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一種雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料及其制備方法與流程

文檔序號:12047164閱讀:682來源:國知局
一種雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料及其制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物材料領域,具體涉及一種雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料及其制備方法。



背景技術:

水凝膠不溶于水,但能在水中溶脹,由于其具有高含水量、優(yōu)良的溶脹性能、良好的生物相容性、高滲透性和3D網(wǎng)狀結構被廣泛應用于組織工程、創(chuàng)傷修復及再生醫(yī)學等領域。近些年來,可注射性水凝膠已成為一個重要的研究領域,引起各界的廣泛關注。與普通凝膠相比,它具有以下優(yōu)勢:(1)成膠快速,可填充任意形狀,使用靈活;(2)可通過注射方式使用,從而創(chuàng)傷較小,減少患者的疼痛;(3)可均勻包裹細胞、蛋白質(zhì)、激素等各種生物活性物質(zhì),生物相容性好;(4)凝膠性能易于調(diào)控,可根據(jù)不同用途如創(chuàng)傷修復、藥物緩釋、組織再生等不同應用場景進行選擇和調(diào)控。

可注射性水凝膠的制備主要有物理交聯(lián)和化學交聯(lián)兩種方式。物理交聯(lián)主要通過分子間相互作用力(范德華力、疏水相互作用、電荷作用、氫鍵等)形成,這類凝膠由于形成過程中不涉及化學反應,因而應用更簡單、更安全,但其力學性能也較弱,穩(wěn)定性較差。相對而言,化學交聯(lián)可以改進這些不足,通過如邁克加成(Michael addition)、席夫堿反應(Schiff-base)、雙硫鍵交換(Disulfide-bonding exchange)等化學反應對聚合物進行交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結構,大大加強水凝膠的力學強度和穩(wěn)定性。不僅如此,基于化學交聯(lián)的可注射性水凝膠除了可以保持良好的力學強度和穩(wěn)定性外,更易通過控制組分之間的不同比例來達到不同的使用場景和目的,這對于實際使用也更為必要,因而更易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料的制備方法。

本發(fā)明提出的一種雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料的制備方法,所述水凝膠生物材料以端基功能化的水溶性聚醚高分子為第一組分,以氨基功能化的大分子為第二組分,然后通過第一組分和第二組分通過注射器快速均勻混合得到;其中:所述第一組分的端基功能化的水溶性聚醚高分子的質(zhì)量百分數(shù)為5~15%,所述第二組分的富含氨基的大分子的質(zhì)量百分數(shù)為1~10%。

本發(fā)明中,所述第一組分為端基功能化水溶性聚醚高分子,具體為端基是NHS羧酸酯基團的功能化聚醚高分子,包括但不限于線性、多臂或樹枝狀的功能化聚乙二醇高分子等,其結構分別如結構式1~4所示:

本發(fā)明中,所述第一組分線性、多臂或樹枝狀的端基功能化的聚乙二醇高分子的分子量分別在2kDa~20kDa范圍內(nèi)。

本發(fā)明中,所述第二組分為富含氨基的大分子,具體為富含氨基的天然或化學改性或合成高分子,包括但不限于殼聚糖及化學改性殼聚糖、多聚賴氨酸、氨基改性膠原蛋白、聚醚胺等,其結構式分別如式5~式8所示。

本發(fā)明中,所述第二組分為富含氨基的富含氨基的天然或化學改性或合成高分子,其中,殼聚糖或化學改性殼聚糖的分子量在100kDa~150kDa范圍內(nèi);多聚賴氨酸的分子量在3.5kDa~10kDa范圍內(nèi);氨基改性膠原蛋白的分子量在80kDa~100kDa范圍內(nèi);聚醚胺的分子量在2kDa~20kDa范圍內(nèi)。

本發(fā)明提出的雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料的制備方法,具體步驟為:將第一組分和第二組分通過注射器快速均勻混合,經(jīng)滅菌處理,封裝后得到所需產(chǎn)品;其中:所述第一組分與第二組分快速混合時固含量之比為5:1~1:1。

