本發(fā)明屬于醫(yī)藥用途領域，特別涉及雙胍類藥物在制備預防或減弱肺纖維化的藥物中的應用。

背景技術：

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。非小細胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的80％-85％；表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)和ALK-TKI為代表的靶向藥物對特定NSCLC患者取得了顯著的療效，但是研究人員發(fā)現(xiàn)，TKI治療過程中會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥--間質(zhì)性肺炎；目前臨床上尚無有效的預防EGFR-TKI和ALK-TKI引起間質(zhì)性肺炎的措施。因此，發(fā)現(xiàn)有效預防間質(zhì)性肺炎的措施對于改善TKI的安全應用、改善患者預后具有非常重要的科學意義和臨床價值。

經(jīng)研究表明，肺纖維化是間質(zhì)性肺炎最基本的病理改變，其發(fā)病機制主要包括成纖維細胞的聚集和細胞外基質(zhì)過量沉積等。目前臨床上多數(shù)是通過預防或減弱肺纖維化的產(chǎn)生，來預防間質(zhì)性肺炎的發(fā)生。

以二甲雙胍為代表性的雙胍類藥物廣泛用于2型糖尿病的治療；隨著研究的不斷深入，CN103371991還公開了二甲雙胍具有預防或治療 肝細胞癌的作用；CN103446080公開了二甲雙胍具有降低乙型肝炎病毒表面抗原水平的作用；CN102743364公開了二甲雙胍具有治療帕金森病的作用，等。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有文獻報道以二甲雙胍為主的雙胍類藥物在制備預防或減弱肺纖維化的藥物中的應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種雙胍類藥物的新用途，即雙胍類藥物在制備預防或減弱肺纖維化的藥物中的應用。

本發(fā)明提供的雙胍類藥物可預防或減弱肺纖維化，進一步可起到預防或減緩間質(zhì)性肺炎的發(fā)生和發(fā)展。

本發(fā)明的雙胍類藥物選自二甲雙胍及其鹽、苯乙雙胍或氯胍。

雙胍類藥物優(yōu)選二甲雙胍時，對肺纖維化尤其是間質(zhì)性肺炎的預防和減弱效果更加顯著。

其中，所述肺纖維化是由EGFR-TKI或ALK-TKI治療非小細胞肺癌時引起的。

EGFR-TKI或ALK-TKI在治療NSCLC患者中會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥--間質(zhì)性肺炎；肺纖維化是間質(zhì)性肺炎最基本的病理改變；為了有效地控制間質(zhì)性肺炎的發(fā)生和發(fā)展，預防或減弱肺纖維化的發(fā)生，是改善EGFR-TKI或ALK-TKI治療過程中的隱患，使其用藥更安全的有效措施。本發(fā)明通過大量的實驗得出，雙胍類藥物可預防或減弱肺纖維化的發(fā)生。

EGFR-TKI類藥物包括很多，本發(fā)明的EGFR-TKI選自第一代的吉非替尼、厄洛替尼或?？颂婺?；第二代的阿法替尼；及第三代的AZD9291、CO-1686或HM61713；ALK-TKI選自克唑替尼或色瑞替尼。

優(yōu)選地，所述EGFR-TKI為吉非替尼。

本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，當二甲雙胍的使用劑量范圍為250-2000mg時，優(yōu)選為500-1000mg；其對肺纖維化的減弱和預防效果更明顯。

更進一步的是，當二甲雙胍的使用劑量為750mg時，其對肺纖維化的減弱和預防效果最明顯。

本發(fā)明另一方面提供了二甲雙胍和輔料制成的緩釋制劑，該緩釋制劑也可預防或減弱肺纖維化。

優(yōu)選的緩釋制劑為緩釋片，該緩釋片包括二甲雙胍和輔料；所用輔料包括麥芽糖醇、月桂酸、緩釋材料、崩解劑和潤滑劑，其中，緩釋材料為甲基丙烯酸甲酯和山梨醇酐三硬脂酸酯的混合物，崩解劑為微晶纖維素和刺梧桐膠的混合物，潤滑劑為硬脂酸鎂，所述緩釋片各成分的重量份如下：

