本發(fā)明與分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的技術(shù)有關(guān)，更詳而言之是指一種以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的方法。

背景技術(shù)：

牛樟芝是一種生長在樟科植物(如牛樟樹心材)的寄生真菌，具有抗氧化，降血壓和增強(qiáng)免疫力等功效，不僅可作為食材，并已被廣泛運(yùn)用于治療藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和癌癥。牛樟芝的活性成分為三萜類化合物(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)、腺苷(adenosine)、維生素、蛋白質(zhì)、勝肽、核酸等。三萜類中主要有麥角甾(ergostane)三萜類(樟菇酸A(zhankuic acid A),樟菇酸C(zhankuic acid C)與樟芝酸C(antcin C),樟芝酸K(antcin K))與羊毛甾烷(lanostane)三萜類(去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)與去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid))成分。牛樟芝子實體萃取物中的antcin A成分，可抑制老鼠血癌細(xì)胞的活性，zhankuic acid A及zhankuic acid C有強(qiáng)的癌細(xì)胞毒殺作用。牛樟芝萃取純化的三萜類成分：dehydrosulphurenic acid、dehydroeburicoic acid的實驗結(jié)果證明，具有抗腫瘤活性、促使癌細(xì)胞凋亡，但不影響人體正常細(xì)胞。牛樟芝多醣體成分也被實驗證明。

已知從牛樟芝中萃取其活性成分：三萜類化合物與多醣體成分的方法，如中國專利CN 102614195 A與美國專利20100210869 A1，以乙醇溶液、正己烷溶液及乙酸乙酯溶液依次對牛樟芝子實體進(jìn)行萃取其麥角甾與羊毛甾烷三萜類成分。美國專利7994158B2首先以水或有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯、己烷、醇類、氯仿)萃取，得到的水或有機(jī)溶劑萃取物，再經(jīng)硅膠、Sephadex吸收、濃縮和純化。美國專利20100227404 A1以乙酸乙酯、乙醇和水萃取牛樟芝子實體中的多醣體，中國臺灣專利I299665以乙醇萃取牛樟芝菌絲體中的多醣體。

由上可知，已知萃取牛樟芝中三萜類化合物與多醣體機(jī)能成分的技術(shù)，不僅耗時，需使用大量的有機(jī)溶劑，且過程中有機(jī)溶劑可能會與機(jī)能成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，完成后溶劑去除與濃縮過程中，加熱蒸發(fā)溶劑易造成機(jī)能成分部分破壞與溶劑殘留于分離物或純化物中，險有改進(jìn)之處。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的即在提供一種以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī) 能成分的方法，其可直接取得牛樟芝中三萜類化合物與多醣體機(jī)能成分，不需經(jīng)繁復(fù)的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，成本低，更可保持牛樟芝中生物活性成分的活性，甚為環(huán)保、安全，具實用價值。

緣是，為達(dá)成前述的目的，本發(fā)明提供一種以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的方法，主要在預(yù)定溫度與壓力的操作條件下，將牛樟芝萃取液與超臨界狀態(tài)溶劑通入一分餾槽內(nèi)，用以萃取出牛樟芝的三萜類化合物與多醣體等機(jī)能成分，再將萃取出的機(jī)能成分與超臨界狀態(tài)溶劑，在預(yù)定溫度與低于前述壓力的操作條件下，持續(xù)通入三個分離槽，用以分別于各分離槽中獲得牛樟芝萃取液中的三萜類化合物與多醣體機(jī)能成分。

優(yōu)選地，所述牛樟芝萃取液以1:5-10(W/V)的比例將牛樟芝粉末與乙醇混合離心而成。

更優(yōu)選地，所述牛樟芝粉末為牛樟芝的子實體、菌絲體、皿式培養(yǎng)或固態(tài)培養(yǎng)的粉末。

優(yōu)選地，在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃的操作條件下，將所述牛樟芝萃取液放置于所述分餾槽，以超臨界流體流速3-9L/hr、牛樟芝萃取液流速1-3L/hr流入分餾槽進(jìn)行萃取，超臨界狀態(tài)溶劑為超臨界二氧化碳/乙醇。

優(yōu)選地，將所述分餾槽內(nèi)萃取出的機(jī)能成分依序輸送經(jīng)過連接的三個分離槽逐步降壓，用以可選擇性分離與純化提升三萜類化合物與多醣體機(jī)能成分的含量與純度。

更優(yōu)選地，在溫度40℃或60℃下，依序分別以3000、2000、1000psi的壓力在三個所述分離槽快速降壓分離超臨界狀態(tài)溶劑。

優(yōu)選地，在壓力為4000Psi、溫度為40℃的操作條件下，最適于將牛樟芝三萜類成分分離于所述分餾槽的頂部，而牛樟芝多醣體成分容易被分離于該分餾槽的底部。

