本發(fā)明涉及一種樟芝菌絲體萃取物，特別是涉及一種降低癌細(xì)胞抗藥性的樟芝菌絲體萃取物及其活性物質(zhì)和組合物。

背景技術(shù)：

癌癥是現(xiàn)代人常見的疾病之一，每年都高居十大死因首位，大約每四個(gè)人就有一人會(huì)罹患癌癥，癌癥的預(yù)防和治療已成為現(xiàn)代人不可漠視的問題。我們的身體是由無數(shù)細(xì)胞所組成的，細(xì)胞會(huì)經(jīng)由有絲分裂制造新細(xì)胞，從而令我們生長、取代舊細(xì)胞、或修補(bǔ)因受傷而損壞的細(xì)胞。這樣的機(jī)制由基因負(fù)責(zé)控制，要是基因調(diào)控上出現(xiàn)問題就容易導(dǎo)致細(xì)胞病變，進(jìn)而產(chǎn)生不正常增生的細(xì)胞而導(dǎo)致癌癥。這些細(xì)胞病變?cè)谖覀兘邮胀庠诃h(huán)境的壓力時(shí)逐漸累積，也有部分的人遺傳到已損毀的基因。正常的細(xì)胞會(huì)隨基因調(diào)控有秩序地進(jìn)行分裂和復(fù)制，當(dāng)失去控制時(shí)，就會(huì)不停地復(fù)制，在身體里累積成塊狀，成為腫瘤。腫瘤可分為良性(benign)和惡性(malignant)兩種，惡性的腫瘤又稱為癌，良性腫瘤的細(xì)胞不會(huì)擴(kuò)散到身體其他部分，而惡性腫瘤因?yàn)橛邪┘?xì)胞，所以具有轉(zhuǎn)移的能力。它最初形成的時(shí)候，會(huì)守在原部位上，故稱為“原位癌”。但隨著情況惡化，它就會(huì)破壞周圍的組織并擴(kuò)散至其他器官去，變成侵襲性的癌癥。當(dāng)腫瘤由原來位置擴(kuò)散到身體其他部位時(shí)，這叫做繼發(fā)性癌癥(secondary cancer)或轉(zhuǎn)移性癌癥(metastasis)。

癌癥的治療方式取決于癌癥的種類、發(fā)生的部位以及是否擴(kuò)散到身體其他部位。常見的治療方式包括外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療等等；有時(shí)候也會(huì)結(jié)合使用來達(dá)到更好的治療效果。利用口服或靜脈注射抗癌藥物來消滅癌細(xì)胞或抑制癌細(xì)胞的生長一直是化學(xué)藥物治療的主流，使用的對(duì)象經(jīng)常是已經(jīng)轉(zhuǎn)移或是無法手術(shù)根除的惡性腫瘤。

在早期發(fā)現(xiàn)的癌癥可以外科手術(shù)切除來治療，但當(dāng)癌癥晚期時(shí)會(huì)經(jīng)由血液跟淋巴轉(zhuǎn)移到其他器官，此時(shí)單靠局部治療已經(jīng)無法完全控制住癌細(xì)胞，單靠 局部治療通常無法完全控制住癌細(xì)胞便需要采用全身性的治療，例如化學(xué)治療，荷爾蒙治療或新一代的標(biāo)靶治療等方式。目前常使用的化療藥物有紫杉醇類如paclitaxol(太平洋紫杉醇)和docetaxel(歐洲紫杉醇)、purine(嘌呤)類似物如gemcitabine(2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷)、topoisomerase II inhibitor(拓樸異構(gòu)酶第二型抑制劑)如campto(CPT-11)(喜樹堿)、第三代白金類衍生物如oxaliplatin(奧沙利鉑)、脂質(zhì)體的結(jié)合物如liposomal adriamycin(阿霉素脂質(zhì)體)，在提升化療的效果和減輕副作用上都有顯著進(jìn)展?；瘜W(xué)治療使用的目的除了能殺死癌細(xì)胞外，也能減小腫瘤的體積，末期病人使用化療能減少患者痛苦，與手術(shù)及放射治療結(jié)合使用，減低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

