牛樟芝的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種牛樟芝的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括：培養(yǎng)基配制步驟，將重量百分比為0.1～50％的葡萄糖、1～5％的蛋白胨、0.1～50％的大麥萃取物、0.1～50％的酵母萃取物及0.5～10％的固化劑，以水配制成柱體培養(yǎng)基，該柱體培養(yǎng)基的深度為2～20公分；接種步驟，在所述柱體培養(yǎng)基的內(nèi)部設(shè)置有多個預(yù)定接種位，該多個預(yù)定接種位距離所述柱體培養(yǎng)基的外表面0.5～10公分深處，將牛樟芝接種于各個預(yù)定接種位上；以及培養(yǎng)步驟，將所述柱體培養(yǎng)基于溫度23～28℃下培養(yǎng)至少三個月，獲得牛樟菌體。本發(fā)明的牛樟芝的培養(yǎng)方法不僅能夠提高單位培養(yǎng)基的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體的生長量，而且能夠降低雜菌污染的情形，減少生產(chǎn)損失。
【專利說明】牛樟芝的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛樟芝的培養(yǎng)方法，特別涉及一種能夠使牛樟芝產(chǎn)生三萜類化合物的牛樟芝培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛樟芝(Taiwanofungus camphorates),又名牛樟燕或樟芝，屬于真菌界中的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、同擔(dān)子菌綱(Homobasidiomycetes)、無折菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，牛樟芝只生長在臺灣的保育樹種牛樟木上，為臺灣特有菇類。
[0003]從牛樟芝的菌絲體或子實(shí)體抽出物中，發(fā)現(xiàn)多種生理活性物質(zhì)，例如多醣體、腺苷或多種三萜類化合物，其中，在這些三萜類化合物中，如胺蕈A(Antcin A)、胺蕈B (Antcin B)、胺蕈 C ( Antcin C)、胺蕈 E (Antcin E)、胺蕈 F (Antcin F)、甲基胺蕈酯G (Methylantcinate G)、甲基胺蕈酯 H(Methylantcinate H)、胺卓蕈(Antrocin)、4，7_ 雙甲氧基-5-甲基-1,3 雙氧苯(4, 7-dimethoxy-5-methyl-l, 3-benzodioxole)及 2, 2’，5,5，_ 四甲氧基 _3，4，3，，4，—雙甲基—內(nèi)雙氧 _6，6，-聯(lián)苯(2，2’，5，5’ —tetramethoxy-3，
4,3’，4’-bimethyl_enedioxy-6,6’_dimethylbiphenyl)等，經(jīng)研究證實(shí)具有抗癌細(xì)胞生長的能力。
[0004]然而，由于牛樟芝是生長于牛樟木上的真菌，產(chǎn)量稀少且不易取得，因此本領(lǐng)域是通過人工培育牛樟芝的方式，獲得牛樟芝菌絲體或子實(shí)體，進(jìn)一步萃取該牛樟芝菌絲體或子實(shí)體內(nèi)的生理活性物質(zhì)(如三萜類化合物或多醣體)。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)的牛樟芝培養(yǎng)方法包括:固態(tài)培養(yǎng)法、液態(tài)發(fā)酵法、椴木栽培法或太空包栽培法，然而，上述現(xiàn)有技術(shù)卻各有缺點(diǎn)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)的固態(tài)培養(yǎng)法，是挖取一塊約I公分見方的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體，并將其貼附于固態(tài)培養(yǎng)基的表面，使該牛樟芝能夠貼附于該固態(tài)培養(yǎng)基的表面生長，雖然現(xiàn)有技術(shù)的固態(tài)培養(yǎng)法可以獲得牛樟芝的菌絲體或子實(shí)體，且較不易產(chǎn)生雜菌，然而，以現(xiàn)有技術(shù)的固態(tài)培養(yǎng)法所獲得的菌絲體或子實(shí)體中卻僅含有極低量的三萜類化合物，因此現(xiàn)有技術(shù)的固態(tài)培養(yǎng)法所獲得的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體，無法應(yīng)用于萃取其生理活性物質(zhì)從而不在產(chǎn)業(yè)上使用。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)的液態(tài)發(fā)酵法，是將牛樟芝的菌絲體接種于液態(tài)培養(yǎng)液中，該液態(tài)培養(yǎng)液雖然能夠提高牛樟芝內(nèi)所含有的生理活性物質(zhì)，然而培養(yǎng)過程中需加入如蔗渣或五谷雜糧等固體基質(zhì)作為牛樟芝菌絲體的支撐物，因此，液態(tài)發(fā)酵法必須以大體積的反應(yīng)器培養(yǎng)，其制備成本高，且液態(tài)發(fā)酵法也容易發(fā)生雜菌污染的情形。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)的椴木栽培法，是將牛樟芝接種在牛樟椴木上，其所獲得的牛樟芝成分與野生牛樟芝所含的生理活性物質(zhì)的種類相近，但由于牛樟椴木取得不易，并且培育成本較高，因此無法大量生產(chǎn)制備三萜類化合物。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)的太空包栽培法，雖然整體成本較低，但其培育過程中容易受到雜菌污染，且生理活性物質(zhì)含量較低，因此，也無法大量生產(chǎn)制備三萜類化合物。