本發(fā)明提供的二甲雙胍緩釋片加入了麥芽糖醇和月桂酸的混合物，可使該緩釋片具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過加速試驗及長期試驗驗證 該緩釋片的性狀、含二甲雙胍的量、有關物質(zhì)、崩解時限及溶出度均沒有變化；在緩釋片中加入甲基丙烯酸甲酯和山梨醇酐三硬脂酸酯混合物的緩釋材料，使該緩釋片在1、2、6、12和24小時的累積溶出百分率分別達到33-35％、68-70％、80-82％、87-89％和90％以上，該緩釋片具有釋藥平穩(wěn)、緩慢釋藥的效果，并且能夠達到24h釋藥；在緩釋片內(nèi)加入的微晶纖維素和刺梧桐膠能夠使該緩釋片快速崩解，崩解時限在10min內(nèi)，到達體內(nèi)迅速起效。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明提供一種雙胍類藥物的新用途，該雙胍類藥物可用于預防或減弱肺纖維化，雙胍類藥物不但可以顯著減弱轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)引起的肺纖維化，還可以顯著EGFR-TKI或ALK-TKI治療非小細胞肺癌時產(chǎn)生的肺纖維化，同時可以顯著減弱EGFR-TKI或ALK-TKI加重的博來霉素引起的肺纖維化；從而起到預防或減緩間質(zhì)性肺炎的效果，其可避免EGFR-TKI或ALK-TKI治療非小細胞肺癌時產(chǎn)生的并發(fā)癥，有效地提高EGFR-TKI或ALK-TKI的治療效果，減少患者并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)。

附圖說明

圖1為免疫熒光技術檢測肺纖維化指標α-actin表達的結果；

圖2為采用western blot技術檢測肺纖維化標志物α-actin及COL1A1的表達及檢測TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達的結果；

圖3為免疫熒光技術檢測纖維化指標α-actin表達的結果；

圖4為western blot技術檢測纖維化標志物α-actin及COL1A1的表達，檢測TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達的結果；

圖5為HE染色及Masson染色的結果；

圖6為Elisa方法檢測羥脯氨酸含量的結果；

圖7為免疫組化檢測α-actin表達的結果；

圖8為western blot檢測COL1A1、α-actin及TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達的結果。

具體實施方式

實施例1 一種二甲雙胍緩釋片

按照常規(guī)的方法制備。

實施例2 一種二甲雙胍緩釋片

按照常規(guī)的方法制備。

動物實驗

實驗例1 二甲雙胍顯著減弱轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)引起的肺纖維化的研究

1.1 實驗方法

將肺成纖維細胞株HFL-1隨機分成四組，分別為對照組，TGF-β組、二甲雙胍組和TGF-β+二甲雙胍組；

對照組無特殊處理；TGF-β組給予TGF-β處理(10μg/L，作用時間48h)；二甲雙胍組給予二甲雙胍處理(10μM，作用時間48h)；TGF-β+二甲雙胍組給予TGF-β聯(lián)合二甲雙胍處理(10μg/L+10μM，作用時間48h)；

48h后，采用免疫熒光技術檢測肺纖維化指標α-actin的表達；采用western blot技術檢測肺纖維化標志物α-actin、COL1A1及TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達。

1.2 實驗結果

從圖1中可以看出，與對照組相比，TGF-β處理的肺成纖維細胞株HFL-148h后，α-actin蛋白的表達明顯增加；而只給予二甲雙胍處理后，α-actin蛋白的表達沒有明顯變化；與TGF-β組比較，TGF-β聯(lián)合二甲雙胍處理后，α-actin蛋白的表達顯著降低；由此得出，二甲雙胍可顯著減弱轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達。

從圖2中可以看出，與對照組相比，TGF-β處理的肺成纖維細胞株HFL-148h后，COL1A1、α-actin、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯增加；而只給予二甲雙胍處理后，這些蛋白的表達明顯降低；與TGF-β組比較，TGF-β聯(lián)合二甲雙胍處理后，COL1A1、α-actin、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達顯著降低； 由此得出，二甲雙胍可顯著減弱轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)引起的肺纖維化標志物α-actin和COL1A1蛋白的表達，顯著抑制TGF-β信號通路關鍵下游蛋白的表達，顯著抑制肺纖維化的關鍵機制。