1970年代發(fā)現(xiàn)臨床上癌癥病人經(jīng)化學(xué)治療后，對(duì)于多種化療藥物的敏感度降低，稱為癌癥多重抗藥性(multidrug resistance；MDR)，是造成化學(xué)治療失敗的重要原因。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有抗藥性的過程，有許多的機(jī)制參與其中，目前已知的機(jī)制包括：增加藥物排出細(xì)胞外、改變藥物代謝途徑或產(chǎn)物、細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)(checkpoint)改變、細(xì)胞凋亡途徑(cell apoptosis)調(diào)控失調(diào)及基因修補(bǔ)(gene repair)機(jī)制改變等。具有多重抗藥性的癌細(xì)胞，會(huì)大量表達(dá)一種穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，稱為P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，P-gp蛋白為ATP-dependent efflux pump(ATP依賴的外排泵)，大量表達(dá)在腸道上皮細(xì)胞及肝臟。許多不同結(jié)構(gòu)的藥物會(huì)經(jīng)由P-gp蛋白攜帶而從細(xì)胞內(nèi)被排出，因而降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度。在癌細(xì)胞中，當(dāng)化療藥物刺激癌細(xì)胞時(shí)，癌細(xì)胞便會(huì)大量表達(dá)P-gp蛋白來將藥物排出，使化療藥物失效。P-gp蛋白在癌細(xì)胞表現(xiàn)多重抗藥性的角色雖已經(jīng)被大量研究，顯示與化療藥物造成的多重抗藥性有重要關(guān)聯(lián)，而其他造成癌細(xì)胞多重抗藥性的機(jī)制也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但是仍無法解決臨床上因多重抗藥性導(dǎo)致化學(xué)治療失敗的問題。多數(shù)的抗癌藥物的治療指數(shù)(therapeutic index)都很狹窄，一旦癌細(xì)胞對(duì)于抗癌藥物的敏感度稍微降低，臨床上礙于毒性的考量，又不能提高劑量，因此造成治療中斷。

樟芝的型態(tài)棒芝又名牛樟菇、樟菰、樟窟內(nèi)菰，臺(tái)灣又稱陰陽對(duì)口菇。樟芝子實(shí)體屬多年生，具有強(qiáng)烈沖鼻的樟樹香氣，此與一般靈芝類有很大的差異，其外型呈板狀或鐘狀。板狀型態(tài)者，面為橘紅(黃)色，整面全有菌孔，板底層 有淺黃白色的木栓質(zhì)，藉此木栓質(zhì)附著在牛樟樹中空心材內(nèi)壁上生長。鐘狀型態(tài)者，子實(shí)層(鐘面)亦呈橘(黃)色，充滿菌孔(4-5個(gè)菌孔/毫米)，內(nèi)有孢子味，極苦，新鮮時(shí)為橘紅色，之后會(huì)成為橘褐色或褐色，鐘體則呈暗綠褐色的皮殼。以顯微鏡觀察其擔(dān)孢子，其型態(tài)為平滑無色的透明微彎柱形。

野生的樟芝是生長在牛樟樹干中空內(nèi)壁上，因?yàn)檫@個(gè)特性，造成很多牛樟樹倒伏。文獻(xiàn)記載，樟芝是在牛樟樹上目前唯一發(fā)現(xiàn)的木材腐杉菌，病征為褐色腐朽，故為褐腐菌。但是樟芝的病原性并不強(qiáng)，因此牛樟樹很少因此死亡。雖然樟芝對(duì)牛樟樹而言是病原菌，但因樟芝價(jià)格昂貴，超過牛樟樹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此是不是牛樟樹的病原菌已經(jīng)不重要了。

樟芝的培養(yǎng)，人工栽培的技術(shù)仍有待努力。所以，目前仍是以深山采集的方式來獲得。但是采集樟芝不是件容易的事，因?yàn)槭紫纫獙ふ遗Ｕ翗涞漠a(chǎn)地。常有的困難是牛樟樹與冇樟，兩者極為相似，不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出，冇樟干油是以黃樟油與十五燒醛(pantadecylaldehyde)為主，因而有沙士中黃樟素(Safrole)的味道，牛樟干油則以松油醇(d-terpinenol)為主，而有樟腦油的味道，藉此即可區(qū)別牛樟與冇樟；第二個(gè)困難是要從大片樹林中找到有中空洞的樹干才行，此相當(dāng)不易?？斩粗腥粲姓林?，則可定期采集。