優(yōu)選地，在溫度為40℃、壓力為4000psi的操作條件下，牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分的選擇性值達(dá)220，最適于將牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分純化區(qū)分于三個分離槽中。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供一種以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的方法，僅通過控制操作溫度與壓力，即可分離出牛樟芝三萜類與多醣體，而且，分離與純化過程中沒有溶劑殘留與毒性等問題，以簡明的牛樟芝三萜類與多醣體分離效率及選擇性計算求得，易于操作、量產(chǎn)并可連續(xù)式運(yùn)作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一較佳實施例的壓力-牛樟芝總?cè)祁惓煞址蛛x效率分析圖。

圖2為本發(fā)明一較佳實施例的壓力-牛樟芝三萜類成分分離效率分析圖。

圖3為本發(fā)明一較佳實施例的壓力-牛樟芝總多醣體成分分離效率分析圖。

圖4為本發(fā)明一較佳實施例的壓力-牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分的選擇性值分析圖。

圖5為本發(fā)明一較佳實施例的三萜類化合物與多醣體成分、分餾槽底部殘余物(R)與三分離槽F1、F2、F3的濃度分布圖。

圖6A為本發(fā)明一較佳實施例的萃取液的HPLC圖譜圖。

圖6B為本發(fā)明一較佳實施例的區(qū)分物1的HPLC圖譜圖。

圖6C為本發(fā)明一較佳實施例的殘余物的HPLC圖譜圖。

具體實施方式

以下，舉本發(fā)明一較佳實施例，并配合附圖做進(jìn)一步的詳細(xì)說明如后：

本發(fā)明一較佳實施例以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的方法，主要先備取1-2Kg的牛樟芝粉末(可為牛樟芝的子實體、菌絲體、皿式培養(yǎng)或固態(tài)培養(yǎng)、粉末)，以1:5-10(W/V)的比例用乙醇混合離心，產(chǎn)生牛樟芝萃取液(Feed)，接著在壓力2000-4000Psi、溫度40-60℃、超臨界流體(二氧化碳SC-CO2/乙醇溶劑)流速3-9L/hr與牛樟芝萃取液流速1-3L/hr的操作條件下，通入一分餾槽內(nèi)進(jìn)行分離的處理，用以可在該分餾槽的頂端獲取牛樟芝三萜類含量y(triterpenoids)與多醣體含量y(polysaccharides)，該分餾槽底端獲取牛樟芝三萜類含量x(triterpenoids)與多醣體含量x(polysaccharides)。該分餾槽內(nèi)徑36mm、高度1000mm的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有不銹鋼單體片。

接著，在溫度40℃或60℃下，將超臨界流體與萃取出牛樟芝的三萜類化合物與多醣體等機(jī)能成分，持續(xù)地依序輸送經(jīng)過連接的三個分離槽，分別以3000、2000、1000psi的壓力逐步降壓，也即，第一分離槽3000psi的壓力，第二分離槽2000psi的壓力，而最后的第三分離槽1000psi的壓力，可在該分餾槽底部得到殘余物，即牛樟芝萃取液中的三萜類與多醣體等機(jī)能成分，三個分離槽分別得到區(qū)分物1(F1)，區(qū)分物2(F2)和區(qū)分物3(F3)。三個分離槽皆為內(nèi)徑36mm、高度500mm的不銹鋼槽體。

以下，利用不同的操作條件(改變壓力與溫度)實施前述方法，取牛樟芝萃取液(Feed)、分餾槽頂部得到的萃取物(Extract)、分餾槽底部得到的殘余物(Raffinate)，三個分離槽分別得到的區(qū)分物1(F1)，區(qū)分物2(F2)和 區(qū)分物3(F3)，分析定量以下性質(zhì)：(1)牛樟芝總?cè)祁惡俊?2)牛樟芝總多醣體含量、(3)牛樟芝中三萜類化合物成分與含量。

總?cè)祁惡康臏y量，以熊果酸當(dāng)為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長548nm吸光度換算標(biāo)準(zhǔn)品含量，定量單位以mg/ml表示。總多醣體含量的測量，以苯酚硫酸法測定試劑，在波長490nm吸光度換算葡萄糖的含量，定量單位以mg/ml表示。三萜類化合物的個別成分與含量的測量，以C18管柱的HPLC定量分析，單位以mg/ml表示。實驗結(jié)果分為二部分：(1)牛樟芝中的機(jī)能成分最適分離與純化條件，(2)總?cè)祁惡?、總多醣體含量與三萜類的個別化合物成分的分離與純化量產(chǎn)制程，數(shù)據(jù)分析如圖1至圖6所示。

首先，將牛樟芝萃取液分離后，收集該分餾槽頂部與底部的樣品，分析二者含量并計算出牛樟芝三萜類的分離效率(Ktriterpenoids)、牛樟芝多醣體的分離效率(Kpolysaccharides)與二者含量的選擇性值(selectivity)。定義如下：