1.3 結論

從以上可以得出二甲雙胍能夠顯著減弱轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)引起的肺纖維化。

實驗例2 二甲雙胍顯著減弱吉非替尼刺激引起的肺纖維化的研究

2.1 實驗方法

將肺成纖維細胞株HFL-1分為6組，分別為對照組，P9-CM組，P9-CM+吉非替尼組，P9-CM+吉非替尼+二甲雙胍組，R9-CM組，R9-CM+二甲雙胍組；

對照組無特殊處理；P9-CM組給予來自PC-9細胞的條件培養(yǎng)基處理細胞48h；PC-9+吉非替尼組給予來自吉非替尼30μM處理的PC-9細胞的條件培養(yǎng)基處理細胞48h；PC-9+吉非替尼+二甲雙胍組給予來自吉非替尼30μM處理的PC-9細胞的條件培養(yǎng)基聯(lián)合二甲雙胍20μM處理細胞48h；R9-CM組給予來自PC-9GR細胞的條件培養(yǎng)基處理細胞48h；R9-CM+二甲雙胍組給予來自PC-9GR細胞的條件培養(yǎng)基聯(lián)合二甲雙胍20μM處理細胞48h；

48h后，采用免疫熒光技術檢測纖維化指標α-actin的表達；采用western blot技術檢測纖維化標志物α-actin、COL1A1及TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達。

2.2 實驗結果

從圖3中可以看出，與對照組相比，經(jīng)過P9-CM組、R9-CM組和P9-CM+吉非替尼組處理的HFL-1細胞48h后，α-actin蛋白的表達明顯增加；與P9-CM組比較，經(jīng)過P9-CM+吉非替尼組處理的HFL-1細胞48h后，α-actin蛋白的表達也明顯增加，由此得出，吉非替尼不但能夠顯著提高肺纖維化標志物α-actin蛋白的含量，并且能夠進一步 提高P9-CM組處理后的HFL-1細胞內(nèi)的α-actin蛋白的含量；與P9-CM+吉非替尼組比較，經(jīng)過P9-CM+吉非替尼+二甲雙胍組處理后的HFL-1細胞，α-actin蛋白的表達顯著降低；與R9-CM組比較，經(jīng)過R9-CM+二甲雙胍組處理后的HFL-1細胞，α-actin蛋白的表達顯著降低；由此得出，二甲雙胍不但可以顯著減弱來自PC-9細胞株的條件培養(yǎng)基和來自PC-9GR細胞株的條件培養(yǎng)基引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達；而且能夠顯著減弱吉非替尼刺引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達。

從圖4中可以看出，與對照組相比，經(jīng)過R9-CM組和P9-CM+吉非替尼組處理的HFL-1細胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯增加；與P9-CM組比較，經(jīng)過P9-CM+吉非替尼組處理的HFL-1細胞48h后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯增加；與P9-CM+吉非替尼組比較，經(jīng)過P9-CM+吉非替尼+二甲雙胍組處理后的HFL-1細胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯降低；與R9-CM組比較，經(jīng)過R9-CM+二甲雙胍組處理后的HFL-1細胞中，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯降低；由此得出，二甲雙胍可顯著減弱吉非替尼和來自PC-9GR細胞株的條件培養(yǎng)基引起的肺纖維化標志物α-actin和COL1A1蛋白的表達，顯著抑制TGF-β信號通路關鍵下游蛋白的表達，顯著抑制肺纖維化的關鍵機制。

2.3 結論

從以上可以得出二甲雙胍能夠顯著減弱吉非替尼引起的肺纖維化。

實驗例3 二甲雙胍顯著減弱吉非替尼加重的博來霉素引起的肺纖維化的研究

3.1 實驗材料

6周齡健康雄性SD大鼠75只(購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心)，體重200g-210g；

吉非替尼，購自英國Tocris Bioscience公司；

二甲雙胍，購自美國sigma公司；

HE及Masson染色試劑盒，由福州邁新生物技術公司生產(chǎn)；

酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒，由武漢優(yōu)爾生公司生產(chǎn)。

3.2 動物模型的制備及分組

將75只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周以后，按隨機數(shù)字表的方法分為對照組，博萊霉素組，二甲雙胍組，吉非替尼組和吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組，每組各15只；