樟芝子實(shí)體在過去一直被認(rèn)為對(duì)解毒、高血壓、止癢、腹瀉、過敏、肝癌的治療有效。因牛樟芝富含三萜類化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxide dismutase：SOD)、腺苷(adenosine)、多糖體(polysaccharides)、β-D-葡聚糖(β-D-glucan)、維生素，其中豐富的三萜類化合物及多糖體成份被認(rèn)為可以一定程度地抑制癌細(xì)胞增生，且具有殺死癌細(xì)胞的能力，特別是對(duì)于肝癌、胃癌、乳癌、子宮頸癌有不錯(cuò)的保健功效。目前很多研究發(fā)現(xiàn)三萜類具有抗炎、鎮(zhèn)痛、毒殺腫瘤細(xì)胞及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、抗缺氧等作用；而且還具有提高免疫力的作用。而β-D-葡聚糖能通過刺激巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及自然殺手細(xì)胞等，增強(qiáng)免疫功能進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。

而癌癥為為十大死因之首，且化療過程常因癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性使化療的成效不佳，解決癌癥的化療抗藥性成為一個(gè)亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種用于降低癌癥抗藥性的樟芝菌絲體萃取物及其活性物質(zhì)和組合物，包含有效劑量的樟芝菌絲體萃取物或樟芝菌絲體的活性物質(zhì)，降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗藥性。

本發(fā)明的目的在于提供一種樟芝菌絲體萃取物，所述樟芝菌絲體萃取物是由以下步驟制備得到：

步驟1：取牛樟芝菌絲體，以有機(jī)溶劑經(jīng)超聲波震蕩，再經(jīng)過振搖后，得到牛樟芝菌絲體萃取液；

步驟2：以減壓濃縮去除所述牛樟芝菌絲體萃取液中的有機(jī)溶劑，再以乙酸乙酯和水進(jìn)行分層，取乙酸乙酯層，去除乙酸乙酯，得牛樟芝菌絲體粗萃取物；

步驟3：將步驟2所得的牛樟芝菌絲體粗萃取物以膠體管柱層析純化，并以正己烷-乙酸乙酯洗脫，得樟芝菌絲體萃取物。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟1中，所述有機(jī)溶劑為甲醇，所述牛樟芝菌絲體與所述有機(jī)溶劑的體積比為1:5-20。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟3中，所述膠體管柱為硅膠或Sephadex LH-20膠體管柱，，所述正己烷-乙酸乙酯的體積比為95：5至0：100。

本發(fā)明還提供一種降低癌細(xì)胞抗藥性的組合物，包含有效劑量的上述樟芝菌絲體萃取物。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述癌細(xì)胞包括子宮頸癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述癌細(xì)胞抗藥性是通過檢測多重抗藥蛋白MDR1的表達(dá)量體現(xiàn)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述樟芝菌絲體萃取物與化療藥物并用。該方式可降低癌細(xì)胞的抗藥性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述化療藥物為太平洋紫杉醇(即Paclitaxel)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包含有效劑量的樟芝菌絲體萃取物，和至少一種醫(yī)藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。

本發(fā)明還提供一種降低癌細(xì)胞抗藥性的活性物質(zhì)，所述降低癌細(xì)胞抗藥性的活性物質(zhì)是由樟芝萃取而得，包含活性化合物：4-Acetyl antroquinonol、 Antrodin或Antroquinonol。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述降低癌細(xì)胞抗藥性的活性物質(zhì)，包含有效劑量的所述活性化合物，和至少一種醫(yī)藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本案發(fā)明人經(jīng)過長久的構(gòu)思與研究，提供一種利用液態(tài)培養(yǎng)樟芝菌絲體萃取得到的樟芝菌絲體萃取物，且證明了該樟芝菌絲體萃取物具有抑制癌細(xì)胞的多重抗藥性蛋白MDR1的作用，從而達(dá)到減少癌細(xì)胞抗藥性的功效。并且與化學(xué)合成藥物相比，該樟芝菌絲體萃取物還具有更高的安全性。

