攪拌器攪拌條件下，再加入NaCl，使其終濃度達(dá)到0.15M；該溶液帶正電荷；
實(shí)施例3
將種植體表面打磨，清洗，烘干；用50～100μmTiO2微粒對(duì)種植體表面進(jìn)行噴砂處理；再置于氫氟酸與鹽酸組成的混合酸蝕劑中進(jìn)行表面刻蝕處理，取出種植體超聲清洗，干燥；再將種植體置于60℃、5mol/L NaOH溶液孵育24-48h，用水超聲清洗備用。
實(shí)施例4
(1)將實(shí)施例3處理得到的牙種植體浸沒于上文實(shí)施例2所述的殼聚糖溶液中10～20min，以使牙種植體表面帶上正電荷；再用去離子水充分清洗；
(2)將步驟(1)所述的牙種植體浸沒于RGD肽溶液中3h以上；或浸沒于濃度為lmg/ml的AMP復(fù)合物溶液中10min，以使牙種植體表面帶上負(fù)電荷；再用去離子水充分清洗；
(3)根據(jù)需要組裝的層數(shù)，重復(fù)步驟(1)、(2)和(1)即可得到帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體；
(4)將步驟(3)所述的牙種植體在濃度為2mg/mL的硫酸軟骨素硫酸鈉鹽溶液中浸泡15min，溶液體系控制pH值為6，再用去離子水充分清洗后自然干燥；再將涂覆有硫酸軟骨素的牙種植體浸泡于pH值為7，濃度為0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min，再用去離子水充分清洗后自然干燥。
實(shí)施例5
將實(shí)施例4中根據(jù)需要組裝不同層數(shù)涂層的牙種植體，在濃度為2mg/mL的硫酸軟骨素硫酸鈉鹽溶液(帶有負(fù)電荷的多糖溶液)中浸泡10～20min，溶液體系控制pH值為6，再用去離子水充分清洗后自然干燥；
將涂覆該有硫酸軟骨素的材料浸泡于pH值為7，濃度為0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min，再用去離子水充分清洗后自然干燥，獲得涂覆有硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層的材料。
針對(duì)上述方法制備獲得的牙種植體，進(jìn)行表面接觸角分析，其結(jié)果從親水性和潤濕性上也證實(shí)了涂層的存在。
根據(jù)分析可知，本發(fā)明所制備的帶有不同層數(shù)涂層的牙種植體。其涂層主要依靠陽離子與陰離子相互之間的靜電引力，在種植體固體表面形成有序排列的分子涂層，因?yàn)闅ぞ厶呛蚏GD或AMP復(fù)合物是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。再加上表層硫酸軟骨素層-抗菌肽層復(fù)合層結(jié)構(gòu)的存在，該牙種植體必定具有持久、高效的殺菌、抗感染能力，其抗菌、抗凋亡活性，能夠支持多種細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)的粘附、存活、生長與分化，具有廣闊的應(yīng)用前景。在種植體臨床應(yīng)用中，促進(jìn)種植體.骨組織界面愈合、提高骨整合率和提高種植體初期穩(wěn)定性的益處是顯而易見的。