將75只SD大鼠分別用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部去毛后乙醇消毒，縱行切開頸前皮膚，分離組織后暴露氣管；

其中，對照組注入無菌生理鹽水200μl，其余各組向氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速將動物直立，旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻；

各實驗組大鼠于氣管內(nèi)注射當天開始還需連續(xù)灌胃21天，其中，對照組與博萊霉素組給予生理鹽水2ml灌胃，吉非替尼組給予吉非替尼200mg/kg灌胃；二甲雙胍組給予二甲雙胍300mg/kg灌胃；吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組給予吉非替尼200mg/kg聯(lián)合二甲雙胍300mg/kg灌胃；氣管內(nèi)注射后第21天，殺鼠取肺；

3.3 觀察指標

左肺石蠟切片行HE染色及Masson染色；免疫組化檢測α-actin的表達；取右肺Elisa方法檢測羥脯氨酸含量；western blot檢測COL1A1、α-actin及TGF-β下游關鍵信號通路蛋白的表達。

3.4 實驗結果

從圖5中可以看出，經(jīng)HE染色法后，與對照組相比，經(jīng)過博來霉素組和吉非替尼組處理小鼠的肺后，肺間隔增厚、肺間質(zhì)水腫及纖維化毛細血管充血量均顯著增加；與博來霉素組比較，經(jīng)過吉非替尼組處理小鼠的肺后，肺間隔增厚、肺間質(zhì)水腫及纖維化毛細血管充血量也顯著增加；與博來霉素組比較，經(jīng)過二甲雙胍組處理小鼠的肺后，肺間隔增厚、肺間質(zhì)水腫及纖維化毛細血管充血量均顯著降低；與吉非替尼組比較，經(jīng)過吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組處理小鼠的肺后，肺間隔增厚、肺間質(zhì)水腫及纖維化毛細血管充血量均顯著降低；由此得出，二甲雙胍可顯著降低肺間隔增厚、肺間質(zhì)水腫及纖維化毛細血管充血，顯著減弱肺組織損傷程度；經(jīng)masson染色可得出，與對照組相比，經(jīng)過博來霉素組和吉非替尼組處理小鼠的肺后，肺組織纖維化程度加重；與博來霉素組比較，經(jīng)過吉非替尼組處理小鼠的肺后，肺組織纖維化程度也加重；與博來霉素組比較，經(jīng)過二甲雙胍組處理小鼠的肺后，肺組織纖維化程度明顯減弱；與吉非替尼組比較，經(jīng)過吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組處理小鼠的肺后，肺組織纖維化程度明顯減弱；由此得出，二甲雙胍顯著減弱了肺組織的纖維化程度。

從圖6中可以看出，與對照組比較，經(jīng)過博來霉素組和吉非替尼組處理小鼠的肺后，羥脯氨酸的含量顯著增加；與博來霉素組比較，經(jīng)過吉非替尼組處理小鼠的肺后，羥脯氨酸的含量也顯著增加；與博來霉素組比較，經(jīng)過二甲雙胍組處理小鼠的肺后，羥脯氨酸的含量顯著降低；與吉非替尼組比較，經(jīng)過吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組處理小鼠的肺后，羥脯氨酸的含量顯著降低；由此得出，二甲雙胍可顯著降低羥脯氨酸的含量，顯著減弱組織膠原沉積。

從圖7中可以看出，與對照組相比，經(jīng)過博來霉素組處理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表達明顯增加；與博來霉素組相比，經(jīng)過吉非替尼組處理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表達也明顯增加，由此得出， 吉非替尼可加重博來霉素引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達；與博來霉素組比較，經(jīng)過二甲雙胍組處理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表達明顯降低；與吉非替尼組比較，經(jīng)過吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組處理小鼠的肺后，α-actin蛋白的表達顯著降低；由此得出，二甲雙胍不但可以顯著減弱博來霉素引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達；而且能夠顯著減弱吉非替尼加重的博來霉素引起的肺纖維化標志物α-actin蛋白的表達。