本發(fā)明的降低癌細(xì)胞抗藥性的活性物質(zhì)，是由樟芝萃取而得，其中包含4-Acetyl antroquinonol、Antrodin或Antroquinonol等活性化合物，上述活性物質(zhì)具有抑制癌細(xì)胞的多重抗藥性蛋白MDR1的作用，從而達(dá)到減少癌細(xì)胞抗藥性的功效。并且與化學(xué)合成藥物相比，該活性物質(zhì)還具有更高的安全性。

附圖說明

圖1為樟芝菌絲體萃取物對(duì)MDR1表達(dá)量影響示意圖；

圖2為樟芝菌絲體活性物質(zhì)對(duì)MDR1表達(dá)量影響示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但并不對(duì)本發(fā)明造成任何限制。本說明書中所述的所有技術(shù)性及科學(xué)術(shù)語，除非另外有定義，皆為該所屬領(lǐng)域具有通常技藝者可共同了解的意義。

菌株來源：

本發(fā)明所使用的菌株A.camphorata CCRC-35396是購買自財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，且此菌株寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為：中國，北京，中關(guān)村；保藏編號(hào)為CGMCC NO.0575；保藏日期為：2001年5月9日；分類命名為：樟芝Antrodia camphorata。

實(shí)施例1

樟芝菌絲體的發(fā)酵

將CCRC-35396菌株接種至2升Hinton錐形瓶，該錐形瓶內(nèi)含有1升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成份為1.0％葡萄糖、0.5％黃豆粉、0.5％蛋白胨、0.01％硫酸鎂(MgSO₄)、0.01％消泡劑(KM-72 antifoam)，調(diào)整pH值至pH4.0，于28℃下振蕩培養(yǎng)10天。培養(yǎng)出的菌絲體于無菌室中轉(zhuǎn)移至200升發(fā)酵槽，該發(fā)酵槽內(nèi)含有120升上述培養(yǎng)基，在28℃下發(fā)酵培養(yǎng)12天。

實(shí)施例2

樟芝菌絲體萃取

將發(fā)酵所得的樟芝菌絲體發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，以10倍體積的濃度為100％的甲醇于15-25℃超聲波震蕩1小時(shí)，可重復(fù)萃取數(shù)次再以120rpm振搖過夜萃取，將上述所得萃取液經(jīng)減壓濃縮除去甲醇，殘余的甲醇萃取物以乙酸乙酯與水進(jìn)行分層，將乙酸乙酯層抽取液減壓濃縮除去溶劑后，以硅膠管柱層析作初步分離，依序以正己烷─乙酸乙酯(95:5→0:100)洗脫得樟芝菌絲體萃取物，共得12個(gè)部份。依照極性由小到大分別標(biāo)示為ACME(A～K)，回溶后保存于4℃。

實(shí)施例3

樟芝菌絲體活性物質(zhì)的純化

將樟芝菌絲體萃取物ACME-G與ACME-H混和，以硅膠及Sephadex LH-20管柱層析進(jìn)一步分離，得到化合物4-Acetyl antroquinonol B、Antrodin C、Antroquinonol，回溶后保存于4℃。得到的純化合物經(jīng)HPLC與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照以確認(rèn)。

實(shí)施例4

人類癌細(xì)胞株培養(yǎng)

于6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)皿的每一孔加入1毫升培養(yǎng)基，其內(nèi)含有5×10⁴個(gè)細(xì)胞，于5％二氧化碳與37℃環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼覆于培養(yǎng)皿上；用以檢測樟芝菌絲體萃取物對(duì)人類子宮頸HeLa細(xì)胞及樟芝中的活性物質(zhì)對(duì)人類 肝癌HepG2細(xì)胞MDR1表達(dá)量的影響。

樟芝菌絲體萃取物或活性物質(zhì)溶解于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中，檢測時(shí)DMSO的濃度不超過0.1％以避免其毒性影響細(xì)胞生長；細(xì)胞以樟芝菌絲體萃取物或活性物質(zhì)處理24小時(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)萃?。粚?shí)驗(yàn)組為樟芝菌絲體萃取物或活性物質(zhì)合并加入化療藥物paclitaxel。