[0010]上述方法雖然都能夠獲得含有三萜類化合物的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體，但是其培養(yǎng)操作不易，容易產(chǎn)生雜菌，使得整批次培養(yǎng)的牛樟芝受到污染而造成生產(chǎn)上的重大損失，且現(xiàn)有技術(shù)的牛樟芝培養(yǎng)方法所生產(chǎn)制備的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體的質(zhì)量不高，其所含的三萜類化合物仍不足。
[0011]因此，現(xiàn)有技術(shù)的牛樟芝培養(yǎng)方法仍存在有不足之處，有待于進(jìn)一步改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的牛樟芝的培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。
[0013]本發(fā)明的主要目的是提供一種牛樟芝的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括:(1)培養(yǎng)基配制步驟，所述培養(yǎng)基配制步驟包括將重量百分比為0.1-50%的葡萄糖、I-5%的蛋白胨、0.1-50%的大麥萃取物、0.1-50%的酵母萃取物以及0.5-10%的固化劑，用水配制成混合溶液，將所述混合溶液煮沸，使其完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱體培養(yǎng)基，所述柱體培養(yǎng)基的深度為2-20公分；(2)接種步驟，所述接種步驟包括在所述柱體培養(yǎng)基的內(nèi)部設(shè)置有多個預(yù)定接種位，所述多個預(yù)定接種位距離所述柱體培養(yǎng)基的外表面有0.5-10公分深，將牛樟芝接種于所述各個預(yù)定接種位上；以及(3)培養(yǎng)步驟，所述培養(yǎng)步驟包括將接種完成的柱體培養(yǎng)基在溫度23-28°C環(huán)境下培養(yǎng)至少三個月，獲得牛樟菌體。
[0014]優(yōu)選地，在所述培養(yǎng)步驟后，還包括干燥步驟，所述干燥步驟包括將長有牛樟菌體的柱體培養(yǎng)基，在30-40°C下烘干至含水量低于2%，獲得牛樟干燥菌塊。
[0015]優(yōu)選地，所述各個預(yù)定接種位之間相距0.5-2公分。
[0016]優(yōu)選地，所述柱體培 養(yǎng)基為多面柱體或圓柱體。
[0017]優(yōu)選地，所述固化劑為瓊脂。
[0018]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)時間為4-12個月。
[0019]優(yōu)選地，所述干燥步驟的干燥時間為24-72小時。
[0020]通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法，不僅能夠提高單位培養(yǎng)基的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體的生長量，而且能夠降低雜菌污染的情形，大大改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)制備的牛樟芝菌絲體或子實(shí)體的質(zhì)量不高，所含的三萜類化合物仍不足的缺點(diǎn)，并簡化了培養(yǎng)程序，避免了生產(chǎn)上的損失。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明牛樟芝培養(yǎng)方法的步驟方塊圖(一)；
[0022]圖2a是本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基的立體外觀圖-四面柱體；
[0023]圖2b是本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基的立體外觀圖-六面柱體；
[0024]圖2c是本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基的立體外觀圖-八面柱體；
[0025]圖2d是本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基的立體外觀圖-十二面柱體；
[0026]圖2e是本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基的立體外觀圖-圓柱體；
[0027]圖3是本發(fā)明牛樟芝培養(yǎng)方法的步驟方塊圖(二)；