Ktriterpenoids＝分餾槽頂部牛樟芝三萜類含量(V*y(triterpenoids))÷分餾槽底部牛樟芝三萜類含量(L*x(triterpenoids))。

Kpolysaccharides＝分餾槽頂部牛樟芝多醣體含量(V*y(polysaccharides))÷分餾槽底部牛樟芝多醣體含量(L*x(polysaccharides))。

選擇性值定義：＝Ktriterpenoids÷Kpolysaccharides。

當(dāng)Kpolysaccharides＝1時，表示該分餾槽頂部的牛樟芝多醣體含量等于分餾槽底部牛樟芝多醣體含量。當(dāng)Ktriterpenoids＝1時，表示該分餾槽頂部的牛樟芝三萜類含量等于分餾槽底部牛樟芝三萜類含量。因此，Ktriterpenoids>>1時，表示牛樟芝三萜類含量容易被分離于分餾槽的頂部；Kpolysaccharides<<1時，表示牛樟芝多醣體含量容易被分離于該分餾槽底部。操作壓力與溫度會改變牛樟芝中的三萜類化合物與多醣體成分的分離效率。

分離后的數(shù)值結(jié)果顯示：如圖1所示，溫度在40℃范圍下，壓力越高時(即壓力達(dá)4000psi時)，牛樟芝總?cè)祁惓煞值姆蛛x效率(Ktriterpenoids)達(dá)50左右。以最適溫度40℃分析不同壓力范圍下(2000-4000psi)的牛樟芝三萜類每個成分的分離效率，圖2顯示牛樟芝三萜類成分在壓力4000psi時，如樟菇酸A(zhankuic acid A)與去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)的分離效率達(dá)150以上，樟芝酸C(antcin C)與去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的分離效率達(dá)30以上，而樟芝酸K(antcin K)與樟菇酸C(zhankuic acid C)的分離效率至少達(dá)10以上。如圖3所示，溫度在60℃范圍下，壓力越高時(即壓力達(dá)4000psi時)，牛樟芝總多醣體成分的分離效率(Kpolysaccharides)達(dá)3.6；相對地，溫度在40℃與壓力4000psi 時，牛樟芝總多醣體成分的分離效率只有0.23。因此，由圖1與圖3可知，采用溫度40℃與壓力4000psi時，最適于將牛樟芝三萜類成分分離于分餾槽的頂部，而，牛樟芝多醣體成分則容易被分離于該分餾槽底部。

如圖4所示，當(dāng)溫度在40℃范圍下與壓力達(dá)4000psi時，牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分的選擇性值達(dá)220，顯示在此操作條件下，最適于將牛樟芝中的三萜類化合物與多醣體成分純化區(qū)分在三個分離槽中(F1、F2、F3)。舉例而言，選擇溫度40℃與壓力4000psi的操作條件下，將牛樟芝中的三萜類化合物，分離于分餾槽的頂端，再利用降壓(即降低壓力至3000、2000、1000psi在F1、F2、F3)，可以選擇性地分離、區(qū)分與純化牛樟芝中的三萜類化合物與多醣體成分含量與純度。因此，如圖5所示，利用最適合的選擇性值實驗數(shù)值，以牛樟芝萃取液(Feed)在溫度40℃與壓力4000psi的操作條件下，分離出分餾槽底部得到殘余物(R)與分餾槽頂部得到萃取物(Extract)，再將Extract區(qū)分至三個分離槽F1、F2、F3中。如圖5分析R、F1、F2、F3的三萜類化合物與多醣體成分濃度分布，顯示牛樟芝萃取液中的多醣體成分被分配至分餾槽的底部R；同時，牛樟芝萃取液中的三萜類成分被分配至分離槽F1與F2中，牛樟芝三萜類中的樟芝酸C(antcin C)、去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)與樟菇酸A(zhankuic acid A)成分大部分被區(qū)分在分離槽F1中。比較牛樟芝萃取液、第一分離槽-區(qū)分物1(F1)與分餾槽的底部R中的牛樟芝三萜類成分，圖6A至圖6C的HPLC圖譜顯示與證明：牛樟芝萃取液中的三萜類化合物可以經(jīng)過分餾槽分離后，95％以上的三萜類化合物可以分離與純化至第一分離槽-區(qū)分物1(F1)中。

由上可知，本發(fā)明所提供以超臨界流體技術(shù)分離與純化牛樟芝中機(jī)能成分的方法，其可將牛樟芝萃取液分離出活性成分--三萜類與多醣體，相較于已知萃取與分離牛樟芝中三萜類化合物與多醣體成分的方法，本發(fā)明僅通過控制操作溫度與壓力，即可分離出牛樟芝三萜類與多醣體，而且，分離與純化過程中沒有溶劑殘留與毒性等問題，以簡明的牛樟芝三萜類與多醣體分離效率及選擇性計算求得，易于操作、量產(chǎn)并可連續(xù)式運(yùn)作，甚具實用價值。