實(shí)施例5

MDR1蛋白檢測

蛋白質(zhì)萃取步驟：所有步驟于冰上進(jìn)行，移除細(xì)胞的培養(yǎng)基，以磷酸緩沖溶液清洗，加入含有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)的細(xì)胞溶解液(lysis buffer)以打破細(xì)胞并且避免蛋白質(zhì)水解，用刮勺將細(xì)胞輕輕刮下，使用微量吸管重復(fù)抽吸以打破細(xì)胞，將打破的細(xì)胞液收集至離心管，12000-13000rpm、4℃離心20分鐘，抽取上清液，作蛋白質(zhì)定量后以蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測MDR1表達(dá)量。

蛋白質(zhì)定量步驟：樣品加入Bradford試劑，以酶標(biāo)儀(ELISA READER)檢測595nm的吸光值；以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以回推計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)印跡法步驟：將定量的蛋白質(zhì)樣本以6％十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，MDR1蛋白的分子量為141KD；轉(zhuǎn)印后以MDR1的一級(jí)抗體辨識(shí)，壓片分析MDR1表達(dá)量，以β-actin表達(dá)量作內(nèi)部定量控制以校正MDR1的表達(dá)量。

實(shí)施例6

樟芝菌絲體萃取物對(duì)MDR1表達(dá)量的影響

檢測樟芝菌絲體萃取物處理對(duì)人類子宮頸癌Hela細(xì)胞MDR1表達(dá)量的影響，以樟芝菌絲體萃取物處理Hela細(xì)胞24小時(shí)，再以paclitaxel處理細(xì)胞48小時(shí)，如圖1所示，低濃度(0.1μM)paclitaxel處理使HeLa細(xì)胞的MDR1表達(dá)量 增加11.3％，高濃度(0.5μM)paclitaxel處理使HeLa細(xì)胞的MDR1表達(dá)量增加44.6％(p<0.01)；樟芝菌絲體萃取物處理(未合并使用paclitaxel)的HeLa細(xì)胞中，實(shí)施例2中得到的樟芝菌絲體萃取物中標(biāo)示為ACME-F的部分使MDR1表達(dá)量增加但沒有顯著差異，ACME-G跟ACME-H使HeLa細(xì)胞MDR1表達(dá)量降低，ACME-H使HeLa細(xì)胞MDR1表達(dá)量降低29％(p<0.05)；ACME-F、ACME-G、ACME-H合并使用paclitaxel處理使HeLa細(xì)胞的MDR1表達(dá)量顯著降低(p<0.01)，其中以ACME-G的抑制效果最為顯著，MDR1表達(dá)量由144.61％降低至10.43％(p<0.001)。

實(shí)施例7

檢測樟芝菌絲體活性物質(zhì)處理對(duì)人類肝癌HepG2細(xì)胞MDR1表達(dá)量的影響，以樟芝菌絲體活性物質(zhì)Antroquinonol(即圖2中C)處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)，如圖2所示，能有效減少M(fèi)DR1表達(dá)量，再以化療藥物paclitaxel處理人類肝癌HepG2細(xì)胞48小時(shí)，低濃度paclitaxel(0.1μM)使Hep G2細(xì)胞中MDR1表達(dá)增加8.7％，而在高濃度paclitaxel(0.5μM)使Hep G2細(xì)胞中MDR1表達(dá)增加34.2％；以樟芝菌絲體活性物質(zhì)處理人類肝癌HepG2細(xì)胞，4-Acetyl antroquinonol B(即圖2中A)使MDR1表達(dá)量增加45.8％(p<0.05)，Antrodin C(即圖2中B)跟Antroquinonol(即圖2中C)使MDR1表達(dá)量顯著減少(p<0.001)；以樟芝菌絲體活性物質(zhì)合并使用paclitaxel，三種樟芝中的純化合物都使MDR1表現(xiàn)顯著降低(p<0.01)，其中以Antroquinonol的效果最顯著，MDR1表達(dá)量由134.16％降至9.34％(p<0.001)。

本發(fā)明的樟芝菌絲體萃取物和活性物質(zhì)，是以天然藥用真菌發(fā)酵而得，相較于化學(xué)合成藥物，除更具安全性，還具有減少癌細(xì)胞抗藥性之功效。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)， 但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。