[0028]圖4是本實(shí)施例的UPLC-MS/MS層析圖([m/z] +)；[0029]圖5是本實(shí)施例的UPLC-MS/MS層析圖([m/z] _)。
[0030]附圖標(biāo)記說明如下:
[0031]培養(yǎng)基配制步驟S1、接種步驟S2、培養(yǎng)步驟S3、干燥步驟S4、柱體培養(yǎng)基1、底面
11、頂面12、側(cè)表面13、間距D、預(yù)定接種位P、斜線部分S。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為使審查員能進(jìn)一步了解本發(fā)明的結(jié)構(gòu)、特征及其他目的，現(xiàn)結(jié)合所附較佳實(shí)施例附以附圖詳細(xì)說明如下，本附圖所說明的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明。
[0033]如圖1所示，圖1是本發(fā)明的牛樟芝培養(yǎng)方法的步驟方塊圖，包括培養(yǎng)基配制步驟S1、接種步驟S2及培養(yǎng)步驟S3。
[0034]該培養(yǎng)基配制步驟SI，將重量百分比為0.1-50%的葡萄糖(Glucose)、I-5%的蛋白腺(Peptone)、0.1-50%的大麥萃取物(Malt extract)、0.1-50%的酵母萃取物(Yeast extract)及0.5-10%的固化劑,用水配制成混合溶液,將該混合溶液煮沸,使上述成分完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱體培養(yǎng)基，所述柱體培養(yǎng)基的深度為2-20公分。
[0035]具體地說，本發(fā)明的混合溶液中，葡萄糖提供牛樟芝生長所需的碳源，蛋白胨、大麥萃取物及酵母萃取物提供牛樟芝生長所需的氮源及其他微量元素，所述混合溶液能夠依本領(lǐng)域人員的所常規(guī)技術(shù)，額外添加其他有助于牛樟芝生長的成分，如微量元素或維生素；其中，所述固化劑可以選擇瓊脂(Agar)，混合溶液含有0.5-10%的瓊脂，以提供牛樟芝菌絲生長時所需的支持，又能夠避免瓊脂的密度過高而阻礙牛樟芝菌絲的生長。
[0036]本發(fā)明柱體培養(yǎng)基可以選擇多面柱體或圓柱體，其中，本發(fā)明所指的所述柱體培養(yǎng)基的深度，不限定為該柱體培養(yǎng)基的柱高及柱寬，即該柱高與該柱寬是介于2至20公分，以提供足夠的深度供牛樟芝在所述柱體培養(yǎng)基的內(nèi)部生長，又不會因柱體培養(yǎng)基的厚度過大而不易進(jìn)行該接種步驟S2的操作。
[0037]如圖2a至2e所示，該柱體培養(yǎng)基I為多面柱體,所述多面柱體包括底面11、頂面12及至少一個側(cè)表面13，該底面11是貼附于一個培養(yǎng)盤上，該頂面12及該側(cè)表面13提供用以接種牛樟芝的表面，其中，該側(cè)表面13可以為平面或曲面，若該側(cè)表面13為平面，該側(cè)表面13的個數(shù)較佳優(yōu)選3至12個，如圖2a至圖2e所示的四面柱體、六面柱體、八面柱體或十二面柱體，或者該所述柱體的側(cè)表面13的個數(shù)超過12個，所述該柱體則接近為圓柱體，故該側(cè)表面13接近為曲面。
[0038]該接種步驟S2，在所述柱體培養(yǎng)基的內(nèi)部設(shè)有多個預(yù)定接種位，所述多個預(yù)定接種位距離該柱體培養(yǎng)基的外表面0.5-10公分深處,將牛樟芝接種于各個預(yù)定接種位上。具體地說，所述牛樟芝不限定為既有的牛樟菌株，如Taiwanofungus camphoratesKPOl (GenBank accession number:JQ945230)或臺灣新竹食品科學(xué)工業(yè)發(fā)展研究所的牛樟菌株(BCRC 35396、BCRC 35398、BCRC 35716、BCRC 36401、BCRC 36711、BCRC 36795、BCRC37848,BCRC 37849或BCRC 37850)。本發(fā)明通過將該牛樟芝的菌絲于三維空間中且多次地接種在所述柱體培養(yǎng)基內(nèi)部，使所述牛樟芝受到所述柱體培養(yǎng)基的全面性的包覆，并提高柱體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及空間利用率，增加牛樟芝于單位培養(yǎng)基中的菌絲量，進(jìn)而提高牛樟芝產(chǎn)生生理活性物質(zhì)(如三萜類化合物)的含量；本發(fā)明也可在所述柱體培養(yǎng)基的外表面進(jìn)行接種，以充分利用柱體培養(yǎng)基。
[0039]舉例說明，如圖2a所示，本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基I的外表面包括有底面11、頂面12及四個側(cè)表面13，以該頂面12為基準(zhǔn)，朝向該底面11延伸至至少0.5公分以深處，其余五個面以此類推，其所圈圍的范圍為該預(yù)定接種位P的許可范圍，即如圖所示的斜線部份S ;本實(shí)施例的四面柱體的柱高選擇為6公分，該底面11及頂面12為正四邊形，該四邊形的邊長選擇為3公分(即該四個側(cè)表面13邊長為3公分及6公分)。