從圖8中可以看出，與對照組相比，經(jīng)過博來霉素組和吉非替尼組處理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯增加；與博來霉素組比較，經(jīng)過吉非替尼組處理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSmad3、pSTAT3和pAKT蛋白的表達明顯增加；與博來霉素組相比，經(jīng)過二甲雙胍組處理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯降低；與吉非替尼組相比，經(jīng)過吉非替尼二甲雙胍聯(lián)用組處理小鼠的肺后，COL1A1、α-actin、pSmad2、pSTAT3、pAKT和dpERK1/2蛋白的表達明顯降低；由此得出，二甲雙胍可顯著減弱博來霉素引起的肺纖維化標志物α-actin和COL1A1蛋白的表達；而且能夠顯著減弱吉非替尼加重的博來霉素引起的肺纖維化標志物α-actin和COL1A1蛋白的表達；并且顯著抑制TGF-β信號通路關鍵下游蛋白的表達，顯著抑制肺纖維化的關鍵機制。

3.5 結論

從以上可以得出二甲雙胍能夠顯著減弱博來霉素引起的肺纖維化；并且顯著減弱吉非替尼加重的博來霉素引起的肺纖維化。

實驗例4 不同劑量的二甲雙胍對博來霉素引起的肺纖維化的影響

4.1 實驗材料

6周齡健康雄性SD大鼠90只(購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心)，體重200g-210g；

吉非替尼，購自英國Tocris Bioscience公司；

二甲雙胍，購自美國sigma公司；

HE及Masson染色試劑盒，由福州邁新生物技術公司生產(chǎn)；

酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒，由武漢優(yōu)爾生公司生產(chǎn)。

4.2 動物模型的制備及分組

將90只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周以后，按隨機數(shù)字表的方法分為對照組，博萊霉素組，二甲雙胍1組，二甲雙胍2組，二甲雙胍3組，二甲雙胍4組、二甲雙胍5組、二甲雙胍6組和二甲雙胍7組，每組各10只；

將90只SD大鼠分別用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，頸部去毛后乙醇消毒，縱行切開頸前皮膚，分離組織后暴露氣管；

其中，對照組注入無菌生理鹽水200μl，其余各組向氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg，5g/L)，注射后迅速將動物直立，旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻；

各實驗組大鼠于氣管內(nèi)注射當天開始還需連續(xù)灌胃21天，其中，對照組與博萊霉素組給予生理鹽水2ml灌胃；二甲雙胍1組給予二甲雙胍200mg灌胃；二甲雙胍2組給予二甲雙胍250g灌胃；二甲雙胍3組給予二甲雙胍500mg灌胃；二甲雙胍4組給予二甲雙胍750mg灌胃；二甲雙胍5組給予二甲雙胍1000mg灌胃；二甲雙胍6組給予二甲雙胍2000mg灌胃；二甲雙胍7組給予二甲雙胍2250mg灌胃氣管內(nèi)注射后第21天，殺鼠取肺；稱重，計算肺指數(shù)，形態(tài)學改變分級肺泡炎和肺纖維化分級。

肺泡炎和肺纖維化程度分為4級：0級無明顯變化；1級輕度變化，病變范圍小于全肺的20％；2級中度改變，病變范圍占全肺的 20-50％；3級重度改變，病變范圍占全肺的50％以上。Elisa方法檢測羥脯氨酸含量。

4.3 實驗結果

不同劑量的二甲雙胍對博來霉素引起的肺纖維化的影響見表1。

表1 不同劑量的二甲雙胍對博來霉素引起的肺纖維化的影響

與博來霉素組相比，P^*﹤0.05，P^a﹤0.01。

從表中可以看出，二甲雙胍1組能夠輕微的降低肺指數(shù)、纖維化分級及肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量；而二甲雙胍2組到二甲雙胍7組能夠顯著降低肺指數(shù)、纖維化分級及肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量；即，隨著二甲雙胍量的增加，肺指數(shù)、纖維化分級及肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量降低的越明顯，而當二甲雙胍的用量達到750mg時，肺指數(shù)、纖維化分級及肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量降低的水平已接近于對照組，繼續(xù)增加量，對肺指數(shù)、纖維化分級及肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量影響不大。