本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明制備的雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料,其制備方法簡單,快速,容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),在組織工程支架、骨修復材料、藥物控釋材料、生物粘合劑、創(chuàng)傷敷料、醫(yī)用止血及抗菌等材料方面將有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1為實施例2中4-arm-PEG-SCM聚合物的核磁譜圖(CDCl3,300MHz);

圖2為實施例2中ε-PL聚合物的核磁譜圖(D2O,300MHz);

圖3為實施例2中原位功能水凝膠材料的溶脹性能測試;

圖4為實施例2中原位功能水凝膠材料的抑菌測試圖;其中:(a)為試驗組(水凝膠試樣),(b)為對照組(對照試樣),(c)為不加樣品組;

圖5為實施例2中原位功能水凝膠材料的細胞毒性測試(細胞形態(tài)圖);其中:A,25%樣品提液,B,50%樣品提液,C,75%樣品提液,D,100%樣品提液,E,空白對照,F(xiàn),陽性對照(DMSO);

圖6為實施例2中原位功能水凝膠材料的細胞毒性測試(MTT定量檢測)。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖對本發(fā)明進行說明,所舉的實施例僅是對本發(fā)明產(chǎn)品或方法做概括性例示,有助于更好地理解本發(fā)明,但不會限制本發(fā)明的范圍,在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的修改和改進,均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。下述實施例中所述實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法;所述試劑和材料,如無特殊說明,均可由商業(yè)途徑獲得。

實施例1

將3.0g聚乙二醇(PEG1500-SCM2)溶于0.1M pH 7.4的PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在5%~15%之間,設為組分一;將1.0g多聚賴氨酸(ε-PL)溶于0.1M pH 7.4PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在1%~10%之間,設為組分二;隨后分別將組分一和組分二裝入雙組分混合注射器中,通過快速混合即可制備該雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料。經(jīng)滅菌處理,封裝后即得到產(chǎn)品。

實施例2

將1.0g四臂-聚乙二醇(4-arm-PEG-SCM4,核磁分析圖譜見圖1)溶于0.1M pH 7.4的PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在5%~15%之間,設為組分一;將0.8g多聚賴氨酸(ε-PL,核磁譜圖見圖2)溶于0.1M pH 7.4PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在1%~10%之間,設為組分二;隨后分別將組分一和組分二裝入雙組分混合注射器中,通過快速混合即可制備該雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料。經(jīng)滅菌處理,封裝后即得到產(chǎn)品。

實施例3

將1.8g八臂-聚乙二醇(8-arm-PEG-SCM8)溶于去離子水中,其質(zhì)量分數(shù)控制在5%~15%之間,設為組分一;將0.2g氨基改性膠原蛋白(Collagen-NH2)溶于去離子水中,控制其質(zhì)量分數(shù)在1%~3%之間,設為組分二;隨后分別將組分一和組分二裝入雙組分混合注射器中,通過快速混合即可制備該雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料,經(jīng)滅菌處理,封裝后即得到產(chǎn)品。

實施例4

將0.6g樹枝狀-聚乙二醇(dendrimer-PEG-SCM)溶于0.1M pH 7.4的PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在5%~15%之間,設為組分一;將2.4g聚醚胺溶于0.1M pH 7.4PBS緩沖液,其質(zhì)量分數(shù)控制在5%~10%之間,設為組分二;隨后分別將組分一和組分二裝入雙組分混合注射器中,通過快速混合即可制備該雙組分可注射型原位功能水凝膠生物材料,經(jīng)滅菌處理,封裝后即得到產(chǎn)品。

實施例5

雙組分可注射型原位水凝膠的溶脹率(Swelling Ratio,SR)測試:

該水凝膠材料的溶脹測試按照如下方法進行測試:

首先將實施例2中水凝膠進行冷凍干燥,然后對其進行稱重,記為Ws,隨后將其浸泡在0.1M pH 7.4的PBS緩沖液中,在特定的時間間隔點取出水凝膠,用濾紙吸去表面水分后進行稱重記為Wt,時間間隔點分別為10min、20min、30min、60min、120min、240min、360min、720min、1440min、2880min及4230min。測試結束后,按照公式(1)計算其溶脹率:

溶脹曲線如圖3所示。由圖可知我們的雙組分可注射型原位水凝膠具有非常高的溶脹能力,其在6個小時內(nèi)溶脹率可達8000%以上,相比市面上常見的水凝膠有較大的優(yōu)勢。

實施例6

雙組分可注射型原位水凝膠的抑菌測試:

該水凝膠材料的抑菌率按如下方法測試:

首先在無菌操作下打開大腸桿菌的甘油保種菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h,用0.9%生理鹽水進行10倍系列稀釋操作,充分混勻,制備含菌量為5×103cfu/ml~5×104cfu/ml的菌懸液。取水凝膠試樣(0.6g)和對照試樣(與水凝膠試樣同等重量,成分為瓊脂)分別置于15ml離心管中,另設一個不加樣品組(空的15ml無菌離心管),然后取上述菌懸液,分別在水凝膠試樣、對照試樣以及不加樣品組的離心管中添加1ml菌懸液,室溫振蕩1h,到規(guī)定時間后,對上述所有離心管中的菌懸液稀釋10倍后,取100微升稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿中,用涼至40~45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15ml,作傾注,轉(zhuǎn)動平皿,使其充分均勻,瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板,35℃±2℃培養(yǎng)24h,觀察結果。抑菌率按公式(2)計算:

式中:

A對照組平均菌落數(shù)(CFU/ml);

B試驗組平均菌落數(shù)(CFU/ml)。

測試結果顯示,該雙組分可注射型原位功能水凝膠材料的抑菌率達到了98%以上(如表1及圖4所示),具有較強的抑菌作用。

表1

實施例7

雙組分可注射型原位水凝膠的細胞毒性測試:

該水凝膠材料的細胞毒性采用GB/T 16886.12/ISO 10993.12的方法即將水凝膠的浸提液與小鼠的成纖維細胞(L929)進行接觸培養(yǎng)的方法進行測試,具體過程如下,細胞培養(yǎng):首先將L929細胞采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)培養(yǎng),調(diào)節(jié)細胞密度至1×105個細胞/mL,取96孔板,每孔接種100uL,孵育24h;浸提液制備:稱量1g試樣,切成5mm×25mm的小塊,加入5mL無血清DMEM培養(yǎng)基,37℃水浴振蕩浸提24h,然后采用0.22um過濾膜過濾浸提液,添加10%FBS,然后分別稀釋濃度為75%、50%、25%;細胞毒性測試:除去培養(yǎng)L929細胞24h后96孔板中的培養(yǎng)基,分別加入100uL不同濃度的浸提液(100%、75%、50%、25%),高密度聚乙烯浸提液作為陰性對照,含0.5%苯酚的DMEM完全培養(yǎng)基作為陽性對照,DMEM完全培養(yǎng)基作為空白,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24h;取孔板觀察細胞形態(tài),進行形態(tài)學改變評價;除去培養(yǎng)基,加入50uL MTT溶液二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2h,每孔加入100uL異丙醇,振蕩培養(yǎng)板酶標儀測定570nm處光密度(參照波長650nm)。細胞存活率按公式(3)進行計算:

其中,OD570e為供試品100%浸提液組的光密度平均值;OD570b為空白組光密度平均值。

測試結果分別如圖5和圖6所示,可以看出該雙組分可注射型原位功能水凝膠對細胞完全無毒性,生物相容性好。

實施例1、實施例3和實施例4的溶脹率、抑菌率和細胞毒性測試同實施例2。

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