[0040]如圖2e所示，本實(shí)施例的柱體培養(yǎng)基I的外表面包括有底面11、頂面12及一個側(cè)表面13，以該頂面12為基準(zhǔn)，朝向該底面11延伸至至少0.5公分以深處，該頂面12及該側(cè)表面13以此類推，其所圈圍的范圍為該預(yù)定接種位P的許可范圍，即如圖所示的斜線部份S ;該圓柱體的柱高為6公分，該圓柱體的底面11及頂面12為圓形，該圓形的直徑為6公分。
[0041]以接種環(huán)(或接種針)沾取牛樟芝菌絲體(Taiwanofungus camphorates KPOI)后，將沾取有牛樟芝菌絲體的接種環(huán)深入該柱體培養(yǎng)基I的斜線區(qū)塊中，且各預(yù)定接種位之間設(shè)有一個間距D，該間距D優(yōu)選是0.5-2公分，以避免各個接種的牛樟芝菌絲距離過近，而互相抑制生長。
[0042]通過各個預(yù)定接種位的間距D為0.5-2公分的距離，確保各個預(yù)定接種位上的牛樟芝菌絲體能夠充分利用周圍的營養(yǎng)，有利于牛樟芝菌絲的生長，又能夠避免各預(yù)定接種位上的牛樟芝菌絲體因接種過于密集而抑制其生長效率。
[0043]該培養(yǎng)步驟S3，將接種完成的柱體培養(yǎng)基于溫度23-28°C的環(huán)境下培養(yǎng)至少三個月，獲得一個牛樟菌體。具體地說，本實(shí)施例的牛樟芝是培養(yǎng)至少3個月以上，優(yōu)選培養(yǎng)至4-12個月后，即可獲得含有生理活性物質(zhì)的牛樟菌體，特別是含有較高含量的三萜類化合物。
[0044]如圖3所示，本發(fā)明的牛樟芝的培養(yǎng)方法優(yōu)選是在該培養(yǎng)步驟S3后，再進(jìn)行干燥步驟S4，該干燥步驟將長有牛樟菌體的柱體培養(yǎng)基，于30-40°C下烘干至含水量低于2%，獲得牛樟干燥菌塊。由于所述牛樟干燥菌塊去除了大部分的水分，因此易于保存或進(jìn)行后續(xù)生理活性物質(zhì)的萃取操作。
[0045]為證實(shí)本發(fā)明牛樟芝的培養(yǎng)方法所獲得的牛樟菌體，確實(shí)能夠產(chǎn)生如三萜類化合物的生理活性物質(zhì)，以下是本發(fā)明的較佳實(shí)施例及其三萜類化合物的定性結(jié)果。
[0046]如表I所示，表I是本實(shí)施例混合溶液的成分及重量百分比，將所述混合溶液煮沸后，待混合溶液冷卻凝固之前時，倒入四面柱體的模具中，并于室溫靜置至該混合溶液凝固，獲得如圖2a所示的四面柱體培養(yǎng)基，將所述柱體培養(yǎng)基傾倒出來，置于培養(yǎng)盤上；本實(shí)施例的操作優(yōu)選在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行，以避免其他微生物污染所述柱體培養(yǎng)基而影響后續(xù)牛樟芝的培養(yǎng)。
[0047]表1:本實(shí)施例的混合溶液的配方
【權(quán)利要求】
1.一種牛樟芝的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括: 培養(yǎng)基配制步驟，所述培養(yǎng)基配制步驟包括將重量百分比為0.1-50%的葡萄糖、I-5%的蛋白胨、0.1-50%的大麥萃取物、0.1-50%的酵母萃取物以及0.5-10%的固化齊IJ，用水配制成混合溶液，將所述混合溶液煮沸，使其完全溶解后，使所述混合溶液凝固成柱體培養(yǎng)基，所述柱體培養(yǎng)基的深度為2-20公分； 接種步驟，所述接種步驟包括在所述柱體培養(yǎng)基的內(nèi)部設(shè)置有多個預(yù)定接種位，所述多個預(yù)定接種位距離所述柱體培養(yǎng)基的外表面有0.5-10公分深，將牛樟芝接種于所述各個預(yù)定接種位上；以及 培養(yǎng)步驟，所述培養(yǎng)步驟包括將接種完成的柱體培養(yǎng)基在溫度23-28°C環(huán)境下培養(yǎng)至少三個月，獲得牛樟菌體。
2.如權(quán)利要求1所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，在所述培養(yǎng)步驟后，還包括干燥步驟，所述干燥步驟包括將長有牛樟菌體的柱體培養(yǎng)基，在30-40°C下烘干至含水量低于2 %，獲得牛樟干燥菌塊。
3.如權(quán)利要求1或2所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，所述各個預(yù)定接種位之間相距0.5-2公分。
4.如權(quán)利要求3所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，所述柱體培養(yǎng)基為多面柱體或圓柱體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，所述固化劑為瓊脂。
6.如權(quán)利要求1或2所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，所述培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)時間為4-12個月。
7.如權(quán)利要求2所述的牛樟芝的培養(yǎng)方法，其中，所述干燥步驟的干燥時間為24-72小時。
【文檔編號】A01G1/04GK103444430SQ201210180001
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】顏宏愷, 戴瑞凡, 賈銅安, 賈鐵安 申請人:慧普生技股份有限公司